Summary
Her er en modifisert valse røret metode for dyrking og intermitterende høyoppløselig avbilding av gnager hjernen skiver over mange uker med presis reposisjonering på photoetched coverslips. Neuronal levedyktighet og skive morfologi er godt vedlikeholdt. Anvendelser av innelukket systemet bruker virus for celle-type spesifikke uttrykk er gitt.
Abstract
Kultivert gnager hjernen stykker er nyttig for studerer cellulære og molekylære virkemåten til neurons og glia i et miljø som opprettholder mange av deres normale i vivo interaksjon. Skiver fra en rekke transgene musen linjer eller bruk av viral vektorer for uttrykk for fluorescently merket proteiner eller journalister i vill type hjernen skiver kan høy-resolution tenkelig ved fluorescens mikroskopi. Selv om flere metoder har blitt utviklet for imaging hjernen skiver, kombinerer skive kultur muligheten til å utføre utgjort repeterende høyoppløselige bilder i bestemte celler i levende skiver over lange tidsperioder problemer. Dette gjelder spesielt når viral vektorer brukes for uttrykk for eksogene proteiner siden dette er best gjort i et lukket system å beskytte brukerne og forhindre. Enkle endringer som er gjort til valse røret hjernen stykke kultur metoden, og at ved repeterende høyoppløselig avbildning av skiver over mange uker i et lukket system rapporteres. Dyrking skiver på photoetched coverslips tillater bruk av fiducial merker raskt og presist flytte scenen å bildet feltet identiske over tid før og etter ulike behandlinger. Eksempler vises for bruk av denne metoden kombinert med spesifikk neuronal farging og uttrykk for å observere endringer i hippocampus stykke arkitektur, viral-mediert neuronal uttrykk for fluorescerende proteiner og utvikling av cofilin patologi, som ble tidligere observert prefiks av Alzheimers sykdom (AD) skive behandling med oligomers av amyloid-β (Aβ) peptid som svar.
Introduction
Primære kultur dissosiert neurons fra regioner av gnager hjernen er et viktig verktøy brukes av forskere til å observere Svar å pathologically innblandet stimuli. Men har slike studier ulempen ved å se på nerveceller i bare 2D og uten deres glial støttesystem. Videre med mindre vokst under forhold med svært høy tetthet (640 neurons/mm2 eller ca 16% av arealet) der det blir umulig å følge tilfeldig resultatet av en dendrite eller axon for mer enn en kort avstand fra celle kroppen, hippocampus neuronal levedyktighet synker over 4 uker betydelig1, begrenser bruken av dissosiert kulturer for utvidede studier av alder-relaterte sykdommer. Dyrking av skiver forberedt fra gnager hjernen er et attraktivt alternativ som overvinner disse begrensningene ved å vedlikeholde en organisert celle arkitektur og levedyktigheten for uker eller måneder. For å opprettholde mange regioner av gnager hjernen i skive kultur har vært beskrevet2.
To store metoder brukes for langsiktig kultur av hjernen skiver: dyrking på membraner på luft-flytende grensesnitt3 eller dyrking på coverslips i forseglet rør kan rotere en valse inkubator å gi lufting4. Skiver kultivert på membraner kan avbildes direkte med høy oppløsning fluorescens mikroskopi bruke oppreist mikroskop og vann nedsenking mål5. Alternativt har skiver kultivert på membraner blitt overført til glass bunn retter å oppnå god oppløsning av dendrittiske spines bruker en invertert mikroskop6. Begge metodene Imaging skiver dyrket på membraner er imidlertid åpne systemer som krever middels endringer og bruker ofte soppdrepende og/eller antibiotika for å forhindre eller redusere forurensning5,6. Skiver på en membran i luften mellomstore grensesnittet opprettholde gode morfologi og overlevelse, men tilbake til nøyaktige under repeterende bildebehandling på forstørring er svært vanskelig med mindre eksperimentet følger bare små grupper av celler uttrykke merketråd fluorescerende. Selv om skiver dyrket på membraner har blitt brukt med viral-mediert uttrykk effekter av transgener5,6, kan biosafety protokoller kreve en lukket kultur-systemet benyttes for visse viral vektorer som brukes for uttrykke fluorescently merket proteiner og journalister av cellen fysiologi. Videre krever nedsenking mål dekontaminering mellom eksempler som skal følges i kultur5. En stor anvendelse av membran grensesnitt kulturer er å kombinere høy oppløsning bildebehandling med elektrofysiologi på gang poeng7.
Metoden valse røret med coverslips inne i plast røret tillater ikke noen elektrofysiologi eller høy-resolution tenkelig uten å fjerne dekkglassvæske. Dermed er denne metoden oftest brukt til langsiktige studier der etter fiksering observasjoner er gjort8. Beskrevet her er en metode som utnytter valse røret kultur teknikken, men på boret ut rør med skiver på coverslips som kan avbildes gjentagelser så lenge kulturer opprettholdes. Lukkede systemet krever ingen medium endring for bildebehandling og utnytter photoetched coverslips for å gi fiducial merker at imaging på forstørring, etter dager eller uker, presis feltene tidligere fotografert.
Vi bruker denne metoden for å undersøke endringer gnager prefiks, en stor hjerne region involvert inne hukommelse og læring. Gnager hippocampus er ofte studert som en modell for patologisk eller alder-relaterte endringer observert under utviklingen av kognitiv svekkelse9, for eksempel de som oppstår i Annonsen. Vår metode er spesielt godt egnet til å studere patologiske forandringer som utvikler i et enkelt stykke over tid som respons til endringer i miljøet, slik som økning i Aβ-peptider som er karakteristisk for AD8. En patologi forbundet med menneskelige og gnager AD hjernen er tilstedeværelsen av cofilin-utgangen aggregater og stenger, sistnevnte som inneholder bunter av filamenter som cofilin og utgangen er i en 1:1 molar forholdet10,11, 12. stenger har blitt observert i fast skiver av rotte hippocampus etter Aβ behandling, samt i en levende gnagere hjerne skive uttrykke cofilin-GFP utsatt for hypoksi8, og de kan bidra til at synaptic dysfunksjon i AD og slag. Her bruker vi denne nye culturing metoden for å observere den gang forløp og distribusjon i skiver av uttrykt eksogene chimeric fluorescerende proteiner introdusert av forskjellige virus. Vi deretter bruke neuronal bestemte uttrykk for en cofilin reporter konstruere å følge utviklingen av cofilin stang og samlet patologi i hippocampus skiver i respons på behandling med løselig Aβ oligomers (Aβo).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Dyr bruk følger godkjent avl og dyr bruk protokoller som svarer til Animal Care og bruk retningslinjer av Colorado State University.
