Summary
提示し、培養するため変更されたロール チューブ法をここでは、フォトエッチング coverslips に再配置する正確に何週間もかけてスライスの齧歯動物の脳の断続的な高分解能イメージング。神経細胞の生存とスライス形態も維持されます。細胞型特異的発現ウイルスを用いたこの完全に囲まれたシステムのアプリケーションを提供しています。
Abstract
培養齧歯類脳スライスは、ニューロンとグリア通常体内の相互作用の多くを保持する環境での細胞および分子の挙動を調べる場合に役立ちます。蛍光顕微鏡による高分解能イメージングのためさまざまなトランスジェニック マウス線または蛍光付けられた蛋白質または野生型脳スライスのレポーターの発現ウイルスベクターの使用から得られたスライスを許可します。イメージング脳スライス、スライス培養を組み合わせて実行する機能のいくつかの方法が開発されているが、長時間にわたりライブ スライスの特定のセルの繰り返しの高分解能イメージングは、問題を提起しています。最高ユーザーを保護し、交差汚染を防ぐためにクローズド システムで行われるため外因性タンパク質の発現ウイルスベクターを使用、これは特に当てはまります。密閉システムで何週間もかけてスライスの繰り返しの高分解能イメージングを可能にするローラー管脳スライス培養法は、単純な変更が報告されます。フォトエッチング coverslips にスライスを養殖を迅速かつ正確には、さまざまな治療法の前後に時間をかけて同じフィールドをイメージするステージを再配置する基準マークの使用できます。特定の神経細胞の染色し海馬スライスのアーキテクチャの変化を観察するための式、蛍光蛋白質のウイルスによる神経発現とコフィリン病理学の発展と組み合わせてこのメソッドの使用方法の例が表示されます。アルツハイマー病 (AD) の海馬におけるアミロイド β (a β) ペプチドのオリゴマーをスライス処理に応答, 以前。
Introduction
齧歯動物の頭脳の地域から解離細胞の初代培養はレスポンスを病理組織学的に観察する研究者によって使用される重要なツールに刺激が関与しています。ただし、このような研究は、ニューロンだけ 2 D で、グリア サポート システムを見ての欠点を持っています。さらに、それの非常に高密度化 (640 ニューロン/mm2または表面積の約 16%) の条件下で栽培しない限りなります短い距離以上の海馬はその細胞体から樹状突起や軸索のランダムな副産物を従うことができません。神経細胞生存率 4 週間以上1、加齢に伴う病態の拡張研究解離文化の使用を制限する著しく低下しました。齧歯動物の脳から調製したスライスの養殖は、数週間または数か月の組織細胞と生存率を維持することでこれらの制限を克服する魅力的なオプションです。スライス培養における齧歯動物の脳の多くの異なる領域を維持するための条件は、説明2をされています。
2 つの主要な方法は広く使用される長期培養脳スライス:3の気液界面膜を培養または密封された管内 coverslips に培養通気4を提供するためにローラーのインキュベーターで回転できます。膜上で培養したスライスの正立顕微鏡と水浸漬目標5を使用して高解像度蛍光顕微鏡による直接イメージを作成できます。また、膜上で培養したスライスは、倒立顕微鏡6を使用して樹状突起スパインの良好な分解能を達成するためにガラス底培養皿に転送されています。ただし、膜上に成長したスライスを画像の両方の方法は媒体の変更を必要とし、多くの場合抗真菌剤や抗生物質を使用して回避または低減汚染5,6オープン ・ システムです。優れた形態や生存率、空気中の界面膜上のスライスを維持が高倍率で反復的なイメージ投射の間の正確な位置に戻るは非常に難しい実験は細胞の唯一の小さなグループに続く蛍光マーカーを表現します。膜上に成長したスライスは、ウイルスによる発現遺伝子5,6で使用されている、バイオ セーフティ プロトコル必要がありますに使用される特定のウイルスのベクトルに囲まれた文化システムが採用されます。蛍光を表現するタグ付きのタンパク質や細胞生理学記者。さらに、浸漬の目的は文化5に続いて、サンプル間の除染を必要とします。膜インターフェイス文化の 1 つの主要なアプリケーションは、単一の時間ポイント7で電気生理学と高分解能イメージングを組み合わせることです。
プラスチック製のチューブ内 coverslips にロール チューブ法、coverslip を削除せず電気生理学または高分解能イメージングを許可しません。したがって、このメソッドは、最も頻繁に8のポスト固定観測が実施された長期的な研究に適用されています。ここで説明した、ローラー チューブ培養技術を利用して、文化として長い間繰り返しイメージを作成することができます coverslips にスライスと掘削を管に維持される方法です。囲まれたシステムは、イメージングの中型の変更を必要としないと、フォトエッチング coverslips イメージング高倍率、数日または数週間後で以前のイメージを作成する正確なフィールド許可基準マークを提供するために利用します。
齧歯動物の海馬は、記憶と学習に関与する主要な脳の領域に変更を検討する本手法に適用します。齧歯動物の海馬は、認知障害9広告で発生したなどの開発中に病理組織学的、または加齢に伴う変化のためのモデルとしてよく勉強しました。本手法は特に広告8の特徴である a β ペプチドの増加などの環境の変化に対応で時間をかけて 1 つのスライス内で開発の病理学的変化の研究に適しています.コフィリン アクチン凝集体の存在である人間と齧歯動物の AD 脳に関連付けられている 1 つの病理学、ロッド、コフィリンとアクチン フィラメントの後者含まれているバンドルは、1:1 モル比10、11,12. ロッド固定スライス a β 投与ラット海馬だけでなく、コフィリン gfp 低酸素8を受けるライブ齧歯動物脳スライス内で観察されているし、広告に見られるシナプスの機能不全に貢献するかもしれないストローク。ここで我々 は時間コースと別のウイルスによって導入された表現された外因性キメラ蛍光蛋白質のスライス内の分布を観察するのにこの新しい培養方法を使用します。コフィリン ロッドと海馬スライスにおける可溶性 a β オリゴマー (a βo) による治療への応答の集計の病理学の発展に従ってくださいコフィリン記者構造、神経特異的発現し利用します。
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Protocol
動物の使用に続く承認された繁殖と動物使用プロトコル準拠する動物愛護とコロラド州立大学の使用のガイドラインの。
