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Neuroscience

Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos

doi: 10.3791/56434 Published: October 10, 2017

Summary

Nós descrevemos um método para laminotomy em suínos que fornece acesso aos gânglios lombares raiz dorsal (DRG) para injeção intraganglionic. Progresso de injeção é monitorado no intraoperatório e histologicamente confirmado acima de 21 dias após a cirurgia. Este protocolo pode ser usado para futuros estudos pré-clínicos envolvendo injeção DRG.

Abstract

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são estruturas anatomicamente bem definidas que contêm todos os neurônios sensoriais primários abaixo da cabeça. Este fato faz DRG alvos atraentes para injeção da novela terapêutica visa tratamento de dor crônica. Em modelos animais pequenos, laminectomia tem sido usada para facilitar injeção DRG porque envolve a remoção cirúrgica do osso vertebral cercam cada DRG. Vamos demonstrar uma técnica para injeção intraganglionic de DRG lombar em uma espécie de animal grande, ou seja, a suína. Laminotomy é executada para permitir acesso direto a DRG utilizando materiais, instrumentos e técnicas neurocirúrgicas padrão. Comparado com a remoção de osso mais extensa através de laminectomia, implementamos laminotomy para conservar a anatomia da coluna vertebral ao conseguir acesso suficiente DRG. Progresso no intra-operatório de injeção DRG é monitorado usando uma tinta atóxica. Após eutanásia no pós-operatório dia 21, o sucesso da injeção é determinado pela histologia para distribuição intraganglionic de 4' 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI). Injetamos uma solução biologicamente inativa para demonstrar o protocolo. Esse método pode ser aplicada no futuro pré-clínicos estudos para soluções terapêuticas alvo de DRG. Nossa metodologia deve facilitar a Traduzibilidade dos paradigmas animais pequenas intraganglionic próprios de teste em uma espécie animal. Além disso, este protocolo pode servir como um recurso fundamental para os estudos pré-clínicos de injeção DRG em suínos de planejamento.

Introduction

Gânglios da raiz dorsal (DRG) são coleções anatomicamente discretas, neuronais, localizadas ao longo da coluna vertebral. Cada DRG contém os neurônios sensoriais primários que codificam e transmitir estímulos periféricos ao sistema nervoso central (SNC) de regiões específicas do corpo. Por exemplo, a dor da osteoartrite começa quando os receptores de dor localizados sobre uma articulação percebem estímulos nocivos. Este processo é denominado de nocicepção. Consciência a longo prazo dos estímulos nocivos leva à dor crônica 1.

Dor crônica é um tema frequente de estudo pré-clínicos 2 onde um dos objetivos é desenvolver métodos úteis para entrega alvo de analgésicos a DRG, tais como a injeção de intraganglionic 3. No entanto, DRG são difíceis de acesso porque eles residem dentro dos limites magrela do Forame intervertebral 4. Vários grupos superaram com êxito este obstáculo através do uso de cirurgia da coluna vertebral em roedores 5,6,7,8,9,10.

Na clínica, laminectomia é uma operação comum da coluna vertebral e refere-se a remoção cirúrgica da lâmina vertebral, desse modo unroofing o canal vertebral 11. Incorporação de técnicas cirúrgicas para permitir acesso direto de DRG tem sido bem sucedida em roedores 5,12, no entanto, a tradução pode ser irrealistas considerando diferenças no tamanho das estruturas relevantes e como isso influencia farmacocinética ou viabilidade técnica 13,14. Por exemplo, um estudo determinou o diâmetro transversal da medula espinhal em T10 ser 3.0, 7.0 e 8,2 mm para humanos, respectivamente, 15, porco e rato. Assim, o animal grande modelos melhor humanas aproximadas de estruturas nervosas.

Em suínos, et al . Raore usado laminectomia multi-nível para obter acesso à medula espinhal cervical por múltiplas injeções intraspinal 16. O procedimento foi bem tolerado e levou a uma fase I ensaio clínico onde os resultados cirúrgicos comparáveis foram documentados 17. Estes resultados encorajam uso continuado de modelos pré-clínicos de animais grandes como preditores de viabilidade técnica e de segurança em humanos.

