Summary
Hier is een gemodificeerde roller buis methode voor het kweken en intermitterende high-resolution beeldvorming van knaagdier hersenen plakjes vele weken met precieze herpositionering op photoetched coverslips. Neuronale levensvatbaarheid en morfologie van het segment zijn goed onderhouden. Toepassingen van deze volledig gesloten systeem met virussen voor celtype specifieke expressie worden geleverd.
Abstract
Gekweekte knaagdier hersenen segmenten zijn handig voor het bestuderen van de cellulaire en moleculaire werking van neuronen en glia in een omgeving die veel van hun normale in-vivo -interacties onderhoudt. Segmenten die zijn verkregen uit een verscheidenheid van transgene muis lijnen of gebruik van virale vectoren voor expressie van fluorescently tagged proteïnen of verslaggevers in wild type hersenen segmenten toestaan voor hoge resolutie beeldvorming door fluorescentie microscopie. Hoewel verschillende methoden zijn ontwikkeld voor de beeldvorming van de hersenen segmenten, segment cultuur te combineren met de mogelijkheid voor het uitvoeren van heeft repetitieve high-resolution beeldvorming van specifieke cellen in levende segmenten over lange perioden problemen opgeleverd. Dit is vooral waar wanneer virale vectoren worden gebruikt voor de expressie van exogene eiwitten omdat dit het best in een gesloten systeem gebeurt ter bescherming van gebruikers en voorkoming van kruisbesmetting. Eenvoudige modificaties aan de roller buis hersenen segment cultuur methode die voor de repetitieve high-resolution beeldvorming van segmenten in vele weken in een gesloten systeem zorgen worden gemeld. Het kweken van segmenten op photoetched coverslips staat het gebruik van fiducial merken snel en nauwkeurig verplaatsen in het werkgebied naar het identiek veld image na verloop van tijd vóór en na verschillende behandelingen. Voorbeelden staan voor het gebruik van deze methode in combinatie met specifieke neuronale kleuring en meningsuiting te observeren van veranderingen in het hippocampal segment platform, virale-gemedieerde neuronale expressie van fluorescente proteïnen en de ontwikkeling van cofilin pathologie, die werd eerder waargenomen in de hippocampus de ziekte van Alzheimer (AD) in reactie op de behandeling van het segment met oligomeren van amyloid-β (Aβ) peptide.
Introduction
Primaire cultuur van gedissocieerde neuronen uit regio's van knaagdier hersenen is een belangrijk instrument dat wordt gebruikt door onderzoekers te observeren van de reacties op pathologically betrokken prikkels. Dergelijke studies hebben echter het nadeel van neuronen in enige 2D en zonder hun gliale steunregeling kijken. Bovendien, tenzij geteeld onder omstandigheden van zeer hoge dichtheid (640 neuronen/mm2 of ongeveer 16% van de oppervlakte) waarin het onmogelijk is te volgen de willekeurige uitvloeisel van een dendriet of axon voor meer dan een korte afstand van de cel lichaam, hippocampal neuronale levensvatbaarheid daalt meer dan 4 weken aanzienlijk1, beperking van het gebruik van gedissocieerde culturen voor uitgebreide studies van leeftijdsgebonden aandoeningen. Het kweken van segmenten van knaagdier hersenen bereid is een aantrekkelijke optie die deze beperkingen overwint door het behoud van een georganiseerde cel architectuur en levensvatbaarheid voor weken of maanden. Voorwaarden voor het behoud van vele verschillende regio's van knaagdier hersenen in segment cultuur geweest beschreven2.
Twee methoden worden veel gebruikt voor langetermijnkweek van hersenen segmenten: kweken op membranen op de lucht-liquid interface3 of kweken op coverslips in verzegelde buizen kan draaien in een incubator van de roller om beluchting4. Segmenten gekweekt op membranen kunnen rechtstreeks worden beeld met hoge-resolutie fluorescentie microscopie via een rechtop Microscoop en water onderdompeling doelstellingen5. Als alternatief, plakjes gekweekt op membranen zijn overgedragen aan glazen bodem gerechten om goede oplossing van dendritische spines met behulp van een omgekeerde Microscoop6te bereiken. Echter zijn beide methoden van imaging segmenten geteeld op membranen open systemen die vereisen middellange wijzigingen en vaak Antimycoticum en/of antibiotica te gebruiken om te voorkomen of verminderen van verontreiniging5,6. Segmenten op een membraan op de lucht-medium-interface onderhouden uitstekende morfologie en overleving, maar terug te keren naar exacte locaties tijdens herhaalde beeldvorming bij hoge vergroting is uiterst moeilijk, tenzij het experiment alleen kleine groepen van cellen volgt geeft uiting aan een fluorescerende marker. Hoewel segmenten geteeld op membranen zijn gebruikt met virale-gemedieerde expressie van transgenen5,6, vereist bioveiligheid protocollen een gesloten cultuur-systeem worden gebruikt voor bepaalde virale vectoren die worden gebruikt voor uitdrukken van fluorescently geëtiketteerde eiwitten en verslaggevers van celfysiologie. Bovendien vereisen de onderdompeling doelstellingen decontaminatie tussen monsters die wordt gevolgd in cultuur5. Een belangrijke toepassing van membraan interface culturen is het combineren van high-resolution beeldbewerking met electrofysiologie op keer punten7.
De roller buis methode met coverslips in de kunststof buis niet elke electrofysiologie of hoge resolutie imaging zonder het verwijderen van het dekglaasje aan toe. Dus, deze methode is meestal vereffend langetermijnstudies waarin na fixatie opmerkingen hebben gesteld8. Hier wordt beschreven, is een methode die maakt gebruik van de roller techniek voor de cultuur van de buis maar op geboord-out buizen met plakjes op coverslips die herhaaldelijk beeld kan worden voor zo lang als de culturen worden gehandhaafd. Het gesloten systeem vereist geen middellange verandering voor imaging en maakt gebruik van photoetched coverslips om fiducial merken waarmee imaging op hoge vergroting, na dagen of weken, de precieze velden eerder beeld.
Wij hanteren deze methode te onderzoeken van wijzigingen in het knaagdier zeepaardje, een grote hersenen regio betrokken bij geheugen en leren. De knaagdieren hippocampus is vaak bestudeerd als een model voor pathologische of leeftijd-gerelateerde veranderingen waargenomen tijdens de ontwikkeling van cognitieve stoornissen9, zoals die zich in AD voordoen. Onze methode is bijzonder goed geschikt voor het bestuderen van pathologische veranderingen die zich binnen een enkel sneetje na verloop van tijd in reactie op veranderingen in het milieu, zoals verhogingen in Aβ peptides ontwikkelen, die is kenmerkend voor AD8. Een pathologie, gekoppeld aan menselijke en knaagdier AD brein is de aanwezigheid van cofilin-actine aggregaten en staven, de laatste met bundels van filamenten waarin cofilin en actine zijn in een 1:1 verhouding van de molaire10,11,, 12. staven zijn waargenomen in vaste segmenten van rat hippocampus na Aβ behandeling, alsmede binnen een segment van de levende knaagdieren hersenen cofilin-GFP onderworpen aan hypoxie8uitdrukken, en zij kunnen bijdragen tot de synaptische dysfunctie gezien in AD en beroerte. Hier gebruiken we deze nieuwe kweken methode om het observeren van het tijdsverloop en de distributie in de segmenten van uitgedrukt exogene chimeer fluorescente proteïnen die leidt door verschillende virussen. Vervolgens gebruiken we de neuronale specifieke uitdrukking van een cofilin verslaggever construct te volgen van de ontwikkeling van cofilin staaf en statistische Pathologie in hippocampal plakjes in reactie op behandeling met oplosbare Aβ oligomeren (Aβo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dierlijke gebruik volgt goedgekeurde fok- en gebruik van de dierlijke protocollen die voldoen aan de Animal Care en gebruiken richtsnoeren van Colorado State University.