注: 以下のプロトコルは準備と文化法長期潜伏と海馬スライスの断続的なイメージングをについて説明します。単一の海馬スライスは凝固血漿を使用して特別に作られたフォトエッチング coverslip に接続されているし、coverslips はローラーのインキュベーターで維持するドリル アウト ローラー管の平らな側面にシールが。プラズマの塊は、蛍光タンパク質の発現と高分解能イメージングのためのウイルス感染前にプラスミンにディゾルブされます。蛍光神経の重要な染料を使用して、スライス内のニューロンをイメージします。
1. ローラー管ラックの作製
- 図 1に示すようにテンプレートを使用は、スケール バーを表示サイズに印刷。、釘を使って穴の中心にテンプレート (細かい点のマーカーのできる大きさ) 小さな穴をパンチします。
- 15 cm 培養皿 (14 cm の呼び径) の下部にテンプレートを設定し、穴の位置をマークします。2 番目の料理にこの手順を繰り返します。
- プラスチック用ドリルのビットで穴の中心、皿の端から 2.5 cm の六角形配列 (4.8 cm-の中心) の各皿の上 6 の 1.5 cm 直径の穴をドリルします。図 1Aのようにより大きい穴の 2 つの間に等間隔に配置されている端から 12 mm 3 穴 (直径 3 mm) をあけます。
- 各皿の底に、2 番目の平ワッシャーを一枚続く小さな穴のいずれかを介して平ワッシャーと 2.5 インチ長いビス (直径 3/16 インチ) を配置、お互いに直面してポリエチレンのチューブ (スペーサー、4.7 cm)、別の平ワッシャー、2 番目の細胞培養用ディッシュ、別の平ワッシャー、ロック洗濯機およびナット。
- 2 つのマシンの他のネジとすべてのビスは、場所までだけ緩く締め 1.4 手順を繰り返します。しっかりとナットを締めます。
- 取得最終ローラー管ラック底皿の穴にグロメット (5/16 インチ厚、5/8 インチ穴径) を動作 (図 1Bの場所に 2 つの管と示されて)。一意の番号の各ラックにステッカーを配置します。
2. ローラ チューブと Coverslips の準備
- ローラ チューブの孔あけ治具を作る
- 8 cm 1.5 cm 穴をあけるような角度で 5.5 インチ木製ブロック x 4 x 2 のセンター側にブロックを挿入するとほぼ平行する意志をローラの平らな面に管 (図 2A)。
- 穴を広げるし、テーパ管挿入できるように穴の両方に丸い木製のファイルを使用してを拡大 (ローラ チューブ、キャップ エンド付近の径大きめ) (図 2B)。
- ブロックの側から 5.5 cm 1.5 cm 直径垂直穴をドリルし、側の穴 (図 2C) を中心としました。
- 側孔は十分なテーパーは、中央のスライスの穴と 1.5 cm の垂直穴でマークしたスポットを中心としたのでチューブを配置する目的のスポットでマークされているローラ チューブを挿入します。
- チューブを削除し、スポットからチューブの端までの距離を測定します。治具で穴の中心からこの距離をマークし、(図 2Cの矢印) を掘削管を適切に配置する停止を提供するために爪を挿入します。
- けがを防ぐために木製のブロックの表面を持つフラッシュを爪を切断するのに弓のこを使用します。
- ドリル出版物であることができるスロットを固定 (図 2D黒矢印) がある場合は、治具の下にスプリング クリップを追加します。それ以外の場合、ドリル出版物にしっかりとジグを保持する C-クランプを使用します。
- 治具を使用して保持し (図 2A) を平らな面にフラット両面 11 cm プラスチック培養管の位置、センター下から 1.0 cm と 6 mm 径の穴をドリルに上記し、チューブの側面間の中央に。
注: プラスチック用ドリルビットを使用する必要があります。 - 回転式バリ取りツールで穴 (図 2E) の端を滑らかにし、内側に 4 本の溝を作る穴の縁 (図 2E、インセット) 回転中に穴の排水を容易にします。
- 12 mm の穴パンチ、非毒性ダブル両面接着シリコン ラバー シートから 12 mm 径ディスクをカットします。標準的な 1 つの穴紙パンチ (6 mm 径) を使用して、各ディスクの中心の穴を作る。
- 70% エタノールで掘削管を洗浄、空気は生物学的安全キャビネットでそれらを乾燥し、滅菌チューブと生物学的安全キャビネットに UV ランプ (30 70 cm 平均距離で W) で 40 分パンチ接着ディスク。
- チューブとディスクをすべて露出した表面が滅菌されているので 20 分後再配置します。無菌条件下で白の接着剤のディスクからバッキングをはがし、穴 (図 2F) を合わせ、チューブの外側にシリコン ラバーを貼る。
注意: 紫外線暴露を避けるためには、眼の保護具を着用して、UV ランプの電源を入れる前にキャビネットを閉じます。 - 12 mm 径フォトエッチング (100 番号センター 1 mm 正方形) ドイツのガラス coverslips をクリーンアップします。鉗子で優しく、coverslips を保持、エタノール、水、エタノールが続いて再び、続いてディップし、最後にエタノールを燃焼させる炎の coverslips をディップします。クールに coverslips を許可します。
- Coverslips 鉗子で純水を coverslips 10 s. リンス 2 %3-アミノプロピルトリエトキシシラン アセトンに浸しし、乾いた空気で乾燥させて。
- キャビネットの中に生物学的安全滅菌フィルター紙の上、coverslips を設定、UV 光を入れます。20 分間 coverslips のそれぞれの側を公開します。
注意: 紫外線暴露を避けるためには、眼の保護具を着用して、UV ランプの電源を入れる前にキャビネットを閉じます。
3. 海馬スライス標本
- 解剖を開始する前に組織のチョッパーの両刃かみそりの刃の部分を準備します。ブレードを慎重に指で縦に折り、半分にはめ込みます。
- 無水エタノールで処理した後、それらをきれいにし、乾燥空気に綿棒を使用してアセトンでブレードの半分をすすいでください。
注: 脳スライス培養のプロトコル、マウスまたはラット系統または遺伝子型依存しません。異なる遺伝的背景を持つ多くのトランスジェニック マウスの線を使用しています。
- 鉗子、安定用シャーレの側面に対して後方側を上にトリミングされた脳と腹側を保持します。優しく矢状面の正中線を離れて髄膜をいじめるし、微細先端・ デュモン #5 鉗子 (図 3C、破線の円内) による中脳組織を削除します。
