Summary
Um protocolo simples para a superexpressão e purificação da cis -preniltransferase humana, otimizada com codão, em condições não desnaturantes, de Escherichia Coli , é descrito, juntamente com um ensaio de actividade enzimática. Este protocolo pode ser generalizado para a produção de outras proteínas de cis- preniltransferase em quantidade e qualidade adequadas para estudos mecanicistas.
Abstract
As preniltransferases (PT) são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia do difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação. DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica (formando cis duplas ligações da reação de condensação) que catalisa o alongamento da cadeia do difosfato de farnesilo (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP). DHDDS é de importância biomédica, como uma mutação não-conservadora (K42E) na enzima resulta em retinite pigmentosa , levando finalmente a cegueira. Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir grandes quantidades de DHDDS purificado, adequado para estudos mecanicistas. Aqui, o uso de fusão de proteínas, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humanos funcionalmente ativos em
Introduction
As preniltransferases são um grupo de enzimas que catalisam o alongamento da cadeia de difosfato alílico usando difosfato de isopentenilo (IPP) através de múltiplas reações de condensação 1 , 2 . As enzimas de tipo Z catalisam a formação de duplas ligações cis da reação de condensação, enquanto as enzimas do tipo E catalisam a formação de ligações duplas trans 3 . cis -Prenyltransferases (cis-PT, enzimas do tipo Z) são classicamente classificados de acordo com o comprimento da cadeia do produto para de cadeia curta (C 15), de cadeia média (C 50-55), e de cadeia longa (C 70-120 ) 4 . DHDDS (desidrodolichyl difosfato sintase) é uma cis -PT de cadeia longa eucariótica que catalisa o alongamento da cadeia do farnesil difosfato (FPP, um difosfato alílico) através de múltiplas condensações com difosfato de isopentenilo (IPP) 15 , 6 . Isto resulta na formação de difosfato de dehidrodolilo, um difosfato de poliprenal C 55-100 que serve como precursor de dolichilpirofosfato, a molécula transportadora de glicosil envolvida na glicosilação de proteína 1 ligada a N. Entre os judeus asquenazes, uma mutação não-conservadora de falta de expressão (K42E) em DHDDS resulta em retinite pigmentosa autossômica recessiva 7 , 8 . Portanto, o presente protocolo foi desenvolvido para adquirir DHDDS purificado adequado para estudos mecanicistas.
Escherichia coli é considerada o hospedeiro mais conveniente e econômico para a expressão da proteína recombinante e, portanto, também é o hospedeiro mais utilizado. No entanto, quando se tenta sobreexpressar heterologicamente proteínas em E. coli , devem ser feitas considerações específicas de proteínas. Obtendo corretamente dobrado, ativadoE proteínas recombinantes de E. coli , não é uma questão simples devido às propriedades distintas de diferentes proteínas. Numerosas abordagens foram desenvolvidas para superar esses obstáculos. Aqui, o uso de fusão protéica, condições de cultura otimizadas e otimização de codões foram utilizados para permitir a superexpressão e purificação de DHDDS humano funcionalmente ativo em E. coli . De notar, uma tentativa anterior de sobre-expressar levedura cis -PT sem fusão protéica foi infrutífera devido à insolubilidade completa, mesmo na presença de detergente 12 . O protocolo descrito é simples, econômico, economizando tempo e permite a obtenção de preparações DHDDS adequadas para estudos mecanicistas. Dada a homologia de cis -PT entre diferentes espécies, sugerimos que este protocolo possa ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas também.
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Protocol
1. Clonagem de cis -PT para superexpressão em E. coli
- Se obter o vector de expressão pET-32b, concebidos para a clonagem e expressão de alto nível de sequências de proteínas fundidas com a proteína de 109aa tioredoxina (TRX) 17, e E. coli cod-optimizada 18 sequcia de comprimento completo -PT-cis codificação.
