Summary
Præsenteret her er en modificeret roller tube metode til dyrkning og intermitterende høj opløsning billeddannelse af hjernen, gnaver skiver i mange uger med præcise repositionering på photoetched coverslips. Neuronal levedygtighed og skive morfologi er godt vedligeholdt. Anvendelser af denne fuldstændig lukket system ved hjælp af virus til celletype specifikke udtryk er fastsat.
Abstract
Kulturperler gnaver hjernen udsnit er nyttigt for at studere den cellulære og molekylære opførsel af neuroner og glia i et miljø, der har bevaret mange af deres normale i vivo -interaktioner. Udsnit fra en bred vifte af Transgene mus linjer eller brug af virale vektorer for udtryk af fluorescently mærket proteiner eller journalister i vildtype hjernen skiver mulighed for høj opløsning billeddannelse af Fluorescens mikroskopi. Selv om flere metoder er blevet udviklet til billeddannelse hjerne skiver, kombinerer skive kultur med mulighed for at udføre har gentagne høj opløsning billeddannelse af specifikke celler i live skiver over lange perioder stillet problemer. Dette gælder især, når virale vektorer bruges til udtryk af eksogene proteiner, da dette gøres bedst i et lukket system til at beskytte brugere og forhindre krydskontaminering. Simple ændringer til metoden roller tube hjernen skive kultur, der giver mulighed for gentagen høj opløsning billeddannelse af skiver i mange uger i et lukket system er rapporteret. Dyrkning skiver på photoetched coverslips tillader brug af referencepunkter til hurtigt og præcist flytter scenen for at image feltet identisk med tiden før og efter forskellige behandlinger. Eksempler er vist for brug af denne metode, kombineret med specifikke neuronal farvning og udtryk til at observere ændringer i hippocampus skive arkitektur, viral-medieret neuronal udtryk af fluorescerende proteiner og udviklingen af cofilin patologi, der blev tidligere observeret i hippocampus af Alzheimers sygdom (AD) som svar på skive behandling med oligomerer af amyloid-β (Aβ) peptid.
Introduction
Primære kultur af dissocierede neuroner fra regioner i gnavere hjernen er et vigtigt redskab, som forskere for at iagttage Reaktionerne på patologisk impliceret stimuli. Sådanne undersøgelser har dog Ulempen at anskue neuroner i eneste 2D og uden deres glial støttesystem. Desuden, medmindre dyrket under forhold med meget høj tæthed (640 neuroner/mm2 eller ca. 16% af areal) hvor det bliver umuligt at følge den tilfældige udvækst af en dendrit eller axon for mere end en kort afstand fra sin celle organ, hippocampus neuronal levedygtighed forringes over 4 uger betydeligt1, begrænse brugen af dissocierede kulturer til udvidede undersøgelser af aldersbetingede patologier. Dyrkning af skiver forberedt fra gnaver hjerne er en attraktiv mulighed, der overvinder disse begrænsninger ved at opretholde en organiseret celle arkitektur og bæredygtighed uger eller måneder. Betingelserne for opretholdelse af mange forskellige regioner af gnaver hjernen i Skive kultur er blevet beskrevet2.
To store metoder er almindeligt brugt til langtidskulturer af hjernen skiver: dyrkning på membraner på air-liquid grænseflade3 eller dyrkning på coverslips i forseglet rør lov til at rotere i en rulle inkubator at give beluftning4. Skiver kulturperler på membraner kan direkte afbildet med høj opløsning Fluorescens mikroskopi ved hjælp af en opretstående mikroskop og vand fordybelse mål5. Alternativt er skiver kulturperler på membraner blevet overført til glas bund retter at opnå god opløsning af dendritiske spines bruger en inverteret mikroskop6. Begge metoder af imaging skiver dyrkes på membraner er dog åbne systemer, der kræver mellemlang ændringer og ofte bruge svampedræbende og/eller antibiotika til at forebygge eller mindske forurening5,6. Skiver på en membran på grænsefladen luft-medium opretholde fremragende morfologi og overlevelse, men vender tilbage til præcise steder under gentagne imaging på høj forstørrelse er yderst vanskeligt, medmindre eksperimentet følger kun små grupper af celler udtryk for en fluorescerende markør. Selvom skiver dyrkes på membraner har været brugt med viral-medieret udtryk af transgener5,6, kan biosikkerhed protokoller kræve en lukket kultur system anvendes for visse virale vektorer, der bruges til at udtrykke fluorescently markeret proteiner og journalister i celle fysiologi. Derudover kræver fordybelse mål dekontaminering mellem prøver, der vil blive fulgt op i kultur5. En større anvendelse af membran interface kulturer er en kombination af høj opløsning imaging med Elektrofysiologi på én gang point7.
Metoden roller tube med coverslips inde i plastik røret tillader ikke nogen Elektrofysiologi eller lang-dagsorden tænkelig uden at fjerne coverslip. Således, denne metode har oftest udlignet langtidstest hvor efter fiksering observationer foretaget den8. Beskrevet her er en metode, der udnytter roller tube kultur teknik men på boret ud rør med skiver på coverslips, der kan være afbildet gentagne gange så længe som kulturerne vedligeholdes. Det lukkede system kræver ingen ændring af medium til billedbehandling og udnytter photoetched coverslips for at levere referencepunkter, der tillader imaging på høj forstørrelse, efter dage eller uger, felterne præcise tidligere afbildet.
Vi anvender denne metode til at undersøge ændringer i gnavere hippocampus, en større hjerne region involveret i hukommelse og indlæring. Gnaver hippocampus er ofte studeret som en model for patologisk eller aldersrelaterede ændringer observeret under udvikling af kognitiv svækkelse9, såsom dem, der opstår i Annoncen. Vores metode er særligt velegnet til at studere patologiske ændringer, der udvikler sig inden for en enkelt skive over tid reaktion på miljømæssige ændringer, såsom stigninger i Aβ peptider, som er karakteristisk for AD8. En patologi forbundet med menneskelige og gnaver AD hjernen er tilstedeværelsen af cofilin-actin aggregater og stænger, de sidstnævnte indeholdende bundter af filamenter, hvor cofilin og actin er i en 1:1 molar forholdet10,11, 12. stænger er blevet observeret i faste skiver af rotte hippocampus efter Aβ behandling, samt inden for en levende gnavere hjernen skive at udtrykke cofilin-NGL underkastes hypoxi8, og de kan bidrage til den synaptiske dysfunktion set i AD og slagtilfælde. Her bruger vi denne nye dyrkningsbaserede metode for at observere tidsforløb og distribution inden for skiver af udtrykt eksogene kimære fluorescerende proteiner indført af forskellige vira. Vi derefter udnytte den neuronale specifikt udtryk for en cofilin journalist konstruere at følge udviklingen af cofilin stang og samlede patologi i hippocampus skiver i reaktion på behandling med opløselige Aβ oligomerer (Aβo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Brug af dyr følger avlsgodkendt og brug af dyr protokoller, der overholder til Animal Care og bruge retningslinjer fra Colorado State University.