- それは開いている (図 3C破線) を広めるため脳の側に沿って 2 つのカットを作る。脳には、背側を下、しゅろ、配置されます、一度海馬の割れ目が見えるはず (図 3D矢印)。
- Polychlorotrifluoroethylene プラスチック フィルムの部分に広がり開いて脳を転送し、スライス組織チョッパーのステージ上の位置します。GBSS/グルコースとブレードをウェットし、海馬を ~ 300 μ m の厚さのスライスに切る。
- 転送ピペットと GBSS/グルコース (図 3E) を含む新鮮な 60 mm ディッシュにプラスチック フィルムをスライスした脳をフラッシュします。優しくピンチオフし、罰金の先端の鉗子、残り髄膜スライス (図 3G, H) から他の非海馬組織 (図 3F) といじめます。
4. めっきスライス
- スライスを取得すると、準備された coverslip のフォトエッチング側のセンターに鶏プラズマの 2 μ L を配置します。わずか 3 〜 4 mm 径スポットを達成するためにプラズマを広めます。
注: フォトエッチング側はその数字が正しい向きで解剖顕微鏡を通して見るとカバーガラスの上にあります。 - 1 脳スライスを滅菌狭い先端ヘラ (図 4A) でプラズマ スポット (図 4B) に転送します。GBSS/グルコースからスライスを持ち上げながらヘラの先端で、スライスを維持して閉じ鉗子を使用します。
- プラズマ閉じ鉗子と、coverslip のスポットにヘラをタッチ、coverslip の上にスライスをプッシュします。
- 別のチューブでトロンビンの 2.5 μ L でプラズマのミックス 2.5 μ。(図 4B) それをミックスする、優しくこの混合物とスライスと上下のピペットの 2.5 μ L をすばやく配置します。
プラズマがので、これはすぐに行う必要があります 10-15 秒内で凝固する注:。スライスの接着が問題 5 μ L で 5 μ L の血漿をミックス スライス、スライス、coverslip の上に平らになるように混合した後いくつかの取り外しで 4-5 μ L を使用してください。 - クリアパーツ以前ローラ チューブに貼付シリコーン系粘着剤の露出側からカバーを取り外し、穴 (図 4C) 内のスライスを合わせ接着剤に脳スライス coverslip。
- 密着性を確保するため、ソフト、coverslip を均等に押しそれ約 1 分の生物学的安全キャビネットに転送しながら親指で coverslip にも圧力を適用されます。
- 生物学的安全キャビネットで各管 (図 4D) に完全な Neurobasal の培養液 (材料表) の 0.8 mL を追加します。
- クランプが保有する安全に滅菌綿接続パスツール ピペットで 5% CO295% 空気混合を流れ。ガスの混合物をローラ チューブをフラッシュし、それがピペットの周りから引き出されると急速にチューブをキャップします。
- チューブをスライス番号とラベルし、数をラックします。幾何学的均衡を保っていることを確認、ローラー ラックにチューブを挿入します。チューブの数が奇数がある場合は、バランス チューブを追加します。
- ローラーについてでローラー ラックを回す 35 ° C のローラー インキュベーターでラックを配置 10 13 RPH (図 4E)。チューブの底に培地を維持、インキュベーターの傾きは、ボード上のフロントを上げることによって約 5 ° をバックアップします。
- スライス トリートメントや観測の日付のすべての情報を記録に使用されるスプレッドシートにスライスと管の番号を入力します。
- 上約文化では、6 日目は、各管にアクティブ プラスミンの 1 μ L (0.002 U) を追加。
- 血栓が完全に溶解した後 (通常数時間以内)、メディアを取り出して、プラスミンせず新鮮な媒体を置き換えます。必要であればスライスをプラスミンで夜通し孵化することができ、媒体変更次の日。
- スライスは、通常の実験で使用する前に、少なくとも 7-10 日間孵化します。培地を吸引し、7 日目とその後 7 日ごとに再び 3 または 4 日に換えます。
5. 遺伝子発現ウイルスベクターの準備
注: スライス培養神経細胞における遺伝子の発現により遺伝子組み換え齧歯類から脳を使用してか、遺伝子を導入することにより組換え複製欠損ウイルスによる感染。(AV) アデノ ウイルス、アデノ随伴ウイルス (AAV) および組換えレンチ ウイルスのベクトルがすべてで使用されて私たちの海馬スライス培養脳スライスのキメラを異なる蛍光タンパク質の発現。
- 13,14法によると利息の RNA を表現するため欠乏 AV は別記レプリケーションの準備します。価としてウイルス発現蛋白に対する抗体を用いたシリアル希釈法による感染 U/mL にウイルス説明14。コフィリン集計およびコフィリン アクチン ロッド形成を観察するには、コフィリン R21Q mRFP cDNA (プラスミド #51279)16を利用します。
注: サイトメガロ ウイルス プロモーターは多くの細胞タイプ13で高発現レベルを駆動するために役に立つに対し、synapsin 1 プロモーターは神経細胞特異的発現15に最適です。 - 興味の遺伝子を含むプラスミドと担当者/キャップ プラスミド、ヘルパー プラスミドの有無は転送の共トランスフェクションによる AAV を上記17,18としてウイルス E1 遺伝子を供給する HEK293 包装セルに準備します。
注: 組換え AAV は、ターゲット ホスト細胞ゲノム19挿入用も作ることが。転送プラスミド C 末端 mRFP1 蛍光タンパク質タグ (プラスミド #50856) synapsin プロモーターを含む AAV プラスミド下流からカルシウム センサー GCaMP5G20にクローン人間コフィリン 1 を使用します。P2A 割自己ペプチッド シーケンスを符号化する DNA の断片が GCaMP5G とコフィリン RFP の PCR による単一 AAV トラン スクリプト21から両方の蛋白質の表現を提供するために転送プラスミッドの準備の間に挿入されます。 - 遺伝子または分割ウイルス ギャグやポル、rev、vsv g 遺伝子上に混合物を包装第 3 世代レンチ ウイルスと共に、関心と統合信号の cDNA を含む伝達プラスミドの共トランスフェクションによる組換えレンチ ウイルスのベクトルを準備します。3 つの独立したプラスミド22,23。
