Summary
يصف لنا طريقة ل laminotomy في الخنازير التي توفر الوصول إلى العقد القطنية الظهرية الجذرية (DRG) لحقن إينتراجانجليونيك. رصد التقدم حقن إينتراوبيراتيفيلي والأشيع وأكد تصل إلى 21 يوما بعد الجراحة. يمكن استخدام هذا البروتوكول للدراسات الإكلينيكية المستقبلية التي تشمل حقن DRG.
Abstract
العقد الجذرية الظهرية (DRG) هي هياكل تشريحيا المعالم التي تحتوي على كافة الخلايا العصبية الحسية الأولية أسفل الرأس. وهذه الحقيقة تجعل الرسم أهدافا جذابة لحقن للمداواة رواية تهدف إلى علاج الألم المزمن. وقد استخدمت الصفيحة في نماذج حيوانية صغيرة، لتسهيل الحقن الرسم لأنه ينطوي على الاستئصال الجراحي للعمود الفقري العظام المحيطة بكل الرسم. علينا أن نظهر تقنية لحقن إينتراجانجليونيك للرسم القطني في أنواع حيوانية كبيرة، إلا وهي الخنازير. يتم تنفيذ Laminotomy للسماح بالوصول المباشر إلى الرسم باستخدام تقنيات الجراحة العصبية القياسية والأدوات والمواد. وبالمقارنة مع إزالة العظام أكثر شمولاً عن طريق الاستئصال، علينا أن ننفذ laminotomy للحفاظ على تشريح العمود الفقري أثناء تحقيق وصول DRG كاف. رصد التقدم الموضعية لحقن الرسم باستخدام صبغة غير سامة. في أعقاب القتل الرحيم بعد العمليات الجراحية في اليوم 21، يتحدد نجاح حقن الأنسجة لتوزيع إينتراجانجليونيك 4 ', 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI). نحن حقن حلاً غير نشط بيولوجيا لتبرهن على البروتوكول. يمكن أن يكون هذا الأسلوب التطبيقية الدراسات السريرية في المستقبل بهدف الحلول العلاجية للرسم. ينبغي أن تيسر لنا منهجية اختبار طواعية نماذج الحيوانات الصغيرة إينتراجانجليونيك في أنواع حيوانية كبيرة. بالإضافة إلى ذلك، قد يعمل هذا البروتوكول كمورد أساسي لتخطيط الدراسات الإكلينيكية لحقن الرسم في الخنازير.
Introduction
العقد الجذرية الظهرية (DRG) مجموعات منفصلة تشريحيا، والخلايا العصبية التي تقع على طول العمود الفقري. كل الرسم يحتوي على الخلايا العصبية الحسية الأولية التي ترميز وترحيل المحفزات الطرفية للجهاز العصبي المركزي (CNS) من مناطق محددة من الجسم. على سبيل المثال، يبدأ الألم من هشاشة العظام عند مستقبلات الألم الموجودة حول مشترك لإدراك المنبهات الضارة. ويطلق على هذه العملية nociception. توعية طويلة الأجل من المنبهات الضارة يؤدي إلى الألم المزمن 1.
الألم المزمن موضوع متكرر من الدراسة السريرية 2 فيها هدف واحد تطوير أساليب مفيدة للتنفيذ الهادف للمسكنات للرسم، مثل حقن إينتراجانجليونيك 3. ومع ذلك، الرسم يصعب الوصول إليها نظراً لأنهم يقيمون داخل حدود الثقب الفقرية 4بوني. العديد من المجموعات التغلب بنجاح على هذه العقبة من خلال استخدام جراحة العمود الفقري في القوارض 5،6،،من78،،من910.
في العيادة، الاستئصال هو عملية مشتركة للعمود الفقري، ويشير إلى الاستئصال الجراحي للصفيحة الفقرية، مما أونروفينج الفقري القناة 11. إدماج التقنيات الجراحية لتوفير إمكانية الوصول المباشر من الرسم قد نجحت في القوارض 5،12، ومع ذلك، قد تكون الترجمة غير الواقعي الاختلافات النظر في حجم الهياكل ذات الصلة والكيفية التي يؤثر الدوائية أو الجدوى التقنية 13،14. على سبيل المثال، حددت الدراسة واحد قطر الحبل الشوكي عرضية في T10 إلى 3.0 و 7.0 و 8.2 مم للفئران والخنازير والإنسان، على التوالي 15. وهكذا، النماذج الحيوانية الكبيرة أفضل التقريبي الأبعاد البشرية لهياكل الجهاز العصبي.
في الخنازير، تستخدم روري et al. الصفيحة متعدد المستويات للوصول إلى الحبل الشوكي عنق الرحم ل حقن إينتراسبينال متعددة 16. الإجراء كان جيد التحمل وأدت إلى مرحلة أنا التجارب السريرية حيث كانت النتائج الجراحية مقارنة موثقة 17. هذه النتائج تشجع الاستمرار في استخدام نماذج حيوانية كبيرة الإكلينيكية تنبؤ للجدوى التقنية والسلامة في البشر.
