Summary
Wir beschreiben eine Methode zur Laminotomie bei Schweinen, die Zugang zu LWS Dorsal Root Ganglien (DRG) für die intraganglionic Injektion. Intraoperativ und histologisch bestätigt bis zu 21 Tage nach der Operation Injektion Fortschritte überwacht. Dieses Protokoll kann für zukünftige präklinischen Studien mit DRG-Injektion verwendet werden.
Abstract
Dorsal Root Ganglien (DRG) sind anatomisch gut definierte Strukturen, alle primäre sensorische Neuronen unter dem Kopf enthalten. Diese Tatsache macht DRG attraktive Ziele für die Injektion von neuer Therapeutika zur Behandlung von chronischen Schmerzen. In kleiner Tiermodelle wurde Laminektomie zur DRG-Injektion zu erleichtern, weil es chirurgische Entfernung der vertebralen Knochen rund um jede DRG beinhaltet. Wir zeigen eine Technik für die intraganglionic Injektion von lumbalen DRG in eine große Tierarten, nämlich Schweine. Laminotomie wird durchgeführt, um direkten Zugriff auf DRG mit standard neurochirurgische Techniken, Instrumente und Materialien. Verglichen mit umfangreicher Knochenentfernung über Laminektomie, implementieren wir Laminotomie um Wirbelsäule Anatomie zu sparen, während ausreichenden DRG Zugang zu erreichen. Intraoperative Fortschritt der DRG-Injektion wird unter Verwendung eines ungiftigen Farbstoffs überwacht. Nach Euthanasie am postoperativen Tag 21 bestimmt der Erfolg der Injektion Histologie für den intraganglionic Vertrieb von 4', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI). Wir injizieren eine biologisch inaktive Lösung um das Protokoll zu demonstrieren. Diese Methode könnte angewandte in Zukunft präklinischen Studien zum Ziel therapeutischen Lösungen für DRG. Unsere Methodik sollte erleichtern testen die Übersetzbarkeit von intraganglionic kleine Tier Paradigmen in einem großen Tierarten. Darüber hinaus kann dieses Protokoll als eine wichtige Ressource für die Planung von präklinischen Studien der DRG-Injektion bei Schweinen dienen.
Introduction
Dorsal Root Ganglien (DRG) sind anatomisch diskrete, neuronale Sammlungen befindet sich entlang der Wirbelsäule. Jede DRG enthält die primären sensorischen Neuronen, die kodieren und Relais periphere Stimuli auf das zentrale Nervensystem (ZNS) von bestimmten Körperregionen. Zum Beispiel beginnt der Schmerz von Osteoarthritis Schmerz-Rezeptoren liegt etwa eine gemeinsame Schmerzreize wahrnehmen. Dieser Vorgang wird Nozizeption bezeichnet. Langfristigen Sensibilisierung für Schmerzreize führt zu chronischen Schmerzen 1.
Chronische Schmerzen sind ein häufiges Thema der präklinischen Studie 2 , wo ein Ziel ist es, nützliche Methoden für die gezielte Gabe von Schmerzmitteln, DRG, z. B. intraganglionic Injektion 3zu entwickeln. Allerdings DRG sind schwer zugänglich, da sie innerhalb der boney Grenzen des intervertebralen Foramina 4befinden. Mehrere Gruppen haben dieses Hindernis durch den Einsatz von Wirbelsäulen-Chirurgie in Nagetieren 5,6,7,8,9,10erfolgreich überwinden.
In der Klinik Laminektomie ist eine gemeinsame Operation der Wirbelsäule und bezieht sich auf chirurgische Entfernung der Wirbelkörper Lamina, dadurch den Wirbelkanal 11Konvektion. Einbeziehung der Operationstechniken, DRG-Direktzugang zu leisten war erfolgreich in Nagetieren 5,12, Übersetzung kann jedoch unrealistisch angesichts Unterschiede in der Größe von relevanten Strukturen und Einflüsse, die Pharmakokinetik oder technische Machbarkeit 13,14. Beispielsweise ermittelt eine Studie den transversalen Rückenmark Durchmesser an T10 3.0, 7.0 und 8,2 mm für Ratte, Schwein und Mensch, bzw. 15sein. So Modelle großes Tier besser ungefähre menschlichen Dimensionen des nervösen Strukturen.
Bei Schweinen verwendet Raore Et Al. mehrstufige Laminektomie Zugang zu der zervikalen Rückenmark für mehrere intraspinal Injektionen 16. Das Verfahren wurde gut vertragen und führte zu einer Phase ich klinische Studie wo vergleichbare chirurgische Ergebnisse dokumentiert 17waren. Diese Ergebnisse ermutigen Weiternutzung von präklinischen große Tiermodellen als Prädiktoren der technischen Machbarkeit und Sicherheit beim Menschen.
Bislang existiert keine detaillierte Methodik für chirurgische Zugang und Injektion der DRG in einem großen Tierarten. Um dieser translationale Kluft zu verringern, berichten wir über ein Protokoll für die DRG-Belichtung und Injektion über Laminotomie bei Schweinen. Standard-neurochirurgische Techniken, Instrumente und Materialien wurden verwendet und die Methode wurde entwickelt, um die modernen chirurgischen Praxis zu imitieren. Wir zeigen intraganglionic Injektion mit einer wässrigen Lösung für Lendenwirbelsäule DRG und bestätigen Sie die erfolgreiche Lieferung per Histologie nach postoperativen Tag 21.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle hier beschriebene Methoden von der institutionellen Animal Care und Nutzung Committee (IACUC) der Mayo-Klinik genehmigt worden.