- 転送プラスミド シングル ステップ システム24のクローン作成を使用して synapsin プロモーターとコフィリン R21Q mRFP cDNA (プラスミド #51279) から pLKO.1 GFP (プラスミド #30323) を synapsin のプロモーターとコフィリン-R21Q-mRFP、hPGK の交換にまとめるプロモーターと GFP cDNA、それぞれ。
- 使って、最終的なプラスミド HEK293T 細胞にカルシウム リン酸によって前述23として。
- 10 cm の 4 つの料理から媒体を収集、150 K カットオフ遠心コンセントレーターを使用して 500 μ L に集中およびクイック液体窒素で凍結後、小さい因数で-80 ° C で最終的なレンチ ウイルスを保存します。細胞に感染した 1 回だけ因数を解凍します。
- 各型のウイルス量は感染後ウイルスの様々 なボリュームと、遺伝子の表現に従う文化別のスライス数を設定して必要な式の程度を達成するために準備を経験的決定します。
注: 通常、ウイルスの 1-10 μ L は、1 スライス当たり使用されます。
6. スライス トリートメント
- ウイルスに感染しているスライス
- ベクトルの適切な生物学的安全性レベルのウイルス仕事のため承認された生物学的安全キャビネットでの作業、ウイルス (通常 1-10 μ L) の因数を 0.8 mL の完全培に混ぜてください。
- 漂白剤を含むコレクション トラップに滅菌パスツール ピペットを使用してスライスから培地を吸引します。最初のトラップと真空源間二次トラップを使用常にします。
- この媒体に置き換えて実施上ウイルス含む因数、ラックに培養管を戻り、インキュベーターに配置。
- ウイルスの生物学的安全キャビネットとスライスの培養の 2-5 日後転送滅菌ピペットでウイルスを含んでいる媒体を削除し、ウイルスを殺すために承認された抗ウイルス剤が含まれているボトルに入れます。
- 重要な染料とニューロンの染色
- 準備しクイック因数 100 μ M の濃度で液体窒素中で凍結 4 μ L で神経の重要な色素25の因数を格納し、-20 ° C でこれらを格納ないフリーズ/フリーズ解除染料 2 回以上。
- ラベルの蛍光顕微鏡による可視化のためのニューロン、神経の重要な染料の 1 つの因数を解凍し、完全 Neurobasal 培地で 4 mL に希釈する (最終的な色素の濃度は 100 nM)。
- 誤嚥によって (または転送ピペットの中にウイルスが含まれている場合)、スライスからメディアを取り出して、0.8 ml 100 nM の神経の重要な染料を含む培地の交換します。スライスをインキュベーターのローラー装置に戻ります。
- 2 h のスライスをインキュベート後色素含有培地を吸引し、0.8 mL の生物学的安全キャビネットで新鮮な完全培と置き換えます。
注: 分類の重要な染料を使用してスライスにおける神経細胞の培養のいくつかの時間が必要です。最初の画像は通常、色素治療後 24 時間を取られます。ニューロンにラベルを付ける特に神経イメージングよりを与えるため 2-3 日間の下落背景の蛍光性があります。72 時間後重要な染料の強度が低下します。 - スライス形態変化を時間の経過に従って、スライスごとに 7 日間のラベルを書き換えます。
7. スライス画像
- 倒立顕微鏡上のスライスを表示します。明るい蛍光イメージング、イメージング、前に 24 h のフェノールレッド pH インジケーターせず完全 Neurobasal A 培地と培養液を交換します。
注: にとってはここで報告した実験、スライスは線形エンコードを搭載した倒立回転のディスク共焦点レーザー蛍光顕微鏡で見ている x, y ステージ ピエゾ z コントロールと敏感な高解像度デジタル カメラ。 - ローラ管装置から、coverslip を垂直に保つためにステージ アダプター (図 5B) に配置されている特注チューブ ホルダー (図 5A) にイメージを作成するスライス培養管を転送します。目的および長い間隔で反復的なイメージング セッション中に同じ方向にスライスを維持します。
- ステージ アダプター (図 5B) の位置に管を保持するためにチューブに対してタイトなスライダーにプッシュします。
注: チューブ ホルダーの詳細ステージ アダプターとヒーターにアクセスできる: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/。
注: これらのオフ設定位置基準マークから許可スライスのイメージを作成するとき、同じ coverslip 場所の一貫性のある特定元 x, y 基準マークの設定変更されてもいつチューブまたはステージ アダプター取り外して交換します。
注: 画像は一般サイズと画像特徴の目的の解像度に応じて、2 μ m の 0.5 μ m の間隔で取得されます。品質の 3 D 画像を構築する必要がありますイメージ機能拡張買収、複数の平面上の小さな機能を視覚化するより小さい間隔、平面間で必要な。
注: ほとんどのイメージング セッション報告ここで 18 分/スライスの下にあった。ただし、回数とも、以上のいくつかのスライスをイメージしてスライスの長期的な生存率の明らかな害がなく、単一のセッションで 40 分と長い。
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Representative Results
フィディシャル マークを正確にどのように判断に活用できる時間をかけて同じフィールド内で同じセルを減らせる、フォトエッチング coverslips (図 6A) 上に成長したスライスを調べた。ニューロンは重要な染料との汚損によって視覚化された (100 nM の 2 h のため非神経細胞に染色されません)、25の細胞を傷つけることがなく時間をかけてニューロンから消えます。我々 識別する基準ラベル付け後に重要な色素標識細胞 24 h の領域を見つけた 1 つのグリッドの正方形 (図 6A, B) でマーク記録 x と y オフセット基準マーク (図 6B) からの位置および収集60 × 対物 4 日間連続でイメージングを繰り返し、この地域の共焦点画像のスタックを使用してください。同じ場所で撮影した 30 μ m の画像のスタックの最大投影画像 (図 6C F) のとおりです。地域内で発生するいくつかの形態学的変化が 4 日間で、(いくつかのマークが) 同一のセルを時間をかけて続くことができます。重要な染料の蛍光強度が時間の経過とともに減少したが、ニューロンがまだラベル付け後 4 日間明確に識別できます。神経の重要な染料の蛍光性のほとんどは、細胞質内で拡散反射光が常に観察されたいくつかの点状染色より顕著になった蛍光減少を背景として。不健康なスライスでは、悪化のスライスとして非神経細胞の点状染色は観察されたも。これらの結果は、それらを見つけるに基準マークを使用して、スライス内の特定のセルすることができます繰り返しイメージ化されることを示します。