Bemærk: Protokollen nedenfor beskriver metoden forberedelse og kultur for langsigtet inkubation og intermitterende billeddannelse af hippocampus skiver. En enkelt hippocampus skive er knyttet til en specielt forberedt photoetched coverslip ved hjælp af et plasma blodprop, og derefter coverslips er forseglet på den flade side af en boret-out rulle tube, som er fastholdt i en rulle inkubator. Plasma blodpropper er opløst med plasmin før viral infektion for fluorescerende proteiner udtryk og lang-dagsorden tænkelig. En fluorescerende neuronal vitale farvestof bruges til billede neuroner i skiver.
1. forberedelse af Roller Tube Rack
- Brug skabelonen vist i figur 1A udskrives til den størrelse vist på skalalinjen. Med et søm, punch små huller (store nok til en fin spids markør) i skabelonen centreret om hullerne.
- Sæt skabelonen på bunden af en 15 cm vævskultur parabol (nominel diameter på 14 cm) og markere placeringen af hullerne. Gentag dette på en anden tallerken.
- Med borehoveder designet til brug på plastik, bore seks 1,5 cm diameter huller på hver tallerken i en sekskantet array (4,8 cm center-til-center) med hul Centre 2,5 cm fra kanten af skålen. Bor tre huller (3 mm i diameter) 12 mm fra den kant, der er placeret equidistantly mellem to af de større huller som vist i figur 1A.
- Med bunde i hvert fad overfor hinanden, placere en 2,5 tommer lang maskine skrue (3/16 tommer diameter) med en flad skive gennem en af de små huller, efterfulgt af en anden flad spændeskive, et stykke polyethylen slanger (spacer, 4,7 cm), en anden flad skive , den anden vævskultur parabol, en anden flad skive, en låsning skive og en møtrik.
- Gentag trin 1.4 på de andre to maskinskruer, og stramme kun løst før alle maskinskruer er på plads. Spænd møtrikkerne sikkert.
- Arbejde øskner (5/16 tomme tyk, 5/8 inch huldiameter) ind i hullerne i bunden parabol til at opnå den endelige roller tube rack (figur 1B; vist med to rør på plads). Placere en mærkat på hver rack med et entydigt nummer.
2. forberedelse af Roller rør og Coverslips
- Gør jig til at bore hul i roller rør
- Bor en 1,5 cm hul 8 cm dyb center side af en 2 x 4 x 5,5 tommer træ blok i en vinkel sådan at den flade side af rullen tube vil være næsten parallel med blokken, når de indsættes (fig. 2A).
- Forstørre hullet ved hjælp af en rund træ fil at udvide såvel koniske hul for at tillade tube indsættelse (roller rør er lidt større i diameter nær cap slutningen) (figur 2B).
- Bor en 1,5 cm diameter lodret hul, 5,5 cm fra siden af blokken, og centreret over side hul (figur 2C).
- Når side hul er tilspidset nok, skal du indsætte en rulle rør, der er markeret på det ønskede sted at centrere hul til skive og placere røret så det markerede sted er centreret i 1,5 cm lodret hul.
- Fjerne røret og måle afstanden fra stedet til enden af røret. Markere denne afstand fra centrum af hullet i jig og indsætte et søm til at give et stop for at korrekt placere røret til boring (pil i figur 2C).
- Bruge en nedstryger til at afskære flugter med overfladen af træ-blok til at forhindre skade neglen.
- Tilføje foråret klip i bunden af jig, hvis der er en boremaskine presse med slots, der gør det muligt at være forankret (figur 2D sort pil). Ellers bruge C-klemmer til at holde jig sikkert på Boremaskinen.
- Ved hjælp af jig beskrevet ovenfor for at holde og placere en flad dobbeltsidet 11 cm plastik kultur tube med den flade side op (figur 2A), bor en 6 mm diameter hul med center 1,0 cm fra bunden og centreret mellem siderne af røret.
Bemærk: Et borehoved, designet til plast bør anvendes. - Med en swiveling afgratning værktøj, udglatte kanterne i hul (figur 2E) og gøre 4 rillerne på indersiden kant af hullet (figur 2E, inset) til afløb for hullet under rotation.
- Med en 12 mm hul punch, skåret 12 mm diameter diske fra ikke-giftige dobbelt dobbeltsidet klæbemiddel silicium gummi ark. Ved hjælp af en standard et hul paper punch (6 mm i diameter), lave et hul i midten af hver disk.
- Skyl de borede rør med 70% ethanol, luft tørre dem i en biologisk sikkerhed kabinet, og sterilisere rør og udstansede klæbende diske i 40 min. under UV-lampe (30 W i 70 cm gennemsnitlige afstand) i den biologiske sikkerhed kabinet.
- Flyt rør og diske efter 20 min, så at alle udsatte overflader er steriliseret. Under sterile forhold, skræl off white sikkerhedskopiering fra en selvklæbende disc og anbringer silikonegummi på ydersiden af et rør, tilpasse hullerne (figur 2F).
Forsigtig: For at undgå UV-eksponering, bære øjenbeskyttelse og lukke skabet, før du tænder på UV-lampe. - Ren 12 mm diameter photoetched (100 center nummereret 1 mm firkanter) tyske glas coverslips. Hold coverslips forsigtigt med pincet og dyp i absolut ethanol, efterfulgt af vand, efterfulgt af absolut ethanol igen, og endelig dyppe coverslips i en flamme at forbrænde ethanol. Tillade coverslips at køle.
- Holder coverslips med pincet, dyppe i 2% 3-aminopropyltriethoxysilane i acetone for 10 s. Skyl coverslips med ultrarent vand og lad lufttørre.
- Angiver coverslips på sterile filterpapir i en biologisk sikkerhed kabinet og drej på UV lys. Udsætte hver side af coverslips i 20 min.
Forsigtig: For at undgå UV-eksponering, bære øjenbeskyttelse og lukke skabet, før du tænder på UV-lampe.