Até à data, nenhuma metodologia detalhada existe para acesso cirúrgico e injeção de DRG em uma espécie animal. Para diminuir esse fosso translacional, relatamos um protocolo para exposição DRG e injeção através de laminotomy em suínos. Materiais, instrumentos e técnicas neurocirúrgicas padrão foram utilizados e o método foi projetado para imitar a prática cirúrgica moderna. Demonstramos a injeção intraganglionic utilizando uma solução aquosa de DRG lombar e confirmar entrega bem sucedida através de histologia após dia pós-operatório 21.

Protocol

todos os métodos descritos aqui foram aprovados pelo cuidado institucional do Animal e Comissão de utilização (IACUC) da clínica Mayo.

1. pré-requisitos de Rigor e reprodutibilidade

  1. para garantir o rigor do desenho, siga os padrões nacionais de laboratório boa práticas estão em todos os momentos e obterem aprovação interna por IACUC (ou comitê semelhante) antes de qualquer animal envolvimento em experiências.
    Nota: Este protocolo foi projetado para manter uma abordagem clinicamente fiel. Assim, os materiais, instrumentos e técnicas envolvidas são descritas de forma idêntica para os mais altos padrões clínicos em seres humanos. Por exemplo, técnica asséptica estrita é seguida e nunca devem ser utilizados materiais expirados.
  2. Para oferecer suporte a reprodutibilidade desta metodologia em um ambiente experimental, desenvolver procedimentos internos habituais de funcionamento e de controle para variabilidade na raça suína, peso, sexo e idade entre coortes separadas.
    Nota: O design deste protocolo foi baseado na utilização de suínos com peso kg. 38-53

2. Pré-operatório Cuidado Animal

  1. administrar profilaxia intramuscular (IM) ceftiofur, dado em 5 mg/kg, 1 dia antes do procedimento.
  2. Rápido animais de alimentos sólidos e restringir os animais de tratamentos cosméticos, ou seja, os banhos de óleo, 12 h antes do procedimento.
  3. Induzir anestesia geral até 1 horas após o procedimento, usando IM tiletamina e eficiente, dado como Telazol em 5 mg/kg e IM xilazina, dada em 2 mg/kg.
  4. Uma vez que induzida, administrar subcutânea liberação sustentada a buprenorfina (SC) (SR), dada em 0,18 mg/kg.
  5. Coloque um cateter de orelha-veia e realizar intubação de rápida sequência para colocar um tubo endotraqueal.
  6. Anexar um oxímetro de pulso com função de língua para monitorar a frequência cardíaca e oxigenação de controlo do ritmo cardíaco.
  7. Colocar o animal na posição de bruços e cortar a pele sobre o dorso usando uma tosquiadeira elétrica. Grampo de cabelo sobre uma área grande, bilateral, estende-se da linha média sagital ao plano coronal mediana longitudinalmente o ápice sacral para os espinhos escapulares. Use fita adesiva para remover o cabelo e pele flutuante.
  8. Esfregue a área cortada até 3 vezes com água morna e sabão e seque a pele com uma toalha de pano sem.
  9. Pontos anatômicos bilaterais Mark, usando uma caneta de marcação cirúrgica. Marcar a última costela, cristas ilíacas, processos espinhosos e processos transversos.
    Nota: Marcando a última costela, cristas ilíacas e processos transversos, a coluna lombar é demarcada ao longo de seus limites laterais, superiores e inferiores, respectivamente. Este protocolo foi projetado para orientar o acesso e a injeção de qualquer DRG lombar de interesse. Para referência, a crista ilíaca superior alinhar-se com o nível vertebral L3 ou L4.
  10. Cobrir o animal com um cobertor quente para o transporte para a suíte operativa.