1. Voraussetzungen der Präzision und Reproduzierbarkeit
- , strenge des Designs zu gewährleisten, befolgen die nationalen Standards der guten Laborpraxis Praktiken sind zu allen Zeiten und eine interne Genehmigung vom IACUC (oder ähnlichen Ausschuss) vor jedem Tier Beteiligung an Experimente.
Hinweis: Dieses Protokoll wurde entwickelt, um einen klinisch treu Ansatz beizubehalten. So sind die Materialien, Instrumente und Techniken in einer Art und Weise identisch mit der höchsten klinischen Standards beim Menschen beschrieben. Zum Beispiel strenger steriler Technik folgt und abgelaufene Materialien sollten niemals verwendet werden. - , Reproduzierbarkeit dieser Methodik in einem experimentellen Rahmen unterstützen interne Dienstanweisungen entwickeln und Steuern für Variabilität in Schweine Rasse, Gewicht, Geschlecht und Alter zwischen separaten Kohorten.
Hinweis: Das Design dieses Protokolls stützte sich auf die Verwendung von Schweinen mit einem Gewicht von 38-53 kg
2. Präoperative Animal Care
- verwalten prophylaktische intramuskuläre (IM) Ceftiofur, bei 5 mg/kg, 1 Tag vor dem Eingriff gegeben.
- Schnell Tiere von fester Nahrung und kosmetischen Behandlungen, d.h. Ölbäder, 12 h vor dem Eingriff Tiere verhindern.
- Induzieren Vollnarkose innerhalb 1 h die Vorgehensweise unter Verwendung IM Tiletamin und Zolazepam, als Telazol bei 5 mg/kg, und ich bin Xylazin, gegeben bei 2 mg/kg.
- Sobald induziert, verwalten subkutane (SC) nachhaltig Buprenorphin Release (SR), am 0,18 mg/kg.
- Legen Sie einen Ohr-Venen-Katheter und führen schneller Abfolge Intubation um einen endotracheal Schlauch platzieren.
- Befestigen Sie ein Pulsoximeter mit Herzfrequenz monitoring-Funktion auf der Zunge, Sauerstoffversorgung und Herzfrequenz überwachen.
- Legen Sie das Tier in die Bauchlage und die Haut über den Handrücken mit einer elektrischen Haarschneidemaschine clip. Clip Haar über eine große, bilateralen Bereich von der Mittellinie Sagittalebene zur Mittellinie koronalen Ebene und längs von der sakralen Spitze, das Skapulier Stacheln. Verwenden Sie Klebeband, um frei schwebenden Haut und Haare zu entfernen.
- Schrubben den abgeschnittenen Bereich bis zu 3 Mal mit warmem Wasser und Seife und trocknen Sie die Haut mit einem fusselfreien Handtuch.
- Mark bilaterale anatomischen Landmarken mit einem chirurgischen Markierstift. Markieren Sie die letzten Rippen, Beckenkamm Kämme, Dornfortsätze und Querfortsätze.
Hinweis: Durch die Markierung der letzten Rippen, Beckenkamm Kämme und Querfortsätze, ist die Lendenwirbelsäule entlang seiner überlegen, minderwertigen und seitlichen Grenzen bzw. abgegrenzt. Dieses Protokoll wurde entwickelt, um Zugang und Injektion von einer lumbalen DRG von Interesse zu führen. Als Referenz, die überlegene Beckenkamm Wappen mit der L3 oder L4 Ebene der Wirbelsäule ausrichten. - Decken das Tier mit einer warmen Decke für den Transport bis zur operativen Suite.
3. Positionierung in der operativen Suite
- sanft Aufzug und Position des Tieres anfällig in einem modifizierten große menschliche Tier Schlinge mit gepolsterten Bauch Blende.
Hinweis: Die Abdominal-Blende ermöglicht Reduzierung der Bauchpresse ähnlich wie bei der Wilson-Rahmen während der Chirurgie der Wirbelsäule verwendet. Wiederum nimmt das intraoperative Blutung aus der Wirbelsäule Blutgefäße. Die Schlinge ist vorteilhaft, weil die Beine dürfen frei durch gepolsterte Öffnungen hängen, die das Tier von peripheren Nerven Impingement zu schützen. Jedoch weil die Schlinge Rahmen aus Metall besteht, sollte es gepolstert mit Isolierung, elektrische Kurzschlüsse und unbeabsichtigte tierischen brennen zu vermeiden. Eine Decke Roll platziert werden kann, um den Kopf und Hals in einer bequemen Position, je nach Größe des Tieres zu positionieren. - Pflegen Vollnarkose mit 1-3 % inhaliert (IH) Isofluran, titriert, Wirkung. Befeuchten der Augen mit ophthalmologischen Salbe und klebt sie sanft geschlossen.
- Ort-Linien für die Überwachung der Vitalfunktionen, Dokument Temperatur, Blutdruck, Herzfrequenz und Sauerstoffversorgung. Lüftung zu überwachen, indem Capnographie.
- Legen Sie eine klebende, Einweg elektrochirurgische dispersive Elektrode über den linken oder rechten Schulterblatt (Scapula).
- Verwalten erwärmt gesäugt Ringer ' s als Wartung Flüssigkeiten durch den Ohr-Venen-Katheter. Geben Sie Flüssigkeiten mit einer Rate von 5 bis 10 mL/kg/h.
- Stellen eine Erwärmung gezwungen-Luft-Gerät über die thorakalen und zervikalen Region und vermeiden, umfasst die letzten Rippen.