3. hippocampus skive forberedelse
- Før du starter dissektion, forberede halvdele af tveægget barberblade væv chopper. Fold vingerne på langs omhyggeligt med fingrene og snap i halve.
- Skyl bladet halvdele med acetone ved hjælp af en vatpind til at rense dem, efterfulgt af skylning i absolut ethanol og luft tørring.
Bemærk: Hjernen skive kultur protokol er uafhængig af mus eller rotte stamme eller genotype. Mange Transgene mus linjer med forskellige genetiske baggrunde har været brugt.
- Med pincet, hold trimmet hjernen bageste side opad og ventrale side mod side af petriskål for stabilitet. Forsigtigt drille lager meninges omkring sagittal midterlinjen og fjerne den midthjernen væv ved hjælp af en fint tippes Dumont #5 pincet (figur 3C, stiplede cirkel).
- Gøre to snit langs siden af hjernen til at sprede det åbne (figur 3C, stiplede linjer). Når hjernen er placeret dorsale side ned og sprede åbne, hippocampus revne skal være synlige (figur 3D, pil).
- Overføre spredning åben hjernen til et stykke Polychlortrifluorethylen plastfolie og Placer det til udskæring på scenen i et væv chopper. Våde blade med GBSS/glucose og hugge hippocampus i ~ 300 µm tykke skiver.
- Med en overførsel pipette, skylle skiveskåret hjernen off plastfolie i en frisk 60 mm skål indeholdende GBSS/glucose (figur 3E). Forsigtigt klemme ud og drille væk, med fine tippes pincet, de resterende meninges og andre ikke-hippocampus væv (figur 3F) fra skiver (figur 3G, H).
4. plating skiver
- Når udsnit er opnået, skal du placere 2 µL af kylling plasma på midten af photoetched siden af en forberedt coverslip. Sprede plasma lidt for at opnå en 3-4 mm diameter spot.
Bemærk: Photoetched side er den øverste side af coverslip når de ses gennem et mikroskop for dissektion således, at tallene er orienteret korrekt. - Overføre 1 hjernen skive med en steril smal-tip spatel (figur 4A) til plasma staffage (fig. 4B). Bruge lukkede pincet til at holde skive på spatel tip mens du løfter udsnit fra GBSS/glucose.
- Røre spatel til plasma spot på coverslip, og med lukkede pincet, skubbe skive på coverslip.
- Mix 2.5 µL plasma med 2,5 µL af thrombin i en separat tube. Hurtigt placere 2,5 µL af denne blanding over og omkring skive og afpipetteres op og ned forsigtigt for at blande det (fig. 4B).
Bemærk: Plasma vil størkne inden for 10-15 s, så det skal gøres hurtigt. Hvis skive vedhæftning er et problem, mix 5 µL plasma med 5 µL thrombin og bruge 4-5 µL på skive, at fjerne nogle efter blanding så at skive ligger fladt på coverslip. - Fjern den klare plast dækker fra den udsatte side af silikone gummi limen tidligere anbragt på en valse tube og placere coverslip med hjernen skive på limen justere skive i hul (figur 4C).
- For at sikre vedhæftning, anvende blødt, jævnt Tryk på coverslip med tommelfingeren ved at trykke coverslip ned jævnt og holde det for omkring 1 min mens overføre den til den biologiske sikkerhed kabinet.
- I en biologisk sikkerhed kabinet, 0,8 mL komplet Neurobasal A næringssubstratet (Table of Materials) tilsættes til hvert rør (figur 4D).
- Flow et 5% CO2/95% luftblandingen gennem en steril bomuld-tilsluttet Pasteur pipette holdes sikkert af en klemme. Skyl roller tube med gasblandingen og hurtigt cap røret som det trækkes tilbage fra omkring pipetten.
- Mærke rør med skive antal og rack nummer. Indsæt rør i en rulle rack, at sikre de er geometrisk afbalanceret. Hvis der er et ulige antal rør, tilføje rør til at balancere.
- Placere stativerne i et 35 ° C roller inkubator med ruller dreje rulle rack på omkring 10-13 RPH (figur 4E). For at holde mediet i bunden af rørene, tilbage tilt rugemaskinen ca 5° ved at øge sin front på et bord.
- Angiv skive og rør på et regneark, som bruges til at registrere alle oplysninger af skive behandlinger og observation datoer.
- På omkring dag 6 i kultur, tilføje 1 µL (0,002 U) af aktive plasmin til hver tube.
- Efter blodpropper opløses fuldstændigt (normalt inden for et par timer), fjerne medium og erstatte det med friske medium uden plasmin. Hvis det er nødvendigt, skiver kan være inkuberes med plasmin natten over og medium ændret den næste dag.
- Skiver er normalt inkuberes i mindst 7-10 dage før brug i eksperimenter. Opsug medium og erstatte det på dag 3 eller 4, igen på dag 7, og hver 7 dage derefter.
5. forberedelse af virale vektorer for transgen udtryk
Bemærk: Udtryk af transgener i neuroner i Skive kulturer er opnået enten ved hjælp af hjerner fra genetisk modificerede gnavere eller ved at indføre transgenet ved infektion med rekombinant replikering mangelfuld vira.Adenovirus (AV), adeno-associeret virus (AAV) og rekombinant lentivirus vektorer har alle været anvendt i vores hippocampus skive kulturer i udtryk for forskellige fluorescerende proteiner kimærer i hjernen skiver.
- Forberede replikering mangelfuld AV for at udtrykke RNA interesse efter metoder beskrevet andetsteds13,14. Titer virus for smitsomme U/mL ved seriel fortynding metode ved hjælp af en antistof mod et viralt udtrykt protein som beskrevet14. At observere cofilin aggregater og cofilin-actin rod dannelsen, udnytte cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plasmid #51279)16.
Bemærk: Synapsin 1 arrangøren er et glimrende valg for neuronal specifikke udtryk15, cytomegalovirus promotor er nyttigt for kørsel høj udtryk niveauer i mange celle typer13. - Forberede AAV af co Transfektion af overførsel plasmid som indeholder gen af interesse og en rep/cap plasmid, med eller uden en helper plasmid, til HEK293 emballage celler, der leverer viral E1 genet, som tidligere beskrevet17,18.
