Summary
Ett enkelt protokoll för överuttryck och rening av kodonoptimerad human cis- fenyltransferas under icke-denaturerande betingelser från Escherichia Coli , beskrivs tillsammans med en enzymatisk aktivitetsanalys. Detta protokoll kan generaliseras för produktion av andra cis- prenyltransferasproteiner i kvantitet och kvalitet lämplig för mekanistiska studier.
Abstract
Prenyltransferaser (PT) är en grupp enzymer som katalyserar kedjeförlängning av allylldifosfat med användning av isopentenyldifosfat (IPP) via flera kondensationsreaktioner. DHDDS (dehydrodolichyldifosfat-syntas) är en eukaryotisk långkedjig cis -PT (bildande cis -dubbelbindningar från kondensationsreaktionen) som katalyserar kedjeförlängning av farnesyldifosfat (FPP, ett allylldifosfat) via flera kondensationer med isopentenyldifosfat (IPP). DHDDS är av biomedicinsk betydelse, eftersom en icke-konservativ mutation (K42E) i enzymet resulterar i retinitpigmentosa , vilket slutligen leder till blindhet. Därför utvecklades föreliggande protokoll för att förvärva stora mängder renade DHDDS, lämpliga för mekanistiska studier. Här användes användningen av proteinfusion, optimerade odlingsbetingelser och kodonoptimering för att tillåta överuttryckning och rening av funktionellt aktiva humana DHDDS i
Introduction
Prenyltransferaser är en grupp enzymer som katalyserar kedjeförlängning av allylldifosfat med användning av isopentenyl-difosfat (IPP) via flera kondensationsreaktioner 1 , 2 . Z-typ-enzymer katalyserar bildningen av cis -dubbelbindningar från kondensationsreaktionen, medan E-typ-enzymer katalyserar trans -dubbelbindningsbildning 3 . cis -Prenyltransferases (cis -PT, Z-typ enzymer) är klassiskt klassificeras efter deras produkt kedjelängd till kortkedjiga (C 15), medellång kedja (C 50-55), och lång kedja (C 70-120 ) 4 . DHDDS (dehydrodolichyldifosfat-syntas) är en eukaryot långkedjig cis -PT som katalyserar kedjeförlängning av farnesyldifosfat (FPP, ett allylldifosfat) via flera kondensationer med isopentenyldifosfat (IPP) 1, 5 , 6 . Detta resulterar i bildning av dehydrodolichyldifosfat, ett C 55-100 polyprenyldifosfat som tjänar som en föregångare för dolichylpyrofosfat, glykosylbärarmolekylen involverad i N-bunden proteoglykosylering 1 . Bland Ashkenazi-judar resulterar en missens icke-konservativ mutation (K42E) i DHDDS i autosomal recessiv retinit pigmentosa 7 , 8 . Därför utvecklades föreliggande protokoll för att förvärva renade DHDDS som är lämpliga för mekanistiska studier.
Escherichia coli anses vara den mest bekväma och kostnadseffektiva värden för rekombinant proteinuttryck och är därför också den mest använda värden. Men när man försöker heterologiskt överuttrycka proteiner i E. coli , bör proteinspecifika överväganden göras. Hämta ordentligt vikta, aktivaE rekombinanta proteiner från E. coli , är inte en enkel fråga på grund av de olika egenskaperna hos olika proteiner. Flera tillvägagångssätt har utvecklats för att övervinna dessa hinder. Här användes användningen av proteinfusion, optimerade odlingsbetingelser och kodonoptimering för att tillåta överuttryckning och rening av funktionellt aktiva humana DHDDS i E. coli . Av anmärkning, ett tidigare försök att överuttrycka jäst cis -PT utan proteinfusion misslyckades på grund av att slutföra olöslighet även i närvaro av detergent 12. Det beskrivna protokollet är enkelt, kostnadseffektivt, tidsbesparande och låter en få DHDDS-preparat som är lämpliga för mekanistiska studier. Med tanke på homologin hos cis -PT bland olika arter, föreslår vi att detta protokoll kan tillämpas för annan eukaryot cis -PT också.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Kloning av cis -PT för överuttryck i E. coli
- Erhålla pET-32b expressionsvektor, utformad för kloning och högnivåuttryck av proteinsekvenser fusionerade med 109aa-tioredoxin (TRX) -proteinet 17 och E. coli -kodonoptimerad 18 kodande sekvens av full längd cis -PT.