3. Posicionamento na suíte operativa

  1. suavemente do elevador e a posição do animal propenso num grande animal humano modificado sling com abertura abdominal acolchoada.
    Nota: A abertura abdominal permite a diminuição da pressão abdominal semelhante ao quadro Wilson utilizado durante a cirurgia humana da coluna vertebral. Por sua vez, isso diminui o sangramento intra-operatório de vasos sanguíneos da coluna vertebral. O sling é vantajoso, porque as pernas são permitidas para pendurar-se livremente através das aberturas acolchoadas que proteger o animal de choque do nervo periférico. No entanto, porque o frame do sling é feito de metal, que deve ser acolchoada com isolamento para evitar curto-circuitos elétricos e queimadura animal inadvertida. Um rolo de manta pode ser colocado para posicionar a cabeça e o pescoço em uma posição confortável, dependendo do tamanho do animal.
  2. Manutenção de anestesia geral usando 1-3% inalado isoflurano (IH), titulado para o efeito. Umedecer os olhos com pomada oftálmica e suavemente fita eles.
  3. Linhas de lugar para monitoramento de sinais vitais para documento de temperatura, pressão arterial, frequência cardíaca e oxigenação. Monitor de ventilação por capnografia.
  4. Coloque um eletrodo dispersivo eletrocirúrgico descartável, adesivo sobre a escápula esquerda ou direita.
  5. Administrar aquecido de lactato de Ringer ' s como fluidos de manutenção através do cateter de orelha-veia. Dar líquidos a uma taxa de 5-10 mL/kg/h.
  6. Coloque um dispositivo de aquecimento de ar forçado sobre a região cervical e torácica e evitar cobrindo as últimas costelas.

4. Preparação estéril do campo operatório para uma injeção de lado esquerdo

Nota: a partir daí, proceder de forma estéril rigorosa.

  1. Preparar a pele sobrejacente o início da coluna lombar com ampla aplicação de 0,7% iodo povacrylex e 74% álcool isopropílico de acordo com o fabricante ' instruções s. Para assegurar que a agulha guia mais tarde pode ser colocada de forma estéril, lateralize aplicação para o lado da injeção planejada, estendendo a anti-sepsia para o plano coronal mediana passado as apófises transversas marcados.
  2. Colocar toalhas cirúrgicas descartáveis em forma retangular para delinear o local da incisão planejada, que é sobre a linha média ao longo do marcado processos espinhosos lombares.
  3. Aplicar um adesivo antimicrobiano incise disponha sobre as toalhas operativas e expostos a pele. Braçadeira de cortinas no lugar e estender a borda do drapery fora do campo operatório.
  4. Garantir um caimento vertical para polos na cabeça do sling, entre o campo operatório e o acompanhamento técnico.
  5. Secure linhas de sucção e eletrocirurgia dentro do campo operatório, fixando o drapejam estéril. Passe as extremidades livres dos tubos e fios para fora do campo estéril.

5. Incisão e dissecção Subperiosteal de pele

  1. palpar os processos espinhosos lombares ao longo da linha mediana e identificar 3 níveis vertebrais consecutivos.
  2. Usar um bisturi #15 para abrir uma incisão sagital mediana de 8-12 cm através a cortina entalha diretamente posterior para os processos espinhosos. Manter a hemostasia utilizando gaze de tamponamento e eletrocirurgia monopolar.
    Nota: Tenha cuidado para não se desviar da linha média, como a incisão é avançada na direção anterior, porque isso limita a sangrar dos músculos paraspinal. Palpação periódica para os processos espinhosos facilita avanço. Auto retenção afastadores Weitlaner, Fi ou Gelpi pode ser colocado e reposicionado conforme necessário para facilitar a dissecação. Sucção é usada para manter a visibilidade.
  3. Dissecar o tecido subcutâneo e gordura usando eletrocirurgia monopolar até atingir a fáscia toracolombar. Palpar os processos espinhosos profundamente à fáscia toracolombar e cortar a fáscia ao longo da linha mediana para expor o ligamento supra-espinhal abrangendo entre processos espinhosos.
    Nota: A fáscia toracolombar é identificada como uma bainha aponeurótico, organizada com um grão de tecido conjuntivo que entrelaça em um oblíquo, lateral de direção medial. Neste ponto, a incisão pode ser alongada na direção superior ou inferior para garantir que 3 processos espinhosos são totalmente visíveis, com o processo espinhoso centermost alinhado no centro do campo de dissecação.
  4. Usar uma lâmina #15 para colocar uma incisão profunda parasagital 2mm através do ligamento supra-espinhal posterior para cada processo espinhoso. Coloque cada incisão ao longo do terceiro esquerdo da superfície posterior do processo espinhoso.
  5. Gentilmente liberar o ligamento supra-espinhal em cada nível ao longo de cada incision usando um elevador mais livre de 5 mm.
  6. Identificar o avião subperiosteal e dissecar dentro daquele avião ao longo da superfície lateral de cada processo espinhoso.
  7. Faz dissecação subperiosteal em cada processo espinhoso de forma paralela para assegurar que um gentil, dissecação mesmo é alcançada.
  8. Incise a fixação muscular paraspinal ao longo dos espaços interespinhoso usando eletrocirurgia monopolar em concerto com dissecação subperiosteal.
  9. Identificar a lâmina em cada nível e continuar subperiosteal dissecação lateralmente para atingir a borda lateral do zygapophyseal 2 articulações que conectam as 3 vértebras expostas e para atingir a borda lateral da lâmina entre as articulações, chamado os pars interarticularis.
    Nota: O interarticulares é a borda posterior do Forame intervertebral, no qual reside o DRG. Ocasionalmente, uma pequena veia surge de um forame localizado na superfície posterior da lâmina. Estas veias têm uma tendência a se romper durante a dissecção subperiosteal. Hemostasia é facilmente conseguida usando uma combinação de eletrocirurgia bipolar e cera para osso aplicado ao forame.