Bemærk: Rekombinant AAV kan også laves til målrettede indsættelse i vært celle genom19. For overførsel plasmid bruger vi menneskelige cofilin 1 med en C-terminal mRFP1 fluorescens protein tag (plasmid #50856) klonede ind i en synapsin promoter-holdige AAV plasmid nedstrøms fra calcium sensor GCaMP5G20. Et stykke DNA kodning P2A selvstændige cleaving peptid sekvens er indsat ved PCR mellem GCaMP5G og cofilin-RFP under udarbejdelsen af overførsel plasmid at give udtryk for både proteiner fra en enkelt AAV udskrift21. - Forberede rekombinant lentivirus vektorer af co Transfektion af overførsel plasmid som indeholder genet eller cDNA af interesse og integration signaler, sammen med en tredje generation lentivirus emballage blanding, der opdeler viral gag, pol, rev og vsv-g gener på tre separate plasmider22,23.
- For overførsel plasmid, brug et enkelt trin kloning system24 for at samle synapsin promotor og cofilin-R21Q-mRFP cDNA (fra plasmid #51279) til pLKO.1-NGL (plasmid #30323), med synapsin promotor og cofilin-R21Q-mRFP erstatter hPGK initiativtageren og normal god landbrugspraksis cDNA, henholdsvis.
- Transfect den endelige plasmid i HEK293T celler af calcium fosfat som tidligere beskrevet23.
- Indsamle medium fra fire 10 cm retter, koncentrat til 500 µL bruger 150K-cutoff centrifugal koncentratorer og gemme den endelige lentivirus ved-80 ° C i små prøver efter Hurtig nedfrysning i flydende kvælstof. Tø en alikvot kun én gang til at inficere celler.
- Bestemme empirisk mængden af hver virustype parat til at opnå graden af udtryk ønske ved at oprette en række forskellige skive kulturer at følge udtryk for transgener efter infektion med forskellige mængder af virus.
Bemærk: Typisk 1-10 µL af virus bruges pr. skive.
6. skive behandlinger
- Inficere skiver med virus
- Arbejder i en biologisk sikkerhed kabinet godkendt til virus arbejde på den biologiske sikkerhed plan passende for vektoren, bland en alikvot af virus (som regel 1-10 µL) med 0,8 mL af komplet medium.
- Opsug medium fra Skive ved hjælp af en steril Pasteur afpipetteres i en samling fælde der indeholder blegemiddel. En sekundær trap bruges altid mellem den første fælde og vakuumkilde.
- Erstatte dette medium med virus-holdige alikvot forberedt ovenfor, vende tilbage kultur rør til et rack og sted i rugemaskinen.
- Efter 2-5 dages inkubation skiver med virus i den biologiske sikkerhed kabinet, ophæve den virus-holdige medium med en steril overførsel pipette og læg det i en flaske, der indeholder en godkendt antiviral agent for at dræbe virus.
- Farvning af neuroner med vitale farvestof
- Forberede og gemme delprøver af fluorescerende neuronal vitale farvestof25 af Hurtig nedfrysning 4 µL af delprøver i flydende kvælstof i en koncentration på 100 µM og gemme disse ved-20 ° C. Ikke fryse/tø farvestoffet mere end én gang.
- At mærke neuroner for visualisering af Fluorescens mikroskopi, tø en alikvot af neuronal vitale farvestoffet og fortyndes op til 4 mL i komplet Neurobasal medium (endelige farvestof koncentration er 100 nM).
- Fjern mediet fra skiver af aspiration (eller med en overførsel pipette Hvis mediet indeholder virus) og erstatte det med 0,8 mL af det medium, der indeholder 100 nM neuronal vitale farvestof. Returnere skiver til apparatet roller i rugemaskinen.
- Efter inkubation skiver til 2 h, Aspirér farvestof, der indeholder mediet og erstatte det med 0,8 mL frisk komplet medium i en biologisk sikkerhed kabinet.
Bemærk: Mærkning af neuroner i skiver med vitale farvestof kræver flere timers inkubation. De første billeder er normalt træffes 24 timer efter dye behandling. Selvom neuroner er specielt mærket, er der baggrunden fluorescens, der falder over 2-3 dage til at give bedre neuronal billeddannelse. Intensiteten af den vitale farvestof afslår efter 72 timer. - For at følge ændringer i Skive morfologi over tid, ommærke skiver hver 7 dage.
7. skær Imaging
- Se udsnit på en inverteret mikroskop. Lyseste fluorescens imaging, på 24 timer før imaging, udveksle næringssubstratet med komplet Neurobasal A medium uden Phenol rød pH indikator.
Bemærk: For eksperimenter rapporteret her, skiver er set på en inverteret spinning disc Konfokal fluorescens mikroskop udstyret med en lineær kodet x, y scenen med piezo z kontrol og en følsom high-resolution digital kamera. - Overføre tube med skive kultur til afbildning fra roller tube apparater til skræddersyede tube indehaveren (figur 5A), som er placeret i fase-adapter (figur 5B), at holde coverslip vinkelret på målet og vedligeholde skive i den samme retning under gentagne imaging sessioner over lange intervaller.
- Skubbe skyderen på scenen adapter tæt mod røret at holde røret i stilling (figur 5B).
Bemærk: Oplysninger om indehaveren tube fase adapter, og varmeren kan tilgås på: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Bemærk: Disse off-set positioner fra den fiducial mark tillade konsekvent indkredsning af det samme coverslip sted når skive er afbildet, selvom den oprindelige x, y indstilling af varemærket fiducial skifter når rør eller fase adapteren fjernes og erstattes.
Bemærk: Billede fly er normalt fremstillet i intervaller på 0,5 µm til 2 µm, afhængig af størrelse og ønskede opløsning af billed funktioner. Opbygge en kvalitet 3D billede kræver at billede funktioner strækker sig over flere fly af erhvervelsen, og så for at visualisere mindre funktioner, mindre intervaller er påkrævet mellem fly.
Bemærk: De fleste imaging sessioner rapporteret her var under 18 min./skive. Men vi har afbildet nogle skiver ti eller flere gange, og selv som længe 40 min i en enkelt session, uden tilsyneladende afbræk i den langsigtede overlevelse af udsnittet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Til at bestemme, hvordan præcist referencepunkternes kan udnyttes for at reimage de samme celler inden for samme over tid, undersøgte vi skiver dyrkes på photoetched coverslips (fig. 6A). Neuroner var visualiseres ved farvning med et afgørende farvestof (100 nM for 2 h; ikke pletter ikke-neuronale celler), der forsvinder fra neuroner over tid uden at skade celler25. Vi identificerede en fiducial mark i en enkelt grid square (figur 6A, B), fundet en region af afgørende dye-mærket neuroner 24 h efter mærkning, indspillet af x og y modregnes i positioner fra den fiducial mark (fig. 6B), og indsamles, ved hjælp af en 60 X mål, Konfokal billedstakke i denne region, gentage imaging på 4 dage i træk. De maksimale projektion billeder af en 30 µm billedstak taget i den samme placering er vist (figur 6C-F). Selv om nogle morfologiske ændringer sker inden for området over 4 dage, kan de identiske celler (hvoraf flere er markeret) følges over tid. Fluorescens-intensiteten af den vitale farvestof faldt over tid men neuroner var stadig tydeligt identificerbare 4 dage efter mærkning. Selv om de fleste af neuronal vitale farvestof fluorescens var diffuse i cytoplasmaet, nogle punktformet farvning var altid observeret, som blev mere mærkbar som baggrund fluorescens faldt. I usunde skiver, blev en punktformet farvning af ikke-neuronale celler også observeret som skiver forværret. Disse resultater viser, at identificerede celler i skiver kan gentagne afbildning ved hjælp af referencepunkternes for at finde dem.