Merk: Protokollen nedenfor beskriver metoden forberedelse og kultur for langsiktig inkubasjon og intermitterende avbilding av hippocampus skiver. En enkelt hippocampus skive er knyttet til et spesielt forberedt photoetched dekkglassvæske bruker en plasma blodpropp, og deretter coverslips er forseglet på den flate siden av en boret ut valse røret, som opprettholdes i en berg inkubator. Plasma clots oppløst med plasmin før virusinfeksjon fluorescerende protein uttrykk og høy-resolution tenkelig. En fluorescerende neuronal viktig fargestoff brukes å image nerveceller i skiver.
1. forberedelse av valse røret Rack
- Bruk malen vises i figur 1A skrevet ut størrelsen som er vist i skala-feltet. Med en spiker, slå små hull (store nok til en fin spiss markør) i malen sentrert på hullene.
- Angi malen på bunnen av en 15 cm vev kultur parabol (nominell diameter på 14 cm) og plassering av hullene. Gjenta dette på en andre rett.
- Med borekroner utformet for bruk på plast, bore seks 1,5 cm diameter hull på hver rett i et Sekskantet array (4,8 cm til midtpunkt) med hull sentre 2,5 cm fra kanten av parabolen. Bore tre hull (3 mm i diameter) 12 mm fra kanten som plasseres equidistantly mellom to av de større hullene som vist i figur 1A.
- Med bunnen av hver rett mot hverandre, plassere en 2,5 tommers lang maskin skruen (3/16 tommers diameter) med en flat skive gjennom en av de små hullene etterfulgt av en andre flat skive, et stykke av polyetylen rør (spacer, 4,7 cm), en annen flat vaskemaskin , andre vev kultur parabol, en annen flat skive, en låsing skive og en mutter.
- Gjenta trinn 1.4 på de andre to maskin skruene, og skjerper bare løst til alle maskin skruene er på plass. Stram nøtter sikkert.
- Arbeide grommets (5/16 tomme tykk, 5/8 tommers hull diameter) inn i hullene på bunnen rett hente siste valse røret rack (figur 1B, vises med to rør på plass). Plassere et klistremerke på hvert rack med et unikt nummer.
2. forberedelse av Roller rør og Coverslips
- Gjør jig for boring hullet i Rull rør
- Bore 1,5 cm hull 8 cm dyp center side av en 2 x 4 x 5,5 tommer tre blokk i en vinkel slik at den flate siden av valsen rør vil være nesten parallelt med blokken når satt inn (figur 2A).
- Forstørre hullet med en runde tre fil både bredere og taper hullet for å tillate innsetting av rør (Rull rør er litt større i diameter cap slutten) (figur 2B).
- Bore et 1,5 cm diameter loddrette hull, 5,5 cm fra siden av blokken, og sentrert over siden hullet (figur 2C).
- Når siden hullet er konisk nok, sett en valse røret som er merket på det ønskede stedet center hullet for skive og plassere røret slik merket stedet er sentrert i 1,5 cm loddrett hullet.
- Fjern røret og måle avstanden fra stedet til slutten av røret. Merk denne avstanden fra midten av hullet i dekopaj og sette en spiker for å gi en stopper for å plassere riktig røret for boring (pil i figur 2C).
- Bruk en hacksaw for å kutt neglen rustfrie med overflaten av tre blokken å hindre skade.
- Legge til våren klipp nederst på pilken hvis det er en drill trykk med spor som tillater det å være forankret (figur 2D svart pil). Ellers bruk C-klemmer for å holde dekopaj trygt på bore trykk.
- Bruker dekopaj beskrevet ovenfor for å holde og plassere en flat side 11 cm plast kultur rør med den flate siden opp (figur 2A), bore en 6 mm diameter hull med center 1.0 cm fra bunnen og sentrert mellom sidene av røret.
Merk: En borekrone designet for plast bør brukes. - Med en swiveling deburring verktøyet, jevne ut kantene i hullet (figur 2E) og gjøre 4 riller på innsiden kanten av hullet (figur 2E, innfelt) å lette drenering av hullet under rotasjon.
- Med 12 mm hull punch, skjær 12 mm diameter disker fra giftfri dobbel side lim silisium belegget. Bruke et standard en papir hull (6 mm diameter), lage et hull i midten av hver disk.
- Skyll boret rør med 70% etanol, luft tørke dem i en biologiske sikkerhetskabinett skap, og sterilisere rør og stemplet selvklebende plater for 40 min under UV lampen (30 W med 70 cm gjennomsnittsavstand) i biologisk sikkerhet regjering.
- Omplasser rør og plater etter 20 min slik at alle synlige flater er sterilisert. Under sterile forhold, skrelle av hvit støtte fra en selvklebende plate og påføre silikongummi på utsiden av en tube, justere hullene (figur 2F).
Advarsel: For å unngå UV eksponering, Bruk vernebriller og Lukk kabinettet før du slår på UV-lampen. - Rengjør 12 mm diameter photoetched (100 center nummerert 1 mm firkanter) tyske glass coverslips. Hold coverslips forsiktig med tang og dukkert i absolutt etanol, etterfulgt av vann, etterfulgt av absolutt etanol igjen, og til slutt dypp coverslips i en flamme å brenne av etanol. Tillate coverslips å kjøle.
- Holder coverslips med tang, dyppe i 2% 3-aminopropyltriethoxysilane i aceton for 10 s. skylling coverslips med ultrapure vann og la luften tørr.
- Sette coverslips på sterilt filter papir i en biologiske sikkerhetskabinett skap og slå på UV lys. Vise hver side av coverslips etter 20 min.
Advarsel: For å unngå UV eksponering, Bruk vernebriller og Lukk kabinettet før du slår på UV-lampen.
3. hippocampus skive forberedelse
- Før du starter dissection, forberede halvdelene av tveegget barberblader vev chopper. Brett bladene på langs med fingrene og feste i halvparten.
- Skyll blad halvdelene med aceton med en bomullspinne å rense dem, fulgt av skylling i absolutt etanol og luft tørke.