- Tome cuidado para ter um site de clivagem de TEV-protease (proteina de vírus de gravura de tabaco) (ENLYFQ / G, onde "/" indica o ponto de clivagem) 9 seguido de um ligador flexível curto (SGSGSG, para aumentar a acessibilidade do espaço de clivagem) a montante do cis - Seqüência de TP ( Figura 1 A ). Além disso, adicionar locais de restrição 5 'e 3' adequados para clonagem.
- Clone a construção de DNA sintetizada no vetor pET-32b usando técnicas de ligação padrão 10 .
2. OverexpreSons de DHDDS Humano em E. coli
- Transforme as células competentes E. coli T7 express com a construção DHDDS TRX-fusion de acordo com as instruções do fabricante.
- Placa as células transformadas de acordo com as instruções do fabricante sobre LB-agar sob condições seletivas de ampicilina (200 mg / L).
- Inocular colônias selecionadas em 100 mL de meio LB em frascos de 250 mL com culturas iniciais com 100 mg / L de ampicilina e incubar durante a noite a 37 ° C com agitação constante a 200 rpm.
- Inocular 80 mL da cultura em dois frascos de 5 L (40 mL por balão), contendo cada um 1,5 L de meio 2x YT (triptona 16 g / L, extracto de levedura 10 g / L, NaCl 5 g / L) com 100 mg / L ampicilina.
- Incubar a cultura a 37 ° C com agitação constante a 180 rpm até atingir OD 600 nm = 0,5.
- Abaixe a temperatura para 16 ° C e induzir as células por adição de β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) isopropílico 0,5 mM. VigaristaContinuam incubando sob a mesma condição durante 16-20 h para a expressão da proteína.
- Colher as células por centrifugação (10 000 x g durante 10 min).
Nota: O protocolo pode ser pausado aqui; O sedimento das células deve ser mantido a -80 ° C até a purificação.
3. Purificação de DHDDS Humano
- Ressuspender as células no tampão A (Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 0,1%, β-mercaptoetanol 10 mM), 1 μg / mL de DNase I e uma mistura de inibidor de protease.
- Homogeneizar as células usando um homogeneizador de vidro e Teflon.
- Deslocar as células usando um microfluidizador ou equivalente a 12.000 - 15.000 psi 11 .
- Centrifugar o lisado celular a 40.000 xg durante 45 minutos a 4 ° C. Recupere o sobrenadante, contendo a fração solúvel.
- Carregar o sobrenadante sobre uma coluna de cromatografia de afinidade de 5-10 mL de cobalto imobilizado em metal (Co 2+ -MIAC) 12 com 10MM de imidazole, seguido de lavagem completa com tampão A e 10 mM de imidazole para reduzir a ligação de proteínas não específicas.
- Eluir as proteínas sobre-expressas com tampão A suplementado com imidazol 250 mM.
- Remova o imidazole utilizando uma coluna de dessalinização preparativa de 53 mL equilibrada com o tampão A.
- Adicionar protease TEV marcada com 6xHis (1 mg TEV protease por proteína 50 mg) às proteínas eluídas para remover a sua proteína de fusão TRX marcada com 6xHis a 4 ° C durante a noite.
- Carregar as proteínas clivadas em uma coluna Co 2+ -IMAC, equilibrada com o tampão A suplementado com imidazol 5 mM, para remover a proteína de fusão TRX marcada com His e a protease de TEV.
- Recolher o fluxo e concentrar-se a 3 - 4 mL usando um filtro centrífugo de corte molecular de 30 kDa.
- Carregar a proteína concentrada em uma coluna de cromatografia de exclusão de tamanho superdex-200 equilibrada com o tampão A para purificação final. A proteína elui como dímero (~ 76 kDa). Selecione as frações relevantes, comparando o perfil de eluição com uma curva de calibração da coluna.
- Avalie a pureza da preparação usando SDS-PAGE.
- Determine a concentração de proteína necessária para a experimentação a jusante e alíquotas de congelação rápida de proteínas concentradas purificadas em nitrogênio líquido e armazene a -80 ° C até o uso.