4. Sterile Vorbereitung des operativen Bereich für eine linksseitige Injektion
Hinweis: von diesem Punkt vorwärts, gehen Sie in strengen sterilen Mode.
- Bereiten die Haut über der Lendenwirbelsäule beginnend mit breite Anwendung von 0,7 % Jod Povacrylex und 74 % Isopropyl-Alkohol laut Hersteller ' Anweisungen. Um sicherzustellen, dass die Führer Nadel später auf sterile Weise platziert werden kann, lateralize Anwendung auf die Seite der geplanten Injektion durch die Ausweitung der Antisepsis in Richtung der Mittellinie koronalen Ebene hinter dem markierten Querfortsätze.
- Legen Sie chirurgische Einmalhandtücher in rechteckigen Mode auf die geplante Schnittführung Website eingehen, die über der Mittellinie entlang der markierten lumbalen Dornfortsätze ist.
- Anwenden, die ein Klebstoff antimikrobielle einzuschneiden über die operativen Handtücher drapieren und Haut ausgesetzt. Klemmen Sie Vorhänge an Ort und erweitern Sie den Faltenwurf Rand aus dem Operationsfeld.
- Sichern eine vertikale drapieren, Polen an der Spitze der Schlinge zwischen den operativen Bereich und der Überwachung Techniker.
- Secure Linien für Saug- und Elektrochirurgie im operativen Bereich von Spannen auf den sterilen Tüchern. Übergeben Sie die freien Enden der Rohre und Drähte aus dem sterilen Bereich.
5. Schnitt und subperiostale Dissektion der Haut
- entlang der Mittellinie der lumbalen Dornfortsätze ertasten und 3 aufeinanderfolgende Wirbelkörper Ebenen zu identifizieren.
- Verwenden #15 Skalpell um einen 8-12 cm Mittellinie sagittaler Schnitt durch den Incise Faltenwurf direkt posterior zu den Dornfortsätzen zu öffnen. Blutstillung mit Gaze Tamponade und monopolare Elektrochirurgie erhalten.
Hinweis: Darauf sollte geachtet werden, nicht, von der Mittellinie abweichen, wie der Schnitt in die vordere Richtung fortgeschritten ist, weil dies schränkt Blutungen aus der paraspinalen Muskulatur. Periodische Palpation für die Dornfortsätze erleichtert die Weiterentwicklung. Selbst behalten Weitlaner, Meyerding oder Gelpi Retraktoren kann platziert und neu positioniert, wie notwendig, um die Zerlegung zu erleichtern. Absaugung wird verwendet, um die Sichtbarkeit zu erhalten. - Sezieren die subkutanen Gewebe und Fett mit monopolare Elektrochirurgie, bis die Kopf Faszie erreicht wird. Tief, um die Brust Faszie Dornfortsätze ertasten und schneiden die Faszie entlang der Mittellinie zu entlarven, den Supraspinous Ligament spanning zwischen Dornfortsätzen.
Hinweis: Die Kopf Faszie ist als eine organisierte, aponeurotic Mantel mit einem Bindegewebe Körnchen identifiziert, die in eine schräge, seitliche in medialer Richtung verwebt. An dieser Stelle kann der Schnitt verlängert werden, in entweder überlegen oder unterlegen Richtung, damit 3 Dornfortsätze mit der welcher Dornfortsatz ausgerichtet in der Mitte des Feldes Dissektion vollständig sichtbar sind. - Verwenden eine #15 Klinge um eine 2 mm Tiefe parasagittalen Einschnitt durch den Supraspinous Ligament nach jeder Dornfortsatz platzieren. Legen Sie jeden Schnitt entlang der linken Drittel der hinteren Oberfläche der Dornfortsatz.
- Lösen sanft Supraspinous Ligament auf jeder Ebene entlang jeder incmit einem 5 mm freier Aufzug Ision.
- Subperiostale Flugzeug zu identifizieren und zu zergliedern, innerhalb dieser Ebene entlang der seitlichen Oberfläche jeder Dornfortsatz.
- Subperiostale Dissektion führen bei jeder Dornfortsatz auf eine parallele Weise um sicherzustellen, dass eine sanfte, wird sogar Dissektion erreicht.
- Einzuschneiden paraspinalen Muskeln Anlage entlang der interspinöse Räume mit monopolare Elektrochirurgie im Konzert mit subperiostale Dissektion.
- Der Lamina auf jeder Ebene zu identifizieren und weiter subperiostale Dissektion seitlich an der seitlichen Grenze der 2 zygapophyseal Gelenke, die die 3 sichtbaren Wirbel verbinden und die Seitenkante der Lamina zwischen den Gelenken, genannt die Pars zu erreichen Interarticularis.
Hinweis: Der Pars Interarticularis ist der hinteren Rand des Foramen Bandscheiben wobei die DRG wohnt. Gelegentlich ergibt sich eine kleine Vene aus einem Foramen befindet sich auf der hinteren Oberfläche der Lamina. Diese Venen haben eine Tendenz, während die subperiostale Dissektion reißen. Hämostase lässt sich durch eine Kombination von bipolaren Elektrochirurgie und Knochen Wachs aufgetragen, Foramen.
6. Einstufige Laminotomie
- das Ziel von Laminotomie als der welcher Lamina befindet sich zwischen und medial zu den 2 zygapophyseal Verbindungen identifizieren.
- Spur der Lamina an seinen minderwertigen Rand, bis zu einem Punkt nur medial der zusammenhängenden minderwertig artikuläre Prozess des kaudalen zygapophyseal Gelenks.