وحتى الآن، يوجد لا منهجية مفصلة للوصول إلى العمليات الجراحية والحقن للرسم في أنواع حيوانية كبيرة. لتضييق هذه الفجوة متعدية الجنسيات، ونحن التقرير بروتوكول للتعرض للرسم وحقن عن طريق laminotomy في الخنازير. واستخدمت تقنيات الجراحة العصبية القياسية والأدوات، والمواد، والأسلوب الذي صمم لتقليد الممارسة الجراحية الحديثة. ونحن تثبت حقن إينتراجانجليونيك باستخدام محلول مائي للرسم القطني وتأكيد التسليم الناجحة عبر الأنسجة بعد بعد العمليات الجراحية يوم 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
عليها جميع الأساليب الموصوفة هنا "رعاية الحيوان المؤسسية" واستخدام اللجنة (IACUC) لينك.
1-الشروط المسبقة لدقتها وإمكانية تكرار نتائج
- لضمان دقة التصميم، واتباع المعايير الوطنية مختبر جيدة الممارسات في جميع الأوقات، والحصول على موافقة الداخلية بواسطة IACUC (أو لجنة مماثلة) قبل أي الحيوان المشاركة في التجارب-
ملاحظة: صمم هذا البروتوكول للمحافظة على نهج المؤمنين سريرياً. وهكذا، يرد وصف المواد والأدوات، والتقنيات المستخدمة بطريقة مطابقة لأعلى معايير سريرية في البشر. على سبيل المثال، يتم اتباع أسلوب تعقيم صارمة ولا ينبغي ابدأ استخدام المواد منتهية الصلاحية. - لدعم إمكانية تكرار نتائج هذه المنهجية في إعداد تجريبية، وضع إجراءات التشغيل الموحدة الداخلية والسيطرة لتقلب في سلالة الخنازير والوزن والجنس والعمر بين أفواج منفصلة.
ملاحظة: يستند تصميم هذا البروتوكول إلى استخدام الخنازير وزنها 38-53 كجم
2. رعاية الحيوان قبل العملية
- إدارة سيفتيوفور (IM) العضلي الاتقائية، إعطاء 5 ملغ/كغ، يوم واحد قبل الإجراء.
- حيوانات أغذية الصلبة بسرعة وتقييد الحيوانات من العلاجات التجميلية، أي النفط الحمامات، ح 12 قبل الإجراء.
- التخدير العام الحث ضمن ح 1 من الإجراء، باستخدام الدردشة تيليتاميني وزولازيبام، تيلازول في 5 مغ/كغ، وايم إكسيلازيني، نظراً للساعة 2 مغ/كجم
- بمجرد فعل، إدارة (SC) تحت الجلد البوبرينورفين يستمر الإفراج (SR)، النظر في 0.18 ملغم/كجم
- مكان قسطرة الوريد إذن وإجراء تنبيب التسلسل السريع لوضع أنبوب داخل رغامى.
- نعلق نبضي مع معدل ضربات القلب الرصد وظيفة للسان لرصد معدل ضربات القلب والأكسجين. وضع الحيوان في موقف المعرضة
- وقصاصة الجلد على دورسوم استخدام ماكينة كهربائية. قص الشعر على مساحة كبيرة، والثنائية تمتد من الطائرة السهمي خط الوسط للطائرة الاكليلية خط الوسط وطوليا من ذروة المقدسة بالاشواك المنكب. استخدم شريط لاصق لإزالة الشعر والجلد التعويم الحر.
- فرك المنطقة المقطوعة تصل إلى 3 مرات بالماء الدافئ والصابون وتجفيف الجلد باستخدام منشفة خالية من الوبر.
- مارك المعالم التشريحية الثنائية باستخدام قلم تمييز العمليات جراحية. الاحتفال آخر الأضلاع، والقمم حرقفي، العمليات الشائكة، وعمليات عرضية.
ملاحظة: بمناسبة آخر الأضلاع، القمم الحرقفي، وعمليات عرضية، العمود الفقري القطني هو ترسيم على طول حدوده أعلى وأدنى والأفقي، على التوالي. قد تم تصميم هذا البروتوكول لتوجيه الوصول وحقن من أي DRG القطني من الفائدة. للإشارة، القمم حرقفي متفوقة تتماشى مع مستوى العمود الفقري L3 أو L4. - تغطي الحيوان ببطانية دافئة للنقل إلى جناح المنطوق.
3. لتحديد المواقع في "جناح منطوق"
- برفق أرفع وموقف الحيوان المعرضة إلى حيوان إنسانية كبيرة تم تعديل حبال مع فتحه البطن مبطن.
ملاحظة: فتحه البطن يسمح لتخفيض الضغط البطن مشابهة للإطار ويلسون المستخدمة أثناء الجراحة البشرية في العمود الفقري. وفي المقابل، هذا يقلل المضاعفات النزف من الأوعية الدموية العمود الفقري. حبال لأنه مفيد الساقين ويسمح لشنق بحرية من خلال فتحات المحشوة التي تحمي الحيوان من اصطدام الأعصاب الطرفية. ومع ذلك، نظراً لأن الإطار حبال مصنوع من المعدن، ينبغي مبطن مع العزل تجنب عرقلة الكهربائية وحرق الحيوانات غير مقصود. يمكن أن توضع لفة بطانية لوضع الرأس والرقبة في وضع مريح، تبعاً لحجم الحيوان. - المحافظة على التخدير العام استخدام % 1-3 استنشاقه isoflurane (IH)، معاير للتأثير. ترطيب العينين مع مرهم العيون والشريط بلطف لهم إغلاق.