6. Nível único Laminotomy

  1. identificar o alvo de laminotomy como a lâmina de centermost localizada entre e medial para as 2 juntas zygapophyseal.
  2. Rastrear a lâmina de sua borda inferior, a um ponto apenas medial ao processo articular inferior contíguo da articulação zygapophyseal caudal.
  3. Usar um elevador mais livre de 5 mm ou cureta para palpar a transição entre a borda da lâmina e canal central de caudalmost.
    Nota: Cuidado para não forçar o instrumento palpating anterior como isto entrará em contato com o saco dural e a medula espinhal. Observe que a medula espinhal em suínos ultrapassa a coluna lombar 18. Um rongeur do disco intervertebral pode ser usado para remover a sobrejacente nesta área para facilitar a palpação de tecidos moles adicionais.
  4. Uso um 2-mm até morder, 45º Kerrison rongeur para extrair o osso de forma piece-wise. Remover o osso ao longo da base do processo espinhoso superiormente para um nível apenas caudal à superfície caudal do pedículo e sair lateralmente para toda a sua extensão.
  5. Uso angulado ruginas osso para ajudar com a remoção de osso. Deixe o processo articular inferior que foi conectado com a lâmina no lugar até o laminotomy é em grande parte concluída.
  6. Confirmar que o processo articular inferior é livremente móvel e anexado apenas pela cápsula articular zygapophyseal. Incise a cápsula usando uma lâmina 15 # ou #11.
  7. Remover o processo articular inferior de forma piece-wise, mas deixar o processo articular superior adjacente intacta.
    Nota: Como o laminotomy é concluída, hemostasia é realizada com eletrocirurgia bipolar. Eletrocirurgia monopolar não é usada por causa da proximidade de estruturas neurais. Cera para osso pode ser colocada ao longo de sítios de sangramento do osso exposto e esponjas de gelatina absorvível podem ser usadas para obter hemostasia perto de tecidos moles. Cottonoid é uma ferramenta útil para fluido seroso de pavio e sangue longe a dissecação.

7. Dissecação de DRG

  1. evacuar a gordura peridural em uma forma piece-wise de superficial para profunda começando medialmente e prosseguindo lateralmente. Remover a gordura por dissecação suave, usando a pinça bipolar e sucção com 6-10 dicas de aspiração Frazier francês.
    Nota: Lupa ampliação ou o uso de um microscópio de dissecação é útil para fornecer o nível de detalhamento necessário seguramente evacuar a gordura epidural e obter hemostasia meticulosa do plexo venoso epidural usando eletrocirurgia bipolar.
  2. Identificar o saco dural ao longo da linha mediana correndo em uma direção superoinferior, paralela ao eixo da incisão da pele. Remova a gordura epidural ao longo o saco dural, até o saco dural pode ser visto a dar origem a manga de raiz de nervo dural.
  3. Rastrear a manga dural lateralmente e inferiormente pela evacuação de gordura epidural até é visto para ampliar em torno da DRG.
    Nota: Identifica o DRG para sua forma oval e amarelo, a cor laranja. Da espinha lombar médio, DRG é geralmente 4-6 mm de tamanho, maior a medial para lateral direção e localizado diretamente inferior ou 2-3 mm medial para seu respectivo pedículo. Um gancho de nervo romba, direito-angular pode ser usado para palpar delicadamente para pedículo.
  4. Evacuar gordura epidural lateralmente, passado o DRG, até que o nervo espinhal adjacente é visto.
    Nota: Se ocorrer durotomy, repará-lo pelo fechamento estanque usando sutura nylon 6-0 e condutor de agulha micro suave em uma simples execução stich.