Opmerking: Het protocol hieronder de voorbereiding en cultuur wordt methode beschreven voor de langdurige incubatie en intermitterende beeldvorming van hippocampal segmenten. Een enkel hippocampal sneetje is gekoppeld aan een speciaal geprepareerde photoetched dekglaasje aan met behulp van een plasma-clot, en vervolgens de coverslips op de platte kant van een buis geboord-out roller, die wordt onderhouden in een incubator roller zijn verzegeld. Plasma stolsels worden opgelost met Plasmine voordat virale infectie voor fluorescerende eiwit expressie en hoge resolutie beeldbewerking. Een fluorescerend neuronale vitale kleurstof wordt gebruikt om het imago van neuronen binnen de segmenten.
1. voorbereiding van de Roller buis Rack
- Gebruik de sjabloon weergegeven in Figuur 1A afgedrukt naar de grootte weergegeven op de balk van de schaal. Punch met een nagel, kleine gaatjes (groot genoeg voor een fijne punt marker) in de sjabloon die is gecentreerd op de gaten.
- Instellen van de sjabloon op de bodem van een schotel weefselkweek 15 cm (nominale diameter 14 cm) en markeer de positie van de gaten. Herhaal dit op een tweede schotel.
- Met boor bits ontworpen voor gebruik op plastic, boorgaten zes 1,5 cm diameter op elke schotel in een zeshoekig matrix (4,8 cm center-naar-midden) met gat centra 2,5 cm vanaf de rand van de schotel. Boorgaten drie (diameter 3 mm) 12 mm van de rand die equidistantly tussen twee van de grotere gaten zoals aangegeven in Figuur 1Azijn geplaatst.
- Met de bodem van elk gerecht een 2,5-inch lange Machineschroef (3/16 inch diameter) tegenover elkaar, plaats met een vlakke wasmachine via een van de kleine gaatjes, gevolgd door een tweede platte ring, een stuk polyethyleen buis (spacer, 4,7 cm), een andere vlakke sluitring , de tweede weefselkweek schotel, een andere platte ring, een borgring en een moer.
- Herhaal stap 1.4 op de andere twee schroeven van de machine, en aanscherping losjes totdat alle schroeven van de machine aanwezig zijn. Draai daarna de noten veilig.
- De grommets (5/16 inch dik, 5/8 inch gat diameter) werken in de gaten van de schotel van de bodem te verkrijgen van de laatste roller buis rack (Figuur 1B; weergegeven met twee buizen in plaats). Plaats een sticker op elk rack met een uniek nummer.
2. voorbereiding van de Roller buizen en Coverslips
- Het maken van de mal voor het boren van het gat in de roller buizen
- Boor een gat van 1,5 cm 8 cm diep in de centrum-zijde van een 2 x 4 x 5,5 inch houten blok onder een hoek van dergelijke bijna parallel met het blok als ingevoegd dat de platte kant van de roller buis zal worden(Figuur 2).
- Vergroten van het gat met een ronde houten bestand zowel verbreden en het gat zodat de buis inbrengen taps (roller buizen zijn lichtjes grotere diameter in de buurt van het einde van het GLB) (Figuur 2B).
- Boor een verticale gat van 1,5 cm diameter, 5.5 cm vanaf de kant van het blok, en gecentreerd over de kant gat (Figuur 2C).
- Wanneer het gat kant is genoeg tapered, plaatst u een roller-buis die gemarkeerd is als op de gewenste plek te midden van het gat voor het segment en plaats de buis zodat de gemarkeerde plek wordt gecentreerd in het verticale gat van 1,5 cm.
- Verwijder de buis en meet de afstand van de plek aan het einde van de buis. Markeer deze afstand van het centrum van het gat in de mal en invoegen van een nagel om een stop om de juist positie de buis voor het boren (pijl in Figuur 2C).
- Gebruik een ijzerzaag af te snijden de nagel flush met het oppervlak van het hout blok om verwonding te verhinderen.
- Lente clips toevoegen aan de onderkant van de mal als er een boor pers met "slots" die het mogelijk maken om te worden verankerd (Figuur 2D zwarte pijl). Gebruik anders C-klemmen te houden van de mal veilig op de pers van de boor.
- Met behulp van de mal hierboven beschreven om te houden en een platte dubbelzijdige 11 cm kunststof cultuur buis met de platte kant omhoog(Figuur 2)positie, boor een gat van 6 mm diameter met het centrum 1,0 cm vanaf de onderkant en gecentreerd tussen de zijkanten van de buis.
Opmerking: Een boor ontworpen voor plastic moet worden gebruikt. - Met een draaibare deburring tool, de randen van het gat (Figuur 2E) vloeiend en maak 4 groeven aan de binnenkant rand van het gat (Figuur 2E, inset) ter vergemakkelijking van de drainage van het gat tijdens rotatie.
- Met een 12 mm gat punch, gesneden van 12 mm doorsnede schijven van niet-giftige dubbel zijdig zelfklevend silicon rubber bladen. Met behulp van een standaard één papier perforator (6 mm diameter), maak een gat in het midden van elke schijf.
- Spoel de geperforeerde buizen met 70% ethanol, lucht droog ze in een biologische veiligheidskast, en steriliseren van de buizen en de geponste adhesive discs voor 40 minuten onder de UV-lamp (30 W op gemiddelde afstand van 70 cm) in de biologische veiligheid kabinet.
- De buizen en verplaatsen schijven na 20 min zodat alle blootgestelde oppervlakken zijn gesteriliseerd. Onder steriele condities, schil de naturel back-ups maken van een zelfklevende schijf en brengt de silicone rubber aan de buitenkant van een buis, uitlijnen van de gaten (Figuur 2F).
Let op: Om te voorkomen dat UV-blootstelling, Oogbescherming dragen en sluit het kabinet voordat ik overga op de UV-lamp. - Schoon 12 mm diameter photoetched (100 center genummerd 1 mm pleinen) Duitse glas coverslips. Houd de coverslips zachtjes met een tang en duik in absolute ethanol, gevolgd door water, gevolgd door absolute ethanol weer, en ten slotte Dompel de coverslips in een vuurvlam te branden uit de ethanol. Toestaan coverslips om te koelen.
- Houd de coverslips met een tang en duik in de 2% 3-aminopropyltriethoxysilaan in aceton voor 10 s. spoelen de coverslips met ultrazuiver water en laat lucht droog.
- De coverslips instellen op steriele filterpapier binnenkant van een biologische veiligheid kabinet en zet aan de UV licht. Elke zijde van de coverslips gedurende 20 minuten bloot.
Let op: Om te voorkomen dat UV-blootstelling, Oogbescherming dragen en sluit het kabinet voordat ik overga op de UV-lamp.
3. hippocampal Slice voorbereiding
- Voordat u begint de dissectie, kunt u het helften van tweesnijdend Scheermesjes voorbereiden door de weefsel chopper. Vouw de messen in de lengte zorgvuldig met vingers en snap doormidden.