- Eine 5 mm freier Aufzug oder Kürette zu verwenden, um den Übergang zwischen den Caudalmost Rand der Lamina und zentralen Kanal palpieren.
Hinweis: Wird darauf geachtet, nicht zwingen palpating Instrument anterior, da dies den Duralsack und Rückenmark kontaktieren wird. Beachten Sie, dass das Rückenmark bei Schweinen über die Lendenwirbelsäule 18 hinausgeht. Eine Bandscheibe Rongeur kann verwendet werden, um zusätzliche weiche Gewebe über diesem Bereich Erleichterung Palpation entfernen. - Verwendung einer 2 mm Up-beißen, 45 Grad Kerrison Rongeur Knochen in stückweiser Weise zu extrahieren. Knochen an der Basis der Dornfortsatz souverän auf ein Niveau nur kaudalen an der kaudalen Oberfläche der Stiel entfernen und seitlich heraus in vollem Umfang.
- Abgewinkelt Verwendung Knochen Rongeurs, mit Knochenentfernung zu unterstützen. Lassen Sie die minderwertigen artikuläre Prozess, der an der Lamina an Ort angeschlossen wurde, bis die Laminotomie weitgehend abgeschlossen ist.
- Bestätigen, dass die minderwertigen Gelenk frei mobil und angehängten nur durch die zygapophyseal Gelenkkapsel erfolgt. Die Kapsel mit einem #15 und #11 Klinge einzuschneiden.
- Entfernen Sie den minderwertigen artikuläre Prozess in ein stückweiser Mode aber den angrenzenden überlegene artikuläre Prozess intakt lassen.
Hinweis: Nach Abschluss der Laminotomie erfolgt Blutstillung mit bipolaren Elektrochirurgie. Monopolare Elektrochirurgie wird nicht wegen der Nähe des neuralen Strukturen verwendet. Knochen Wachs entlang Websites von Blutungen aus freiliegenden Knochen gesetzt werden kann und resorbierbare Gelatine Schwämmen können zur Blutstillung in der Nähe von weichem Gewebe zu erhalten. Cottonoid ist ein hilfreiches Werkzeug zum Docht Serous Flüssigkeit und Blut weg von der Dissektion.
7. Dissektion der DRG
- evakuieren die epidurale Fett in ein stückweiser Mode von oberflächlichen tief Anfang medial und seitlich verläuft. Entfernen von Fett durch sanfte Dissektion mit bipolare Pinzetten und Absaugung mit 6-10 Französisch Frazier Saug Tipps.
Hinweis: Vergrößerung der Lupe oder die Verwendung eines sezierenden Mikroskops ist hilfreich bei der Bereitstellung der Detaillierungsgrad musste sicher evakuieren die epidurale Fett und sorgfältiger Blutstillung die epidurale venösen Plexus mit bipolaren Elektrochirurgie erreichen. - Identifizieren den Duralsack entlang der Mittellinie verläuft in Superoinferior Richtung, parallel zur Achse der Hautschnitt. Epidurale Fett entlang der Duralsack zu entfernen, bis der Duralsack dural Nerv Wurzel Hülse entstehen zu sehen.
- Verfolgen die duralen Ärmel seitlich und inferior durch epidurale Fett Evakuierung bis es angezeigt wird, um zu vergrößern um die DRG.
Hinweis: Identifizieren der DRG für seine ovale Form und gelb bis orange Farbe. In der Mitte des lumbalen Wirbelsäule ist die DRG in der Regel 4-6 mm groß, am längsten in der Medial in seitlicher Richtung und befindet sich direkt, minderwertig oder 2-3 mm medial ihrer jeweiligen Knochenschrauben. Ein stumpfe, rechtwinklige Nerv Haken kann verwendet werden, um sanft für den Stiel palpieren. - Evakuieren epidurale Fett seitlich, vorbei an der DRG, bis der angrenzenden Spinalnerven gesehen wird.
Hinweis: Wenn Durotomy auftritt, durch wasserdichten Verschluss mit 6-0 Nylon-Naht und glatte Mikro Nadelhalters in eine einfache laufende Stich reparieren.
8. Injektion von DRG
- Verwendung einer Spinalnadel 22-Gauge, die Flugbahn einer 32-Gauge Konvektion verbesserte Lieferung (CED) Nadel zu führen. Punktion die 22-Gauge Anleitung Nadel durch die Haut und paraspinalen Muskeln.
Hinweis: Die CED-Nadel zielt auf Flüssigkeitskonvektion im Gewebe, auch bekannt als Bulk Flow, durch Druck Steigungen 19 , 20. - Ziel ist es die Führer Nadel entlang einer Flugbahn, die nähert sich der Längsachse der DRG und führt zu der Spitze der Nadel aus der seitlichen paraspinale Wand des Feldes Dissektion.
- Fine tune den Nadel Weg, bis das Lumen der Nadel mit der Mitte der DRG übereinstimmt.
Hinweis: Die Guide-Nadel nie darf an die DRG. - Steril Injectate in eine sterile Spritze aufstellen und verbinden Sie die Spritze mit Schlauch steril Infusion.
- Sichern den Schlauch an die CED-Nadel und hand die Spritze aus dem sterilen Bereich. Schließen Sie die Spritze an eine programmierbare Spritzenpumpe.