8. Injeção de DRG

  1. uso uma agulha espinhal 22 para guiar a trajetória da agulha calibre 32 convecção entrega aprimorada (CED). Punção da agulha de calibre 22 guia através dos músculos, pele e paraspinal.
    Nota: A agulha CED é projetada para alcançar a convecção fluida em tecido, também conhecido como fluxo de granel, devido a gradientes de pressão 19 , 20.
  2. Aponta a agulha guia ao longo de uma trajetória que se aproxima do eixo longitudinal da RDG e resulta na ponta da agulha emergentes da parede lateral paraspinal do campo dissecação.
  3. Fine tune o caminho da agulha até o lúmen da agulha se alinha com o centro da RDG.
    Nota: A agulha guia nunca devem entrar em contato com a DRG.
  4. Elaborar injectate estéril para uma seringa estéril e conecte a seringa para o tubo de infusão estéril.
  5. Fixar o tubo na agulha do CED e a seringa para fora do campo estéril. Conecte a seringa de uma bomba de seringa programável.
    Nota: Tubulação está preparada para um comprimento de 5 pés para garantir a manutenção de esterilidade e mobilidade. Além disso, é de suma importância que nenhuma bolha de ar ser introduzido na solução.
  6. Avançar o injectate até expressão é visto da ponta de agulha CED.
  7. Coloque a agulha CED dentro do lúmen da agulha guia e avance lentamente a agulha de CED, até que surge a partir da ponta da agulha guia. Certifique-se de que o DRG não é perfurado durante o alinhamento da agulha.
  8. Fine tune guia da posição da agulha ao longo do eixo longo de sua trajetória para determinar a localização final da ponta da CED.
  9. Secure guia de agulha e agulha de CED juntos usando cubos de agulha bloqueio depois de profundidade e alinhamento do guia e agulhas CED é alcançado.
  10. Confirmar que todas as conexões de aparelhos de injeção estão plenamente garantidas, incluindo o guia agulha, agulha de CED, e tubulação conectada carregado com injectate.
  11. Fazer avançar a agulha guia ao longo de seu eixo longo para aproximar a ponta da agulha CED e DRG.
  12. Punção RDG com a ponta da agulha CED.
  13. Mergulhe a ponta da agulha CED no centro tridimensional da RDG.
  14. Entregar 100 μL de injectate pelo CED usando uma taxa graduada e um volume de 3 passos.
  15. Entregar 4 μl a 2 µ l/min para a primeira etapa. Entrega 8 μL em 4 µ l/min. para a segunda etapa. Entregar 88 μL em 8 µ l/min para a terceira e última etapa.
    Nota: Permitir que uma pausa de 3 min entre etapas e após a etapa final para permitir o equilíbrio de pressão.
  16. Retirar o aparelho de injeção após a etapa de injeção final e 3-min pausa ao longo de seu eixo longo com um movimento suave e gentil.
    Nota: Para soluções injetáveis são incolores, tintura colorida está incluída na solução em uma concentração de 0,1% peso/volume para auxiliar na avaliação visual da distribuição de injectate 12. Além disso, o corante vital 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) está incluído na solução em uma concentração de 0,25 μg/μL, quando o projeto de estudo requer avaliação histológica da distribuição de injectate 5.

9. Encerramento

  1. aplicar 3 rodadas de irrigação salina quente para o sítio cirúrgico antes da sutura para mobilizar e liberar o site de detritos, ou seja, fragmentos de ossos. Usar sucção para recuperar a solução salina e detritos.
    Nota: Hemostasia meticulosa é assegurada quando a irrigação permanece clara. Agentes hemostáticos (esponja de gelatina) e cottonoid são removidas neste momento. Certifique-se de que todos os materiais e instrumentos foram desminados do local da incisão antes da sutura.
  2. Usar uma técnica de 3 camadas para o encerramento.
  3. Sutura da fáscia toracolombar usando sutura 0 de uma forma simples, interrompida, noninverted. Coloque um stich cada 5-8 mm para atingir fechamento estanque.
  4. Sutura do tecido subcutâneo usando sutura 2-0, de forma simples, interrompida, invertida, com um ponto colocado cada 5 a 8-mm para alcançar a força adequada.
  5. Fechar a pele usando sutura 0 de uma forma simples, funcionando ou interrompido moda.
  6. Usar um contador de agulha para garantir que nenhum farelos estão desaparecidos há
  7. Irrigar pele com soro fisiológico, secar a pele e coloque as tiras de bandagem adesiva a incisão perpendicular.
  8. Lugar de tiras de gaze em cima do curativo e anexar um adesivo final antimicrobiano incise drape.