- Spoel het mes helften met aceton met behulp van een wattenstaafje om hen, gevolgd door het spoelen in absolute ethanol schoon en lucht drogen.
Opmerking: Het protocol van de cultuur van het segment van hersenen is onafhankelijk van de muis of rat stam of genotype. Vele transgene muis lijnen met verschillende genetische achtergronden zijn gebruikt.
- Met een tang, houdt u de bijgesneden hersenen posterieure zijde omhoog en de ventrale zijde tegen de zijkant van de petrischaal voor stabiliteit. Zachtjes weg hersenvliezen rond de Sagittaal middellijn plagen en verwijderen van het weefsel van de veroorzaakt met behulp van een fijne pincet voor omver te werpen Dumont #5 (Figuur 3C, onderbroken cirkel).
- De twee sneden maken langs de kant van de hersenen om het te verspreiden openen (Figuur 3C, onderbroken lijnen). Zodra de hersenen wordt geplaatst dorsale zijde naar beneden en verspreiding open, de hippocampal horizontalis zichtbaar moet zijn (Figuur 3D, pijl).
- De verspreiding open hersenen overbrengen in een stukje polychlorotrifluoroethylene kunststoffolie en plaats deze voor het snijden in het werkgebied van een weefsel chopper. NAT van het mes met GBSS/glucose en hak de hippocampus in dikke sneden van ~ 300 µm.
- Spoel de gesneden hersenen uit de plastic folie in een vers 60 mm schotel met GBSS/glucose (Figuur 3E) met een precisiepipet overdracht. Zachtjes knijpen af en plagen weg, met fijne omver te werpen pincet, de resterende hersenvliezen en andere niet-hippocampal weefsel (Figuur 3F) van de segmenten (Figuur 3G, H).
4. plating segmenten
- Zodra segmenten zijn verkregen, plaats 2 µL van kip plasma in het midden van de photoetched-kant van een voorbereide dekglaasje aan. Verspreid de plasma licht om een 3-4 mm doorsnede-plek.
Opmerking: De photoetched kant is de bovenzijde van het dekglaasje aan wanneer bekeken via een dissectie Microscoop zodanig zijn dat de getallen correct georiënteerd zijn. - 1 sneetje van de hersenen met een steriele spatel voor smalle-tip (Figuur 4A) naar de plek van de plasma (Figuur 4B) overbrengen. Gesloten pincet gebruiken om het segment op het puntje van de spatel terwijl het opheffen van het segment van de GBSS/glucose.
- Aanraken van de spatel de plasma plek op het dekglaasje aan, en met een gesloten tang, duw het segment op het dekglaasje aan.
- Mix-2.5 µL van plasma met 2,5 µL van trombine in een aparte buis. Plaats 2.5 µL van dit mengsel over en rondom de slice en Pipetteer op en neer snel voorzichtig te mengen (Figuur 4B).
Opmerking: Het plasma zal stollen binnen 10-15 s, dus dit moet snel gebeuren. Als segment hechting een probleem is, Meng 5 µL plasma met 5 µL trombine en gebruik van 4-5 µL op het segment, het verwijderen van sommige na het mengen zodat het segment ligt plat op het dekglaasje aan. - Verwijder de duidelijke plastic die van de blootgestelde zijde van de siliconen rubber lijm eerder op een roller buis aangebracht en plaats van het dekglaasje aan met het segment van de hersenen op de lijm uitlijnen van het segment binnen het gat (Figuur 4C).
- Om ervoor te zorgen de hechting, pressiemiddelen zacht, zelfs aan het dekglaasje aan met de duim door te drukken op het dekglaasje aan down gelijkmatig en te houden voor ongeveer 1 minuut terwijl over te dragen aan de biologische veiligheidskast.
- Voeg in een biologische veiligheidskast, 0.8 mL kweekmedium volledige Neurobasal A (Tabel van materialen) aan elke buis (Figuur 4D).
- Een 5% CO2%van het /95 mengsel van lucht door middel van een steriel katoenen-plugged Pasteur pipet veilig gehouden door een klem te stromen. Spoel de roller buis met het gasmengsel en de buis snel van het GLB als het uit is genomen rond de pipet.
- De buizen van een label met het Segmentnummer en rek nummer. Invoegen buizen in een roller rack, ervoor te zorgen dat zij zijn geometrisch evenwichtig. Als er een oneven aantal buizen, voeg buizen om evenwicht te brengen.
- Plaatsen van de rekken in een incubator van de roller 35 ° C met rollen draaien de roller hangklep langs over 10-13 RPH (Figuur 4E). Om te houden van het medium in de bodem van de buizen, tilt de incubator terug ongeveer 5° door het verhogen van de voorzijde op een bord.
- Het nummer van het segment en tube op een werkblad, dat wordt gebruikt voor het opnemen van alle informatie van segment behandelingen en observatie datums invoeren.
- Op ongeveer dag 6 in cultuur, voeg 1 µL (0.002 U) van actieve Plasmine aan elke buis.
- Nadat de stolsels volledig ontbinden verwijderen van het medium (gewoonlijk binnen een paar uur), en vervangen door verse medium zonder Plasmine. Indien nodig, segmenten kunnen worden geïncubeerd met Plasmine 's nachts en het medium veranderde de volgende dag.
- Segmenten worden meestal gedurende ten minste 7-10 dagen voor gebruik in proeven geïncubeerd. Medium gecombineerd en vervang deze op dag 3 of 4, weer op dag 7, en daarna om de 7 dagen.
5. bereiding van virale vectoren transgenic expressie
Opmerking: Uitdrukking van transgenen in de neuronen van segment culturen wordt bereikt met behulp van de hersenen van genetisch gemanipuleerde knaagdieren of door de invoering van de transgenic door infectie met recombinant replicatie gebrekkig virussen.Adenovirussen (AV), adeno-geassocieerde virussen (AAV) en recombinant lentivirus vectoren hebben alle gebruikt in onze hippocampal segment culturen voor expressie van verschillende fluorescente proteïne Chimaera in plakjes van de hersenen.
- Bereiden replicatie gebrekkig AV voor het uitdrukken van het RNA van belang volgens methoden die elders beschreven13,14. Titer de virussen voor infectieuze U/mL door de methode van de seriële verdunning met behulp van een antilichaam aan een viraal uitgedrukt proteïne als beschreven14. Te observeren cofilin aggregaten en de vorming van de staaf van de cofilin-actine, gebruik maken van de cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plasmide #51279)16.
Opmerking: De synapsin 1 promotor is een uitstekende keuze voor neuronale bijzondere uiting15, terwijl de promotor cytomegalovirus handig is voor het besturen van de expressie van de hoge niveaus in vele cel typen13. - AAV door co transfectie van overdracht bereiden plasmide met het gen van belang en een rep/cap plasmide, met of zonder een helper plasmide, in HEK293 verpakking cellen, die de virale E1-gen, als eerder beschreven17,18 leveren.