長期間培養神経組織のスライス内で生存率の経時変化を調べると、我々 後同じスライス 5 週間以上神経重要な色素イメージングの前に 24 時間を週に 1 回使用してラベル付けします。数週間にわたってこの重要な染料と染色の複数のラウンドは、集計の蓄積を増加しました。プラズマの塊は、まだ新鮮なメッキのスライス内のニューロンは染付読み込まれ 1 日体外(1 DIV) でイメージします。5 週間のため再び毎週同じスライスをイメージしました。4 x 目的と 1 つのスライスから得られる画像 (図 7A ~ E) のとおりです。CA と DG の領域の錐体細胞層が 488 nm、蛍光発光の測定で興奮すると付きます明るく > 620 nm。19 スライスを観察 5 週間にわたって、3 つのスライスは、coverslip オフ来たと他の 2 つは彼らの典型的な形態を失い、不透明になった彼らの死を示す。したがって、実験の約 70% の生存率を考慮すべきと分析のための十分な数を確保するために余分なスライスを準備します。300 μ m の組織のチョッパーで公称厚さ設定のスライスを作製した.文化の 5 週間後イメージング神経の回転のディスク共焦点顕微鏡の 40 X 石油目的のスライスをアップ coverslip から染色スライスを重要なによってスライス厚を測定しました。257 の平均でニューロンの焦点の損失が発生しました nm (n = 5 スライス スライスごとに使用される複数の場所で)、メッキの時から発生していたそのスライスの薄毛のほとんどを示します。我々 可能性がありますいない正確に測定スライス厚蛍光顕微鏡による凝固血漿中重要な染料を与えたびまん性蛍光フォーカスの喪失が発生した位置を正確に測定し難いのでメッキの時。しかし、プラズマの塊が削除された後、スライス内のニューロンの 3 D 画像はスライスで簡単に得られます。図 7F、低倍率で表示される 21 の DIV のスライスを共焦点顕微鏡 (1 μ m ステップ) 60 × 対物と神経の重要な染料とロードした後 3 日をイメージしました。60 μ m の 3 D 画像は、焦点面 (図 7G) から構築されました。ニューロンと重要な染料が付いていますその突起プロセスは、3 D で続くことができます。スライスの 3 D 構造と形態が少なくとも 3 ヶ月間、手入れの行き届いた、最長時間は、現在の研究で使用されました。
いくつかのスライスでも以前イメージ位置の形態に大きな変化が発生しました場所をかかることがあります、coverslip のスライスの動きを示唆しています。確かに、イメージングの長い間隔上イメージング対象フィールドのセルが以前のイメージング セッションで観察されたものと同じ確実に把握が難しくなった。したがって、毎週 4 週間 (図 8) にまたがる 60 × 対物と同じ位置につけた重要な色素標識スライスの共焦点スタックの最大投影像を示す神経細胞生存率がよく維持されているが、それはセッションの間長い時間間隔で画像を取得するとき時間をかけて特定のニューロンを識別することは困難。おそらく複数 fluorophores が付いている分類されるセルのパターンは、画像のスタックのスクロールで観察するとローカライズされたグループ内のセルより簡単に認識されているでしょう。
海馬のニューロンにおける外来遺伝子の導入のための別のウイルスのベクトルの有用性を評価するために AV、AAV、および組換えレンチウイルスベクター、それぞれ異なる蛍光タグを表現するまたはを使用して使用してスライス感染性を比較しました。ドライブ式に異なるプロモーター。AV (2 x 107感染 U/スライス) coverslips に培養の 9 週間をされていたマウス海馬スライスの感染に使用された強力な非細胞特定の CMV プロモーターの背後にあるコフィリン mRFP を表現します。5 日後感染、周囲スライス 4 × 対物 (図 9A) で観測された最も強烈な表現でスライス全体コフィリン mRFP の表現が見つかった。コフィリン mRFP を表現するスライス内のセルは、20 × 対物 (図 9B) いくつかの明るい点状染色による観察もとも神経および非神経細胞における発現を拡散します。文化 (感染後 8 週間) で 17 週間後自発コフィリン棒は、おそらく野生型コフィリン mRFP (図 9C)26,27の過剰発現によるいくつかの細胞で形成していた。
また実証した AAV (1010粒子) はスライスで表現される可能性があります。神経特定 synapsin プロモーターが21翻訳のエンベロープタンパク質のリンカーの自己切断の P2A ペプチッド シーケンスを持つ GCaMP5 コフィリン mRFP の式を行なった AAV と文化 9 週間で感染したスライスの画像がキャプチャされた 8週間後感染 (文化で 17 週間)。GCaMP5 とコフィリン mRFP を表現するニューロン、いくつかコフィリン棒/集計は、(図 9D F) を結成しました。ロッド/凝集体の蛍光強度は完全な飽和せず拡散反射光のコフィリン mRFP の非常に小さな蛍光を観察できる、強力なされ、棒のコフィリン蛍光画像の開花。自発コフィリン棒は、ニューロンの野生型コフィリン蛍光タンパク質キメラ同様持っているされて過剰発現26,27, ニューロン10を強調したに表示されます。感染14 AAV 価を決定するために使用される粒子の数に基づいて決定される、アデノ ウイルスの抗体に基づく AAV の 100 を 500 倍より高い粒子数は約同じ感染を入手する必要が/スライスの AV と比較しての式