10. Cuidado pós-operatório do Animal

  1. os tubos, cobrir com cobertores e transportar o animal para recuperação.
  2. Siga os procedimentos operacionais institucionais padrão para acompanhamento pós-operatório e a recuperação da cirurgia de sobrevivência. No mínimo, observar o animal cada 15 min até o retorno da consciência, por hora, até que a recuperação anestésica completa é alcançada e duas vezes por dia daí em diante.
  3. Gestão de dor pós-operatória fornecer ao administrar IM ou oral carprofeno, dada em 4 mg/kg, uma vez ao dia durante 5 dias, começando no dia pós-operatório 0. Administrar SC buprenorfina SR, dado em 0,18 mg/kg, uma vez no 2º dia pós-operatório.
  4. Administrar anti-sepsia pós-operatória, dando a IM ceftiofur, dado a 5 mg/kg, uma vez no dia pós-operatório 4.
  5. Remover o curativo no pós-operatório dia 5-7. Remover as suturas quando a cicatrização estiver completa, geralmente no pós-operatório dia 10-14.
  6. Humanamente eutanásia do animal de acordo com os procedimentos operacionais padrão institucionais, uma vez atingido o ponto de extremidade do estudo.

Representative Results

Avaliação histológica de propagação injectate
Sucesso na entrega de injectate de DRG é determinado pela avaliação histológica de DAPI se espalhou. A técnica envolve o posicionamento da ponta da agulha no centro tridimensional da RDG. Portanto, entrega bem sucedida é determinada pela avaliação da extensão da DAPI coloração de secções histológicas ambos perto (seções DRG centrais) e distante (seções DRG periféricas) para a ponta da agulha. Figura 1A e figura 1B representam uma injeção bem sucedida de um DRG. DAPI coloração foi dispersada uniformente através do parênquima DRG central e periférico. Assim, uma bem sucedida injeção DRG é ilustrada pela disseminação difusa de DAPI coloração em toda a arquitetura DRG tridimensional. Injeção sub-ótimo é ilustrada pela coloração inconsistente. Por exemplo, mínima coloração (Figura 1) ou a mancha focal ao longo da orla exterior mas o aspecto não interno do parênquima DRG (Figura 1) indica a injeção sem sucesso. Também, considerados em conjunto, Figura 1 (seção DRG central) e a Figura 1 (seção DRG periférica) ilustram uma falta de coloração consistente em três dimensões para este único DRG lombar.

Figure 1
Figura 1 : Avaliação tridimensional da distribuição de DAPI em injetado DRG. (A) uma seção central de uma injetada lombar DRG representativo de um resultado positivo. A coloração do corante marcador DAPI é uniformemente dispersas por todo o DRG inteira em duas dimensões. (B) um paralelo, seção periférica da mesma RDG em (A), ilustrando a consistência de DAPI espalhar dentro de um segundo avião da seção, confirmando uma injeção bem sucedida em três dimensões. (C) uma seção central de uma injetada lombar DRG representativo de um resultado sub-ótimo. Mínima para nenhuma mancha de DAPI é vista exceto focos ocasionais. (D) uma paralela, periférica seção da RDG mesmo em (C), ilustrando a distribuição parcial de DAPI ao longo da periferia do DRG. Azul: DAPI. Vermelho: autofluorescência. Escala de barras = 500 μm (A e C), 100 μm (B e D). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