- Se till att du har ett TEV-proteas (spaltningspunkt för tobaksprosproteas) klyvningsplats (ENLYFQ / G, där "/" indikerar klyvpunkten) 9 följt av en kort flexibel länkare (SGSGSG, för att förbättra tillgängligheten av klyvplatsen) uppströms cis -PT-sekvensen ( Figur 1 A ). Lägg också till lämpliga 5 'och 3' restriktionsställen för kloning.
- Klonera den syntetiserade DNA-konstruktionen i pET-32b-vektorn med användning av standardligeringstekniker 10 .
2. OverexpreSsion av human DHDDS i E. coli
- Transformera E. coli T7 express kompetenta celler med TRX-fusion DHDDS konstruktion enligt tillverkarens instruktioner.
- Platta de transformerade cellerna enligt tillverkarens instruktioner om LB-agar under ampicillinselektiva förhållanden (200 mg / L).
- Inokulera utvalda kolonier i 100 ml LB-medium i 250 ml kolvar startkulturer med 100 mg / L ampicillin och inkubera över natten vid 37 ° C med konstant skakning vid 200 rpm.
- Inokulera 80 ml av odlingen i två 5 liter kolvar (40 ml per kolv), vardera innehållande 1,5 liter 2x YT-medium (16 g / 1 trypton, 10 g / 1 jästextrakt, 5 g / 1 NaCl) med 100 mg / L ampicillin.
- Inkubera kulturen vid 37 ° C med konstant skakning vid 180 varv per minut tills dess att nå OD 600 nm = 0,5.
- Sänk temperaturen till 16 ° C och inducera cellerna genom att tillsätta 0,5 mM isopropyl-p-D-1-tiogalaktopyranosid (IPTG). LuraInkubera under samma tillstånd under 16-20 h för proteinuttryck.
- Skörda cellerna genom centrifugering (10 000 x g i 10 min).
Obs! Protokollet kan pausas här; Cellpelleten bör hållas vid -80 ° C tills rening.
3. Rening av humant DHDDS
- Resuspendera cellerna i buffert A (25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,1% Triton X-100, 10 mM p-merkaptoetanol), 1 | ig / ml DNas I och en proteashämmarblandning.
- Homogenisera cellerna med hjälp av en glas-Teflon-homogenisator.
- Stör cellerna med hjälp av en mikrofluidizer eller motsvarande vid 12 000 - 15 000 psi 11 .
- Centrifugera celllysatet vid 40 000 xg under 45 min vid 4 ° C. Återställ supernatanten, innehållande den lösliga fraktionen.
- Ladda supernatanten på en 5 - 10 ml koboltimobiliserad metallaffinitetskromatografi (Co 2+ -IMAC) 12 kolonn med 10MM imidazol, följt av noggrann tvättning med buffert A och 10 mM imidazol för att reducera icke-specifik proteinbindning.
- Eluta de överuttryckta proteinerna med buffert A kompletterad med 250 mM imidazol.
- Avlägsna imidazol med användning av en 53 ml preparativ avsaltningskolonn ekvilibrerad med buffert A.
- Tillsätt 6xHis-märkt TEV-proteas (1 mg TEV-proteas per 50 mg protein) till de eluerade proteinerna för att avlägsna deras 6xHis-märkta TRX-fusionsprotein vid 4 ° C över natten.
- Ladda de klyvda proteinerna på en Co2 + -IMAC-kolonn, jämviktad med buffert A kompletterad med 5 mM imidazol, för att avlägsna det klyvda 6x His-märkta TRX-fusionsproteinet och TEV-proteaset.
- Samla genomflödet och koncentrera till 3 - 4 ml med hjälp av ett 30 kDa molekylvikt avskärningscentrifugalfilter.
- Belasta det koncentrerade proteinet på en superdex-200-storleksuteslutningskromatografikolonn jämviktad med buffert A för slutlig rening. Proteinet elueras som en dimer (~ 76 kDa). Välj relevanta fraktioner genom att jämföra elueringsprofilen till en kolonnkalibreringskurva.
- Bedöm renheten av preparatet med SDS-PAGE.
- Bestäm den proteinkoncentration som behövs för nedströms experiment och flashfrysa alikvoter av renade koncentrerade proteiner i flytande kväve och förvara vid -80 ° C tills användning.