Hinweis: Schlauch ist bereit, eine Länge von 5 Fuß um sicherzustellen, dass Sterilität und Mobilität aufrecht erhalten werden. Außerdem ist es von größter Wichtigkeit, dass keine Luftblasen in Lösung gebracht werden. - Die Injectate vorschieben, bis Ausdruck von der CED Nadelspitze gesehen wird.
- Die CED-Nadel innerhalb der Führer Nadel Lumen platzieren und die CED-Nadel langsam vorwärts, bis es von der Nadelspitze Reiseführer auftaucht. Sicherzustellen, dass die DRG nicht beim Ausrichten der Nadel punktiert wird.
- Feinabstimmung die Nadelposition Reiseführer entlang der Längsachse von seiner Flugbahn um den endgültigen Standort der CED Spitze bestimmen.
- Die Führung zu sichern, Nadel und CED Nadel zusammen mit ineinandergreifenden Nadel Hubs, Tiefe und Ausrichtung des Leitfadens und CED Nadeln erreicht.
- Bestätigen, die alle Injektion Apparat Verbindungen vollständig gesichert sind, einschließlich der Anleitung Nadel, CED Nadel und angeschlossenen Schläuche geladen mit Injectate.
- Der Führer Nadel entlang seiner Längsachse zur Angleichung der CED Nadelspitze und DRG.
- Punktion die DRG mit CED Nadelspitze.
- Eintauchen die CED Nadelspitze in die dreidimensionale Mitte der DRG.
Hinweis: da die DRG eine dreidimensionale Struktur von variabler Größe und Form ist, DRG-Exposition muss vollständig sein, damit die CED Nadelspitze exakt auf das eigentliche Zentrum der DRG zu platzieren. Das eigentliche DRG-Zentrum befindet sich an der Kreuzung der drei anatomischen Achsen, nämlich, anterior, Posterior, lateral, zu medial und minderwertige Achsen überlegen. - Liefern 100 μL des Injectate von CED mit einem abgestuften Preis und Volumen von 3 Schritte.
- Liefern 4 µl 2 μl/min für den ersten Schritt. 8 μl bei 4 μl/min für den zweiten Schritt zu liefern. 88 μL bei 8 μl/min für den dritten und letzten Schritt liefern.
Hinweis: Lassen Sie eine 3-Minuten Pause zwischen den einzelnen Schritten und nach den letzten Schritt zum Druck Gleichgewichtherstellung ermöglichen. - Nach der letzten Injektion Schritt und 3 min Pause entlang seiner Längsachse in eine glatte, sanfte Bewegung der Injektionsapparat zurückzutreten.
Hinweis: Für injizierten Lösungen, die farblos sind, ist farbige Farbstoff in die Lösung mit einer Konzentration von 0,1 % Gewicht/Volumen zur visuellen Beurteilung der Injectate Verteilung 12 Unterstützung enthalten. Auch die lebenswichtigen Farbstoff 4 ', 6-Diamidino-2-Phenylindole (DAPI) ist in Lösung mit einer Konzentration von 0,25 µg/μl enthalten, wenn das Design der Studie histologische Beurteilung der Injectate Verteilung 5 erfordert.
9. Verschluss
- gelten 3 Runden der warmen Kochsalzlösung Bewässerung an der Operationsstelle vor Schließung zu mobilisieren und spülen Sie die Website von Schutt, d.h. Knochenfragmente. Absaugung verwenden, um die Saline und Schutt wiederherzustellen.
Hinweis: Sorgfältige Blutstillung ist gewährleistet, wenn Bewässerung klar bleibt. Blutstillende Mittel (Gelatine Schwamm) und Cottonoid sind zu diesem Zeitpunkt entfernt. Stellen Sie sicher, dass alle Materialien und Instrumente von der Inzision Website vor Schließung gelöscht wurden. - Verwenden eine 3-lagige Technik für Schließung.
- Naht den Kopf Faszie mit 0 Naht in einer einfachen, unterbrochene, noninverted Mode. Legen Sie einen Stich alle 5-8 mm um wasserdichten Verschluss zu erreichen.
- Naht das subkutane Gewebe mit 2: 0 Nahtmaterial in eine einfache, unterbrochene, invertierte Mode mit einem Stich platziert jedes 5 - bis 8 mm, ausreichende Festigkeit zu erreichen.
- Die Haut mit 0 Naht in einem einfachen Betrieb zu schließen oder unterbrochen Mode.
- Verwenden Sie einen Nadel Leistungsindikator, um sicherzustellen, dass keine Kleie vermisst for
- Die Haut mit Kochsalzlösung zu bewässern, Austrocknung der Haut und legen Pflaster Streifen senkrecht auf die Inzision.
- Ort Gaze auf die Bandage Streifen und legen einen endgültigen Kleber antimikrobielle einzuschneiden drapieren.
10. Postoperative Animal Care
- Extubate, bedecken Sie mit warmen Decken und transportieren das Tier Erholung.
- Folgen institutionelle operativen Standardverfahren für die postoperative Überwachung und Erholung von der Operation überleben. Auf ein Minimum, beobachten das Tier alle 15 min bis Rückkehr des Bewußtseins, stündlich bis volle Narkose Erholung erreicht wird, und zweimal am Tag danach.
- Bieten postoperative Schmerztherapie durch Verabreichung IM oder mündliche Carprofen bei 4 mg/kg, einmal täglich für 5 Tage ab postoperativen Tag 0 gegeben. SC Buprenorphin SR, zu verwalten, da bei 0,18 mg/kg, einmal am 2. postoperativen Tag.
- Postoperative Antisepsis zu verwalten, indem man IM Ceftiofur gegeben bei 5 mg/kg, einmal am 4. postoperativen Tag.