Procuramos descrever um método de exposição cirúrgica de DRG através de laminotomy e injeção de intraganglionic em uma espécie animal saudável, especificamente, a suína. Em roedores, um método semelhante foi detalhada 12 e usado para entregar agentes farmacológicos convencionais 8,10 e vetores virais 6,7,9,12 DRG. Os resultados de estudos animais pequenos acima são promissores e esperamos que nosso protocolo irá pavimentar o caminho para que outros possam traduzir estes resultados anteriores para suínos. Animais saudáveis e doentes foram utilizados nos estudos acima, apoiando o utilitário de pequenos animais em pesquisa pré-clínica. Inevitavelmente, grandes modelos animais serão necessários para fazer a comparação melhor disponível para DRG humana em termos de distribuição de tamanho e injectate. Por exemplo, a discrepância no tamanho DRG é claramente evidente entre ratos e humanos. DRG L5 em adulto, ratos machos medem aproximadamente 2,6 x 1,5 mm 5 comparado a 11,6 x 6,6 mm em seres humanos adultos, do sexo masculino 21. Com base em medições radiográficas ao vivo em suínos, DRG L5 foram encontrados para ser aproximadamente 8,0 x 6,0 mm 22. Portanto, suína situam-se como uma espécie particularmente útil para estudos pré-clínicos devido a semelhanças estruturais com o sistema nervoso humano e nas proximidades de anatomia músculo-esquelética. Isto é evidenciado pela tradução reversa utilizada para a concepção deste protocolo de acordo com o realizado na clínica. Além disso, está a usar animais e suína é motivo de crescente importância na investigação biomédica. Este protocolo irá apoiar estudos pré-clínicos de intraganglionic entrega de soluções injectáveis para avançar as conclusões anteriores do trabalho em roedores para animais de grandes porte. Desse modo, o presente protocolo pode promover novas estratégias para tratamento de dor crônica que integram técnicas de entrega anatomicamente seletiva com novos agentes molecularmente seletivos, que, podemos prever, podem ter o potencial de transformar a dor medicina 3.

Notas adicionais para injeção de DRG bem sucedida

O periósteo prelaminar nível vertebral lombar em suínos cefálica continua no lugar do ligamento amarelo. Durante laminotomy, o periósteo pode ser facilmente separado por colocação do rongeur Kerrison e pode imitar a aparência de dura-máter. É um passo fundamental para diferenciar o ligamento amarelo, periósteo, gordura epidural e sac dura como a dissecação é realizada. Além disso, a exposição do espaço peridural é mais eficiente e incorre menos sangramento se o periósteo é removido em simultâneo com a lâmina. Se o periósteo não é removido juntamente com o osso, pode ser feito com uma lâmina #11 e removida para expor a gordura epidural subjacente.

Para não fazer o mal é uma prioridade, e esta deve ser equilibrada com o objetivo de acesso DRG e injeção. Assim, é tomar cuidado para não avançar a evacuação da gordura epidural anterior mais ou anteromedially do que é necessário para permitir a identificação do saco dural, manga de raiz de nervo dural e DRG. Dissecção em direção ântero-medial, onde o saco dural dá origem a manga de raiz de nervo dural é particularmente perigosa como uma veia epidural longitudinal será ser encontrada. Além disso, a dissecação nesta direção aumenta o risco para durotomy não intencional, sinalizado pelo fluxo do líquido cefalorraquidiano da superfície do saco dural.

Um último ponto de crítica é a de identificar o saco dural, raízes dorsais, DRG na sua totalidade e o nervo espinhal. Esta ajuda a estabelecer a prova de 4 pedaços de convergindo anatómicos que assegurar uma completa definição de DRG. Definir o DRG em sua totalidade é necessária para posicionar a ponta da agulha no seu centro tridimensional, que permite que a agulha do CED para estabelecer um gradiente de pressão consistente enquanto maximiza a distância e as fronteiras anatômicas circundantes. Ambos os fatores aumentam significativamente os volumes entregados e gama de difuso espalhar 19,20. Entrega de injectate em um local que não seja o verdadeiro centro anatômico resulta em injeção sub-ótima porque inconsistentes pressões resultam quando injectate vazamentos do site nas proximidades da DRG punção 20.