4. Cromatografia Analítica de Tamanho-Exclusão (SEC)
- Para garantir a capacidade da proteína para suportar ciclos de congelamento-descongelamento, descongelar uma alíquota das proteínas congeladas e centrifugar a 21,000 x g durante 10 min para remover agregados insolúveis. Recolher o sobrenadante.
- Carregar as proteínas em uma coluna analítica superdex-200 pré-equilibrada com Tris-HCl 25 mM, pH 7,5, NaCl 150 mM, Triton X-100 a 0,02%, β-mercaptoetanol 10 mM, utilizando um sistema de cromatografia líquida de ultra-performance 13 , 14 .
- Monitorar fluore de triptofanoScence (λ ex = 280 nm, λ em = 350 nm) para detectar o perfil de eluição de eluição das proteínas. Certifique-se de ter uma curva de calibração válida para avaliação do peso molecular - tais curvas estão disponíveis através dos fabricantes de coluna SEC.
5. Enzima cinética - atividade dependente do tempo 15 , 16 , 17
- Para garantir a actividade da proteína purificada, mistura de 5? M DHDDS purificadas com 10 FPP? M e 50? M 14 C-IPP para iniciar a reacção em tampão A com 0,5 mM de MgCl 2 a 22 - 30 ° C.
Nota: As condições de reação exatas podem variar com as preparações de cis- TPs diferentes de DHDDS. Além disso, a atividade do DHDDS também depende da temperatura e [Mg 2+ ].
Cuidado: 14 C-IPP é radioativo e deve ser usado de acordo com as normas locais de segurança de radiação. Retire 15 μL de amostras da reação a 0, 2, 4 e 6 h, após a extinção imediata da reação pela adição de 15 μL de tampão A suplementado com EDTA 20 mM (até uma concentração final de 10 mM de EDTA). - Adicione 1 ml de 1-butanol saturado com H 2 O e vorteie cuidadosamente para extrair os produtos da reação.
Nota: O protocolo pode ser parado aqui e as amostras podem ser mantidas para leitura posterior. - Adicione coquetel de cintilação às amostras e, usando um contador de cintilação, quantifique produtos de reação na fase de butanol abrangendo 14 C, juntamente com a radioatividade de 15 μL da mistura de reação, representando a radioatividade total.
- Subtrair as leituras de fundo medido usando as amostras de 0 h de cada ponto do tempo e calcular a porcentagem de 14 C-IPP utilizada.
- Calcule a incorporação líquida de 14 C-IPP em cada ponto de tempo, calculando a porcentagem utilizada do total de 14 14 C-IPP com o tempo.
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Representative Results
A visão geral da construção usada aqui e o processo de purificação são mostrados na Figura 1 . As amostras obtidas em cada passo de purificação são mostradas na Figura 2 . Esta análise SDS-PAGE mostra a purificação gradual de DHDDS, resultando em um produto altamente purificado. A Figura 3 mostra os resultados da SEC analítica da enzima purificada, revelando que a proteína só é observada como um homodímero. A Figura 4 mostra um ensaio de actividade representativo dependente do tempo. 14 A incorporação de C-IPP aumenta claramente ao longo de 6 h, verificando que a enzima purificada é funcional.