- خطوط مكان لرصد علامة حيوية للوثيقة درجة الحرارة وضغط الدم ومعدل ضربات القلب والأوكسجين. مراقبة التهوية عن طريق كابنوجرافي-
- ضع قطب المشتتة الكهربائية لاصقة، المتاح على الكتف الأيمن أو الأيسر. استعد
- إدارة "المسابقة لاكتاتيد" ' s كسوائل الصيانة عن طريق قسطرة الوريد الإذن. إعطاء السوائل بمعدل 5-10 مل/كغ/h.
- مكان جهاز الاحترار الجوي أجبر أكثر من منطقة الصدر وسرطان عنق الرحم وتجنب تغطي الأضلاع الأخيرة-
4. إعداد العقيمة "من ميدان المنطوق" لحقنه من جانب اليسار
ملاحظة: من هذه النقطة إلى الأمام، المضي قدما في أزياء العقيمة الدقيق.
- تحضير الجلد تغمر بداية الفقرات القطنية مع التطبيق الواسع النطاق لنسبة 0.7 في المائة اليود بوفاكريليكس و 74% كحول الأيزوبروبيل وفقا للشركة المصنعة ' تعليمات s. للتأكد من أن الإبرة دليل يمكن وضعها في وقت لاحق بطريقة عقيمة، لاتيراليزي التطبيق إلى الجانب الحقن المخططة بتمديد مراجعتان نحو الطائرة الاكليلية خط الوسط في الماضي عمليات عرضية ملحوظ.
- المكان المتاح المناشف الجراحية في أزياء مستطيلة مخطط الموقع شق المخطط الذي يتم عبر خط الوسط على طول العمليات الشائكة القطني ملحوظ.
- تطبيق لاصقة مضادات الميكروبات جداً ثني على المناشف المنطوق وتعرض الجلد. المشبك الستائر في مكان وتمتد على حافة القماش قبالة ميدان المنطوق.
- الآمنة ثني رأسي للبولنديين على رأس حبال بين ميدان المنطوق والرصد الفني. خطوط
- آمنة لشفط وكهربيه داخل ميدان المنطوق لقط للستائر العقيمة. تمرير الحرة نهايات الأنابيب والأسلاك الخروج من حقل معقم.
5. الجلد شق وتشريح سوببيريوستيل
- جس القطني العمليات الشائكة على طول خط الوسط، وتحديد مستويات العمود الفقري على التوالي 3.
- استخدام مشرط #15 لفتح شق خط الوسط 8-12 سم السهمي عن طريق ثني إينسيسي الخلفي مباشرة في العمليات الشائكة. المحافظة على استخدام سد شاش وكهربيه أحادي القطب الأرقاء.
ملاحظة: أن الحرص لا تحيد عن خط الوسط كما الشق متقدمة في الاتجاه الأمامي لأن هذا يحد من النزيف من العضلات باراسبينال. وييسر الجس الدوري للعمليات الشائكة النهوض. قد وضعت ذاتي الاحتفاظ الكامشات ويتلانير، أو ميييردينج، أو جلبي وموضعها حسب الحاجة لتيسير التشريح. يتم استخدام الشفط للحفاظ على الرؤية. - تشريح النسيج تحت الجلد والدهون باستخدام كهربية أحادي القطب حتى يتم التوصل إلى اللفافة ما. جس العمليات الشائكة العميقة إلى اللفافة ما وقطع اللفافة على طول خط الوسط لفضح الرباط سوبراسبينوس التي تمتد بين العمليات الشائكة.
ملاحظة: يتم تعريف اللفافة ما غمد المنظمة، أبونيوروتيك مع حبة نسيج الضام التي يشابك في مائلة، أفقي إلى الاتجاه الآنسي. عند هذه النقطة، قد تطول الشق في أي من الاتجاهين أعلى أو أدنى التأكد من أن العمليات الشائكة 3 مرئية تماما مع العملية الشائكة سينتيرموست الانحياز داخل مركز مجال تشريح. - استخدام شفرة #15 لوضع شق 2 مم باراساجيتال عميق من خلال الرباط سوبراسبينوس الخلفي لكل عملية الشائكة. ضع كل شق على طول الثالث الأيسر من السطح الخلفي من العملية الشائكة. الإصدار
- برفق في الرباط سوبراسبينوس في كل مستوى على طول كل لجنة التفاوض الحكومية الدوليةإيسيون استخدام مصعد أكثر تحرراً 5 مم.
- تحديد الطائرة سوببيريوستيل وتشريح داخل الطائرة على طول السطح الأفقي لكل عملية الشائكة.
- إجراء تشريح subperiosteal في كل العملية الشائكة بطريقة موازية للتأكد من أن لطيف، والتشريح حتى يتحقق.