4. Analytisk storlek-uteslutningskromatografi (SEC)
- För att försäkra proteinets förmåga att utstå frysning-tina cykler, tina en alikvot av de frusna proteinerna och centrifugera vid 21 000 x g under 10 min för att avlägsna olösliga aggregat. Samla supernatanten.
- Belasta proteinerna på en superdex-200 analytisk kolonn som är för-jämviktad med 25 mM Tris-HCl, pH 7,5, 150 mM NaCl, 0,02% Triton X-100, 10 mM p-merkaptoetanol, med användning av ett ultraservik-vätskekromatografisystem 13 , 14 .
- Övervaka tryptofan fluorScence (A ex = 280 nm, A em = 350 nm) för att detektera proteinernas elueringselueringsprofil. Var noga med att ha en giltig kalibreringskurva för molekylviktbedömning - sådana kurvor är tillgängliga via SEC-kolumntillverkarna.
5. Enzymkinetik - tidsberoende aktivitet 15 , 16 , 17
- För att säkerställa aktiviteten hos det renade proteinet, blanda 5 | iM av renade DHDDS med 10 | iM FPP och 50 ^ M 14 C-IPP för att initiera reaktionen i buffert A med 0,5 mM MgCl2 vid 22 - 30 ° C.
Obs! De exakta reaktionsbetingelserna kan variera med preparat av cis -PT som skiljer sig från DHDDS. Vidare beror DHDDS aktivitet också på temperaturen och [Mg 2+ ].
Varning: 14 C-IPP är radioaktiv och bör användas enligt lokala säkerhetsbestämmelser för strålning. Dra 15 μL prov från reaktionen vid 0, 2, 4 och 6 h, efter omedelbar quenching av reaktionen genom tillsats av 15 | il buffert A-tillsatt 20 mM EDTA (till en slutlig koncentration av 10 mM EDTA). - Lägg 1 ml H2O-mättad 1-butanol och vortexa grundligt för att extrahera reaktionsprodukterna.
Obs! Protokollet kan stoppas här och proverna kan sparas för senare läsning. - Tillsätt scintillationscocktail till proverna och kvantifierar reaktionsprodukter i butanolfasen med 14 C tillsammans med radioaktiviteten 15 μL från reaktionsblandningen, vilket representerar den totala radioaktiviteten, med hjälp av en scintillationsräknare.
- Subtrahera bakgrundsavläsningarna uppmätta med hjälp av 0 h-proverna från varje tidpunkt och beräkna procentuellt av 14 C-IPP utnyttjas.
- Beräkna netto 14 C-IPP-inkorporering vid varje tidpunkt genom att beräkna procentuellt utnyttjat från totalt 14 14 C-IPP-införlivande med tiden förväntas.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Allmän översikt över konstruktionen som används här och reningsprocessen visas i Figur 1 . Proverna erhållna vid varje reningssteg visas i figur 2 . Denna SDS-PAGE-analys visar stegvis rening av DHDDS, vilket resulterar i en högrenad produkt. Figur 3 visar resultaten av analytisk SEC av det renade enzymet, vilket avslöjar att proteinet endast observeras som en homodimer. Figur 4 visar en representativ tidsberoende aktivitetsanalys. 14 C-IPP-inkorporering stiger klart över 6 h, vilket verifierar att det renade enzymet är funktionellt.
Figur 1: Human DHDDS-kloning och rening . (
Figur 2: Rening av humana DHDDS . SDS-PAGE analys av humana DHDDS affinitetsreningssteg. Bana 1, molekylviktsmarkör (kDa); Bana 2, rå extrakt Bana 3, Co 2+ -IMAC-genomströmning. Pil indikerar TRX-DHDDS-fusionsproteinet; Bana 4, Co2 + -IMAC-eluat; Bana 5, protein-TEV-proteasblandning efter inkubation över natten Bana 6, Co 2+ -IMAC-genomströmning genom att följa TEV-klyvning; Spår 7, Co 2+ -IMAC-eluat efter TEV-klyvning; Lane 8, renad human DHDDS (indicÅtföljt av en pil) efter storleksexklusionskromatografi. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Analytisk SEK av renad human DHDDS. Tryptofanfluorescens övervakades såsom beskrivits i protokollet. Enligt kalibreringskurvan för denna kolumn bildar DHDDS en homodimer (77,4 kDa). Pilen indikerar tomrumsvolymen. Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 4 : TiMigberoende aktivitet hos renade humana DHDDS. In vitro- aktivitet hos renade humana DHDDS i reaktionen med 10 | iM FPP och 50 | iM 14 C-IPP som substrat uttrycks som IPP-inkorporering per protein (mol / mol). Vänligen klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet som beskrivs här för rening av funktionella humana DHDDS i E. coli- celler är enkel och effektiv, så att man överexpressar och renar proteinet i 3-4 dagar när en lämplig konstruktion är tillgänglig. Sådana protokoll för proteinrening är av särskild betydelse med tanke på genombrott i genom-sekvensering, vilket gav en mängd information angående genetik hos många sjukdomar 18 , varigenom krävdes utveckling av hög genomströmningsmetoder för att karakterisera patogena mekanismer vid proteinnivån 19 .
