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Immunology and Infection

Sobreexpressão e purificação do ser humano doi: 10.3791/56430 Published: August 3, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Um protocolo simples para a superexpressão e purificação da cis -preniltransferase humana, otimizada com codão, em condições não desnaturantes, de Escherichia Coli , é descrito, juntamente com um ensaio de actividade enzimática. Este protocolo pode ser generalizado para a produção de outras proteínas de cis- preniltransferase em quantidade e qualidade adequadas para estudos mecanicistas.

Abstract

As preniltransferases (PT) são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia do difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação. DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica (formando cis duplas ligações da reação de condensação) que catalisa o alongamento da cadeia do difosfato de farnesilo (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP). DHDDS é de importância biomédica, como uma mutação não-conservadora (K42E) na enzima resulta em retinite pigmentosa , levando finalmente a cegueira. Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir grandes quantidades de DHDDS purificado, adequado para estudos mecanicistas. Aqui, o uso de fusão de proteínas, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humanos funcionalmente ativos em cis -PT entre diferentes espécies sugere que este protocolo pode ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também, como as envolvidas na síntese de borracha natural.

Introduction

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As preniltransferases são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia de difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação 1 , 2 . As enzimas de tipo Z catalisam a formação de duplas ligações cis da reação de condensação, enquanto as enzimas do tipo E catalisam a formação de ligações duplas trans 3 . cis -Prenyltransferases (cis-PT, enzimas do tipo Z) são classicamente classificados de acordo com o comprimento da cadeia do produto para de cadeia curta (C 15), de cadeia média (C 50-55), e de cadeia longa (C 70-120 ) 4 . DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica que catalisa o alongamento da cadeia do farnesil difosfato (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP) 15 , 6 . Isto resulta na formação de difosfato de dehidrodolilo, um difosfato de poliprenal C 55-100 que serve como precursor de dolichilpirofosfato, a molécula transportadora de glicosil envolvida na glicosilação de proteína 1 ligada a N. Entre os judeus asquenazes, uma mutação não-conservadora de falta de expressão (K42E) em DHDDS resulta em retinite pigmentosa autossômica recessiva 7 , 8 . Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir DHDDS purificado adequado para estudos mecanicistas.

Escherichia coli é considerada o hospedeiro mais conveniente e econômico para a expressão da proteína recombinante e, portanto, também é o hospedeiro mais utilizado. No entanto, quando se tenta sobreexpressar heterologicamente proteínas em E. coli , devem ser feitas considerações específicas de proteínas. Obtendo corretamente dobrado, ativadoE proteínas recombinantes de E. coli , não é uma questão simples devido às propriedades distintas de diferentes proteínas. Numerosas abordagens foram desenvolvidas para superar esses obstáculos. Aqui, o uso de fusão protéica, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humano funcionalmente ativo em E. coli . De notar, uma tentativa anterior de sobre-expressar levedura cis -PT sem fusão protéica foi infrutífera devido à insolubilidade completa, mesmo na presença de detergente 12 . O protocolo descrito é simples, econômico, economizando tempo e permite a obtenção de preparações DHDDS adequadas para estudos mecanicistas. Dada a homologia de cis -PT entre diferentes espécies, sugerimos que este protocolo possa ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também.

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Protocol

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1. Clonagem de cis -PT para superexpressão em E. coli

  1. Se obter o vector de expressão pET-32b, concebidos para a clonagem e expressão de alto nível de sequências de proteínas fundidas com a proteína de 109aa tioredoxina (TRX) 17, e E. coli cod-optimizada 18 sequcia de comprimento completo -PT-cis codificação.
  2. Tome cuidado para ter um site de clivagem de TEV-protease (proteina de vírus de gravura de tabaco) (ENLYFQ / G, onde "/" indica o ponto de clivagem) 9 seguido de um ligador flexível curto (SGSGSG, para aumentar a acessibilidade do espaço de clivagem) a montante do cis - Seqüência de TP ( Figura 1 A ). Além disso, adicionar locais de restrição 5 'e 3' adequados para clonagem.
  3. Clone a construção de DNA sintetizada no vetor pET-32b usando técnicas de ligação padrão 10 .