- جداً المرفق العضلات باراسبينال على طول المسافات interspinous استخدام كهربية أحادي القطب في الحفل مع تشريح سوببيريوستيل.
- تحديد الصفيحة على كل مستوى، ومواصلة تشريح subperiosteal أفقياً للوصول إلى الحدود الجانبية في المفاصل zygapophyseal 2 التي تربط فقرات المكشوفة 3 والتوصل إلى الحافة الجانبية الصفيحة بين المفاصل، ودعا بارس interarticularis.
ملاحظة: هو interarticularis بارس الحدود الخلفي من الثقبة الفقرية حيث يتواجد الرسم. في بعض الأحيان، ينشأ الوريد صغيرة من ثقبة تقع على السطح الخلفي الصفيحة. هذه الأوردة لديهم ميل إلى تمزق أثناء تشريح سوببيريوستيل. الأرقاء يتحقق بسهولة باستخدام مزيج من القطبين كهربية والشمع العظام تطبق على الثقبة-
6. مستوى واحد Laminotomy
- تحديد هدف laminotomy الصفيحة سينتيرموست يقع بين والانسي في المفاصل zygapophyseal 2-
- تتبع الصفيحة إلى حافته السفلي، إلى نقطة وسطى فقط لعملية مفصلي أدنى متجاورة المشترك zygapophyseal والذيلية.
- استخدام مصعد أكثر تحرراً 5 مم أو كورت لجس الانتقال بين حافة الصفيحة والقناة الوسطى كودالموست-
ملاحظة: الحرص على لا قوة الصك بالباتينج الأمامي كهذا سيكون الاتصال دورال الكيس والحبل الشوكي. علما بأن يمتد الحبل الشوكي في الخنازير الفقرات القطنية 18. يمكن استخدامها قرص الفقرية رونجيور لإزالة الأنسجة اللينة إضافي تغمر هذا المجال لتيسير الجس. - الاستخدام 2 مم حتى قضم، 45 درجة كرسون رونجيور لاستخراج العظام بطريقة بيسيويسي. إزالة العظام على طول قاعدة العملية الشائكة ﻷسلحته إلى مستوى والذيلية فقط على السطح والذيلية بيديكلي والخروج أفقياً إلى مداها الكامل.
- استخدام زاوية رونجيورس العظام للمساعدة في إزالة العظام. تترك هذه العملية مفصلي أقل شأنا الذي كان متصلاً بالصفيحة في المكان حتى تكتمل إلى حد كبير و laminotomy-
- التأكد من أن عملية مفصلي أقل شأنا بحرية متنقلة وتعلق فقط بواسطة الكبسولة المشتركة زيجابوفيسيل. جداً الكبسولة باستخدام شفرة #15 أو #11-
- إزالة عملية مفصلي أقل شأنا بطريقة بيسيويسي ولكن ترك عملية مفصلي متفوقة المجاورة سليمة.
ملاحظة: اكتمال و laminotomy، يتم إجراء الأرقاء كهربية بين القطبين. لا يتم استخدام كهربية أحادي القطب بسبب قربها الهياكل العصبية. يمكن وضع الشمع العظام على طول مواقع النزيف من العظام المكشوفة والإسفنج الجيلاتين الامتصاص يمكن استخدامها للحصول على الأرقاء القرب من الأنسجة اللينة. كوتونويد أداة مفيدة للسائل المصلي الفتيل والدم بعيداً عن التشريح.
7. تشريح للرسم
- افاكواتي الدهون فوق الجافية بطريقة بيسيويسي من سطحية لبداية العميق ميديالى وتسير أفقياً. إزالة الدهون بتشريح لطيف باستخدام الملقط القطبين والشفط مع نصائح شفط "الفرنسية فرايزر" 6-10-
ملاحظة: لتكبير العدسة أو استخدام مجهر تشريح مفيدة في توفير مستوى التفاصيل اللازمة لإخلاء الدهون فوق الجافية بأمان وتحقيق دقيق الأرقاء من الضفيرة الوريدية الجافية استخدام كهربية بين القطبين- - تحديد الكيس دورال على طول خط الوسط يعمل في اتجاه سوبيروينفيريور، موازية لمحور شق الجلد. إزالة الدهون فوق الجافية على طول الكيس دورال حتى يمكن رؤية الكيس دورال تثير جلبه جذر العصب دورال.
- تتبع الأكمام دورال جانبياً وإينفيريورلي بإخلاء الدهون فوق الجافية حتى يتضح لتكبير حولها الرسم.
ملاحظة: تحديد الرسم على شكل بيضاوي والأصفر إلى اللون البرتقالي. في العمود الفقري القطني منتصف، الرسم هو عادة 4-6 مم في الحجم وأطول في الآنسي إلى الاتجاه الأفقي، ويقع مباشرة دونية أو الآنسي للها بيديكلي الخاصة بكل منها 2-3 مم. يمكن استخدام ربط عصب كليلة، ذو زاوية يمنى لجس برفق بيديكلي- - إخلاء الدهون فوق الجافية أفقياً، في الماضي الرسم، حتى ينظر في العصب الشوكي المجاور.