För att övervinna vanliga fallgropar vid heterolog proteinöverexpression och rening togs flera åtgärder här, vilka är kritiska för att framgångsrikt erhålla lösliga och funktionella proteiner. Först var DHDDS överuttryckt som en TRX-fusion. TRX underlättar fusionsproteinet vikning och ökar fusionsproteinlösligheten, förhindrar inklusion bOdy-formation 20 . Därefter optimerades DNA-konstruktionen för att öka proteinutbytet för kodning i E. coli 21 . Slutligen, för att ytterligare reducera sannolikheten för inklusionskroppbildning, inducerades uttryck av proteinet vid 16 ° C för att sakta ner proteinsynteshastigheten, vilket sannolikt bidrog till proteinvikning 22 .
Med tanke på homologin av cis -PT bland olika arter, föreslår vi att detta protokoll kan tillämpas för annan eukaryot cis -PT samt 1 . Genom att använda det aktuella protokollet som utgångspunkt och med de allmänna riktlinjerna som är kritiska för DHDDS-uttryck, kan denna metod modifieras för optimalt uttryck av olika cis -PT. Till exempel kan man försöka olika fusionspartners (såsom maltosbindande protein) eller ytterligare optimera odlingsbetingelserna för det specifika proteinet som ska studeras.
<P class = "jove_content"> Med sin biomedicinska och biotekniska betydelse 1 , 7 , 8 , framtida användning av det beskrivna protokollet för att erhålla stora mängder renade funktionella DHDDS, tillsammans med andra cis -PT, vilket möjliggör strävan efter deras strukturella och funktionella karakterisering . Till exempel kommer ytterligare molekylära studier av DHDDS att lösa mekanismerna bakom DHDDS-relaterad retinitpigmentosa , vilket potentiellt leder till upptäckt och utveckling av nya terapeutiska metoder. Dessutom, eftersom prokaryota cis -PT är involverade i bakterieväggsyntes, bildar denna grupp av enzymer potentiellt nya mål för nya antibakteriella medel. Faktum är att en grundlig karaktärisering av de eukaryota och prokaryota enzymerna kan möjliggöra en rationell utveckling av antimikrobiella läkemedel selektiva för prokaryotisk cis -PT. Slutligen syntetiseras naturgummi bY medlemmar av cis -PT-familjen, kan den metod som beskrivs här finna framtida användning i industriell syntes av naturgummi.Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har ingenting att avslöja.
Acknowledgments
Arbetet finansierades av Israels vetenskapsstiftelsens Center for Excellence (I-CORE) inom strukturell cellbiologi (1775/12) och Israels vetenskapsstiftelse beviljar 1721/16 och 2338/16 (YH) och 825/14 (DK ). Stödet från Fields Estate Foundation till DK är mycket uppskattat. Detta arbete utfördes av Ilan Edri och Michal Goldenberg i delvis uppfyllande av MD-avhandlingskraven för Sackler-fakulteten, Tel Aviv University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| pET-32b | Novagen | 69016-3 | |
| T7 Express lysY Competent E. coli (High Efficiency) | NEB | C3010I | |
| cOmplete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktail | Roche | 11873580001 | |
| TALON-superflow resin | GE Healthcare | 28-9574-99 | |
| HiPrep 26/10 desalting column | GE Healthcare | 17508701 | |
| HiLoad 16/60 superdex-200 | GE Healthcare | 28989335 | |
| superdex-200 increase 5/150 GL | GE Healthcare | 28990945 | |
| 14C-Isopentenyl pyrophosphate | Perkin-Elmer | NEC773050UC | |
| trans,trans-Farnesyl pyrophosphate | Sigma | 44270-10MG |
References
- Grabinska, K. A., Park, E. J., Sessa, W. C. cis-Prenyltransferase: New Insights into Protein Glycosylation, Rubber Synthesis, and Human Diseases. J Biol Chem. 291 (35), 18582-18590 (2016).