Merk: Hjernen stykke kultur protokollen er uavhengig av mus, rotte belastning eller genotype. Mange transgene musen linjer med ulik genetisk bakgrunn har blitt brukt.
- Med tang, hold trimmet hjernen bakre side opp og ventral side mot siden av Petriskål for stabilitet. Forsiktig erte bort meninges rundt sagittal midtlinjen og fjerne mellomhjernen vev ved hjelp av en fin tippet Dumont #5 pinsett (Figur 3C, stiplet sirkel).
- Gjøre to kutt langs siden av hjernen til å spre den åpen (Figur 3C, stiplede linjer). Når hjernen plasseres dorsal side ned og spre åpne, hippocampus sprekken skal vises (Figur 3D, pil).
- Overføre oppslag åpne hjernen til et stykke polychlorotrifluoroethylene plastfilm og plasser den til kutting på scenen av en vev helikopter. Våt bladet med GBSS/glukose og hogge hippocampus i ~ 300 µm tykke skiver.
- Med en overføring pipette, tømme skiver hjernen av plastfilmen i en fersk 60 mm fat som inneholder GBSS/glukose (Figur 3E). Forsiktig knipe av og erte, med fine tippet tang, gjenværende meninges og andre ikke-hippocampus vev (Figur 3F) fra skiver (Figur 3G, H).
4. plating skiver
- Når stykker har oppnådd, plassere 2 µL av kylling plasma på midten av den photoetched siden av en forberedt dekkglassvæske. Spre plasma litt for å oppnå en 3-4 mm diameter spot.
Merk: Siden photoetched er oversiden av dekkglassvæske sett gjennom disseksjon mikroskop slik at tallene blir riktig orientert. - Overføre 1 hjernen skive med en bakteriefri smal tupp slikkepott (Figur 4A) til plasma punktet (Figur 4B). Bruk stengt tang for å holde sektoren på slikkepott spissen mens du løfter stykket fra GBSS/glukose.
- Touch slikkepott til plasma spot på dekkglassvæske, og med stengt tang, presse sektoren på dekkglassvæske.
- Mix 2.5 µL av plasma med 2,5 µL av trombin i et separat rør. Raskt plassere 2,5 µL av denne blandingen over og rundt skive og Pipetter opp og ned forsiktig for å blande den (Figur 4B).
Merk: Plasma vil levre innen 10-15 s, så dette må gjøres raskt. Hvis skive vedheft er et problem, bland 5 µL plasma med 5 µL trombin og bruker 4-5 µL på sektoren, fjerne noen etter blanding slik at stykket ligger flatt på dekkglassvæske. - Fjern klar plast dekker fra den synlige siden av silikon gummi limet tidligere festet til en valse røret og plasser dekkglassvæske med hjernen sektoren på limet justere sektoren i hullet (Figur 4C).
- For å sikre heft, bruk myke, selv press på dekkglassvæske med tommel ved å trykke på dekkglassvæske ned jevnt og holde det i ca 1 min mens du overfører den til den biologiske sikkerhetskabinett kabinett.
- I en biologisk sikkerhet regjering, legge 0,8 mL komplett Neurobasal A kultur medium (Table of Materials) til hver tube (Figur 4D).
- Flyte en 5% CO2/95% luft blanding gjennom en steril bomull-koblet Pasteur pipette holdt sikkert av en klemme. Rødme valse røret med gassblanding og raskt cap røret som det trekkes fra rundt pipette.
- Merk rør med SKIVE tallet og rack tall. Rør inn en berg-rack, sikre geometrisk balansert. Hvis det er et ulikt antall rør, legge rør å balansere.
- Plasser stativer i en 35 ° C roller inkubator med valser snu roller rack på om 10-13 RPH (Figur 4E). For å holde mediet i bunnen av rør, tilt inkubator tilbake ca 5° ved å heve foran på et bord.
- Angi skive og rør på et regneark, som brukes til å registrere all informasjon skive behandlinger og observasjon datoer.
- På omtrent dag 6 i kultur, legge til 1 µL (0,002 U) av aktive plasmin i hver retning.
- Etter clots oppløse helt (vanligvis innen noen timer), fjerne mediet og erstatte den med ferske medium uten plasmin. Eventuelt skiver kan være inkubert med plasmin over natten og mediet endret neste dag.
- Skiver er vanligvis ruges i minst 7-10 dager før bruk i eksperimenter. Sug opp medium og erstatte den i dag 3 eller 4, igjen på dag 7, og hver 7 dager etterpå.
5. utarbeidelse av Viral vektorer for Transgene uttrykk
Merk: Uttrykk for effekter av transgener i nevronene skive kulturer er oppnådd ved hjelp av hjernen fra genmodifiserte gnagere eller ved innføring av transgene av infeksjon med rekombinant replikering mangelfull virus.Adenoviruses (AV), adeno-assosiert virus (AAV) og rekombinant lentivirus vektorer har alle blitt brukt i våre hippocampus skive kulturer for uttrykk for annet fluorescerende protein chimeras i hjernen skiver.
- Forbered replikering mangelfull AV for å uttrykke RNA rundt ut metodene beskrevet andre steder13,14. Titer virus for smittsomme U/mL av føljetong fortynning metoden bruker et antistoff en virally uttrykt protein som beskrevet14. Å observere cofilin aggregater og cofilin-utgangen rod formasjon, utnytte cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plasmider #51279)16.
Merk: Synapsin 1 selskapet er et utmerket valg for neuronal bestemte uttrykk15, mens cytomegalovirus er nyttig for kjøring høy uttrykk nivåer i mange celle typer13. - Klargjør AAV ved co transfection overføring plasmider inneholder genet av interesse og en rep/lue plasmider, med eller uten en hjelper plasmider, i HEK293 emballasje celler, som leverer viral E1 genet, som beskrevet tidligere17,18.
Merk: Rekombinant AAV kan også gjøres for målrettet innsetting verten celle genomet19. Overføre plasmider bruker vi human cofilin 1 med en C-terminalen mRFP1 fluorescens protein kode (plasmider #50856) klonet i en synapsin som inneholder promoter AAV plasmider nedstrøms fra kalsium sensoren GCaMP5G20. Et stykke av DNA koding P2A selv cleaving peptid sekvensen er satt inn av PCR mellom GCaMP5G og cofilin-RFP, under utarbeidelsen av overføring plasmider å gi uttrykk for begge proteiner fra en enkelt AAV transkripsjon21. - Forberede rekombinant lentivirus vektorer av co transfection av overføring plasmider som inneholder genet eller cDNA av interesse og integrering signaler, sammen med en tredjegenerasjons lentivirus emballasje blanding som skiller viral vits, pol, rev og vsv-g gener på tre separate plasmider22,23.