2. OverexpreSons de DHDDS Humano em E. coli

  1. Transforme as células competentes E. coli T7 express com a construção DHDDS TRX-fusion de acordo com as instruções do fabricante.
  2. Placa as células transformadas de acordo com as instruções do fabricante sobre LB-agar sob condições seletivas de ampicilina (200 mg / L).
  3. Inocular colônias selecionadas em 100 mL de meio LB em frascos de 250 mL com culturas iniciais com 100 mg / L de ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação constante a 200 rpm.
  4. Inocular 80 mL da cultura em dois frascos de 5 L (40 mL por balão), contendo cada um 1,5 L de meio 2x YT (triptona 16 g / L, extracto de levedura 10 g / L, NaCl 5 g / L) com 100 mg / L ampicilina.
  5. Incubar a cultura a 37 ° C com agitação constante a 180 rpm até atingir OD 600 nm = 0,5.
  6. Abaixe a temperatura para 16 ° C e induzir as células por adição de β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) isopropílico 0,5 mM. VigaristaContinuam incubando sob a mesma condição durante 16-20 h para a expressão da proteína.
  7. Colher as células por centrifugação (10 000 x g durante 10 min).
    Nota: O protocolo pode ser pausado aqui; O sedimento das células deve ser mantido a -80 ° C até a purificação.

3. Purificação de DHDDS Humano

  1. Ressuspender as células no tampão A (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 0,1%, β-mercaptoetanol 10 mM), 1 μg / mL de DNase I e uma mistura de inibidor de protease.
  2. Homogeneizar as células usando um homogeneizador de vidro e Teflon.
  3. Deslocar as células usando um microfluidizador ou equivalente a 12.000 - 15.000 psi 11 .
  4. Centrifugar o lisado celular a 40.000 xg durante 45 minutos a 4 ° C. Recupere o sobrenadante, contendo a fração solúvel.
  5. Carregar o sobrenadante sobre uma coluna de cromatografia de afinidade de 5-10 mL de cobalto imobilizado em metal (Co 2+ -MIAC) 12 com 10MM de imidazole, seguido de lavagem completa com tampão A e 10 mM de imidazole para reduzir a ligação de proteínas não específicas.
  6. Eluir as proteínas sobre-expressas com tampão A suplementado com imidazol 250 mM.
  7. Remova o imidazole utilizando uma coluna de dessalinização preparativa de 53 mL equilibrada com o tampão A.
  8. Adicionar protease TEV marcada com 6xHis (1 mg TEV protease por proteína 50 mg) às proteínas eluídas para remover a sua proteína de fusão TRX marcada com 6xHis a 4 ° C durante a noite.
  9. Carregar as proteínas clivadas em uma coluna Co 2+ -IMAC, equilibrada com o tampão A suplementado com imidazol 5 mM, para remover a proteína de fusão TRX marcada com His e a protease de TEV.
  10. Recolher o fluxo e concentrar-se a 3 - 4 mL usando um filtro centrífugo de corte molecular de 30 kDa.
  11. Carregar a proteína concentrada em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho superdex-200 equilibrada com o tampão A para purificação final. A proteína elui como dímero (~ 76 kDa). Selecione as frações relevantes, comparando o perfil de eluição com uma curva de calibração da coluna.
  12. Avalie a pureza da preparação usando SDS-PAGE.
  13. Determine a concentração de proteína necessária para a experimentação a jusante e alíquotas de congelação rápida de proteínas concentradas purificadas em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C até o uso.

4. Cromatografia Analítica de Tamanho-Exclusão (SEC)

  1. Para garantir a capacidade da proteína para suportar ciclos de congelamento-descongelamento, descongelar uma alíquota das proteínas congeladas e centrifugar a 21,000 x g durante 10 min para remover agregados insolúveis. Recolher o sobrenadante.
  2. Carregar as proteínas em uma coluna analítica superdex-200 pré-equilibrada com Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 0,02%, β-mercaptoetanol 10 mM, utilizando um sistema de cromatografia líquida de ultra-performance 13 , 14 .
  3. Monitorar fluore de triptofanoScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) para detectar o perfil de eluição de eluição das proteínas. Certifique-se de ter uma curva de calibração válida para avaliação do peso molecular - tais curvas estão disponíveis através dos fabricantes de coluna SEC.