- Ogura, K., Koyama, T., Sagami, H. Polyprenyl diphosphate synthases. Subcell Biochem. 28, 57-87 (1997).
- Ogura, K., Koyama, T. Enzymatic Aspects of Isoprenoid Chain Elongation. Chem Rev. 98 (4), 1263-1276 (1998).
- Imperiali, B., O'Connor, S. E. Effect of N-linked glycosylation on glycopeptide and glycoprotein structure. Curr Opin Chem Biol. 3 (6), 643-649 (1999).
- Bukhtiyarov, Y. E., Shabalin, Y. A., Kulaev, I. S. Solubilization and characterization of dehydrodolichyl diphosphate synthase from the yeast Saccharomyces carlsbergensis. J Biochem. 113 (6), 721-728 (1993).
- Adair, W. L., Cafmeyer, N. Characterization of the Saccharomyces cerevisiae cis-prenyltransferase required for dolichyl phosphate biosynthesis. Arch Biochem Biophys. 259 (2), 589-596 (1987).
- Zelinger, L., et al. A missense mutation in DHDDS, encoding dehydrodolichyl diphosphate synthase, is associated with autosomal-recessive retinitis pigmentosa in Ashkenazi Jews. Am J Hum Genet. 88 (2), 207-215 (2011).
- Zuchner, S., et al. Whole-exome sequencing links a variant in DHDDS to retinitis pigmentosa. Am J Hum Genet. 88 (2), 201-206 (2011).
- Tropea, J. E., Cherry, S., Waugh, D. S. Expression and purification of soluble His(6)-tagged TEV protease. Methods Mol Biol. 498, 297-307 (2009).
- Crouse, G. F., Frischauf, A., Lehrach, H. An integrated and simplified approach to cloning into plasmids and single-stranded phages. Methods Enzymol. 101, 78-89 (1983).
- Middelberg, A. P. Process-scale disruption of microorganisms. Biotechnol Adv. 13 (3), 491-551 (1995).
- Block, H., et al. Immobilized-metal affinity chromatography (IMAC): a review. Methods Enzymol. 463, 439-473 (2009).
- Sachyani, D., et al. Structural basis of a Kv7.1 potassium channel gating module: studies of the intracellular c-terminal domain in complex with calmodulin. Structure. 22 (11), 1582-1594 (2014).
- Shuart, N. G., Haitin, Y., Camp, S. S., Black, K. D., Zagotta, W. N. Molecular mechanism for 3:1 subunit stoichiometry of rod cyclic nucleotide-gated ion channels. Nat Commun. 2, 457 (2011).
- Chang, S. Y., Tsai, P. C., Tseng, C. S., Liang, P. H. Refolding and characterization of a yeast dehydrodolichyl diphosphate synthase overexpressed in Escherichia coli. Protein Expr Purif. 23 (3), 432-439 (2001).
- Chang, S. Y., Ko, T. P., Liang, P. H., Wang, A. H. Catalytic mechanism revealed by the crystal structure of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with sulfate, magnesium, and triton. J Biol Chem. 278 (31), 29298-29307 (2003).
- Guo, R. T., et al. Crystal structures of undecaprenyl pyrophosphate synthase in complex with magnesium, isopentenyl pyrophosphate, and farnesyl thiopyrophosphate: roles of the metal ion and conserved residues in catalysis. J Biol Chem. 280 (21), 20762-20774 (2005).
- Collins, F. S., Green, E. D., Guttmacher, A. E., Guyer, M. S. A vision for the future of genomics research. Nature. 422 (6934), Institute, U.S.N.H.G.R. 835-847 (2003).
- Freeze, H. H. Understanding human glycosylation disorders: biochemistry leads the charge. J Biol Chem. 288 (10), 6936-6945 (2013).
- LaVallie, E. R., et al. A thioredoxin gene fusion expression system that circumvents inclusion body formation in the E. coli cytoplasm. Biotechnology (N Y). 11 (2), 187-193 (1993).
- Elena, C., Ravasi, P., Castelli, M. E., Peiru, S., Menzella, H. G. Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives. Front Microbiol. 5, 21 (2014).
- Vincentelli, R., et al. High-throughput protein expression screening and purification in Escherichia coli. Methods. 55 (1), 65-72 (2011).