ملاحظة: في حالة حدوث دوروتومي، إصلاحها بمحكم الإغلاق استخدام خياطة نايلون 6-0 وبرنامج التشغيل السلس إبرة صغيرة في شتيخ تشغيل بسيطة.
8. حقن DRG
- استخدام إبرة 22-قياس العمود الفقري لتوجيه مسار إبرة التسليم المعزز (CED) 32-قياس الحمل الحراري. ثقب الإبرة دليل قياس 22 عن طريق عضلات الجلد وباراسبينال-
ملاحظة: الإبرة صعقة يرمي إلى تحقيق الحراري السوائل في الأنسجة، والمعروف أيضا تدفق الجزء الأكبر، بسبب الضغط التدرجات 19 ، 20- - ترمي الإبرة دليل على طول مسار يقارب المحور الطولي للرسم وينتج عنه نصيحة إبرة الناشئة عن الجدار الجانبي باراسبينال حقل التشريح.
- غرامة ضبط مسار إبرة حتى التجويف إبرة بمحاذاة مع مركز الرسم.
ملاحظة: الإبرة دليل ينبغي ابدأ أن يسمح للاتصال الرسم. - وضع إينجيكتاتي العقيمة في محقن معقم والاتصال حقنه بأنابيب ضخ العقيمة.
- يد المحاقن خارج الحقل العقيمة وتأمين الأنابيب إلى الإبرة صعقة. الاتصال حقنه بمضخة الحقن لبرمجة-
ملاحظة: أنابيب مستعدة ليبلغ طوله 5 أقدام ضمان الإبقاء على العقم والتنقل. أيضا، من الأهمية بمكان أن إدخال لا فقاعات الهواء في الحل- - المضي قدما في إينجيكتاتي حتى يعتبر التعبير من طرف إبرة CED. مكان الإبرة صعقة داخل التجويف إبرة دليل
- والنهوض ببطء الإبرة صعقة حتى يتضح من طرف إبرة دليل. ضمان أن لا هو ثقب في الرسم أثناء محاذاة الإبرة.
- غرامة قيمتها موقف إبرة دليل على طول المحور طويلة من مساره لتحديد الموقع النهائي لنصيحة صعقة.
- تأمين الدليل إبرة والإبرة صعقة معا باستخدام المتشابكة إبرة محاور حالما يتحقق العمق والمحاذاة للدليل والإبر CED.
- تأكيد أن كافة اتصالات أجهزة الحقن تماما المضمون، بما في ذلك دليل الإبرة، صعقة الإبرة، وأنابيب اتصال محملة إينجيكتاتي.
- دفع الإبرة دليل على طول محورها طويل لتقريب صعقة إبرة نصيحة والرسم.
- الثقب الرسم مع طرف إبرة صعقة.
- سوبميرسي نصيحة إبرة صعقة في وسط ثلاثي الأبعاد الرسم.
ملاحظة: نظراً لأن الرسم هيكل ثلاثي الأبعاد متغير الحجم والشكل، التعرض للرسم يجب أن تكون كاملة من أجل دقة مكان نصيحة إبرة صعقة في مركز حقيقي للرسم. يقع مركز الرسم الحقيقي عند التقاطع في ثلاثة محاور التشريحية، وهما الأمامي إلى الخلفي، الأفقي إلى الآنسي، ومتفوقة على محاور أدنى. - تسليم 100 ميكروليتر من إينجيكتاتي بصعقة باستخدام معدل تخرج وحجم الخطوات 3-
- ميكروليتر تسليم 4 في 2 ميكروليتر/دقيقة للخطوة الأولى. تسليم 8 ميكروليتر في 4 ميكروليتر/دقيقة للخطوة الثانية. تسليم ميكروليتر 88 في 8 ميكروليتر/دقيقة للخطوة الثالثة والأخيرة-
ملاحظة: تسمح بوقفه 3-دقيقة بين الخطوات وبعد الخطوة النهائية للسماح للموازنة الضغط. - سحب جهاز الحقن، بعد الخطوة النهائية الحقن ووقفه 3-مين على طول محورها طويل في حركة ناعمة، رقيقة.
ملاحظة: لحقن الحلول التي عديم اللون، يتم تضمين صبغة ملونة في الحل بتركيز 0.1% وزن/حجم للمساعدة في تقييم المرئي ل التوزيع إينجيكتاتي 12. أيضا، الصبغة الحيوية 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندولي (DAPI) يتم تضمينها في الحل بتركيز 0.25 ميكروغرام/ميكروليتر عند تصميم الدراسة يتطلب تقييم نسيجية ل التوزيع إينجيكتاتي 5-
9. إغلاق
- تطبيق 3 جولات من الري المالحة الدافئة إلى الموقع الجراحي قبل الإغلاق لتعبئة ومسح موقع الحطام، أي العظام الشظايا. استخدام الشفط لاستعادة المياه المالحة والحطام.
ملاحظة: الأرقاء دقيق يكفل عند الري لا يزال واضحا. تتم إزالة عوامل مرقئ (الجيلاتين الأسفنج) وكوتونويد في هذا الوقت. التأكد من أن جميع المواد والأدوات قد أزيلت من موقع شق قبل الإغلاق- - استخدام أسلوب 3-الطبقات للإغلاق.