Figura 1: Clonagem e Purificação DHDDS Humana . (
Figura 2: Purificação de DHDDS humanos . Análise de SDS-PAGE de passos de purificação de afinidade DHDDS humanos. Pista 1, marcador de peso molecular (kDa); Pista 2, extrato bruto; Lane 3, Co 2+ -IMAC flow-through. A seta indica a proteína de fusão TRX-DHDDS; Pista 4, eluente Co 2+ -IMAC; Lane 5, proteína-TEV protease mistura após incubação durante a noite; Pista 6, Co 2+ -IMAC fluxo através da clivagem TEV; Pista 7, eluente de Co 2 + -IMAC após clivagem de TEV; Pista 8, DHDDS humano purificado (indicPor uma seta) após cromatografia de exclusão de tamanho. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: SEC analítica de DHDDS humano purificado. A fluorescência de triptofano foi monitorada conforme descrito no protocolo. De acordo com a curva de calibração desta coluna, DHDDS forma um homodímero (77,4 kDa). A seta indica o volume vazio. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : TiAtividade dependente de mim de DHDDS humano purificado. A actividade in vitro de DHDDS humano purificado na reacção com FPP 10 uM e 14 C-IPP 50 μM como substratos é expressa como incorporação de IPP por proteína (mol / mol). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
O protocolo descrito aqui para a purificação de DHDDS humano funcional em células de E. coli é simples e eficiente, permitindo a sobreexpressão e purificação da proteína em 3 a 4 dias, uma vez que uma construção adequada esteja disponível. Tais protocolos para a purificação de proteínas são de especial importância, dado os avanços no seqüenciamento do genoma, que forneceu uma infinidade de informações sobre a genética de muitas doenças 18 , exigindo assim o desenvolvimento de métodos de alto rendimento para caracterizar mecanismos patogênicos no nível de proteína 19 .
Para superar armadilhas comuns na sobreexpressão e purificação de proteínas heterólogas, várias medidas foram tomadas aqui, que são críticas para obter proteínas solúveis e funcionais com sucesso. Primeiro, o DHDDS foi sobreexpressado como uma fusão TRX. O TRX facilita a dobragem da proteína de fusão e aumenta a solubilidade da proteína de fusão, evitando a inclusão bFormação de Ody 20 . Em seguida, para aumentar o rendimento de proteína, a construção de DNA foi codon otimizada para expressão em E. coli 21 . Finalmente, para reduzir ainda mais a probabilidade de formação de corpo de inclusão, a expressão da proteína foi induzida a 16 ° C para retardar a taxa de síntese de proteína, provavelmente auxiliando a dobragem de proteína 22 .
Levando em consideração a homologia de cis -PT entre diferentes espécies, sugerimos que este protocolo possa ser aplicado para outras cis -PT eucarióticas, bem como 1 . Usando o protocolo atual como ponto de partida, e com as diretrizes gerais críticas para a expressão DHDDS, esse método pode ser modificado para uma expressão ótima de diferentes cis -PTs. Por exemplo, pode-se tentar diferentes parceiros de fusão (como a proteína de ligação à maltose) ou otimizar ainda mais as condições de cultura para a proteína específica a ser estudada.
<P class = "jove_content"> Com seu significado biomédico e biotecnológico 1 , 7 , 8 , o uso futuro do protocolo descrito para obter grandes quantidades de DHDDS funcional purificado, juntamente com outros cis -PT, permitindo a busca de sua caracterização estrutural e funcional . Por exemplo, outros estudos moleculares de DHDDS resolverão os mecanismos subjacentes à retinite pigmentosa relacionada ao DHDDS, levando potencialmente a descoberta e desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas. Além disso, à medida que os cis -PTs procarióticos estão envolvidos na síntese de parede bacteriana, este grupo de enzimas potencialmente forma novos alvos para novos agentes antibacterianos. De fato, a caracterização completa dos estudos de enzimas eucariotas e procarióticas pode permitir o desenvolvimento racional de drogas antimicrobianas seletivas para a cis -PT procariótica. Finalmente, como a borracha natural é sintetizada bE membros da família cis -PT, a abordagem descrita aqui pode encontrar uso futuro na síntese industrial de borracha natural.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Os autores não têm nada a revelar.
Acknowledgments
Este trabalho foi financiado pelo Centro de Excelência em Pesquisa (I-CORE) da Fundação de Ciência da Ciência de Israel (1775/12) e a Fundação de Ciência de Israel concede 1721/16 e 2338/16 (YH) e 825/14 (DK ). O apoio da Fields Estate Foundation à DK é altamente apreciado. Este trabalho foi realizado por Ilan Edri e Michal Goldenberg no cumprimento parcial dos requisitos de tese de MD da Faculdade de Medicina de Sackler, Universidade de Tel Aviv.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
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