スライスの蛍光蛋白質の組換えレンチ ウイルスによる発現に従う、スライスは 1、3、10、6 DIV と神経細胞の特異的発現 (synapsin プロモーター) コフィリン-R21Q-mRFP の組換えレンチ ウイルスの 30 μ 因数で感染していたライブセル イメージング コフィリン アクチン ロッド形成16として開発。スライスされた 11 DIV で神経の重要な染料が付いたし、染料とコフィリン R21Q mRFP 式 12 と 14 部の特定の地域のイメージ感染ウイルスの 30 μ 因数スライスがイメージングのために存続しなかったが、帳票処理とウイルスの他のボリューム mRFP 発現用量依存性を示した。図 10は、1 μ L と 10 μ L レンチ ウイルス 6 および 8 日後感染での感染のスライスの画像を示しています。2 つの異なるスライスの複数の領域は、共同の重要な染料と mRFP 発現ニューロンの汚損のため定量化されました。スライス 1 μ L レンチ ウイルスの感染、ニューロンの約 28% は感染後 8 日間で 85% に増加し 6 日後感染症で mRFP を表されます。スライス 10 μ L レンチ ウイルスの感染、ニューロンの約 58% mRFP 6 日感染後、感染後 8 日 86% 増で表されます。したがって、1 μ L、レンチ ウイルスは、感染後 8 日間で広範なスライス感染およびニューロンにおける発現を提供するのに十分だった。
未処理または処理濃度文化システムがコフィリン病理学の次の開発に役立つことを示すために、スライス コフィリン-R21Q-mRFP ニューロンを表現するためのレンチ ウイルスに感染が残っていた (1 μ M、333 nM と 100 nM) のフォームのオリゴマーの28までのインキュベーションを受けていた合成人間 a β タンパク質。前の調査からの結果を示したその合成 a βoコフィリン アクチン解離海馬ニューロン29,30,31の 25% まで棒を誘導します。すべての車両 (制御) のスライスし、333 と治療それらに対し a β の 1 μ M の濃度で扱われるすべての 3 つのスライスが最初の 24 時間で coverslip から緩んだ nM と 100 nM a β 濃度を生き延びた彼らは続いていた 2 週間。地域に携帯電話、同じ (CA1、CA3, DG) 100 nM a βoと扱われるスライスされた数日間 (60 x 目標) をイメージします。6 DIV cofilinR21Q mRFP を駆動 synapsin を表現するためのレンチ ウイルスで感染していたコントロールのスライスは、15 DIV (図 11A) によってびまん性細胞 mRFP 表情をしていた。スライス 14 DIV で 100 nM a βoにさらされているし、15 DIV でイメージを示したコフィリン R21Q mRFP 分布なった点状、両方の棒状の構造と集計 (図 11B) に登場します。これらの構造 a β 治療 (図 11C図 11Bとしてセルの同じフィールドである) 後 6 日間さらにもっと顕著になった。多くの場所で神経突起で豊富な神経細胞の細胞体がある (図 11D) 欠席 cofilinR21Q mRFP の点状とロッドのような配列を開発 (図 11Cの矢印)、コフィリン アクチンの分布に似ていますロッドは、文化29,30,31a β 治療ニューロンの神経突起内で以前報告しました。したがって、養殖と海馬スライス標本を観察することのこの新しい方法は、容易にし、開発のさまざまな段階でどのコフィリンの集約とロッド フォームのセルの長期的な生存率および病理学の可逆性を決定するユーザーブロックか、逆に体内よりコフィリン病理形成する試薬での用量-反応測定実行-細胞組織のように。
図 1:ローラー管ラックの準備。(A) 15 cm 培養皿の底を掘削の穴の位置をマーキングのテンプレートです。図を示すスケール バーのサイズに印刷すると場合を切り取り、示すように穴をあけるための 15 cm 培養皿の位置をマークするために使用することができます。(B) 2 つの管の挿入でローラー管ラックを完了します。ラックの上に簡単に表示ステッカー上にラックごとの番号です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: ローラーの培養管の準備。チューブに 6 mm の穴をあけるためのドリル出版物の治具で挿入ローラー管 (A) 正面します。破線は、治具フラット両面ローラー チューブの位置を示しています。(B) 端を挿入チューブと治具の表示およびドリル刃穴に整列します。(C) うちローラ チューブに 6 mm のドリルで穴あけ用の治具の穴の平面図です。白い矢印はチューブを位置決め停止として挿入カット爪の位置を示し、黒の二重線は、ビットの配置。掘削時クリップ (黒矢印) に治具の下に安全にインストールは、位置にそれを保持 (D) 春のチューブします。(E) エッジがスムージング バリ取りツールで穴を掘削、溝、穴 (穴は解剖顕微鏡を通して見たはめ込み番組) の内側にカット後チューブ回転中に穴から中規模排水を図る。(F) 文化は、coverslip の接続するシリコーン系の粘着剤で穴に整列穴チューブします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3:海馬脳スライスの準備。解剖顕微鏡表示で撮影した写真: (A) そのままマウス脳。前脳や小脳を削除するカットの位置は、青の破線として表示されます。(B) 前脳や小脳の取り外しの後。Bから脳の (C) 部分は、上向き (小脳) に向かって後方地域で 90 ° を反転します。皿の横部分を位置決め残りの海馬、視床と視床下部からからかわれることがでく中脳 (青い破線円) の除去に役立ちます。鉗子 (青の破線) で 2 つのカットは、平らに広がることの両方の半球から海馬を含む残りの部分を許可します。海馬の割れ目 (青い矢印) に沿って走る血管を表示 (D) 平坦化された脳作品。この組織は、プラスチック フィルム上に配置、破線の方向にスライスするため組織チョッパーに転送。(E) GBSS/グルコースに戻される後半分のより少し多くの海馬を示す組織をスライスします。(F) 最終的な郭清の海馬と海馬 - 材料を除去するスライスの清掃します。最終的なクリーンアップした後 (G) いくつか浮動スライス。(H) coverslip に転送するための 1 つのスライスの拡大写真。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4:メッキ、インキュベーター スライス。(A) A マウス海馬スライスは鉗子の先端を使用してソリューションから無料それを持ち上げるを助けるヘラの先端の培養皿から削除されます。(B) スライス、フォトエッチングの中心部に平らに配置鶏プラズマの 2 μ L で 12 mm coverslip を扱うし、血栓を生成するプラズマ/トロンビン 1:1 混合物のもう一つの 2.5 μ L を追加しました。