- خياطة اللفافة ما استخدام خياطة 0 بطريقة بسيطة، وتوقف، noninverted. ضع شتيخ كل 5-8 ملم لتحقيق محكم الإغلاق-
- خياطة الأنسجة تحت الجلد باستخدام خياطة 2-0 بطريقة بسيطة، وتوقف، والمقلوب مع غرزة وضع كل 5 إلى 8-مم لتحقيق القوة الكافية.
- إغلاق الجلد باستخدام خياطة 0 في بسيطة، وتشغيل أو توقف الموضة.
- استخدام عداد إبرة لضمان أن لا الأدوات الحادة في عداد المفقودين له.
- ري الجلد مع المالحة والجلد الجاف ووضع شرائط ضمادة لاصقة عمودي على الشق.
- مكان الشاش فوق ضمادة شرائط وإرفاق مادة لاصقة نهائية الميكروبات جداً ثني.
10. رعاية الحيوان بعد العمليات الجراحية
- اكستوباتي، تغطي ببطانية دافئة، ونقل الحيوانات إلى الانتعاش.
- اتباع إجراءات التشغيل المؤسسية الموحدة للرصد والتعافي من الجراحة البقاء على قيد الحياة بعد العمليات الجراحية. كحد أدنى، مراقبة الحيوان كل 15 دقيقة حتى عودة الوعي، وكل ساعة حتى يتحقق الانتعاش الكامل مخدر، ومرتين يوميا بعد ذلك.
- توفير إدارة الألم بعد العمليات الجراحية بإدارة الدردشة أو عن طريق الفم والايبوبروفين، النظر في 4 مغ/كغ، مرة واحدة يوميا لمدة 5 أيام تبدأ من يوم بعد العمليات الجراحية 0. إدارة اتفاقية استكهولم البوبرينورفين ريال، تعطي 0.18 مغ/كغ، مرة واحدة في اليوم بعد العمليات الجراحية 2-
- إدارة مراجعتان بعد العمليات الجراحية بإعطاء سيفتيوفور إيم، إعطاء 5 ملغ/كغ، مرة واحدة في اليوم بعد العمليات الجراحية 4-
- إزالة ضمادة على المنطوق بعد يوم 5-7. إزالة خياطة الجروح التئام الجروح عند الانتهاء، عادة في مرحلة ما بعد المنطوق يوم 10-14-
- إنسانية euthanize الحيوان وفقا لإجراءات التشغيل المؤسسية الموحدة حالما يتم التوصل إلى نقطة نهاية الدراسة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تقييم نسيجية لانتشار إينجيكتاتي
يتحدد النجاح في إيصال إينجيكتاتي إلى الرسم نسيجية تقييم DAPI تنتشر. الأسلوب الذي ينطوي على تلميح إبرة لتحديد المواقع في وسط ثلاثي الأبعاد الرسم. ولذلك، يتحدد النجاح في إيصال بتقييم مدى DAPI تلطيخ من المقاطع النسجية سواء قرب (مقاطع الرسم المركزي) والبعيدة (مقاطع الرسم الطرفية) لطرف الإبرة. الشكل 1A و 1B الشكل تمثل حقنه ناجحة للرسم واحد. تم تفريق تلطيخ DAPI بالتساوي من خلال حمة DRG المركزية والطرفية. وهكذا يتجلى حقنه الرسم ناجح منتشر انتشار DAPI تلطيخ طوال بنية الرسم ثلاثي الأبعاد. ويتجلى الحقن دون المستوى الأمثل تلطيخ غير متناسقة. على سبيل المثال، الحد الأدنى تلطيخ (الشكل 1) أو تلطيخ تركيزه على طول الحافة الخارجية لكن الجانب الداخلي لا من حمة الرسم (الشكل 1) يشير إلى حقن غير ناجحة. أيضا، تعتبر معا، الرقم 1 (قسم مركزي للرسم) و الرقم 1 (قسم الرسم الطرفية) توضح عدم تلطيخ متسقة ضمن الأبعاد الثلاثة لهذا الرسم القطني واحد.