Uma dificuldade com o uso de uma agulha do CED para injeção de DRG é o de conformidade. Depois que a injeção foi iniciado, a ponta da agulha deve ser mantida mais imóvel possível senão gradientes de pressão dissipará devido a mudanças bruscas em conformidade 20. Movimento respiratório é uma fonte de movimento contínuo durante a injeção. No entanto, o risco do movimento da agulha secundário à excursão respiratória é em grande parte removido escorando a CED e guia de agulha dentro de antes da musculatura paraspinal punctura da RDG como a agulha e o DRG se move em sincronia com a respiração. A duração da injeção de um volume de 100 totais μL 24 min à taxa escalonada descrita aqui. Deve ter cuidado para limitar as interrupções externas do aparato de injeção inteiro durante este tempo. Arranjo do campo cirúrgico, pessoal e obstáculos circundantes deve ser modificado conforme necessário antes de iniciar a injeção para assegurar uma interface intacta entre a ponta da agulha CED e DRG.

Disclosures

Nenhum; os autores têm sem conflitos de interesse relacionados com este estudo.

Acknowledgments

O estudo foi realizado com o apoio pela Fundação da família de Schulze (para A.S.B.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Large humane animal sling Britz & Company 002539 Modified to include abdominal aperture
Adhesive patient return electrode - 9 inch Medtronic E7506 -
Ranger blood & fluid warming system 3M 24500 -
Lactated Ringer's fluid Hospira 0409-7953-09 -
Force air warming device 3M 77500 -
Duraprep solution with applicator, 26 mL (0.7% iodine povacrylex, 74% isopropyl alcohol) 3M 8630 -
Sterile disposable surgical towels Medline MDT2168286 -
Ioban 2 incise drape 3M 6651EZSB -
Disposable suction canister and tubing Medline DYND44703H -
Button switch electrosurgical monopolar pencil Medtronic E2450H -
Fine smooth straight bipolar electrosurgical forceps, 4 1/2 inch Bovie A826 -
#15 blade Miltex 4-315 -
#11 blade Miltex 4-311 -
4 x 4 surgical gauze Dynarex 3262 -
Weitlaner self-retaining retractor, 8 inch Miltex 11-618 -
Meyerding self-retaining retractor, 1 x 2 3/8 inch Sklar 42-2078 -
Gelpi self-retaining retractor, 7 inch Sklar 60-6570 -
Freer elevator, 5 mm Medline MDS4641518F -
Bone wax Ethicon W31G -
Spurling intervertebral disc rongeur, 3 mm Sklar 42-2852 -
Spurling 45-degree, up-biting Kerrison rongeur, 2 mm Medline MDS4052802 -
Leksell angled rongeur, 2 mm Sklar 40-4097 -
Gelfoam, size 50 Pfizer AZL32301 -
Cottonoid patty Medtronic 8004007 -
Frazier suction tip, 6 Fr Sklar 50-2006 -
Frazier suction tip, 10 Fr Sklar 50-2010 -
Dandy blunt right angle nerve hook Medline MDS4005220 -
Nylon suture, 6-0 Ethicon 697G -
Castroviejo smooth micro needle holder Medline MDG2428614 -
22 gauge Quinke point spinal needle Halyard Health 18397 -
32 gauge CED needle with locking Luer hub See comments n/a As in: Pleticha, J., Maus, T.P., Christner, J.A., Marsh, M.P., Lee, K.H., Hooten, W.M., Beutler, A.S. Minimally invasive convection-enhanced delivery of biologics into dorsal root ganglia: validation in the pig model and prospective modeling in humans. Technical note. J Neurosurg. 121(4), 851-8 (2014).
Polyethylene tubing, 5 feet Scientific Commodities BB31695-PE/05 -
Monoject syringe, 3 mL Kendall SY15352 -
NanoJet syringe pump Chemyx 10050 -
DAPI Sigma-Aldrich D9542 -
Fast Green FCF Sigma-Aldrich F7252 -
Bulb irrigation syringe Medline DYND20125 -
Fine-toothed Adson forceps Medline MDS1000212 -
Vicryl suture, 0 Ethicon J603H -
Vicryl suture, 2-0 Ethicon J317H -
Needle counter Medline NC20FBRGS -
Steri-strip skin closure, 1/2x4 inch 3M R1547 -

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References

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Laminotomy para acesso de gânglio lombar Dorsal raiz e injeção em suínos
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Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).More

Unger, M. D., Maus, T. P., Puffer, R. C., Newman, L. K., Currier, B. L., Beutler, A. S. Laminotomy for Lumbar Dorsal Root Ganglion Access and Injection in Swine. J. Vis. Exp. (128), e56434, doi:10.3791/56434 (2017).

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