(C) 血栓を設定した後 (約 1-2 分)、カバーがローラ チューブにシリコーン ゴム粘着サークルから削除され、中心穴に血栓と、coverslip の配置その後、coverslip は押された親指の場所であり、(D) 追加 0.8 mL の完全培地の約 1 分の位置で開催されました。(E) ローラー管チューブの下部に媒体を保つために 5 ° 傾斜に前面を大型ローラー インキュベーター内部ホルダー。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5:ローラー チューブ ホルダーとステージ プレート インキュベータ。(A) イメージングのための位置に、coverslip を維持するようにチューブを配置するチューブ ホルダー。(B) チューブ ホルダー マウント顕微鏡ステージ アダプター プレートで。側にスライダーは、イメージング用安全チューブを保持します。(C) ステージのチューブ ホルダーと側面パネルを持つアダプター追加含む暖房ストリップ熱電温度コント ローラーに接続します。チューブがマウントされ、配置されて、一度ボックスに固体上はイメージ投射の間の温度を維持するために追加できます。オレンジ色の線は、熱電対のリードです。計画ではデザインとステージ アダプターおよびヒーターの建物: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/。 この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 同じ細胞の反復的なイメージング、フィデューシャル マークを使用します。(A) 海馬スライス subiculum 展開 (尾) とフォトエッチング (1 mm の正方形) 上客観的および明るいフィールド照明 × 4 で閲覧。プラスチック製のローラーの管の曲率は、グリッドの可視化を高める斜光を作成できます。60 X フィールドのサイズと位置が示されます。(B) A 広場 34 から 4 の一番下の先端と同じ基準のマークを見つけるための 20 × 対物と同じスライスの表示。Y と x のオフセットが再現性をもって高い倍率の共焦点レーザー顕微鏡の目的のボックスの中心の位置に表示されます。(C-F)60 x 目的を使用して、4 日間連続 (14-17 部) で 30 μ m の投影像を作る 13 DIV をイメージしました神経の重要な染料の付いたスライス。同一の細胞は、毎日をイメージしました。それぞれ 3 個のニューロンの内核の位置は、別のシンボルで示されます。彼らはより簡単に、3 D 位置変更として若干画像のスタックをスクロールによって識別されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: 神経の重要な染料とスライスのニューロンをイメージングします。凝固血漿 4 X 目的とめっき後 24 h を撮影でスライスを染色 (A) 神経の重要な染料。染料 (100 nM) スライスされた最初ローラー チューブ ホルダーに装着し、2 h 後洗浄を追加しました。Subiculum 血栓で海馬に巻き付けます。(B-E)6 DIV に追加プラスミンによる血栓溶解、次スライスは重要な染料の毎週のイメージングの前に 24 h で 5 回を再読み込みされました。8、21、28、35 DIV で示されている画像を集めた (B-E、それぞれ)。(F) 海馬スライス培養 3 週間と 4 × 対物のイメージングの前に 24 時間神経重要な染料で染色します。(G) F 1 μ m 間隔で 61 飛行機の 3 D ビュー表示のように同じスライス上のイメージの共焦点スタック。ニューロンの神経突起と細胞体の両方重要な染料が明確にラベルしますが、核からは除外です。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 8:イメージングのスライスの 1 つの場所でニューロンの 4 週間にわたって繰り返し。12、20、30、40 で撮影された重要な色素標識スライスから (位置決め) による細胞の同じフィールドの 30 μ m 共焦点画像のスタックの最大投影像 (A-D、それぞれ)。繰り返し投影像に長い時間フレーム上の個々 のセルを識別することは困難です。ただし、これらの長い期間にわたっても画像のスタックをスクロールして同じ細胞の同定が可能な多くの場合や 3 D 画像を構築することができます回転図 7Gのように、キーを押します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 9:ウイルスによる発現と蛍光タンパク質のイメージング。(A) 海馬スライス 9 週間培養し、CMV プロモーターの背後にあるコフィリン mRFP を表現するためのアデノ ウィルスに感染しています。感染後 5 日でスライス全体表現が見つかりましたが、蛍光がスライス周辺近く明るかった。(B) 同じスライスは、深い 20 × 対物で表示した場合のスライス内のセルの式を示した。画像は 20 枚の画像のスタックからの投射は 2 μ m 離れて間隔です。(C) 同じスライス文化 (感染後 8 週間) で 17 週間後検討し、40 X 目的で撮影した 23 の画像、3 μ m 離れて、70 μ m スタックからこの投影画像に見られるように、コフィリン mRFP は棒状の集計で観察されました。(D-F)マウス海馬スライス、AAV を表現する GCaMP5 - 文化 9 週間で感染 (P2A) - コフィリン - mRFP synapsin プロモーターの背後にあります。蛍光は、10 日後赤と緑のチャンネルに表示されていた。多くのコフィリン含むロッド、および (F) オーバーレイ イメージ カルシウム敏感な記者、(E) (D) GCaMP5 の発現を示すスライスの 1 つの平面イメージ。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 10: コフィリン-R21Q-mRFP 組換えレンチウイルスベクターを感染細胞における synapsin プロモーターによる発現。弱い蛍光信号の検出はウイルスの 10 μ L を使用して 3-4 日後感染についてのによって最初に観察された、60 x 目的で取得したこれらの画像に見られるように 5-6 日、(E) によって使用可能になります。ウイルスの 1 μ L での表現の同じレベルを達成するために時間がかかるが 8 日後感染によってニューロン (重要な染料ラベル) のような高い割合を表現していたコフィリン R21Q mRFP。