الشكل 1 : تقييم ثلاثي الأبعاد لتوزيع DAPI في حقن DRG. (أ) قسم مركزي من الرسم قطني حقن ممثل للتوصل إلى نتيجة ناجحة. تلوين صبغ علامة DAPI بالتساوي موزعة الرسم الكامل في بعدين. (ب) التوازي، القسم المحيطي من الرسم نفسه في (أ)، التي توضح مدى اتساق DAPI تنتشر داخل طائرة ثانية للقسم، يؤكد حقنه ناجحة في ثلاثة أبعاد. (ج) قسم مركزي من الرسم قطني حقن ممثل للتوصل إلى نتائج دون المستوى الأمثل. ويعتبر الحد الأدنى للا تلطيخ DAPI باستثناء البؤر عرضية. (د) موازية الطرفية مقطع من الرسم نفسه في (ج)، التي توضح توزيع جزئية من DAPI على طول محيط الرسم. الأزرق: DAPI. الأحمر: أوتوفلوريسسينسي. تغيير حجم أشرطة = 500 ميكرومتر (ألف وجيم)، 100 ميكرومتر (ب ود). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
وسعينا إلى وصف طريقة للتعرض الجراحية للرسم عن طريق laminotomy وحقن إينتراجانجليونيك في أنواع حيوانية كبيرة صحية، على وجه التحديد، من الخنازير. في القوارض، أسلوب مشابهة تم مفصلة 12 وتستخدم لتقديم عوامل دوائية التقليدية 8،10 والنواقل الفيروسية 6،7،،من912 للرسم. النتائج من الدراسات الحيوانية الصغيرة أعلاه تبشر بالخير ونأمل أن لدينا بروتوكول سيمهد الطريق للآخرين لترجمة هذه النتائج السابقة إلى الخنازير. واستخدمت الحيوانات السليمة والمريضة في الدراسات المذكورة أعلاه، تدعم الأداة المساعدة من الحيوانات الصغيرة في مجال البحوث الإكلينيكية. حتما، سوف يلزم نماذج حيوانية كبيرة جعل المقارنة المتاحة أفضل للرسم البشرية من حيث الحجم وإينجيكتاتي توزيع. على سبيل المثال، التفاوت في حجم الرسم يتجلى بوضوح بين الفئران والبشر. L5 الرسم في تعليم الكبار، قياس الفئران الذكور حوالي 2.6 مم × 1.5 مم 5 مقارنة مع 11.6 مم × 6.6 مم في البشر البالغين، والذكور 21. استناداً إلى قياسات الأشعة يعيش في الخنازير، الرسم L5 وجد أن حوالي 8.0 ملم × 6.0 ملم 22. ولذلك، تقع الخنازير كأنواع مفيدة بشكل خاص للدراسة السريرية بسبب التشابه الهيكلي مع النظام العصبي البشري والقريبة تشريح العضلات والعظام. ويدل على ذلك عكس الترجمة المستخدمة لتصميم هذا البروتوكول وفقا لذلك أجريت في العيادة. وعلاوة على ذلك، يتم استخدام الحيوانات الخنازير وتكتسي أهمية متزايدة في بحوث الطب الأحيائي. وسيدعم هذا البروتوكول الدراسات الإكلينيكية لتقديم الحلول القابلة للحقن لتعزيز النتائج السابقة من العمل في القوارض للحيوانات الكبيرة إينتراجانجليونيك. وبالتالي، قد يعزز هذا البروتوكول رواية استراتيجيات لعلاج الآلام المزمنة التي تدمج تقنيات إيصال تشريحيا انتقائية مع وكلاء جزيئيا انتقائية الرواية، التي يمكننا التنبؤ، قد تنطوي على إمكانية تحويل ألم الطب 3.
ملاحظات إضافية لنجاح الحقن بالرسم
وما زال السمحاق بريلامينار على مستويات العمود الفقري القطني في الخنازير سيفالاد بدلاً من أصفر ليجامينتوم. خلال laminotomy، يمكن أن تكون مفصولة بسهولة في موضع رونجيور كرسون السمحاق ويمكن أن تحاكي مظهر الأم الجافية. خطوة حاسمة للتفرقة بين أصفر ligamentum، السمحاق، والدهون فوق الجافية، والكيس دوراً كما يجري التشريح. وعلاوة على ذلك، التعرض للفضاء فوق الجافية هو أكثر كفاءة وتتحمل أقل نزيف إذا تمت إزالة في السمحاق في وقت واحد مع الصفيحة. إذا لم تتم إزالة السمحاق جنبا إلى جنب مع العظام، فإنه يمكن قطعي بشفرة #11 وإزالتها لفضح الدهون فوق الجافية الكامنة.
للقيام بأي ضرر أولوية قصوى وهذا يجب أن يكون متوازنا مع هدف الوصول إلى الرسم والحقن. وهكذا، هو الحرص لا للنهوض بعملية إجلاء الدهون فوق الجافية أبعد الأسفل أو أنتيروميديالي مما هو ضروري للسماح لتحديد الهوية الإيجابية دورال الكيس والاكمام جذر العصب دورال، والرسم. التشريح في الاتجاه أنتيروميديال حيث الكيس دورال تثير جلبه جذر العصب دورال خطرة بصفة خاصة كما سوف تصادف الوريد فوق الجافية طولية. وعلاوة على ذلك، والتشريح في هذا الاتجاه يزيد من الخطر على دوروتومي غير مقصودة، إلى جانب تدفق السائل الدماغي النخاعي من سطح الكيس دورال.
نقطة حرجة نهائي تحديد الكيس دورال، الجذور الظهرية، الرسم بأكمله والعصب الشوكي. هذا يساعد على إنشاء 4 قطع لتتلاقى التشريحية أدلة على أن ضمان تعريف الرسم كامل. تعريف الرسم في مجملها ضروري من أجل وضع طرف إبرة في مركزة ثلاثية الأبعاد، مما يسمح بالإبرة صعقة لإنشاء تدرج ضغط متسقة مع تحقيق أقصى قدر من المسافة إلى حدود التشريحية المحيطة. كل عوامل زيادة كبيرة في أحجام تسليمها ومجموعة من 19،إينترابارينتشيمال نشر20. تسليم إينجيكتاتي في مكان غير مركز التشريحية صحيحاً يؤدي الحقن دون المستوى الأمثل لأن تؤدي الضغوط غير متناسقة عندما تسرب إينجيكتاتي من موقع قريب من الرسم ثقب 20.