5. Enzima cinética - atividade dependente do tempo 15 , 16 , 17

  1. Para garantir a actividade da proteína purificada, mistura de 5? M DHDDS purificadas com 10 FPP? M e 50? M 14 C-IPP para iniciar a reacção em tampão A com 0,5 mM de MgCl 2 a 22 - 30 ° C.
    Nota: As condições de reação exatas podem variar com as preparações de cis- TPs diferentes de DHDDS. Além disso, a atividade do DHDDS também depende da temperatura e [Mg 2+ ].
    Cuidado: 14 C-IPP é radioativo e deve ser usado de acordo com as normas locais de segurança de radiação. Retire 15 μL de amostras da reação a 0, 2, 4 e 6 h, após a extinção imediata da reação pela adição de 15 μL de tampão A suplementado com EDTA 20 mM (até uma concentração final de 10 mM de EDTA).
  2. Adicione 1 ml de 1-butanol saturado com H 2 O e vorteie cuidadosamente para extrair os produtos da reação.
    Nota: O protocolo pode ser parado aqui e as amostras podem ser mantidas para leitura posterior.
  3. Adicione coquetel de cintilação às amostras e, usando um contador de cintilação, quantifique produtos de reação na fase de butanol abrangendo 14 C, juntamente com a radioatividade de 15 μL da mistura de reação, representando a radioatividade total.
  4. Subtrair as leituras de fundo medido usando as amostras de 0 h de cada ponto do tempo e calcular a porcentagem de 14 C-IPP utilizada.
  5. Calcule a incorporação líquida de 14 C-IPP em cada ponto de tempo, calculando a porcentagem utilizada do total de 14 14 C-IPP com o tempo.

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Representative Results

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A visão geral da construção usada aqui e o processo de purificação são mostrados na Figura 1 . As amostras obtidas em cada passo de purificação são mostradas na Figura 2 . Esta análise SDS-PAGE mostra a purificação gradual de DHDDS, resultando em um produto altamente purificado. A Figura 3 mostra os resultados da SEC analítica da enzima purificada, revelando que a proteína só é observada como um homodímero. A Figura 4 mostra um ensaio de actividade representativo dependente do tempo. 14 A incorporação de C-IPP aumenta claramente ao longo de 6 h, verificando que a enzima purificada é funcional.

figura 1
Figura 1: Clonagem e Purificação DHDDS Humana . ( B ) Esboço do protocolo de purificação DHDDS humano descrito aqui. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2
Figura 2: Purificação de DHDDS humanos . Análise de SDS-PAGE de passos de purificação de afinidade DHDDS humanos. Pista 1, marcador de peso molecular (kDa); Pista 2, extrato bruto; Lane 3, Co 2+ -IMAC flow-through. A seta indica a proteína de fusão TRX-DHDDS; Pista 4, eluente Co 2+ -IMAC; Lane 5, proteína-TEV protease mistura após incubação durante a noite; Pista 6, Co 2+ -IMAC fluxo através da clivagem TEV; Pista 7, eluente de Co 2 + -IMAC após clivagem de TEV; Pista 8, DHDDS humano purificado (indicPor uma seta) após cromatografia de exclusão de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3
Figura 3: SEC analítica de DHDDS humano purificado. A fluorescência de triptofano foi monitorada conforme descrito no protocolo. De acordo com a curva de calibração desta coluna, DHDDS forma um homodímero (77,4 kDa). A seta indica o volume vazio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4
Figura 4 : TiAtividade dependente de mim de DHDDS humano purificado. A actividade in vitro de DHDDS humano purificado na reacção com FPP 10 uM e 14 C-IPP 50 μM como substratos é expressa como incorporação de IPP por proteína (mol / mol). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

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O protocolo descrito aqui para a purificação de DHDDS humano funcional em células de E. coli é simples e eficiente, permitindo a sobreexpressão e purificação da proteína em 3 a 4 dias, uma vez que uma construção adequada esteja disponível. Tais protocolos para a purificação de proteínas são de especial importância, dado os avanços no seqüenciamento do genoma, que forneceu uma infinidade de informações sobre a genética de muitas doenças 18 , exigindo assim o desenvolvimento de métodos de alto rendimento para caracterizar mecanismos patogênicos no nível de proteína 19 .