1 μ L (A, B) で感染 6 日後で mRFP 蛍光陽性ニューロンの 27% だけであったが、これは 8 日 (C, D) を 85% 増します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 11:マウス海馬スライスにおける a β オリゴマーによるコフィリン病理学。30 μ m のイメージとして撮影したすべての画像は 60 x 目的とスタックし、最大投影画像として表示されます。スライスされたコフィリン R21Q mRFP 6 感染部 15 (A) DIV スライス処理車 (DMSO/ハム F12 中 a βoを生成するために使用) と 14 部。(B) スライス 15 DIV が 100 nM a βoと扱われます。(C) B 20 DIV で撮影し、神経の重要な染料ラベルとオーバーレイとして (D) に示すように同じフィールド。矢印は、神経突起がいくつかの細胞体を含むスライスの領域でコフィリン集計および棒の線形配列を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
ここで説明したロール チューブ法は、長期培養とスライスした脳組織の高解像度のライブ イメージングします。ここで適用されるのスライス技術で一つの大きな問題は、取り付けとスライスのメンテナンスです。スライス接着をサポート Coverslip コーティング促進神経突起の伸長と細胞のスライスからの移動を高めることによってスライスが薄くなります。したがって、我々 はこれらの基板の使用を避けた。3-アミノプロピルトリエトキシシラン処理によるガラス上にアミノ基の挿入改善、スライスの付着が少なすぎる、またはあまりにも多く、coverslip 鶏プラズマもスライスの損失につながる遵守問題が発生します。適切な接着に必要な血漿量培養脳スライスのサイズに依存して、したがって、マウス脳切片よりも周辺地域で約 4 倍、ラット海馬スライス用大きく。あまりにも多くのプラズマは、スライスの下凝固、細胞接着、coverslip が障害、プラスミン治療は位置を変更または完全にデタッチするのでスライスを緩め。ただし、血栓のあまりにも小さなプラズマは、インキュベーターの回転の最初の数日中にスライス損失につながる可能性があります。39 スライスを含む最近の実験、3 つは失われたが、失われたもののいくつかはスライスの処理中に発生したスライス損害起因した可能性があります。それにもかかわらず、我々 は通常、実験に必要な複数のスライス数の推定値よりも約 50% を準備します。文化の問題の 2 番目の主要な原因は、coverslip シールの周囲媒体の流出です。この問題は coverslips されていないしっかりと少なくとも 1 分の位置にシールを貼付して後のさらに悪化します。最も可能性の高い圧力を適用するために使用する親指からの熱接着を完了ことができます。行われている漏れは解剖顕微鏡で観察することができます coverslip の下で小さな空気チャネルを介して多くの場合です。これらは通常長期にわたる親指圧力を使用する時に消えます。遅い漏出による文化の約 2% の損失が期待できるので、ウイルス感染を実行する前に、カルチャを設定した後の 10 日を待つお勧めです.過剰な親指圧力、coverslip で均等に生成された場合に特には、亀裂に coverslip もあります。破損が問題で、インキュベーターで暖められたゴム製マウスパッドにフラット ダウン チューブを押して、coverslip の間でより均等に力を提供するために役立つかもしれない。
前述の脳スライス培養 (オープン システム) の気液界面膜や密閉されたプラスチック製のチューブ (閉鎖系) 内部のガラス基板上のメソッドが非常に効果的な長期的なスライスの生存のため、それぞれの方法に長所があり、弱点。空気液体界面膜スライス培養高解像度イメージング7の浸漬の目的で結合された電気生理学的に有利な検索のための細胞の正確なフィールドに関して欠点があります。ウイルスを介した遺伝子発現を使用するとき客観的汚染と潜在的なユーザーの露光時間でイメージの再作成。ウイルスの遺伝子の表現のための使用はより安全で簡単にクローズド システムで実行する顕微鏡対物レンズの汚染が問題ではないです。ご変更されたローラー管法は電気生理学的研究に従順でないがスライスの高分解能イメージングのためのアクセスを提供します。
スライス培養条件2の齧歯動物の脳の多くの地域に確立されているが、最も広く研究脳領域の一つだし、の研究で注目されている海馬に変更されるための唯一の海馬の利用ここ認知障害。CA と DG の領域の錐体細胞層文化で数週間にわたって、組織を維持し、形態は容易に観察することができます。神経細胞生存率および日ヶ月の期間にわたって海馬スライス内の組織の監視に使用することができます、また蛍光特性には、新しく開発された蛍光神経性マーカー25を利用して他の多くの蛍光タンパク質や記者の使用と互換性があります。NeuO でで 488 nm および測定の放出の刺激我々 NeuO 蛍光25の最善ではないが > 617 nm。フォトエッチング coverslips に基準マークは文化の多くの日にわたって繰り返し同じセルを検索を助け、イメージ スライスの同じ領域に何週間もかけてできました。事実上重要なスライスの間伐で行われていないガラス coverslips 文化、スライス厚測定を得る最長の時点で 5 週の間に。
組換えレンチ ウイルスのベクトル、AAV、AV スライスにおける外来遺伝子を表現するために働きます。神経細胞特異的プロモーターのレンチ ウイルスは非常に高い割合の式を取得する場合に役立ちます (> 85%) 感染後 8 日間以内のニューロンの。さらに、スライス培養で人間広告10,11と a β の過剰発現マウス広告モデル32認知障害の開発に関連付けられているコフィリン アクチン ロッド病理を監視できることを示す比較的低濃度 (100 nM) の合成人間 a βo。コフィリン アクチン ロッド病理学および/または多くの神経疾患33で発生する正しい樹状突起スパイン異常を逆に新しい治療を特徴付けるこのメソッドの将来のアプリケーションを含めることを思い描いています。
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
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