Nota: Recombinante AAV kan ook worden gemaakt voor gerichte plaatsing in de ontvangende cel genoom19. Voor de overdracht plasmide gebruiken we menselijke cofilin 1 met een C-terminal mRFP1 fluorescentie eiwit tag (plasmide #50856) gekloond in een synapsin promotor-bevattende AAV plasmide stroomafwaarts van de calcium sensor GCaMP5G20. Een stukje DNA codering de P2A zelf verbrijzelen peptide volgorde ingevoegd door PCR tussen GCaMP5G en cofilin-RFP tijdens de voorbereiding van de transfer plasmide om expressie van beide eiwitten van een enkele AAV transcript21. - Bereiden van recombinante lentivirus vectoren door co transfectie van overdracht plasmide met de gen of cDNA van belang en integratie signalen, samen met een derde generatie lentivirus mengsel dat verdeelt de virale gag, pol, rev en vsv-g genen op verpakking drie aparte plasmiden22,23.
- Voor de overdracht plasmide, met een enkele stap klonen systeem24 u samenvoegen van de promotor van de synapsin en de cofilin-R21Q-mRFP cDNA (van plasmide #51279) tot pLKO.1-GFP (plasmide #30323), met de synapsin promotor en cofilin-R21Q-mRFP ter vervanging van de hPGK promotor en GFP cDNA, respectievelijk.
- Transfect de laatste plasmide in HEK293T cellen door calciumfosfaat als eerder beschreven23.
- Verzamelen van medium uit vier gerechten van 10 cm, concentreren op 500 µL met 150K-cutoff centrifugaal concentrators en opslaan van de laatste lentivirus bij-80 ° C in kleine porties na snel ingevroren in vloeibare stikstof. Ontdooi een aliquoot slechts eenmaal voor cellen te infecteren.
- Empirisch bepalen dat het volume van elk virustype bereid om de mate van expressie gewenst door het opzetten van een aantal verschillende segment culturen te volgen van de expressie van het transgenen na infectie met verschillende volumes van virus.
Opmerking: Doorgaans, 1-10 µL van het virus wordt gebruikt per segment.
6. slice behandelingen
- Segmenten met virus verpesting
- Werken in een biologische veiligheidskast goedgekeurd voor virus werk op de biologische veiligheidsniveau geschikt is voor de vector, Meng een aliquoot gedeelte van het virus (meestal 1-10 µL) met 0,8 mL volledige voedingsbodem.
- Gecombineerd het medium van het segment met behulp van een steriele Pipet van Pasteur in een val van de collectie met bleekmiddel. Een secundaire val wordt altijd tussen de eerste val en de vacuüm bron gebruikt.
- Vervang dit medium door het virus-bevattende aliquot bereid boven, de buizen cultuur terug te keren naar een rack en plaatsen in de incubator.
- Na 2-5 dagen van de segmenten met het virus in de biologische veiligheid kabinet aan het broeden, verwijderen van het virus-bevattende medium met een steriele overdracht pipet en plaats het in een fles met een goedgekeurde antivirale agent om te doden van virus.
- Kleuring van neuronen met vitale kleurstof
- Bereiden en aliquots van fluorescerende neuronale vitale kleurstof25 slaan door snelle bevriezing 4 µL van aliquots in vloeibare stikstof bij een concentratie van 100 µM en slaan deze bij-20 ° C. Niet vorst/dooi de kleurstof meer dan eens.
- Label neuronen voor visualisatie door fluorescentie microscopie, ontdooien van een aliquoot gedeelte van de neuronale vitale kleurstof en Verdun tot 4 mL in volledige Neurobasal medium (laatste kleurstof concentratie is 100 nM).
- Verwijder het medium van segmenten door aspiratie (of met een pipet overdracht als het medium virus bevat) en 0,8 mL van het medium met 100 nM neuronale vitale kleurstof te vervangen. De segmenten terug naar het apparaat van de roller in de incubator.
- Na het broeden van de segmenten voor 2 h, gecombineerd het kleurstof bevattende medium en 0,8 mL verse volledige voedingsbodem in een biologische veiligheidskast te vervangen.
Opmerking: Etikettering van neuronen in plakjes met vitale kleurstof enkele uren van incubatie vereist. De eerste beelden zijn meestal genomen 24u na behandeling van de kleurstof. Hoewel neuronen worden specifiek aangeduid, is er achtergrond fluorescentie die meer dan 2-3 dagen weigert te geven beter neuronale imaging. Intensiteit van de vitale kleurstof daalt na 72 uur. - Volg veranderingen in de morfologie van het segment na verloop van tijd en hernoemen de segmenten elke 7 dagen.
7. slice Imaging
- Segmenten op een omgekeerde Microscoop bekijken. Voor de helderste fluorescentie beeldvorming, op 24u voor imaging, wisselen kweekmedium met volledige Neurobasal A medium zonder de fenol rood pH-indicator.
Opmerking: Voor experimenten gemeld hier, segmenten worden bekeken op een omgekeerde draaiende schijf confocal fluorescentie Microscoop uitgerust met een lineaire gecodeerd x, y podium met piezo z controle en een gevoelige hoge resolutie digitale camera. - Overdracht van de buis met de cultuur van het segment te worden aan de houder op maat buis (Figuur 5A), die wordt geplaatst in de fase adapter (Figuur 5B), houden het dekglaasje aan loodrecht op beeld uit de roller buis apparaat de doelstelling en het segment in dezelfde afdrukstand tijdens herhaalde imaging sessies over lange intervallen te handhaven.
- Duw de schuifregelaar op de fase adapter strak tegen de buis te houden van de buis in positie (Figuur 5B).
Opmerking: Gegevens van de houder van de buis, fase adapter en kachel kan worden geraadpleegd op: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Opmerking: Deze afgezet posities van de fiducial mark toestaan consistente dicht van dekglaasje aan dezelfde locatie als het segment is beeld, hoewel de originele x, y instelling van het fiducial merk wijzigt wanneer de buis of fase adapter worden verwijderd en vervangen.
Opmerking: Afbeelding vliegtuigen worden meestal verkregen met tussenpozen van 0,5 µm tot 2 µm, afhankelijk van de grootte en de gewenste resolutie van de afbeelding eigenschappen. Het opzetten van een 3D-beeld van de kwaliteit vereist dat imago functies over meerdere vlakken van overname uitbreiden, en dus om te visualiseren kleinere functies, kleinere intervallen tussen vliegtuigen nodig zijn.
Opmerking: De meeste imaging sessies gemeld hier waren onder 18 min/segment. Echter hebben we enkele segmenten tien of meer tijden, en zelfs als beeld zolang 40 min in een enkele sessie, zonder zichtbare schade in het voortbestaan van het segment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Om te bepalen hoe nauwkeurig fiducial merken kunnen worden gebruikt om dezelfde cellen binnen dezelfde velden PowerSchool na verloop van tijd, onderzochten we segmenten geteeld op photoetched coverslips (Figuur 6A). Neuronen zijn gevisualiseerd door kleuring met een vitale kleurstof (100 nM voor 2 h; doet geen vlekken non-neuronale cellen), die van neuronen verdwijnt na verloop van tijd zonder nadelige gevolgen voor de cellen25. We geïdentificeerd een fiducial mark in een enkele raster vierkant (Figuur 6A, B), gevonden van een regio van de vitale kleurstof-geëtiketteerden neuronen 24 h na het labelen, opgenomen de x en y gecompenseerd met posities van de fiducial mark (Figuur 6B), en verzameld, met behulp van een 60 X doelstelling, confocal afbeeldingsstapels van deze regio, de beeldvorming op 4 opeenvolgende dagen herhalen. De beelden van de maximale projectie van een 30 µm afbeeldingsstapel genomen op dezelfde locatie staan (Figuur 6C-F). Hoewel sommige morfologische veranderingen in de regio meer dan 4 dagen optreden, kunnen de identieke cellen (waarvan er verscheidene zijn gemarkeerd) worden gevolgd na verloop van tijd. De intensiteit van de fluorescentie van de vitale kleurstof daalde na verloop van tijd maar neuronen waren nog steeds duidelijk herkenbare 4 dagen na de labeling. Hoewel de meeste van de neuronale vitale kleurstof fluorescentie was diffuus in het cytoplasma, sommige punctate kleuring werd altijd waargenomen, die werd meer merkbaar als achtergrond fluorescentie daalde. In ongezonde plakjes, werd een punctate-verkleuring van de non-neuronale cellen ook waargenomen als segmenten verslechterd. Deze resultaten tonen aan dat de geïdentificeerde cellen in plakjes herhaaldelijk beeld kunnen worden met behulp van fiducial merken om ze te vinden.