Para superar armadilhas comuns na sobreexpressão e purificação de proteínas heterólogas, várias medidas foram tomadas aqui, que são críticas para obter proteínas solúveis e funcionais com sucesso. Primeiro, o DHDDS foi sobreexpressado como uma fusão TRX. O TRX facilita a dobragem da proteína de fusão e aumenta a solubilidade da proteína de fusão, evitando a inclusão bFormação de Ody 20 . Em seguida, para aumentar o rendimento de proteína, a construção de DNA foi codon otimizada para expressão em E. coli 21 . Finalmente, para reduzir ainda mais a probabilidade de formação de corpo de inclusão, a expressão da proteína foi induzida a 16 ° C para retardar a taxa de síntese de proteína, provavelmente auxiliando a dobragem de proteína 22 .

Levando em consideração a homologia de cis -PT entre diferentes espécies, sugerimos que este protocolo possa ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas, bem como 1 . Usando o protocolo atual como ponto de partida, e com as diretrizes gerais críticas para a expressão DHDDS, esse método pode ser modificado para uma expressão ótima de diferentes cis -PTs. Por exemplo, pode-se tentar diferentes parceiros de fusão (como a proteína de ligação à maltose) ou otimizar ainda mais as condições de cultura para a proteína específica a ser estudada.

<P class = "jove_content"> Com seu significado biomédico e biotecnológico 1 , 7 , 8 , o uso futuro do protocolo descrito para obter grandes quantidades de DHDDS funcional purificado, juntamente com outros cis -PT, permitindo a busca de sua caracterização estrutural e funcional . Por exemplo, outros estudos moleculares de DHDDS resolverão os mecanismos subjacentes à retinite pigmentosa relacionada ao DHDDS, levando potencialmente a descoberta e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Além disso, à medida que os cis -PTs procarióticos estão envolvidos na síntese de parede bacteriana, este grupo de enzimas potencialmente forma novos alvos para novos agentes antibacterianos. De fato, a caracterização completa dos estudos de enzimas eucariotas e procarióticas pode permitir o desenvolvimento racional de drogas antimicrobianas seletivas para a cis -PT procariótica. Finalmente, como a borracha natural é sintetizada bE membros da família cis -PT, a abordagem descrita aqui pode encontrar uso futuro na síntese industrial de borracha natural.

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Disclosures

Os autores não têm nada a revelar.

Acknowledgments

Este trabalho foi financiado pelo Centro de Excelência em Pesquisa (I-CORE) da Fundação de Ciência da Ciência de Israel (1775/12) e a Fundação de Ciência de Israel concede 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). O apoio da Fields Estate Foundation à DK é altamente apreciado. Este trabalho foi realizado por Ilan Edri e Michal Goldenberg no cumprimento parcial dos requisitos de tese de MD da Faculdade de Medicina de Sackler, Universidade de Tel Aviv.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
pET-32b Novagen 69016-3
T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) NEB C3010I
cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail Roche 11873580001
TALON-superflow resin GE Healthcare 28-9574-99
HiPrep 26/10 desalting column  GE Healthcare 17508701
HiLoad 16/60 superdex-200  GE Healthcare 28989335
superdex-200 increase 5/150 GL  GE Healthcare 28990945
14C-Isopentenyl pyrophosphate Perkin-Elmer NEC773050UC 
trans,trans-Farnesyl pyrophosphate Sigma 44270-10MG

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References

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Sobreexpressão e purificação do ser humano<em&gt; Cis</em&gt; -preniltransferase em<em&gt; Escherichia coli</em
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Edri, I., Goldenberg, M., Lisnyansky, M., Strulovich, R., Newman, H., Loewenstein, A., Khananshvili, D., Giladi, M., Haitin, Y. Overexpression and Purification of Human Cis-prenyltransferase in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (126), e56430, doi:10.3791/56430 (2017).More

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