For at undersøge tidsafhængig ændringer i neuronal organisation og rentabilitet inden for skiver under langtidskulturer, fulgte vi de samme skiver over 5 uger, mærkning med fluorescerende neuronal vitale farvestof en gang om ugen 24 timer før billeddannelse. Flere runder af farvning med denne vitale farvestof over flere uger øget akkumulering af aggregater. Neuroner i frisk forgyldt skiver, der var stadig i plasma blodpropper var lastet med farvestof og afbildet på en dag i vitro (1 DIV). De samme skiver var afbildet igen ugentligt i 5 uger. Billeder fra en enkelt skive med en 4 x mål er vist (figur 7A-E). De pyramideformede cellelag af regionerne CA og GD er smukt mærket når ophidset på 488 nm og fluorescens emission målt på > 620 nm. Over en 5-ugers periode af observere 19 skiver, tre skiver kom ud af coverslip og to andre mistede deres typiske morfologi og blev uigennemsigtigt, anførelse af deres død. Således bør betragtes som en overlevelse på ca. 70% til eksperimenter, og ekstra skiver parat til at sikre et passende antal til analyse. Skiver var forberedt på en nominel tykkelse indstilling på væv chopper af 300 µm. Efter 5 uger i kultur målte vi skive tykkelse af imaging neuronal vitale dye-farvede udsnit fra coverslip op gennem skive med en 40 X olie mål på en roterende disk Konfokal mikroskop. Tab fokusområder af neuroner opstod i gennemsnit 257 nm (n = 5 skiver med flere lokationer anvendes pr. Skive), viser, at meget lidt udtynding af skive havde fundet sted fra tidspunktet for plating. Vi kan ikke præcist måler skive tykkelse af Fluorescens mikroskopi på tidspunktet for plettering fordi afgørende farvestoffet indesluttet i plasma blodprop gav diffuse fluorescens gør det svært at nøjagtigt måle positionen som tab af fokus skete. 3D-billeder af neuroner i skiver fås dog nemt i skiver efter plasma blodprop er fjernet. 21 DIV skive, vist ved lav forstørrelse i figur 7F, blev afbildet med en 60 X mål på en Konfokal mikroskop (1 µm-skridt) 3 dage efter indlæsning med neuronal vitale farvestoffet. En 60 µm 3D billede blev bygget fra de fokale planer (figur 7G). Neuroner og deres neurite processer, der er mærket med den vitale farvestof kan følges i 3D. Morfologi og 3D-struktur af skiver var velholdte i mindst 3 måneder, og de længste gange blev brugt i den aktuelle undersøgelse.
Større ændringer i morfologi af en tidligere afbildede holdning også opstod i nogle skiver, tyder på, at flytning af skive på coverslip kan finde sted. Over længere intervaller mellem imaging blev det bestemt, vanskeligere at vide med sikkerhed, at cellerne i feltet bliver afbildet var identiske med dem, der observeres i tidligere billeddiagnostiske sessioner. Således viser maksimale projektion billeder af Konfokal stakke af vitale dye-mærket skiver erhvervet på lokationen identisk med 60 x mål med ugentlige intervaller der strækker sig over 4 uger (figur 8) at neuronal levedygtighed er velholdt, men at det er vanskeligt at identificere en bestemt neuron med tiden når billeder er fremstillet med lange tidsintervaller mellem sessioner. Formentlig ville mønster af celler mærket med flere fluorophores være mere letgenkendelige, som er celler i lokaliserede grupper når observeret ved at rulle gennem en billedstak.
For at vurdere nytten af forskellige virale vektorer for indførelsen af udefrakommende gener i neuroner i hippocampus skiver, sammenlignede vi skive smitteevne benytter AV, AAV og rekombinante lentiviral vektorer, hver udtrykker forskellige fluorescerende tags eller ved hjælp af forskellige projektledere at drive udtryk. AV (2 x 107 smitsomme U/skive) udtrykker cofilin-mRFP bag en stærk, ikke-celle specifikke CMV promotor blev brugt til at inficere en mus hippocampus skive, der havde været kulturperler 9 uger på coverslips. Udtryk for cofilin-mRFP blev fundet i hele skive på 5 dage efter infektionen, med udtryk mest intense omkring skive periferien som observeret med en 4 x mål (figur 9A). Celler inden for udsnittets udtryk for cofilin-mRFP blev også observeret med en 20 X mål (fig. 9B) med nogle lyse punktformet farvning og også diffuse udtryk i både neuroner og ikke-neuronale celler. Efter 17 uger i kultur (8 uger efter infektionen), havde spontan cofilin-stænger dannet i nogle celler, formentlig drevet af overekspression af vildtype cofilin-mRFP (figur 9C)26,27.
Vi også vist, at AAV (1010 partikler) kunne anvendes til udtryk i skiver.Billeder af skiver inficeret på 9 uger i kultur med AAV, hvor en neuronal specifikke synapsin promotor kørte udtryk for GCaMP5-cofilin-mRFP med en selvstændig cleaving P2A peptid sekvens i linker oversatte polyprotein21, blev fanget 8 uger efter infektionen (17 uger i kultur). I neuroner udtryk for GCaMP5 og cofilin-mRFP, nogle cofilin stænger/aggregater dannet (figur 9D-F). Fluorescens-intensiteten af stænger/aggregater var så stærk, at meget lidt fluorescens af en diffus cofilin-mRFP kunne være observeret uden komplet mætning og blomstrende cofilin fluorescens billede af stænger. Spontan cofilin stænger vises i neuroner i som wild-type cofilin-fluorescerende proteiner kimærer har været over udtrykt26,27, samt i understregede neuroner10. Baseret på titers af adenovirus, som fastsættes på grundlag af smitteevne14 og partikel tæller anvendes til at bestemme AAV titer, omkring 100-500 gange højere partikel antal AAV er nødvendig for at opnå cirka den samme smitteevne / udtryk i skiver i forhold til AV.