- Entfernen Sie die Bandage am postoperativen Tag 5-7. Die Nähte zu entfernen, wenn die Wundheilung abgeschlossen, in der Regel auf postoperativen Tag 10-14 ist.
- Human einzuschläfern das Tier nach institutionellen operativen Standardverfahren der Studienendpunkt erreicht.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Histologische Beurteilung der Injectate Ausbreitung
Erfolgreiche Durchführung der Injectate, DRG richtet sich nach histologischen Beurteilung des DAPI verbreiten. Bei dieser Technik wird die Nadelspitze in der dreidimensionalen Mitte der DRG Positionierung. Daher wird erfolgreiche Zustellung bestimmt durch das Ausmaß der DAPI-Färbung von histologischen Abschnitten beide in der Nähe (zentrale DRG Abschnitte) und fernen (periphere DRG Abschnitte) an der Spitze der Nadel auswerten. Abbildung 1A und 1 b Abbildung repräsentieren eine erfolgreiche Injektion von einer DRG. DAPI-Färbung wurde durch das zentrale und periphere DRG-Parenchym gleichmäßig verteilt. Somit wird eine erfolgreiche DRG-Injektion durch die diffuse Ausbreitung der DAPI-Färbung in die dreidimensionale DRG-Architektur veranschaulicht. Suboptimale Injektion wird durch uneinheitliche Färbung dargestellt. Beispielsweise weist minimale Färbung (Abbildung 1) oder fokalen Färbung entlang dem äußeren Rand aber keine innere Aspekt der DRG Parenchym (Abbildung 1) erfolglos Injektion. Auch illustrieren gemeinsam betrachtet, Abbildung 1 (DRG-Mittelteil) und Abbildung 1 (periphere DRG Abschnitt) einen Mangel an einheitlichen Färbung in drei Dimensionen für diese einzelnen lumbale DRG.
Abbildung 1 : Dreidimensionale Beurteilung des DAPI Verteilung im injizierten DRG. (A) einem Mittelteil aus einem injizierten lumbale DRG repräsentativ für ein erfolgreiches Ergebnis. Die Färbung des Marker-Farbstoffs DAPI ist gleichmäßig verstreut in der gesamten DRG in zwei Dimensionen. (B) eine parallele verbreiten peripheren Abschnitt der gleichen DRG in (A), illustrieren die Konsistenz des DAPI innerhalb einer zweiten Ebene des Abschnitts, bestätigen eine erfolgreiche Injektion in drei Dimensionen. (C) einem Mittelteil aus einem injizierten lumbale DRG repräsentativ für eine Sub-optimale Ergebnisse. Minimale bis keine Färbung des DAPI ist mit Ausnahme von gelegentlichen Herde gesehen. (D) eine parallele, peripheren Abschnitt der gleichen DRG (c) zur Veranschaulichung teilweise Verteilung des DAPI entlang der DRG-Peripherie. Blau: DAPI. Rot: Autofluoreszenz. Skalieren von Balken = 500 μm (A und C), 100 μm (B und D). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Wollten wir beschreiben eine Methode für die chirurgische Exposition der DRG über Laminotomie und intraganglionic Injektion in eine gesunde große Tierarten, insbesondere Schweine. Bei Nagetieren eine ähnliche Methode wurde von detailliertes 12 und verwendet, um konventionelle pharmakologische Agenten 8,10 und Virenvektoren 6,7,9,12 , DRG liefern. Die Ergebnisse aus den oben genannten kleinen tierexperimentellen Studien sind vielversprechend und wir hoffen, dass unser Protokoll ebnet den Weg für andere, diese vorherige Ergebnisse Schwein zu übersetzen. Gesunde und kranke Tiere dienten in den oben genannten Studien, das Dienstprogramm von Kleintieren in der präklinischen Forschung zu unterstützen. Zwangsläufig werden große Tiermodellen menschlichen DRG in Bezug auf Größe und Injectate Verteilung der besten verfügbaren Vergleich zu. Zum Beispiel ist die Diskrepanz in der DRG-Größe deutlich zwischen Ratten und Menschen. L5 DRG bei Erwachsenen, männliche Ratten messen ca. 2,6 x 1,5 mm 5 im Vergleich zu 11,6 x 6,6 mm Erwachsener, männlicher Mensch 21. Basierend auf live-radiologische Messungen bei Schweinen, L5 DRG erwiesen sich ca. 8,0 x 6,0 mm 22. Daher befinden sich die Schweinegrippe als besonders nützliche Spezies für präklinische Studie aufgrund von strukturellen Ähnlichkeiten mit dem menschlichen Nervensystem und Muskel-Skelett-Anatomie. Dies wird belegt durch die Rückübersetzung verwendet, um design-dieses Protokoll nach, die in der Klinik durchgeführt. Darüber hinaus Schweine sind Tiere zu nutzen und von wachsender Bedeutung in der biomedizinischen Forschung. Dieses Protokoll unterstützt präklinische Studien der intraganglionic Lieferung von Injektionslösungen, vorherige Ergebnisse von der Arbeit bei Nagetieren um große Tiere zu gelangen. Dieses Protokoll kann damit, neue Strategien zur Behandlung von chronischen Schmerzen fördern, die anatomisch selektive Lieferung Techniken mit neuartigen molekular selektive Agenten zu integrieren, die wir vorhersagen, Schmerz Medizin 3verändern kann.