- For overføring plasmider, bruk et enkelttrinn kloning system24 for å samle synapsin selskapet samt cofilin-R21Q-mRFP cDNA (fra plasmider #51279) til pLKO.1-GFP (plasmider #30323), med synapsin arrangøren og cofilin-R21Q-mRFP erstatte hPGK arrangøren og GFP cDNA, henholdsvis.
- Transfect den endelige plasmider i HEK293T celler av kalsium fosfat som beskrevet tidligere23.
- Samle medium fra fire 10 cm retter, konsentrere til 500 µL med 150K-cutoff sentrifugal konsentratorer og lagre de endelige lentivirus ved-80 ° C i små dele etter rask frysing i flytende nitrogen. Tine en aliquot bare én gang for å infisere celler.
- Bestemme empirisk volumet av hver virus forberedt på å oppnå graden av uttrykket ønsket ved å sette opp en rekke forskjellige skive kulturer å følge uttrykk for den effekter av transgener etter smitte med ulike mengder virus.
Merk: Vanligvis 1-10 µL av virus er brukt per sektor.
6. skive behandlinger
- Infisere skiver med virus
- Arbeider i en biologisk sikkerhet regjering godkjent for virus arbeid på biologiske sikkerhetskabinett nivå passer for vektor, bland en aliquot av viruset (vanligvis 1-10 µL) med 0,8 mL av komplett medium.
- Sug opp mediet skive med en bakteriefri Pasteur pipette i en samling felle med blekemiddel. En sekundær felle brukes alltid mellom første fellen og vakuum kilden.
- Erstatte dette mediet med virus inneholder aliquot forberedt ovenfor, returnerer kultur rør til en rack og plassere i inkubator.
- Etter 2-5 dager med rugende skiver med virus i biologisk sikkerhet regjering, fjerne virus som inneholder mediet med en bakteriefri overføring pipette og legg den i en flaske som inneholder en godkjent antivirale agent å drepe virus.
- Farging av neurons med viktig fargestoff
- Forberede og lagre dele fluorescerende neuronal viktig fargestoff25 ved rask frysing 4 µL av dele i flytende nitrogen i en konsentrasjon av 100 µM og lagre disse på 20 ° C. Ikke fryse/tine fargestoff flere ganger.
- Etiketten neurons for visualisering av fluorescens mikroskopi, tine en aliquot av neuronal viktig fargestoff og fortynne til 4 mL i fullstendig Neurobasal medium (siste fargestoff konsentrasjonen er 100 nM).
- Fjerne mediet fra skiver av aspirasjon (eller med en overføring pipette Hvis mediet inneholder virus) og erstatte den med 0,8 mL av mediet som inneholder 100 nM neuronal viktig fargestoff. Tilbake skiver til roller apparatet i inkubator.
- Etter rugende sektorene for 2t, Sug opp fargestoff som inneholder mediet og erstatte den med 0,8 mL frisk komplett medium i en biologisk sikkerhet regjering.
Merk: Merking av nerveceller i skiver med viktig fargestoff krever flere timers inkubasjon. De første bildene er vanligvis tatt 24 timer etter fargestoff behandling. Selv om neurons er spesielt merket, er det bakgrunnen fluorescens som avslår over 2-3 dager å gi bedre neuronal bildebehandling. Intensiteten av vitale fargestoff avtar etter 72 h. - For å følge endringer i skive morfologi over tid, relabel skiver hver 7 dager.
7. Skjær Imaging
- Vis skiver i en invertert mikroskop. For smarteste fluorescens bildebehandling, på 24 h før bildebehandling, utveksle kultur medium med komplett Neurobasal A medium uten fenol Red pH indikatoren.
Merk: For eksperimenter rapporterte her, skiver vises på en invertert spinning plate AC confocal fluorescens mikroskop utstyrt med en lineær kodet x, y scenen med piezo z kontroll og en følsom høyoppløst digital kameraet. - Overføre røret med SKIVE kulturen til å avbildes og roller tube apparater til skreddersydde t abonnenten (figur 5A), som er plassert i scenen kortet (figur 5B), å holde dekkglassvæske vinkelrett målet og opprettholde sektoren i samme retning under repeterende tenkelig økter over lange perioder.
- Skyv glidebryteren på scenen kortet tett mot røret holde røret i posisjon (figur 5B).
Merk: Detaljer av rør holderen, scenen kortet, og varmeren kan nås på: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Merk: Disse off-set posisjoner fra fiducial merke tillater konsekvent pinpointing av samme dekkglassvæske sted når stykket er fotografert, selv om den opprinnelige x, y innstillingen av fiducial merke endringer når rør eller scenen kortet fjernes og erstattes.
Merk: Bilde fly er vanligvis hentet i intervaller på 0,5 µm til 2 µm, avhengig av størrelsen og oppløsningen av funksjonene. Bygge en kvalitet 3D image krever at funksjoner strekke seg over flere fly av oppkjøpet, og så for å visualisere mindre funksjoner, mindre intervaller kreves mellom fly.
Merk: De fleste tenkelig øktene rapportert her var under 18 min/skive. Men vi har fotografert noen skiver ti eller flere ganger, og som lenge 40 min i en enkelt økt, uten tilsynelatende skade i den langsiktige overlevelsen av stykket.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Fiducial merker kan brukes til å bestemme hvor nøyaktig for å reimage de samme cellene i de samme feltene over tid, undersøkte vi skiver dyrket på photoetched coverslips (figur 6en). Neurons var visualisert ved farging med en viktig fargestoff (100 nM for 2t; ikke flekker ikke-neuronal celler), som forsvinner fra neurons over tid uten å skade celler25. Vi identifisert en fiducial hake i en enkelt rute (figur 6A, B), fant et område viktig fargestoff-merket neurons 24 timer etter merking, registrert x og y-forskyvning posisjoner fra fiducial merke (figur 6B) og samlet, bruker en 60 X mål, AC confocal bildestakker i denne regionen, gjentatt avbilding på 4 dager. Maksimal projeksjon bilder av en 30 µm bildestakk tatt på samme sted vises (figur 6C-F). Selv om noen morfologiske endringer forekommer i området over 4 dager, kan identiske celler (hvorav flere er merket) følges over tid. Fluorescens intensiteten av vitale fargestoff falt over tid, men neurons fortsatt var klart identifiserbare 4 dager etter merking. Selv om de fleste av neuronal viktig fargestoff fluorescens var diffus i cytoplasma, noen vises punctate flekker ble alltid observert, som ble tydeligere som bakgrunn fluorescens avslått. I usunn skiver, ble en vises punctate flekker av ikke-neuronal celler også observert som skiver forverret. Disse resultatene viser at identifiserte celler i skiver kan avbildes gjentagelser med fiducial merker for å finne dem.