Te onderzoeken tijdafhankelijke veranderingen in neuronale organisatie en haalbaarheid binnen de segmenten tijdens langetermijnkweek, we gevolgd de dezelfde segmenten meer dan 5 weken, labelen met fluorescerende neuronale vitale kleurstof eenmaal per week 24u voor imaging. Meerdere rondes van kleuring met deze vitale kleurstof over enkele weken toegenomen ophoping van aggregaten. Neuronen binnen vers vergulde segmenten die nog steeds in plasma stolsels waren werden geladen met kleurstof en beeld op een dag in vitro (1 DIV). De dezelfde segmenten waren weer wekelijks beeld voor 5 weken. Beelden verkregen uit een enkel sneetje met een doelstelling 4 x staan (Figuur 7A-E). De piramidale cel lagen van de CA en DG regio's helder worden aangeduid als enthousiast op 488 nm en fluorescentie-emissie gemeten bij > 620 nm. Over een periode van 5 weken durende observeren 19 segmenten, drie segmenten kwam uit het dekglaasje aan en twee anderen verloren hun typische morfologie en ondoorzichtig, werd een indicatie van hun dood. Dus, een overlevingskans van ongeveer 70% voor experimenten moet worden beschouwd, en extra segmenten bereid te verzekeren van een voldoende voor analyse. Segmenten waren voorbereid op een nominale dikte-instelling op de chopper weefsel van 300 µm. Na 5 weken in cultuur, we gemeten de dikte van het segment door imaging neuronale vitale kleurstof gebeitste segmenten van het dekglaasje aan omhoog door het segment met een 40 X olie doelstelling op een draaiende schijf confocal microscoop. Verlies van focus van neuronen is opgetreden op een gemiddelde van 257 nm (n = 5 segmenten met meerdere vestigingen gebruikt per segment), waaruit blijkt dat zeer weinig uitdunnen van het segment had plaatsgevonden vanaf het tijdstip van plating. We kunnen niet nauwkeurig meten de dikte van het segment door fluorescentie microscopie ten tijde van plating omdat de vitale kleurstof in de val gelokt in het plasma clot gaf diffuus fluorescentie waardoor het moeilijk voor het nauwkeurig meten van de positie waarop verlies van focus heeft plaatsgevonden. 3D-beelden van neuronen binnen de segmenten zijn echter gemakkelijk verkregen in plakjes, nadat het stollen van het plasma is verwijderd. De 21 DIV segment, vertoond op lage vergroting in Figuur 7F, was 3 dagen na het laden met de neuronale vitale kleurstof beeld met een 60 X doelstelling op een confocal microscoop (in stappen van 1 µm). Een 3D-beeld van 60 µm werd gebouwd vanaf de focal vlakken (Figuur 7G). Neuronen en hun neurite-processen die zijn gemarkeerd met de vitale kleurstof kunnen worden gevolgd in 3D. Morfologie en 3D-structuur van segmenten waren goed onderhouden over ten minste drie maanden, en de langste tijd werden gebruikt in de huidige studie.
Grote veranderingen in de morfologie van een eerder verbeelde positie ook opgetreden in sommige segmenten, suggereren dat verkeer van het segment op het dekglaasje aan kan plaatsvinden. Zeker, over langere intervallen tussen imaging werd het moeilijker om te weten met zekerheid dat de cellen in het gebied wordt beeld identiek aan degene die zijn waargenomen in vorige imaging sessies waren. Dus tonen maximale projectie beelden van de confocal stapels van vitale kleurstof-geëtiketteerden segmenten verworven op de identieke locatie met de doelstelling van 60 x per tussenpozen, verspreid over 4 weken (Figuur 8) dat de neuronale levensvatbaarheid is goed onderhouden, maar dat er moeilijk om te bepalen van een specifieke neuron na verloop van tijd wanneer afbeeldingen worden verkregen met lange tijdsintervallen tussen sessies. Vermoedelijk zou het patroon van cellen die zijn gemarkeerd met meerdere fluorophores gemakkelijker erkende, zijn cellen in gelokaliseerde groepen wanneer waargenomen door te bladeren door een afbeeldingsstapel.
Om te beoordelen van het nut van verschillende virale vectoren voor invoering van exogene genen in de neuronen van hippocampal segmenten, vergeleken we segment infectiviteit met AV, AAV en recombinant lentivirale vectoren, elke uiting van afwijkende fluorescerende labels of het gebruik van verschillende initiatiefnemers op station expressie. AV (2 x 107 besmettelijke U/slice) uiting van cofilin-mRFP achter een sterke, niet-cel specifieke CMV promotor werd gebruikt voor het infecteren van een muis hippocampal segment dat gekweekte 9 weken op coverslips was geweest. Uitdrukking van cofilin-mRFP was verspreid van het segment op 5 dagen na infectie, met expressie intensiefste langs de rand van het segment zoals waargenomen met een 4 x doelstelling (Figuur 9A). Cellen binnen het segment uiting van cofilin-mRFP werden ook waargenomen met een 20 X doelstelling (Figuur 9B) met enkele lichte punctate kleuring en ook diffuse expressie in zowel de neuronen en de non-neuronale cellen. Na 17 weken in cultuur (8 weken na infectie), had spontane cofilin-stangen gevormd in sommige cellen, waarschijnlijk gedreven door overexpressie van wild type cofilin-mRFP (Figuur 9C)26,27.
Wij ook aangetoond dat AAV (1010 deeltjes) kunnen worden gebruikt voor expressie in plakjes.Beelden van segmenten besmet op 9 weken in cultuur met AAV, waarin reed een neuronale specifieke synapsin promotor uitdrukking van GCaMP5-cofilin-mRFP met een zelf verbrijzelen P2A peptide opeenvolging in de linker van de vertaalde polyprotein21, werden gevangen 8 weken na infectie (17 weken in cultuur). In neuronen die uiting geven aan de GCaMP5 en de cofilin-mRFP, gevormd sommige cofilin staven/aggregaten (Figuur 9D-F). De intensiteit van de fluorescentie van de staven/aggregaten was zo sterk dat er zeer weinig fluorescentie van een diffuus cofilin-mRFP kon worden waargenomen zonder volledige verzadiging en bloeiende van het imago van de fluorescentie cofilin van staven. Spontane cofilin staven weergegeven in neuronen waarin wild-type cofilin-belichting fluorescerende eiwit Chimaera hebben overdreven uitgedrukt26,27, evenals in benadrukt neuronen10. Op basis van de titers van adenovirus, die worden bepaald op basis van infectiviteit14 en de graven van de particle gebruikt voor het bepalen van AAV titer, ongeveer 100 tot 500 vouw hogere deeltje nummers van AAV nodig zijn om te verkrijgen van ongeveer de zelfde infectiviteit / expressie in plakjes t.o.v. AV.