Zusätzliche Hinweise für erfolgreiche DRG-Injektion
Das praelaminaren Periost lumbalen vertebralen Ebenen bei Schweinen weiter kopfwärts anstelle des Ligamentum Flavum. Während Laminotomie der Knochenhaut kann leicht durch Platzierung der Kerrison Rongeur getrennt werden und kann zu imitieren das Aussehen der Dura Mater. Es ist ein entscheidender Schritt, Ligamentum Flavum, Periost, epidurale Fett und Dura Sac zu unterscheiden, da die Dissektion durchgeführt wird. Darüber hinaus den Epiduralraum ist effizienter und verursacht weniger Blutungen, wenn das Periost gleichzeitig mit der Lamina entfernt wird. Wenn das Periost nicht zusammen mit Knochen entfernt ist, können Sie mit einer Klinge #11 eingeschnitten und entfernt, um das zugrunde liegende epidurale Fett setzen.
Um keinen Schaden zu tun steht im Vordergrund und dies muss mit dem Ziel der DRG Zugang und Injektion ausgeglichen werden. So wird darauf geachtet, nicht, die Evakuierung der epidurale Fett weiter anterior voraus oder Anteromedially als erforderlich ist, um positive Identifizierung der Duralsack, dural Nerv Wurzel Ärmel und DRG zu ermöglichen. Zerlegung in Richtung Anteromedial wo der Duralsack dural Nerv Wurzel Hülse hervorruft ist besonders gefährlich, wie eine longitudinale epidurale Vene angetroffen werden. Darüber hinaus erhöht Dissektion in diese Richtung das Risiko für unbeabsichtigte Durotomy, von der Oberfläche der Duralsack durch den Abfluss des Liquor cerebrospinalis signalisiert.
Ein letzter kritischer Punkt ist die Identifizierung der Duralsack, dorsalen Wurzeln, DRG in seiner Gesamtheit und Spinalnerven. Dieses kann zu schaffen, 4 Stück von konvergierenden anatomische Beweise dafür, dass sichergestellt werden vollständige DRG-Definition. Definition der DRG in seiner Gesamtheit ist erforderlich, um die Nadelspitze in der dreidimensionalen Mitte positionieren die CED-Nadel, eine konsistente Druckgradient zu etablieren, bei gleichzeitiger Maximierung den Abstand zu den umliegenden anatomischen Grenzen erlaubt. Beide Faktoren erhöhen erheblich die Mengen geliefert und die Auswahl an Intraparenchymal verteilt 19,20. Lieferung von Injectate an einem Ort, der nicht das eigentliche anatomische Zentrum führt zu suboptimalen Injektion, weil inkonsistente Druck entstehen, wenn Injectate aus dem nahe gelegenen Gelände der DRG Punktion 20austritt.
Eine Schwierigkeit mit einer CED-Nadel für DRG-Injektion ist die Compliance. Sobald die Injektion begonnen hat, die Nadelspitze muss möglichst ruhig gehalten werden, sonst Druckgradienten durch abrupte Änderungen in Compliance 20abgeführt werden. Atemwege Motion ist eine Quelle der ständigen Bewegung während der Injektion. Allerdings ist das Risiko einer Nadelbewegung sekundäre respiratorische Exkursion weitgehend entfernt, durch Verankerung der CED und Führer Nadel innerhalb der paraspinalen Muskulatur vor der DRG zu durchbohren, wie die Nadel und die DRG im Gleichtakt mit Atmung zu bewegen. Die Einspritzdauer für ein Volumen von 100 μl Gesamt 24 min mit der abgestuften Rate hier beschrieben. Darauf sollte geachtet werden, um externe Störungen des gesamten Injektionsapparat während dieser Zeit zu begrenzen. Anordnung des Operationsfeldes, Personal und umliegenden Hindernisse sollten geändert werden, je nach Bedarf, bevor die Injektion begonnen wird, um eine ungestörte Schnittstelle zwischen CED Nadelspitze und DRG zu gewährleisten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Keine; die Autoren haben keine Interessenkonflikte im Zusammenhang mit dieser Studie.
Acknowledgments
Die Studie wurde mit Unterstützung durch die Schulze-Familienstiftung (zu A.S.B.) durchgeführt.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Large humane animal sling | Britz & Company | 002539 | Modified to include abdominal aperture |
| Adhesive patient return electrode - 9 inch | Medtronic | E7506 | - |
| Ranger blood & fluid warming system | 3M | 24500 | - |
| Lactated Ringer's fluid | Hospira | 0409-7953-09 | - |
| Force air warming device | 3M | 77500 | - |
| Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) | 3M | 8630 | - |
| Sterile disposable surgical towels | Medline | MDT2168286 | - |
| Ioban 2 incise drape | 3M | 6651EZSB | - |
| Disposable suction canister and tubing | Medline | DYND44703H | - |
| Button switch electrosurgical monopolar pencil | Medtronic | E2450H | - |
| Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch | Bovie | A826 | - |
| #15 blade | Miltex | 4-315 | - |
| #11 blade | Miltex | 4-311 | - |
| 4 x 4 surgical gauze | Dynarex | 3262 | - |
| Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch | Miltex | 11-618 | - |
| Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch | Sklar | 42-2078 | - |
| Gelpi self-retaining retractor, 7 inch | Sklar | 60-6570 | - |
| Freer elevator, 5 mm | Medline | MDS4641518F | - |
| Bone wax | Ethicon | W31G | - |
| Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm | Sklar | 42-2852 | - |
| Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm | Medline | MDS4052802 | - |
| Leksell angled rongeur, 2 mm | Sklar | 40-4097 | - |
| Gelfoam, size 50 | Pfizer | AZL32301 | - |
| Cottonoid patty | Medtronic | 8004007 | - |
| Frazier suction tip, 6 Fr | Sklar | 50-2006 | - |
| Frazier suction tip, 10 Fr | Sklar | 50-2010 | - |
| Dandy blunt right angle nerve hook | Medline | MDS4005220 | - |
| Nylon suture, 6-0 | Ethicon | 697G | - |
| Castroviejo smooth micro needle holder | Medline | MDG2428614 | - |
| 22 gauge Quinke point spinal needle | Halyard Health | 18397 | - |
| 32 gauge CED needle with locking Luer hub | See comments | n/a | As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014). |
| Polyethylene tubing, 5 feet | Scientific Commodities | BB31695-PE/05 | - |
| Monoject syringe, 3 mL | Kendall | SY15352 | - |
| NanoJet syringe pump | Chemyx | 10050 | - |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | - |
| Fast Green FCF | Sigma-Aldrich | F7252 | - |
| Bulb irrigation syringe | Medline | DYND20125 | - |
| Fine-toothed Adson forceps | Medline | MDS1000212 | - |
| Vicryl suture, 0 | Ethicon | J603H | - |
| Vicryl suture, 2-0 | Ethicon | J317H | - |
| Needle counter | Medline | NC20FBRGS | - |
| Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch | 3M | R1547 | - |
References
- Millan, M. J. The induction of pain: An integrative review. Prog Neurobiol. 57 (1), 1-164 (1999).