إحدى الصعوبات مع استخدام إبرة صعقة لحقن الرسم الامتثال. حالما تبدأ الحقن، يجب أن يبقى نصيحة إبرة حيث لا تزال ممكنة أو آخر التدرجات الضغط سوف تتبدد بسبب التغيرات المفاجئة في الامتثال 20. الحركة التنفسية مصدر حركة مستمرة أثناء الحقن. بيد تتم إزالة خطر حركة إبرة ثانوية بالنسبة للجهاز التنفسي رحلة إلى حد كبير بترسيخ الإبرة صعقة ودليل داخل مسبقة باراسبينال الجهاز العضلي للثقب للرسم الإبرة والرسم معا نمضي في التزامن مع التنفس. مدة الحقن لحجم 100 ميكروليتر الإجماليات 24 دقيقة بمعدل صعدت الموصوفة هنا. وينبغي الحرص على الحد الخارجي تعطيل جهاز الحقن بأكمله خلال هذا الوقت. وينبغي تعديل ترتيب الحقل الجراحي، والأفراد، والعقبات المحيطة حسب الحاجة قبل بدء الحقن لضمان واجهة دون عائق بين صعقة إبرة نصيحة والرسم.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
لا شيء؛ الكتاب قد لا يوجد تضارب في المصالح ذات الصلة بهذه الدراسة.
Acknowledgments
وأجرى الدراسة مع دعم مؤسسة الأسرة شولز (إلى A.S.B.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large humane animal sling | Britz & Company | 002539 | Modified to include abdominal aperture |
| Adhesive patient return electrode - 9 inch | Medtronic | E7506 | - |
| Ranger blood & fluid warming system | 3M | 24500 | - |
| Lactated Ringer's fluid | Hospira | 0409-7953-09 | - |
| Force air warming device | 3M | 77500 | - |
| Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) | 3M | 8630 | - |
| Sterile disposable surgical towels | Medline | MDT2168286 | - |
| Ioban 2 incise drape | 3M | 6651EZSB | - |
| Disposable suction canister and tubing | Medline | DYND44703H | - |
| Button switch electrosurgical monopolar pencil | Medtronic | E2450H | - |
| Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch | Bovie | A826 | - |
| #15 blade | Miltex | 4-315 | - |
| #11 blade | Miltex | 4-311 | - |
| 4 x 4 surgical gauze | Dynarex | 3262 | - |
| Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch | Miltex | 11-618 | - |
| Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch | Sklar | 42-2078 | - |
| Gelpi self-retaining retractor, 7 inch | Sklar | 60-6570 | - |
| Freer elevator, 5 mm | Medline | MDS4641518F | - |
| Bone wax | Ethicon | W31G | - |
| Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm | Sklar | 42-2852 | - |
| Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm | Medline | MDS4052802 | - |
| Leksell angled rongeur, 2 mm | Sklar | 40-4097 | - |
| Gelfoam, size 50 | Pfizer | AZL32301 | - |
| Cottonoid patty | Medtronic | 8004007 | - |
| Frazier suction tip, 6 Fr | Sklar | 50-2006 | - |
| Frazier suction tip, 10 Fr | Sklar | 50-2010 | - |
| Dandy blunt right angle nerve hook | Medline | MDS4005220 | - |
| Nylon suture, 6-0 | Ethicon | 697G | - |
| Castroviejo smooth micro needle holder | Medline | MDG2428614 | - |
| 22 gauge Quinke point spinal needle | Halyard Health | 18397 | - |
| 32 gauge CED needle with locking Luer hub | See comments | n/a | As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014). |
| Polyethylene tubing, 5 feet | Scientific Commodities | BB31695-PE/05 | - |
| Monoject syringe, 3 mL | Kendall | SY15352 | - |
| NanoJet syringe pump | Chemyx | 10050 | - |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | - |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | - |
| Bulb irrigation syringe | Medline | DYND20125 | - |
| Fine-toothed Adson forceps | Medline | MDS1000212 | - |
| Vicryl suture, 0 | Ethicon | J603H | - |
| Vicryl suture, 2-0 | Ethicon | J317H | - |
| Needle counter | Medline | NC20FBRGS | - |
| Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch | 3M | R1547 | - |
References
- Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57 (1), 1-164 (1999).
- Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. , (2016).
- Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91 (4), 522-533 (2016).
- Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. , Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
- Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
- Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1024-1031 (2013).
- Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14 (9), 897-906 (2003).
- Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
- Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
- Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. , Thieme. (2010).
- Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251 (2016).
- Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23 (3), 319-335 (1994).
- Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371 (2012).
- Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30 (3), 142-159 (2013).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36 (3), e164 (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71 (2), 405-416 (2012).
- Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16 (1), 61-69 (1991).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122 (3), 697-706 (2015).
- Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27 (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
- Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121 (4), 851-858 (2014).