For å undersøke tidsavhengige endringer i neuronal organisasjon og gjennomførbarheten i stykker under langsiktige kultur, fulgte vi den samme skiver over 5 uker, merking med fluorescerende neuronal viktig fargestoff én gang i uken 24 timer før bildebehandling. Flere runder med flekker med denne viktige fargestoff over flere uker økt akkumulering av aggregater. Neurons i fersk belagt skiver som var fortsatt i plasma clots ble lastet med fargestoff og fotografert på en dag i vitro (1 DIV). Samme sektorene ble fotografert igjen hver uke i 5 uker. Profilen oppnådd fra en enkelt skive med en 4 x målet vises (figur 7AE). Pyramideformet celle lagene i CA og DG sterkt merket når opphisset på 488 nm og fluorescens utslipp avmålt for > 620 nm. Over en 5-ukers periode for å observere 19 skiver, kom tre skiver av dekkglassvæske og to andre mistet sin typiske morfologi og ble ugjennomsiktig, en indikasjon på deres død. Dermed, anses som en overlevelse på ca 70% for eksperimenter, og ekstra skiver forberedt å sikre et tilstrekkelig antall for analyse. Skiver var forberedt på en nominell breddeinnstilling på vev chopper på 300 µm. Etter 5 uker i kultur målt vi skive tykkelsen av tenkelig neuronal viktig fargestoff-farget skiver fra dekkglassvæske opp gjennom stykket med en 40 X oljeobjektiv på en roterende plate AC confocal mikroskop. Tap av fokus av neurons skjedde på gjennomsnittlig 257 nm (n = 5 skiver med flere steder brukes per stykke), viser at lite fortynning av stykket hadde skjedd fra tidspunktet for plating. Vi kunne ikke nøyaktig måle skive tykkelsen av fluorescens mikroskopi ved plating fordi viktig fargestoff fanget i plasma blodpropp ga diffus fluorescens gjør det vanskelig å måle nøyaktig posisjon som tap av fokus oppstod. Imidlertid er 3D-bilder av neurons i skiver lett oppnådd i skiver etter plasma blodpropp fjernes. 21 DIV sektoren, vises i lav forstørrelsesnivået i figur 7F, ble avbildet med en 60 X mål på AC confocal mikroskop (1 µm trinn) 3 dager etter lasting med neuronal viktig fargestoff. En 60 µm 3D image ble bygget fra fokal flyene (figur 7G). Neurons og deres neurite prosesser som er merket med viktig fargestoff kan følges i 3D. Morfologi og 3D strukturen i skiver var godt vedlikeholdt over minst 3 måneder, og lengste tiden ble brukt i denne studien.
Store endringer i morfologi av en tidligere fotografert posisjon også skjedd i noen skiver, antyder at bevegelsen på sektoren på dekkglassvæske kan finne sted. Sikkert, over lengre intervaller mellom imaging ble det vanskeligere å vite med sikkerhet at cellene i feltet blir fotografert var identiske til de i tidligere tenkelig økter. Dermed viser maksimal projeksjon bilder av AC confocal stabler av vitale fargestoff-merket skiver kjøpt på samme sted med 60 x målet på ukentlige intervaller som spenner over 4 uker (Figur 8) at neuronal levedyktighet er godt vedlikeholdt, men at det er vanskelig å identifisere en bestemt Nevron over tid når bilder hentes med lang tidsintervaller mellom økter. Antagelig ville mønster av celler merket med flere fluorophores være mer lett gjenkjennelig, som celler i lokaliserte grupper når observert ved å rulle gjennom en bildestakk.
For å vurdere nytten av ulike viral vektorer for innføring av eksogene gener i nevroner i hippocampus skiver, sammenlignet vi skive infectivity ved hjelp AV og AAV rekombinant lentiviral vektorer, hver uttrykke ulike fluorescerende koder eller bruke ulike arrangører til stasjonen uttrykk. AV (2 x 107 smittsomme U/skive) uttrykker cofilin-mRFP bak en sterk, ikke-celle bestemt CMV promoter ble brukt til å infisere en mus hippocampus skive som hadde vært kulturperler 9 uker på coverslips. Uttrykk for cofilin-mRFP ble funnet i sektoren på 5 dager etter smitte, mest intense rundt skive periferien observert med en 4 x mål (figur 9A)-uttrykk. Celler i sektoren uttrykke cofilin-mRFP ble også observert med en 20 X mål (figur 9B) med noen lyse vises punctate flekker og også diffuse uttrykk i både nevroner og ikke-neuronal celler. Etter 17 uker i kultur (8 uker etter smitte), hadde spontan cofilin-stenger dannet i noen celler, antagelig drevet av overuttrykte wild type cofilin-mRFP (figur 9C)26,27.
Vi har også vist at AAV (1010 partikler) kan brukes for uttrykk i skiver.Bilder av skiver infisert på 9 uker i kultur med AAV, som kjørte en neuronal bestemte synapsin promoter uttrykk for GCaMP5-cofilin-mRFP med en selv cleaving P2A peptid sekvens i linker oversatt polyprotein21, ble fanget 8 uker etter infeksjon (17 uker i kultur). I neurons uttrykke GCaMP5 og cofilin-mRFP, noen cofilin stenger/aggregater dannet (figur 9D-F). Fluorescens intensiteten av stenger/aggregater var så sterk at lite fluorescens av en diffus cofilin-mRFP kunne observeres uten full metning og blomstrende av cofilin fluorescens bildet av stenger. Spontan cofilin stenger vises i nerveceller som vill-type cofilin-fluorescerende protein chimeras har vært over uttrykt26,27, samt understreket neurons10. Basert på titers av adenovirus, som bestemmes på grunnlag av infectivity14 og partikkel teller brukes for å bestemme AAV titer, med 100 til 500 ganger høyere partikkel antall AAV er nødvendig for å oppnå omtrent den samme infectivity / uttrykk i skiver forhold til AV.