Volg recombinante lentivirus-gemedieerde expressie van fluorescente proteïnen in segmenten en waren segmenten besmet op 6 DIV met 1, 3, 10 en 30 µL aliquots van een recombinant lentivirus voor neuronale specifieke expressie (synapsin promotor) van cofilin-R21Q-mRFP, ontwikkeld als een levende cel imaging sonde voor cofilin-actine staaf vorming16. Segmenten waren gelabeld met neuronale vitale kleurstof op 11 DIV en beeld in specifieke regio's voor de kleurstof en cofilin-R21Q-mRFP expressie op 12 en 14 DIV. Het segment met de 30 µL hoeveelheid virus besmet niet overleven voor imaging maar drievoudige segmenten behandeld met de andere volumes van virus bleek een dosis-afhankelijke uiting van mRFP. Figuur 10 toont beelden van segmenten besmet met 1 µL en 10 µL van lentivirus op 6 en 8 dagen na infectie. Meerdere regio's van twee verschillende segmenten werden gekwantificeerd voor co kleuring van neuronen met de vitale kleurstof en mRFP uitdrukking. Voor segmenten besmet met 1 µL van lentivirus, uitgedrukt ongeveer 28% van de neuronen mRFP op 6 dagen na infectie, verhogen tot 85% door 8 dagen na infectie. Voor segmenten besmet met 10 µL van lentivirus, uitgedrukt ongeveer 58 procent van de neuronen mRFP op 6 dagen na infectie, verhogen tot 86% door 8 dagen na infectie. 1 µL van de lentivirus was dus voldoende voor wijdverbreide segment infectiviteit en neuronale expressie door 8 dagen na infectie.
Om aan te tonen dat dit systeem van cultuur handig in de volgende ontwikkeling van cofilin pathologie is, plakjes besmet met lentivirus voor het uitdrukken van cofilin-R21Q-mRFP in de neuronen bleven onbehandeld of behandeld met verschillende concentraties (1 µM, 333 nM, en 100 nM) van synthetische menselijke Aβ eiwit dat incubatie formulier oligomeren28had ondergaan. Resultaten van eerdere studies aangetoond dat synthetische Aβo induceren cofilin-actine staven in maximaal 25% van gedissocieerde hippocampal neuronen29,30,31. Alle drie segmenten behandeld met de 1 µM concentratie van Aβ kwam los van het dekglaasje aan in de eerste 24 h, overwegende dat alle voertuig behandeld segmenten (control) en die behandeld met de 333 nM en 100 nM concentraties van Aβ overleefd voor de twee weken dat ze werden gevolgd. Dezelfde cellulaire gebieden (CA1, CA3 en DG) in een plakje behandeld met 100 nM Aβo waren beeld (60 x doelstelling) gedurende een aantal dagen. Controle segmenten die op 6 DIV met lentivirus besmet waren voor het uitdrukken van synapsin cofilinR21Q-mRFP gedreven had diffuus cellulaire mRFP uitdrukking door 15 DIV (Figuur 11A). Segmenten blootgesteld aan 100 nM Aβo op 14 DIV en beeld op 15 DIV toonde aan dat de verdeling van de cofilin-R21Q-mRFP werd punctate, die voorkomen in beide staaf vormige structuren en aggregaten (Figuur 11B). Deze structuren werd zelfs meer prominente 6 dagen na Aβ-behandeling (Figuur 11C, oftewel hetzelfde veld van cellen als Figuur 11B). Op veel plaatsen rijk aan neurites waar neuronale cel Soma afwezig (Figuur 11D zijn), punctate en staafvormige arrays van cofilinR21Q-mRFP ontwikkeld (pijlen in Figuur 11C), vergelijkbaar met de verdeling van de cofilin-actine staven eerder gemeld binnen neurites van neuronen Aβ-behandeld in cultuur29,30,31. Dus, deze nieuwe methode voor het kweken en observeren van hippocampal plakjes zal gebruikers toestaan om te bepalen de lange termijn levensvatbaarheid van cellen in welke cofilin aggregaten en staven vorm en de omkeerbaarheid van de pathologie in verschillende stadia van ontwikkeling, en gemakkelijk uitvoeren van metingen van de dosis-respons op reagentia die zouden kunnen blokkeren of omkeren van de vorming van cofilin pathologie in een meer in-vivo-zoals cellulaire organisatie.
Figuur 1: Voorbereiding voor roller buis rack. (A) de sjabloon voor het markeren van de posities van het gat voor het boren van de 15 cm weefselkweek schotel bodems. Als de figuur wordt afgedrukt op de grootte van de bar van de schaal weergegeven, kan het worden uitgesneden en gebruikt voor het markeren van de standpunten over een 15 cm cultuur schotel voor het boren van de gaten komt te staan. (B) voltooid roller buis rek met twee buizen ingevoegd. Elk rack is genummerd op een sticker goed zichtbaar op de bovenkant van het rek. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 2 : Voorbereiding van de roller cultuur buisjes. (A) voorzijde bekijken van de buis van de roller ingevoegd in een mal op een boor-pers voor het boren van het gat van 6 mm in de buis. Onderbroken lijn geeft de positie van de platte dubbelzijdige roller buis in de mal. (B) einde bekijken van de mal met de buis ingevoegd en boor bits uitgelijnd over gat. (C) bovenaanzicht van het gat in de mal voor het boren van roller buizen met een 6 mm boor.Witte pijl geeft de positie van de nagel van de licht-donkerscheiding ingevoegd als een stop voor het plaatsen van de buizen en zwarte dubbele lijnen zijn voor bits uitlijning. (D) Spring clips (zwarte pijl) geïnstalleerd op de bodem van de mal te veilig in positie houden bij het boren van buizen. (E) na het boren van het gat, de randen vloeiend met een deburring gereedschap gemaakt worden en groeven worden gesneden aan de binnenkant van het gat (inzet toont het gat door een Microscoop dissectie bekeken) om middellange aftappen uit het gat tijdens buis rotatie. (F) cultuur tube met het gat uitgelijnd met een gat in de silicone rubber lijm, waaraan het dekglaasje aan zal worden gekoppeld. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 3: Voorbereiding van hippocampal hersenen segmenten. Foto's genomen met een dissectie Microscoop zien: (A) intact muis hersenen. Positie van bezuinigingen op het verwijderen van reukkolf en cerebellum worden weergegeven als blauwe, gestreepte lijnen. (B) na verwijdering van reukkolf en cerebellum. (C) stuk van hersenen van B wordt gespiegeld 90 ° met posterieure regio (richting het cerebellum) naar boven. Positionering van het stuk naast de kant van de schotel helpt bij het verwijderen van de veroorzaakt (blauwe onderbroken cirkel) die kan worden geplaagd uit de buurt van de resterende hippocampus thalamus en de hypothalamus. Twee delen, met de verlostang (blauwe, gestreepte lijnen) laat het resterende stuk met de hippocampus van beide halfronden plat worden verspreid. (D) de afgevlakte hersenen stuk waaruit blijkt van het bloedvat loopt langs de hippocampal horizontalis (blauwe pijl). Dit weefsel is geplaatst op plastic folie en overgebracht naar de weefsel chopper voor het snijden in de richting van de stippellijn. (E) gesneden weefsel het weergeven van iets meer dan de helft van de hippocampus na teruggestuurd naar GBSS/glucose. (F) definitieve dissectie van de hippocampus en reinigen van de segmenten voor het verwijderen van niet-hippocampal materiaal. (G) verschillende zwevende segmenten na eindschoonmaak. (H) uitgebreide foto van een enkel sneetje voor overdracht naar dekglaasje aan. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 4 : Identificatietekens en drachtige segmenten. (A) A muis hippocampal segment wordt verwijderd uit de cultuur-schotel op het puntje van een spatel met behulp van het puntje van de verlostang om te helpen tillen vrij van de oplossing. (B) het segment wordt geplaatst vlak in het midden van een photoetched en 12 mm dekglaasje aan op 2 µL van kip plasma behandeld en een ander 2.5 µL van het mengsel van een 1:1 plasma/trombine wordt toegevoegd aan het genereren van een klonter. (C) nadat de clot is ingesteld (ongeveer 1-2 min), de dekking is verwijderd uit de siliconen rubberen zelfklevende cirkel op een buis van de roller en het dekglaasje aan is geplaatst met de klonter gecentreerd in het gat; dan is het dekglaasje aan gedrukt in plaats met een duim en gehouden in positie voor ongeveer 1 min. (D) toevoegen 0,8 milliliters volledige kweekmedium. (E) Roller tube houders binnenkant van een grote roller incubator met de voorkant verhoogd om te kantelen van 5 ° om te houden van het medium aan de onderkant van de buizen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 5: Houder van de buis van de roller en fase plaat incubator. (A) buis houder die posities van de buis zodat het dekglaasje aan wordt gehandhaafd in positie voor imaging. (B) buis houder gemonteerd in een Microscoop fase adapter plaat. Schuifregelaars aan de kant houdt de buis stevig voor imaging. (C) fase adapter met de buis houder en kant panelen toegevoegd met verwarming strips aangesloten op een thermo-elektrische temperatuur controller. Zodra buizen zijn gemonteerd en geplaatst, kan een solide boven naar het vak te helpen handhaven van de temperatuur tijdens de beeldvorming worden toegevoegd. Oranje draad wordt de thermokoppel geleid. Plannen voor het ontwerp en de bouw van de fase adapter en kachel zijn beschikbaar op: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 6 : Gebruik van fiducial merken voor repetitieve beeldvorming van dezelfde cellen. (A) Hippocampal slice op photoetched dekglaasje aan (1 mm vierkanten) met subiculum ontvouwd (staart) bekeken met 4 x gebied van objectieve en heldere verlichting. Kromming van plastic roller buis helpt bij het creëren van een schuine verlichting die de visualisatie van het raster verbetert. Het vak geeft de positie en grootte van een veld X 60. (B) een weergave van hetzelfde segment met een 20 x doelstelling voor het vinden van de fiducial mark als het puntje van de onderkant van de 4 vanaf plein 34. De y en x verschuivingen worden getoond reproducibly het midden van het gewenste vak voor hogere vergroting confocal imaging zoeken. (C--F) Een segment voorzien van neuronale vitale kleurstof die 13 DIV was beeld met behulp van een 60 x-doelstelling en het maken van een beeld van de projectie 30 µm op 4 opeenvolgende dagen (14-17 DIV). Identieke neuronen werden dagelijks beeld. De positie van de nucleus in elk van de drie neuronen is gemarkeerd met een ander symbool. Ze zijn meer gemakkelijk geïdentificeerd door te bladeren door afbeeldingsstapels als hun 3D positie verandert lichtjes. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 7 : Imaging neuronen in plakjes met een neuronale vitale kleurstof. (A) neuronale vitale kleurstof gekleurd segment in plasma clot genomen 24u na beplating met 4 X doelstelling. Kleurstof (100 nM) werd toegevoegd toen het segment was eerste in de roller buis houder geplaatst en 2 uur later uitgewassen.Subiculum is gekruld rond de hippocampus in de klonter. (B--E) Na stollen ontbinding door Plasmine toegevoegd op 6 DIV, was het segment 5 keer opnieuw geladen met de vitale kleurstof 24 h vóór imaging per tussenpozen. Beelden getoond werden verzameld op 8, 21, 28 en 35 DIV (B-E, respectievelijk). (F) Hippocampal segment gekweekt voor 3 weken en bevlekt met neuronale vitale kleurstof 24 h vóór beeldbewerking met 4 X doelstelling. (G) Confocal stapel afbeeldingen op hetzelfde segment zoals in F toont een 3D-weergave van 61 vliegtuigen 1 µm regelmatig genomen. Neuronale vitale kleurstof etiketten duidelijk zowel de neurites als de cel lichaam, maar wordt dit uitgesloten van de kern. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 8 : Repetitieve imaging van neuronen in een enkele locatie van het segment meer dan 4 weken. Maximale projectie beelden van 30 µm confocal afbeeldingsstapels voor hetzelfde veld van cellen (door plaatsing) van de vitale kleurstof-geëtiketteerden segmenten op 12, 20, 30 en 40 DIV genomen (A-D, respectievelijk). Het is moeilijk om herhaaldelijk het identificeren van afzonderlijke cellen over de langere termijnen in projectie beelden. Echter, zelfs gedurende deze lange perioden, identificatie van dezelfde cellen is vaak mogelijk door te bladeren door de afbeeldingsstapels of bouwen van 3D-beelden die kan worden gedraaid, zoals weergegeven in Figuur 7G. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 9 : Viral-gemedieerde expressie en beeldvorming van fluorescente proteïnen. (A) Hippocampal segment gekweekt voor 9 weken en besmet met adenovirus voor het uitdrukken van cofilin-mRFP achter een CMV-promotor. Expressie was verspreid in het segment op 5 dagen na infectie maar fluorescentie was helderste in de buurt van de periferie segment. (B) hetzelfde segment toonde expressie in cellen dieper binnen het segment wanneer bekeken met 20 X doelstelling. Beeld is dat een projectie van een stapel van 20 beelden regelafstand 2 µm uit elkaar. (C) hetzelfde segment werd onderzocht na 17 weken in cultuur (8 weken na infectie) en cofilin mRFP werd waargenomen in staaf vormige aggregaten, zoals te zien in dit beeld van de projectie van een 70 µm stapel van 23 beelden, 3 µm uit elkaar, genomen met een 40 X doelstelling. (D--F) Muis hippocampal segment besmet op 9 weken in cultuur met een uiting van een GCaMP5 - AAV (P2A) - cofilin - mRFP achter een synapsin promotor. Fluorescentie was zichtbaar in zowel rode en groene kanalen na 10 dagen. Een enkel vliegtuig beeld van het segment weergegeven: de expressie van (D) GCaMP5, een calcium-gevoelige verslaggever, (E) veel cofilin-bevattende staven, en (F) een overlay-afbeelding. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 10 : Uitdrukking van cofilin-R21Q-mRFP, aangedreven door een synapsin promotor in neuronen besmet met recombinant lentivirale vectoren. Detectie van een zwakke fluorescentie-signaal is voor het eerst waargenomen door over 3-4 dagen na infectie met 10 µL van virus en wordt bruikbaar door 5-6 dagen, (E), zoals gezien in deze beelden verkregen met een doelstelling van 60 x. Hoewel het duurt langer om hetzelfde niveau van meningsuiting met 1 µL van virus, door 8 dagen na infectie een vergelijkbaar hoog percentage van neuronen (vitale kleurstof label) waren uiting geven aan de cofilin-R21Q-mRFP. Slechts 27 procent van de neuronen waren positief voor mRFP fluorescentie bij 6 dagen na infectie met 1 µL (A, B), maar dit tot 85% (C, D) verhoogd met 8 dagen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Figuur 11 : Aβ oligomeren-geïnduceerde cofilin pathologie in muis hippocampal plakjes. Alle beelden genomen als 30 µm afbeelding stacks met een 60 x doelstelling en worden weergegeven als maximale projectie beelden. Segmenten waren besmet met cofilin-R21Q-mRFP op 6 DIV. (A) 15 DIV segment op 14 DIV met voertuig (DMSO/hammen F12 medium gebruikt voor het genereren van Aβo) behandeld. (B) segment 15 DIV behandeld met 100 nM Aβo. (C) hetzelfde veld zoals in B genomen op 20 DIV en getoond in (D) als een overlay met neuronale vitale kleurstof label. Pijlen wijzen naar lineaire arrays van cofilin aggregaten en staven in de regio van het segment met neurites maar weinige cel organen. Klik hier voor een grotere versie van dit cijfer.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