- Burma, N. E., Leduc-Pessah, H., Fan, C. Y., Trang, T. Animal models of chronic pain: Advances and challenges for clinical translation. J Neurosci Res. , (2016).
- Pleticha, J., Maus, T. P., Beutler, A. S. Future directions in pain management: integrating anatomically selective delivery techniques with novel molecularly selective agents. Mayo Clin Proc. 91 (4), 522-533 (2016).
- Standring, S. The anatomical basis of clinical practice. , Elsevier Churchill. Edinburg. (2005).
- Fischer, G., et al. Direct injection into the dorsal root ganglion: technical, behavioral, and histological observations. J Neurosci Methods. 199 (1), 43-55 (2011).
- Zhao, X., et al. A long noncoding RNA contributes to neuropathic pain by silencing Kcna2 in primary afferent neurons. Nat Neurosci. 16 (8), 1024-1031 (2013).
- Xu, Y., Gu, Y., Wu, P., Li, G. W., Huang, L. Y. M. Efficiencies of transgene expression in nociceptive neurons through different routes of delivery of adeno-associated viral vectors. Hum Gene Ther. 14 (9), 897-906 (2003).
- Puljak, L., Kojundzic, S. L., Hogan, Q. H., Sapunar, D. Targeted delivery of pharmacological agents into rat dorsal root ganglion. J Neurosci Methods. 177 (2), 397-402 (2009).
- Mason, M. R. J., et al. Comparison of AAV serotypes for gene delivery to dorsal root ganglion neurons. Mol Ther. 18 (4), 715-724 (2010).
- Jelicic Kadic, A., Boric, M., Kostic, S., Sapunar, D., Puljak, L. The effects of intraganglionic injection of calcium/calmodulin-dependent protein kinase II inhibitors on pain-related behavior in diabetic neuropathy. Neurosci. 256, 302-308 (2014).
- Greenberg, M. S. Handbook of neurosurgery. , Thieme. (2010).
- Yu, H., Fischer, G., Hogan, Q. H. AAV-mediated gene transfer to dorsal root ganglion. Methods Mol Biol. 1382, 251 (2016).
- Yaksh, T. L., et al. Pharmacology and toxicology of chronically infused epidural clonidine HCL in dogs. Toxicol Sci. 23 (3), 319-335 (1994).
- Federici, T., et al. Surgical technique for spinal cord delivery of therapies: demonstration of procedure in gottingen minipigs. J Vis Exp. (70), e4371 (2012).
- Lee, J. H. T., et al. A novel porcine model of traumatic thoracic spinal cord injury. J Neurotrauma. 30 (3), 142-159 (2013).
- Raore, B., et al. Cervical multilevel intraspinal stem cell therapy: assessment of surgical risks in Gottingen minipigs. Spine. 36 (3), e164 (2011).
- Riley, J., et al. Intraspinal stem cell transplantation in amyotrophic lateral sclerosis: A phase I safety trial, technical note, and lumbar safety outcomes. Neurosurg. 71 (2), 405-416 (2012).
- Olmarker, K., Holm, S., Rosenqvist, A., Rydevik, B. Experimental nerve root compression. A model of acute, graded compression of the porcine cauda equina and an analysis of neural and vascular anatomy. Spine. 16 (1), 61-69 (1991).
- Bobo, R. H., et al. Convection-enhanced delivery of macromolecules in the brain. Proc Natl Acad Sci U.S.A. 91 (6), 2076-2080 (1994).
- Lonser, R. R., Sarntinoranont, M., Morrison, P. F., Oldfield, E. H. Convection-enhanced delivery to the central nervous system. J Neurosurg. 122 (3), 697-706 (2015).
- Shen, J., Wang, H. Y., Chen, J. Y., Liang, B. L. Morphologic analysis of normal human lumbar dorsal root ganglion by 3D MR imaging. AJNR Am J Neuroradiol. 27 (0195–6108 (Print)), 2098-2103 (2006).
- Pleticha, J., et al. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. J Neurosurg. 121 (4), 851-858 (2014).