For å følge rekombinant lentivirus-mediert uttrykk for fluorescerende proteiner i skiver, var skiver infisert 6 DIV med 1, 3, 10 og 30 µL dele en rekombinant lentivirus for neuronal bestemte uttrykk (synapsin promoter) for cofilin-R21Q-mRFP, utviklet som en levende celle imaging sonde cofilin-utgangen rod formasjon16. Skiver var merket med neuronal viktig fargestoff på 11 DIV og fotografert i bestemte regioner for fargestoff og cofilin-R21Q-mRFP uttrykk på 12 og 14 DIV. Stykket infisert med 30 µL aliquot virus overlevde ikke for bildebehandling, men tre eksemplarer skiver behandlet med de andre mengder virus viste en doseavhengig uttrykk for mRFP. Figur 10 viser bilder av skiver infisert med 1 µL og 10 µL av lentivirus på 6 og 8 dager etter smitte. Flere områder av to forskjellige skiver kvantifisert til co farging av neurons med viktig fargestoffet og mRFP uttrykk. For skiver infisert med 1 µL av lentivirus, uttrykt om 28% av neurons mRFP på 6 dager etter smitte, økende til 85% av 8 dager etter smitte. For skiver infisert med 10 µL av lentivirus, uttrykt ca 58% av neurons mRFP på 6 dager etter smitte, økende til 86% av 8 dager etter smitte. Dermed var 1 µL av lentivirus nok til å gi omfattende skive infectivity og neuronal uttrykk av 8 dager etter smitte.
For å demonstrere at dette kultur-systemet er nyttig i følgende utviklingen av cofilin patologi, skiver infisert med lentivirus for å uttrykke cofilin-R21Q-mRFP i nevronene etterlatt ubehandlet eller behandlet med ulike konsentrasjoner (1 µM, 333 nM og 100 nM) av syntetisk menneskelige Aβ protein som hadde gjennomgått inkubasjon til skjemaet oligomers28. Resultater fra tidligere studier viste at syntetiske Aβo indusere cofilin-utgangen stenger i opptil 25% av dissosiert hippocampus neurons29,30,31. Alle tre skiver behandlet med 1 µM konsentrasjonen av Aβ løsnet fra dekkglassvæske i de første 24, mens alle kjøretøy behandlet skiver (kontroll) og de behandlet med 333 nM og 100 nM konsentrasjoner av Aβ overlevde de to ukene som de ble fulgt. Samme mobilnettet regionene (CA1 CA3 og DG) i en skive behandlet med 100 nM Aβo ble fotografert (60 x objektiv) over flere dager. Kontroll stykker som ble smittet på 6 DIV med lentivirus for å uttrykke synapsin drevet cofilinR21Q-mRFP hadde diffus mobilnettet mRFP uttrykket av 15 DIV (Figur 11A). Skiver utsatt for 100 nM Aβo på 14 DIV og fotografert på 15 DIV viste at fordelingen av cofilin-R21Q-mRFP ble vises punctate, vises i både rod strukturer og aggregat (Figur 11B). Disse strukturene ble enda mer prominent 6 dager etter Aβ-behandling (Figur 11C, som er det samme feltet celleområde som Figur 11B). Mange steder rik på neurites hvor neuronal celle somas er borte (Figur 11D), vises punctate og stangen som matriser av cofilinR21Q-mRFP utviklet (piler i Figur 11C), lik fordeling av cofilin-utgangen stenger tidligere rapportert i neurites av Aβ-behandlet nerveceller i kultur29,30,31. Derfor vil denne nye metoden for dyrking og observere hippocampus skiver tillate brukere å bestemme den langsiktige levedyktigheten til celler i cofilin som samler og stenger form og Reversibilitet av patologi på ulike stadier av utviklingen, og lett utføre dose-respons målinger på reagensene som kan blokkere eller reversere dannelsen av cofilin patologi i en mer i vivo-liker mobilnettet organisasjon.
Figur 1: Utarbeidelse av valse røret rack. (A) mal for merking hull stillinger for boring ut 15 cm vev kultur parabol bunner. Hvis figuren skrives til størrelsen på skala-linjen som vises, kan det kuttet ut og brukes for å merke plasseringene på en 15 cm kultur parabol for bore hullene vises. (B) fullført valse røret rack med to rør inn. Hver rack er nummerert på et klistremerke lett synlig på toppen av stativet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2 : Forberedelse av roller kultur tuber. (A) foran visning av valse røret i en gigg på en drill Trykk for boring ut 6 mm hull i røret. Stiplet linje viser plasseringen av flat ensidig roller røret i dekopaj. (B) vise av dekopaj med rør inn og bor på linje over hull. (C) ovenifra hullet i dekopaj for boring ut roller rør med en 6 mm borekronen.Hvite pil viser plasseringen av cut-off spikeren satt inn som et stoppested for posisjonering rør, og svart doble linjer for litt justering. (D) våren klipp (svart pil) installert jig nederst å sikkert holde det i posisjon ved boring rør. (E) etter boring ut hullet, kantene er smoothed med deburring verktøyet og spor kuttes på innsiden av hullet (innfelt viser hullet vises gjennom disseksjon mikroskop) å forsterke middels drenering fra hullet under tube rotasjon. (F) kultur rør med hull justert til et hull i silikon gummi limet, som knyttet til dekkglassvæske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: Utarbeidelse av hippocampus hjernen skiver. Bilder tatt med en disseksjon mikroskop viser: (A) intakt musen hjernen. Plasseringen av kutt å fjerne forebrain og lillehjernen vises som blå stiplede linjer. (B) etter fjerning av forebrain og lillehjernen. (C) stykke hjernen fra B er snudd 90 ° med bakre regionen (mot lillehjernen) vendt oppover. Posisjonering stykket ved siden av parabolen hjelper med fjerning av mellomhjernen (blå stiplet sirkel) som kan være teased fra den gjenværende hippocampus, thalamus og hypothalamus. To kutt med tang (blå stiplet linje) at gjenværende stykket inneholder hippocampus fra begge halvkuler å være spredt flatt. (D) flate hjernen stykke viser blodkaret kjører langs hippocampus rennen (blå pil). Dette vevet er plassert på plastfolie og overført til vev chopper til kutting i retning av den stiplede linjen. (E) skiver vev viser litt mer enn halvparten hippocampus etter returneres til GBSS/glukose. (F) Final Disseksjon av hippocampus og rengjøring sektorene å fjerne ikke-hippocampus materiale. (G) flere flytende skiver etter siste finpuss. (H) forstørret bilde av et enkelt stykke for overføring til dekkglassvæske. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4 : Plating og rugende skiver. (A) A musen hippocampus skive fjernes fra kultur rett på spissen av en slikkepott med spissen av tang til å løfte det fri fra løsningen. (B) stykket er plassert i midten av en photoetched og behandlet 12 mm dekkglassvæske på 2 µL av kylling plasma og en annen 2,5 µL av en 1:1 plasma/trombin blanding legges til å generere en blodpropp. (C) etter blodpropp er angitt (ca 1-2 min), dekket fjernes fra silikon gummi Selvklebende sirkelen på en rull rør og dekkglassvæske plassert med blodpropp sentrert i hullet; dekkglassvæske er trykket på plass med en tommel og holdt i posisjon i ca 1 (D) Legg til 0,8 mL fullstendig kultur medium. (E) Roller tube holdere i en stor Berg inkubator med foran reist for å vippe 5 ° for å holde mediet nederst i rørene. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Valse røret holderen og scenen plate inkubator. (A) Tube holder som plasserer røret slik at dekkglassvæske opprettholdes i posisjon for bildebehandling. (B) Tube holder montert i et mikroskop scenen adapterplate. Glidere på siden holder røret trygt for imaging. (C) scenen adapter med rør holderen og sideplater lagt inneholder Varmebånd koblet til en termoelektrisk temperatur kontroller. Når rørene montert og plassert, kan en solid topp til boksen legges for å opprettholde temperaturen under bildebehandling. Oransje wire er thermocouple ledelsen. Planer for design og bygging av scenen kortet og varmeapparatet er tilgjengelig på: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6 : Bruke fiducial merker for repeterende imaging samme celleområde. (A) hippocampus skive på photoetched dekkglassvæske (1 mm torg) med subiculum foregikk (halen) vises med 4 x objektive og lys belysning. Krumning av plast valse røret bidrar til å skape en skrå belysning som forbedrer visualisering av rutenettet. Boksen viser posisjonen og størrelsen av en 60 X-feltet. (B) en visning av samme stykke med en 20 x mål for å finne fiducial merket som spissen av bunnen av 4 fra 34-plassen. Y og x forskyvningene vises reproduserbar finne midten av boksen ønsket for høyere forstørrelse AC confocal bildebehandling. (C-F) En skive merket med neuronal viktig fargestoff 13 DIV ble avbildet med en 60 x målsetting og gjør en 30 µm projeksjon bilde på 4 dager (14-17 DIV). Identiske neurons ble fotografert hver dag. Plasseringen av kjernen i hver av tre neurons er merket med et annet symbol. De er mer lett identifiseres ved å rulle gjennom bildestakker som 3D posisjon endringer litt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7 : Imaging nerveceller i skiver med en neuronal viktig fargestoff. (A) Neuronal viktig fargestoff farget sektor i plasma blodpropp tatt 24 timer etter plating med 4 X-målet. Fargestoff (100 nM) ble lagt til da stykket var først plassert i valse røret holderen og vasket ut 2 timer senere.Subiculum er krøllet rundt hippocampus i blodpropp. (B--E) Etter blodpropp oppløsningen av plasmin lagt på 6 DIV, var stykket reloaded 5 ganger med viktig fargestoff 24 timer før bildebehandling på ukentlige intervaller. Bilder vist var samlet på 8, 21, 28 og 35 DIV (B-E, henholdsvis). (F) hippocampus skive kultivert i 3 uker og farget med neuronal viktig fargestoff 24 timer før bildebehandling med 4 X-målet. (G) AC Confocal stabelen av bilder på samme stykke som F viser en 3D-visning av 61 fly tatt på 1 µm intervaller. Neuronal viktig fargestoff tydelig etiketter både neurites og celle kroppen, men det er utelukket fra kjernen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 8 : Repeterende imaging av nerveceller i én enkelt plassering av stykket over 4 uker. Maksimal projeksjon bilder av 30 µm AC confocal bildestakker i feltet av celler (ved å plassere) fra avgjørende fargestoff-merket skiver tatt på 12, 20, 30 og 40 DIV (A-D, henholdsvis). Det er vanskelig å full av gjentagelser identifiserer individuelle celler over lengre tidsrammer projeksjon bilder. Men selv i disse lange perioder, identifikasjon av de samme cellene er ofte mulig ved å bla gjennom bildestakker eller bygge 3D-bilder som kan roteres, slik som vist i figur 7G. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 9 : Viral-mediert uttrykk og bildebehandling fluorescerende proteiner. (A) hippocampus skive kultivert i 9 uker og infisert med adenovirus for å uttrykke cofilin-mRFP bak en CMV promoter. Uttrykket ble funnet i sektoren på 5 dager etter smitte men fluorescens var smarteste nær skive periferien. (B) samme stykke viste uttrykk i celler dypere i sektoren sett med 20 X mål. Bildet er en projeksjon fra en stabel med 20 bilder linjeavstand 2 µm fra hverandre. (C) samme stykke ble undersøkt etter 17 uker i kultur (8 uker etter smitte) og cofilin mRFP ble observert i stang formet aggregater som sett i projeksjon bildet fra en 70 µm stabel av 23 bilder, 3 µm hverandre, tatt med en 40 X-målet. (D-F) Musen hippocampus skive infisert på 9 uker i kultur med en AAV uttrykke en GCaMP5-(P2A) - cofilin - mRFP bak en synapsin promoter. Fluorescens var synlig i både rødt og grønt kanaler etter 10 dager. En enkelt flyet bilde av stykket viser uttrykket av (D) GCaMP5, kalsium følsom reporter, (E) mange cofilin inneholder stenger, og (F) et overlegg bilde. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 10 : Uttrykk for cofilin-R21Q-mRFP drevet av en synapsin promoter i nevronene infisert av rekombinant lentiviral vektorer. Påvisning av en svak fluorescens signal er først observert av om 3-4 dager etter infeksjon med 10 µL av virus og blir anvendelig med 5-6 dager, (E) som vist i disse bildene kjøpt med en 60 x målsetting. Selv om det tar lengre tid å oppnå samme nivå av uttrykk med 1 µL av virus, av 8 dager etter infeksjon en lignende høy andel av neurons (viktig fargestoff merket) var uttrykke cofilin-R21Q-mRFP. Bare 27% av neurons var positiv til mRFP fluorescens på 6 dager etter smitte med 1 µL (A, B) men dette økt til 85% (C, D) 8 dager. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 11 : Aβ oligomer-indusert cofilin patologi i musen hippocampus skiver. Alle bilder tatt som 30 µm stabler med en 60 x mål og vises som maksimal projeksjon bilder. Skiver var infisert med cofilin-R21Q-mRFP på 6 DIV. (A) 15 DIV skive behandlet på 14 DIV med kjøretøy (DMSO/HAMS F12 medium brukes til å generere Aβo). (B) skive 15 DIV behandlet med 100 nM Aβo. (C) samme felt som i B tatt på 20 DIV og vises som et overlegg med neuronal viktig fargestoff etikett i (D). Pilene viser lineære arrays av cofilin aggregater og stenger i regionen i sektoren som inneholder neurites men få cellen legemer. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Valse røret metoden beskrevet her gir langsiktig dyrking og høy oppløsning live bildebehandling av skiver hjernevev. En viktig sak med SKIVE teknikken som brukes her er i montering og vedlikehold av skiver. Dekkglassvæske belegg som støtter skive vedheft, fremme skive tynning ved å forbedre resultatet av neurites og migrering av celler av stykket; dermed unngikk vi bruk av disse underlag. Innsetting av amino grupper på glasset av behandling med 3-aminopropyltriethoxysilane bedre etterlevelse av skiver, men for lite eller for mye kylling plasma på dekkglassvæske kan også føre til etterlevelse problemer som fører til tap av skive. Volumet av plasma nødvendig for god er avhengig av størrelsen på kulturperler hjernen stykket, og dermed er større for rotte hippocampus skiver, som er ca 4 ganger større i området enn musen hjernen skiver. Hvis for mye plasma blodpropp under stykket, celle vedheft til dekkglassvæske er svekket og behandling med plasmin vil løsne sektoren slik at den endres posisjon eller løsner helt. Imidlertid kan for lite plasma i blodpropp føre til skive tap i de første dagene av rotasjon i inkubator. I et siste eksperiment som involverer 39 skiver, tre var tapt, men noen av de tapt kan har resultert fra skive skader som er oppstått under prosessen med slicing. Likevel, forbereder vi vanligvis ca 50% flere stykker enn anslått nødvendig for eksperimentet. Den andre ledende årsaken til kultur problemer er lekkasje av middels rundt dekkglassvæske segl. Problemet forverres når coverslips ikke er holdt fast i posisjon for minst 1 min etter påføring dem til segl. Varmen fra tommelen brukes til å legge press sannsynligvis hjelper fullføre vedheft. Lekkasje som oppstår er ofte gjennom små luftkanaler under dekkglassvæske som kan observeres med disseksjon mikroskop. Disse forsvinner vanligvis ved hjelp langvarig tommelen press. Tap av om lag 2% av kulturer på grunn av treg lekkasje kan forventes, og derfor er det anbefalt å vente 10 dager etter å sette opp kulturer før du utfører virusinfeksjoner. Overdreven tommelen press, kan særlig hvis produsert ujevnt over dekkglassvæske, også forårsake dekkglassvæske å knekke. Hvis brudd er et problem, kan trykke rør ned flatt på en gummi musematte varmet i en inkubator hjelpe for å gir jevnere press over dekkglassvæske.
Tidligere beskrevet metoder for hjernen stykke kultur på membraner i luft-flytende grensesnittet (åpent system) eller et glass dekkglassvæske inne i et forseglet plast rør (lukket system) er svært effektive for langsiktig skive overlevelse, men hver metode har sine styrker og svakheter. Skive kulturer på membraner i luften flytende grensesnittet er fordelaktig for kombinert elektrofysiologiske studier med nedsenking mål for høy-resolution tenkelig7, men har ulemper med hensyn til å finne nøyaktig innen celler for reimaging over tid og potensielle bruker eksponering og objektive forurensning ved viral-mediert genuttrykk. Bruk av virus for uttrykk for effekter av transgener er tryggere og enklere å utføre i et lukket system hvor forurensning av mikroskopet mål er ikke et problem. Våre endret valse røret metoden gir tilgang på sektoren for høyoppløselig bildebehandling, selv om det ikke er mottakelig for elektrofysiologiske studier.
Skive kultur forhold er etablert for mange områder av gnager hjernen2, men her vi utnytter bare hippocampus fordi det er en av de mest studerte hjernen regionene og endringene som skjer i hippocampus er av stor interesse for studier av kognitiv svekkelse. Pyramideformet celle lagene i CA og DG opprettholde organisasjonen over flere uker i kultur og kan være lett observert morphologically. Vi har benyttet et nyutviklet fluorescerende neuronal levedyktighet markør25, som fluorescens egenskaper som tillater det å overvåke neuronal levedyktighet og organisasjonen i hippocampus skiver over perioder dager til måneder men også kompatibel med bruk av mange andre fluorescerende proteiner og journalister. Selv om ikke optimalt for NeuO fluorescens25, vi kan opphisse på NeuO på 488 nm og måle utslippet på > 617 nm. Fiducial merker på photoetched coverslips hjalp finne samme cellene gjentagelser over mange dager av kultur og tillatt oss å identiske bildesoner sektorene i mange uker. Nesten oppstod ingen betydelig tynning sektorene på modifisert glasset coverslips under 5 uker i kultur, det lengste punktet som vi fikk skive tykkelsen.
AV og AAV rekombinant lentivirus vektorer fungerer bra for uttrykke eksogene gener i skiver. Lentivirus med en neuronal bestemt promoter er spesielt nyttig for å få uttrykk i en svært høy andel (> 85%) av neurons innen 8 dager etter smitte. Videre viser vi at cofilin-utgangen rod patologi forbundet med utvikling av kognitiv underskudd i menneskelig AD10,11 og Aβ overexpressing mus AD modeller32 overvåkes i skive kulturer behandlet med relativt lave konsentrasjoner (100 nM) av syntetiske menneskelige Aβo. Vi ser at fremtidige anvendelser av denne metoden vil inkludere karakteriserer nye therapeutics for å reversere cofilin-utgangen rod patologi og/eller riktig dendrittiske ryggraden unormalt som forekommer i mange nevrologiske lidelser33.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