For at følge rekombinant lentivirus-medieret udtryk af fluorescerende proteiner i skiver, var skiver smittet på 6 DIV med 1, 3, 10 og 30 µL delprøver af en rekombinant lentivirus for neuronal specifikke udtryk (synapsin promotor) af cofilin-R21Q-mRFP, udviklet som en levende celle imaging sonden for cofilin-actin stang dannelse16. Skiver var mærket med neuronal vitale farvestof på 11 DIV og afbildet i specifikke regioner for dye og cofilin-R21Q-mRFP udtryk på 12 og 14 DIV. Skive inficeret med 30 µL alikvot af virus overlevede ikke for billeddannelse men tredobbelt skiver behandlet med de andre bind af virus viste en dosisafhængig udtryk for mRFP. Figur 10 viser billeder af skiver inficeret med 1 µL og 10 µL af lentivirus på 6-8 dage efter infektionen. Flere regioner af to forskellige skiver var tal for Co farvning af neuroner med vitale farvestof og mRFP udtryk. For skiver inficeret med 1 µL af lentivirus, udtrykt ca 28% af neuroner mRFP på 6 dage efter infektion, forhøjes til 85% af 8 dage efter infektionen. For skiver inficeret med 10 µL af lentivirus, udtrykt ca. 58% af neuroner mRFP på 6 dage efter infektion, forhøjes til 86% af 8 dage efter infektionen. Således var 1 µL af lentivirus tilstrækkelige til at sikre udbredt skive smitteevne og neuronal udtryk af 8 dage efter infektionen.
For at vise, at denne kultur system er nyttige i følgende udvikling af cofilin patologi, skiver inficeret med lentivirus for at udtrykke cofilin-R21Q-mRFP i neuroner blev efterladt ubehandlet eller behandlet med forskellige koncentrationer (1 µM, 333 nM, og 100 nM) af syntetisk menneskelige Aβ-protein, der havde gennemgået inkubation form oligomerer28. Resultater fra tidligere undersøgelser viste denne syntetiske Aβo fremkalde cofilin-actin stænger i op til 25% af dissocierede hippocampus neuroner29,30,31. Alle tre skiver behandlet med 1 µM koncentrationen af Aβ kom løs fra coverslip i de første 24 timer, mens alle køretøjets behandlet skiver (kontrol) og dem, behandlet med 333 nM og 100 nM koncentrationer af Aβ overlevede i de to uger, som de blev fulgt. De samme cellulære regioner (CA1, CA3 og GD) i en skive, der er behandlet med 100 nM Aβo blev afbildet (60 x mål) over flere dage. Kontrol skiver, der blev smittet på 6 DIV med lentivirus for at udtrykke synapsin drevet cofilinR21Q-mRFP havde diffuse cellulære mRFP udtryk af 15 DIV (, punktFigur 11A). Skiver udsat for 100 nM Aβo på 14 DIV og afbildet på 15 DIV viste, at fordelingen af cofilin-R21Q-mRFP blev punktformet, optræder i begge stang formet strukturer og aggregater (fig. 11B). Disse strukturer blev endnu mere fremtrædende 6 dage efter Aβ-behandling (fig. 11C, som er det område af celler, som fig. 11B). Mange steder rig på neurites hvor neuronal celle svovldepositioner er fraværende (Figur 11D), udviklet punktformet og stang-lignende arrays af cofilinR21Q-mRFP (pile i fig. 11C), svarende til fordelingen af cofilin-actin stænger tidligere rapporteret inden for neurites af Aβ-behandlede neuroner i kultur29,30,31. Således, denne nye metode til dyrkning og observere hippocampus skiver vil indrømme brugernes hen til afgøre den langsigtede levedygtighed af celler i hvilke cofilin aggregater og stænger form og reversibiliteten af patologi på forskellige stadier af udvikling og nemt udføre dosis-respons målinger på reagenser, som kunne blokere eller tilbageføre dannelsen af cofilin patologi i en mere i vivo-gerne cellulære organisation.
Figur 1: Forberedelse af roller tube rack. (A) skabelon for at markere hullet holdninger til boring ud 15 cm vævskultur skål bunde. Hvis tallet er udskrevet til størrelsen af den skala bar vist, kan den skæres og bruges til markering af holdninger til en 15 cm kultur parabol til at bore huller vist. (B) afsluttet roller tube rack med to rør indsat. Hver rack er nummereret på en mærkat let synlige på toppen af rack. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2 : Forberedelse af roller kultur rør. (A) Front Se af roller rør indsat i en jig på en Boremaskinen til boring ud 6 mm hul i røret. Stiplet linje viser placeringen af flade dobbeltsidet roller røret i jig. (B) slut se på pirken med rør indsat og bore bit justeret over hullet. (C) Top view af hullet i jig til boring ud roller rør med en 6 mm borehoved.Hvid pil viser placeringen af cut-off neglen indsat som et stop for positionering rør, og sorte dobbelte streger er for lidt justering. (D) foråret klip (sort pil) installeret på jig bunden til sikkert holde den i position, når bore rør. (E) efter boring ud af hullet, kanterne er glattes med en afgratning værktøj og grooves er skåret på den indvendige side af hullet (inset viser hullet set gennem et mikroskop for dissektion) hen til forøge medium afløb fra hullet under tube rotation. (F) kultur tube med hullet justeret til et hul i silikone gummi lim, som vedhæftes coverslip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Forberedelse af hippocampus hjernen skiver. Billeder taget med en dissektion mikroskop viser: (A) intakt mus hjernen. Placeringen af nedskæringer for at fjerne forhjernen og lillehjernen er vist som blå stiplede linjer. (B) efter fjernelse af forhjernen og lillehjernen. (C) stykke af hjernen fra B er vendt 90 ° med posterior region (mod cerebellum) vender opad. Positionering stykket ud for siden af skålen hjælper med fjernelse af midthjernen (blå stiplede cirkel), som kan blive drillet fra resterende hippocampus, thalamus og hypothalamus. To snit med pincet (blå stiplede linjer) tillader den resterende stykke indeholdende hippocampus fra begge hjernehalvdele fordeles fladt. (D) den fladtrykte hjernen stykke viser blodkar kører langs den hippocampus revne (blå pil). Dette væv er placeret på plastfolie og overføres til væv chopper for udskæring i retning af den stiplede linje. (E) skiver væv viser lidt mere end en halv hippocampus efter at være vendt tilbage til GBSS/glucose. (F) endelige dissektion af hippocampus og rengøring af skiver til at fjerne ikke-hippocampus materiale. (G) flere flydende skiver efter sidste oprydning. (H) forstørret billede af en enkelt skive til overførsel til coverslip. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Forkromning og udrugning skiver. (A) A mus hippocampus skive er fjernet fra kultur parabol på spidsen af en spatel, ved hjælp af spidsen af pincet til at løfte den fri for løsningen. (B) Udsnittet er placeret lejlighed i midten af en photoetched og behandlet 12 mm coverslip på 2 µL af plasma, kylling og en anden 2,5 µL af en 1:1 plasma/thrombin blanding er tilføjet til at generere en blodprop. (C) efter blodprop er indstillet (omkring 1-2 min.), dækket er fjernet fra silikone gummi lim cirkel på en valse tube og coverslip er placeret med blodprop centreret i hullet; så coverslip er trykket på plads med en tommelfinger og holdes i position i ca 1 min. (D) Tilføj 0,8 mL af komplet næringssubstratet. (E) rulle tube indehavere inde i en stor rulle kuvøse med forsiden op for at vippe 5 ° for at holde mediet nederst i rørene. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Rulle tube holder og fase plade inkubator. (A) Tube indehaveren, der placerer røret sådan at coverslip opretholdes i position til billedbehandling. (B) Tube holder monteret i et mikroskop fase adapterplade. Skyderne på side holde røret sikkert for imaging. (C) fase adapter med tube holder og side paneler tilføjet indeholdende varme strimler tilsluttet en termoelektrisk temperatur controller. Når rør er monteret og placeret, kan en solid top til boksen tilføjes for at bevare temperaturen under imaging. Orange ledning er termoelement bly. Planer for konstruktion og bygning af etape adapter og varmer er tilgængelige på: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6 : Ved hjælp af referencepunkter for gentagne billeddannelse af samme celler. (A) hippocampus skive på photoetched coverslip (1 mm firkanter) med subiculum udfoldede sig (hale) set på med 4 x objektive og lyse felt belysning. Krumning af plast roller tube medvirker til at skabe en skrå belysning, der forbedrer visualisering af gitteret. Boksen viser placering og størrelse af en 60 X-felt. (B) en opfattelse af den samme skive med en 20 x mål for at finde den fiducial mark som spidsen af bunden af 4 fra pladsen 34. Y og x forskydningerne er vist reproducerbar finde midten af boksen ønskede for højere forstørrelse Konfokal billeddannelse. (C-F) En skive mærket med neuronal vitale farvestof 13 DIV var afbildet ved hjælp af en 60 x mål og gøre en 30 µm projektion billede på 4 dage i træk (14-17 DIV). Ens neuroner blev afbildet hver dag. Placeringen af kernen i hver af tre neuroner er markeret med et andet symbol. De identificeres nemt ved at rulle gennem billedstakke som deres 3D holdning ændringer lidt. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7 : Imaging neuroner i skiver med en neuronal vitale farvestof. (A) Neuronal vitale dye farvet skive i plasma blodprop taget 24 h efter plettering med 4 X mål. Farvestof (100 nM) blev tilføjet ved skive blev først anbringes i roller tube holder og vaskes ud 2 timer senere.Subiculum er krøllet rundt hippocampus i blodprop. (B-E) Efter blodprop opløsning af plasmin tilføjet på 6 DIV, skive blev genindlæst 5 gange med den vitale farvestof 24 timer forud for billeddannelse med ugentlige intervaller. Billeder vist blev indsamlet på 8, 21, 28 og 35 DIV (B-E, henholdsvis). (F) hippocampus skive kulturperler i 3 uger og farves med neuronal vitale farvestof 24 timer forud for billeddannelse med 4 X mål. (G) Konfokal stak af billeder på den samme skive som F viser en 3D-visning af 61 fly taget på 1 µm intervaller. Neuronal vitale farvestof klart etiketter både neurites og cellen kroppen, men det er udelukket fra kernen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8 : Gentagne imaging af neuroner i en enkelt placering af skive over 4 uger. Maksimal prognose billeder af 30 µm Konfokal billedstakke i det samme felt i celler (ved positionering) fra vital dye-mærket udsnit taget på 12, 20, 30 og 40 DIV (A-D, henholdsvis). Det er vanskeligt at identificere gentagne individuelle celler over de længere tidsfrister i projektion billeder. Men selv over disse lange perioder, identifikation af de samme celler er ofte muligt ved at rulle gennem billedstakke eller opbygge 3D-billeder, der kan drejes, som vist i figur 7G. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9 : Viral-medieret udtryk og billeddannelse af fluorescerende proteiner. (A) hippocampus skive kulturperler for 9 uger og inficeret med adenovirus for at udtrykke cofilin-mRFP bag en CMV promotor. Udtrykket blev fundet i hele skive på 5 dage efter infektionen men fluorescens var lyseste nær skive periferien. (B) samme skive viste udtryk i celler dybere i Skive set med 20 X mål. Billedet er en projektion fra en stak på 20 billeder fordelt 2 µm apart. (C) den samme skive blev undersøgt efter 17 uger i kultur (8 uger efter infektionen) og cofilin mRFP blev observeret i stang formet aggregater, som ses i denne projektion billede fra en 70 µm stak af 23 billeder, 3 µm apart, taget med en 40 X mål. (D-F) Musen hippocampus skive inficeret på 9 uger i kultur med en AAV udtryk for en GCaMP5-(P2A) - cofilin - mRFP bag en synapsin promotor. Fluorescens var synlig i både røde og grønne kanaler efter 10 dage. Et enkelt fly billede af skive her vises udtryk for (D) GCaMP5, calcium følsomme reporter, (E) mange cofilin-holdige stænger, og (F) en overlay billede. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10 : Udtryk for cofilin-R21Q-mRFP drevet af en synapsin promoter i neuroner inficeret med rekombinante lentiviral vektorer. Påvisning af en svag fluorescens signal er først observeret af om 3-4 dage efter infektionen ved hjælp af 10 µL af virus og bliver anvendelig af 5-6 dage, (E), som det ses i disse billeder, der er opnået med en 60 x mål. Selv om det tager længere tid at opnå de samme niveauer af udtryk med 1 µL af virus, en tilsvarende høj procentdel af neuroner (vital farvestof mærket) af 8 dage efter infektionen udtrykker cofilin-R21Q-mRFP. Kun 27% af neuroner var positive for mRFP fluorescens på 6 dage efter infektion med 1 µL (A, B), men dette er steget til 85% (C, D) 8 dage. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11 : Aβ oligomer-induceret cofilin patologi i mus hippocampus skiver. Alle billeder taget som 30 µm billede stakke med en 60 x mål og er vist som maksimal prognose billeder. Skiver var inficeret med cofilin-R21Q-mRFP på 6 DIV. (A) 15 DIV skive behandlet på 14 DIV med køretøjet (DMSO/SKINKER F12 medium bruges til at generere Aβo). (B) skive 15 DIV behandlet med 100 nM Aβo. (C) samme felt som i B taget på 20 DIV og vist i (D) som en overlejring med neuronal vitale farvestof etiket. Pilene viser lineære arrays af cofilin aggregater og stænger i regionen i det udsnit, der indeholder neurites, men få celle organer. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Roller tube metode beskrevet her giver mulighed for langsigtet dyrkning og høj opløsning live imaging af skiveskåret hjernevæv. Et stort problem med skive teknik som anvendt her er i montering og vedligeholdelse af skiver. Coverslip belægninger, der understøtter skive vedhæftning, fremme skive udtynding af styrkelse af udkommet af neurites og migration af celler fra Skive; dermed, vi undgik brug af disse substrater. Indsættelse af amino grupper på glasset ved behandling med 3-aminopropyltriethoxysilane forbedret overholdelse af skiver, men for lidt eller for meget kylling plasma på coverslip kan også forårsage overholdelse problemer fører til skive tab. Mængden af plasma behov for ordentlig vedhæftning er afhængig af størrelsen af kulturperler hjernen skive, og dermed er større for rotte hippocampus skiver, som er cirka 4 gange større i areal end mus hjernen skiver. Hvis for meget plasma blodpropper under skive, celle vedhæftning til coverslip er nedsat og behandling med plasmin vil løsne skive, så de ændrer holdning eller løsner helt. Men for lidt plasma i blodprop kan føre til skive tab i de første par dage af rotation i rugemaskinen. I et nyligt eksperiment der involverer 39 skiver, tre var tabt, men nogle af disse tabt kan have medført fra Skive skader, der opstår under udskæring processen. Ikke desto mindre, udarbejder vi normalt omkring 50% flere skiver end anslået antallet behov for eksperimentet. Den næststørste årsag til kultur problemer er lækage af medium omkring coverslip sæl. Dette problem forværres, når coverslips ikke er holdt fast i position i mindst 1 minut efter anbringelse dem til segl. Varmen fra tommelfingeren bruges til at anvende pres sandsynligvis hjælper komplet vedhæftning. Lækage, der forekommer er ofte gennem små luftkanaler under den coverslip, som kan observeres med en dissektion mikroskop. Disse forsvinder normalt ved hjælp af langvarig tommelfinger pres. Tab på omkring 2% af kulturer på grund af langsom lækage kan forventes og derfor anbefales det at vente ti dage efter oprettelsen af kulturer før udførelse af virusinfektioner. Overdreven tommelfinger pres, kan især hvis produceret ujævnt på tværs af coverslip, også forårsage coverslip hen til knæk. Hvis brud er et problem, kan at trykke på rør ned fast til en gummi musemåtte varmes i en inkubator bidrage til at give mere jævnt Tryk på tværs af coverslip.
Tidligere beskrevet metoder til hjernen skive kultur på membraner på luft-flydende interface (åbent system) eller på et glas coverslip inde i en forseglet plastikrør (lukket system) er meget effektiv til langtidsoverlevelse skive, men hver metode har sine styrker og svagheder. Skive kulturer på membraner på luften flydende interface er fordelagtige for kombinerede elektrofysiologiske undersøgelser med fordybelse mål for lang-dagsorden tænkelig7, men har ulemper med hensyn til at finde den nøjagtige felt af celler for reimaging over tid og potentielle bruger eksponering og objektive forurening, når du bruger viral-medieret genekspression. Brug af virus til udtryk af transgener er sikrere og lettere at udføre i et lukket system hvor forurening af mikroskop mål er ikke et problem. Vores ændrede roller tube metode giver adgang af skive for høj opløsning imaging, selv om det ikke er indstillet til elektrofysiologiske undersøgelser.
Skive dyrkningsbetingelser er blevet fastlagt for mange regioner i gnavere hjerne2, men her vi udnytter kun hippocampus, fordi det er en af de mest udbredte studeret hjerneregioner og forandringer, der sker i hippocampus er af stor interesse i undersøgelser af kognitiv svækkelse. De pyramideformede cellelag af regionerne CA og GD opretholde deres organisation i flere uger i kultur og let kan observeres morfologisk. Vi har udnyttet en nyudviklet fluorescerende neuronal levedygtighed markør25, som har fluorescens-egenskaber, der gør det muligt at blive brugt til at overvåge neuronal levedygtighed og organisation inden for hippocampus skiver over en periode af dage til måneder men også er kompatibel med brug af mange andre fluorescerende proteiner og journalister. Selv om ikke optimalt for NeuO fluorescens25, vi kan begejstre på NeuO på 488 nm og foranstaltning emission ved > 617 nm. Referencepunkternes på photoetched coverslips hjalp finde de samme celler gentagne gange over mange dage af kultur og tilladt os at billedet identiske regioner i skiver i mange uger. Stort set opstod ingen betydelig udtynding af skiver på modificerede glas coverslips i 5 uger i kultur, den længste tidspunkt, vi opnåede skive tykkelsesmålinger.
AV, AAV og rekombinant lentivirus vektorer fungerer godt for at udtrykke udefrakommende gener i skiver. Lentivirus med en neuronal specifikke promotor er især nyttig for at opnå udtryk i en meget høj procentdel (> 85%) af neuroner inden for 8 dage efter infektionen. Derudover viser vi, at cofilin-actin stang patologi forbundet med udvikling af kognitive underskud i menneskelige AD10,11 og Aβ overekspression mus AD modeller32 kan overvåges i Skive kulturer behandlet med relativt lave koncentrationer (100 nM) af syntetiske menneskelige Aβo. Vi forestiller os, at fremtidige anvendelser af denne metode vil omfatte kendetegner nye therapeutics for at vende cofilin-actin stang patologi og/eller korrekte dendritiske rygsøjlen abnormiteter, der forekommer i mange neurologiske33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