De hier beschreven methode van de roller-buis zorgt voor langdurige kweken en hoge resolutie live beeldvorming van gesneden hersenweefsel. Een groot probleem met het segment techniek zoals hier toegepast is in de montage en het onderhoud van segmenten. Dekglaasje aan coatings die ondersteuning bieden voor segment adhesie, bevorderen segment uitdunnen door het versterken van de uitgroei van neurites en migratie van de cellen van het segment; zo voorkomen we het gebruik van deze substraten. Het inbrengen van amino groepen op het glas door behandeling met 3-aminopropyltriethoxysilaan verbeterd de hechting van segmenten, maar te weinig of te veel kip plasma op het dekglaasje aan kan ook problemen geven naleving leidt tot verlies van het segment. De hoeveelheid plasma die nodig zijn voor een goede hechting is afhankelijk van de grootte van het segment van de gekweekte hersenen, en dus is groter voor rat hippocampal segmenten, die ongeveer 4 keer zo groot gebied dan muis hersenen segmenten. Als teveel plasma stolsels onder het segment, cel adhesie aan het dekglaasje aan is geschaad en behandeling met Plasmine zal het segment los zodat het gewijzigd standpunt of volledig los. Echter kan te weinig plasma in de klonter leiden tot verlies van het segment tijdens de eerste paar dagen van rotatie in de incubator. In een recente experiment met 39 segmenten, drie verloren zijn maar enkele van deze verloren kan voortvloeien uit segment schade zich voordoet tijdens het snijden. Niettemin, bereiden we meestal ongeveer 50% meer segmenten dan het geschatte aantal die nodig voor het experiment zijn. De tweede belangrijkste oorzaak van de problemen van de cultuur is lekkage van medium rond het dekglaasje aan zegel. Dit probleem verergert wanneer coverslips niet stevig in positie voor ten minste 1 min. gehouden zijn na het aanbrengen van hen aan het zegel. Warmte uit de duim gebruikt toe te passen druk waarschijnlijk helpt het voltooien van de hechting. Lekkage die optreedt is vaak door kleine air kanalen onder het dekglaasje aan die met een dissectie-Microscoop kan worden waargenomen. Deze verdwijnen meestal op het gebruik van langdurige duim druk. Verlies van ongeveer 2% van culturen als gevolg van de trage lekkage kan worden verwacht, en dus wordt u geadviseerd te wachten van 10 dagen na het opzetten van de culturen vóór het uitvoeren van virale infecties. Buitensporige duim de druk, vooral als geproduceerd ongelijk over het dekglaasje aan, kan ook leiden tot het dekglaasje aan te kraken. Als breuk een probleem is, kan te drukken de buizen naar beneden plat op een rubber muismat opgewarmd in een broedmachine helpen om meer gelijkmatige druk over het dekglaasje aan.
Eerder beschreven methoden voor hersenen segment cultuur op membranen op het raakvlak van de lucht-vloeistof (open systeem) of op een glas dekglaasje aan binnenkant van een verzegelde plastic buis (gesloten systeem) zijn zeer effectief voor het voortbestaan van het segment, maar elke methode heeft zijn sterke punten en zwakke punten. Segment culturen op membranen op de vloeibare air-interface zijn voordelig voor gecombineerde elektrofysiologische studies met onderdompeling doelstellingen voor hoge resolutie beeldvormende7, maar hebben nadelen met betrekking tot het vinden van het exacte gebied van cellen voor reimaging in de tijd en de mogelijke blootstelling van de gebruiker en de objectieve besmetting bij het gebruik van virale-gemedieerde genexpressie. Gebruik van virussen voor expressie van transgenen is veiliger en eenvoudiger uit te voeren in een gesloten systeem waar besmetting van Microscoop doelstellingen is geen probleem. Onze gemodificeerde roller buis methode geeft toegang van het segment voor hoge resolutie imaging, hoewel het is niet vatbaar voor elektrofysiologische studies.
Segment kweekomstandigheden voor veel regio's van de knaagdier hersenen2zijn vastgesteld, maar hier gebruiken we alleen hippocampus, want het is een van de meest bestudeerde hersengebieden en veranderingen die zich in de hippocampus voordoen van groot belang in studies van zijn cognitieve stoornissen. De piramidale cel lagen van de CA en DG regio's handhaven hun organisatie over enkele weken in cultuur en kunnen gemakkelijk morfologisch worden waargenomen. We hebben een nieuw ontwikkelde fluorescerende neuronale levensvatbaarheid marker25, die fluorescentie-eigenschappen die kunnen worden gebruikt heeft voor het bewaken van de neuronale levensvatbaarheid en organisatie binnen hippocampal segmenten over perioden van dagen tot maanden maar ook gebruikt verenigbaar zijn met het gebruik van vele andere fluorescente proteïnen en verslaggevers. Hoewel niet optimaal is voor NeuO fluorescentie25, wij op NeuO kunnen prikkelen op 488 nm en maatregel emissie bij > 617 nm. Fiducial merken op de coverslips van de photoetched geholpen met het vinden van dezelfde cellen herhaaldelijk over vele dagen van cultuur en mogen ons beeld identiek regio's van de segmenten vele weken. Vrijwel voorgedaan geen significante dunner worden van de segmenten op de gewijzigde glas coverslips 5 weken in de cultuur, de langste tijd punt waarvoor wij slice diktemetingen verkregen.
AV, AAV en recombinant lentivirus vectoren werken goed voor het uitdrukken van exogene genen in plakjes. Lentivirus met een neuronale specifieke promotor is vooral handig voor het verkrijgen van de expressie in een zeer hoog percentage (> 85%) van neuronen binnen 8 dagen na infectie. Bovendien laten we zien dat de cofilin-actine staaf pathologie in verband met de ontwikkeling van cognitieve tekorten in menselijke AD10,11 en Aβ muis AD modellen32 overexpressing in segment culturen behandeld kan worden gecontroleerd relatief lage concentraties (100 nM) van synthetische menselijke Aβo. Wij voorzien dat toekomstige toepassingen van deze methode zal omvatten karakterisering van nieuwe therapieën om om te keren cofilin-actine staaf pathologie en/of juiste Dendritische spine afwijkingen die zich in veel neurologische aandoeningen33 voordoen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
