Summary
Presentado aquí es un método de tubo de rodillo modificado para cultivo e intermitente proyección de imagen de alta resolución del cerebro de roedor rodajas durante muchas semanas con reposicionamiento preciso en photoetched cubreobjetos. Viabilidad neuronal y la morfología de la rebanada se mantienen bien. Se proporcionan aplicaciones de este sistema totalmente cerrado con virus para la expresión específica de tipo celular.
Abstract
Rebanadas de cerebro de roedor cultivadas son útiles para estudiar el comportamiento celular y molecular de las neuronas y glia en un entorno que mantiene muchas de sus interacciones normales en vivo . Rebanadas de una variedad de líneas de ratón transgénico o el uso de vectores virales para la expresión de proteínas fluorescencia etiquetas o reporteros en rebanadas de cerebro de tipo salvaje permiten proyección de imagen de alta resolución por microscopía de fluorescencia. Aunque se han desarrollado varios métodos para rebanadas de cerebro, combinando cultura rebanada con la capacidad para realizar la proyección de imagen repetitiva imagen alta resolución de células específicas en rebanadas vivo durante largos períodos de tiempo ha planteado problemas. Esto es especialmente cierto cuando los vectores virales se utilizan para la expresión de proteínas exógenas, puesto que esto se hace mejor en un sistema cerrado para proteger a los usuarios y evitar la contaminación cruzada. Simples modificaciones al método de cultivo rodaja rodillo tubo cerebro que permiten la repetitiva imagen de alta resolución de rebanadas durante muchas semanas en un sistema cerrado se divulgan. Rodajas en photoetched cubreobjetos de cultivo permite el uso de marcas fiduciales a rápidamente y exactamente colocar el escenario para el campo idéntico de la imagen en el tiempo antes y después de diferentes tratamientos. Se muestran ejemplos para el uso de este método combinado con tinción neuronal específica y expresión en hipocampo slice arquitectura viral mediada por la expresión neuronal de proteínas fluorescentes y el desarrollo de la patología de cofilin, que previamente se observó en el hipocampo de la enfermedad de Alzheimer (AD) en respuesta al tratamiento de la rebanada con oligómeros del péptido amiloide-β (Aβ).
Introduction
Cultivo primario de neuronas disociadas de las regiones del cerebro de roedor es un instrumento importante utilizado por los investigadores para observar respuestas a patológico implicado estímulos. Sin embargo, estos estudios tienen la desventaja de mirar las neuronas en 2D solo y sin su sistema de soporte de glial. Además, a menos que se cultivan bajo condiciones de muy alta densidad (640 neuronas/mm2 o cerca de 16% de la superficie) en el cual se convierte en imposible seguir un resultado aleatorio de una dendrita o un axón para más que una corta distancia del cuerpo celular hipocampal viabilidad neuronal durante 4 semanas LTO1, limitar el uso de culturas disociadas estudios extendidos de patologías relacionadas con la edad. El cultivo de las rebanadas de cerebro de roedor es una opción atractiva que supera estas limitaciones al mantener una arquitectura celular organizado y viabilidad durante semanas o meses. Condiciones para el mantenimiento de diferentes regiones del cerebro de roedor en sector cultura han sido descritas2.
Dos métodos principales son ampliamente utilizados para el cultivo a largo plazo de las rebanadas de cerebro: permite para girar en un incubador de rodillo para proporcionar aireación4cultivo de membranas en la interfaz aire-líquido3 o cultivo en cubreobjetos en tubos cerrados. Sectores cultivados en las membranas pueden ser directamente reflejadas con microscopía de fluorescencia de alta resolución usando un microscopio vertical y de objetivos de inmersión de agua5. Por otra parte, sectores cultivados en las membranas han sido transferidos a platos de fondo de vidrio para lograr la buena resolución de espinas dendríticas usando un microscopio invertido6. Sin embargo, ambos métodos de rebanadas en las membranas de la proyección de imagen son sistemas abiertos que requieren cambios medianas y suelen utilizan antifúngicos o antibióticos para prevenir o reducir la contaminación5,6. Rodajas en una membrana en la interfase medio aire mantienen excelente morfología y supervivencia, pero volviendo a lugares precisos en imágenes repetitivas a alta magnificación es extremadamente difícil a menos que el experimento sigue sólo pequeños grupos de células expresan un marcador fluorescente. Aunque se han utilizado láminas en membranas con viral mediada por la expresión de los transgenes5,6, protocolos de bioseguridad pueden requerir un sistema de cultivo cerrado se emplea para ciertos vectores virales que se utilizan para expresión de fluorescencia con la etiqueta proteínas y reporteros de fisiología de la célula. Además, objetivos de inmersión requieren descontaminación entre las muestras que se seguirá en la cultura5. Una aplicación importante de las culturas de interfaz de membrana es la combinación de imágenes de alta resolución con electrofisiología en vez puntos7.
El método de tubo de rodillo con cubreobjetos dentro del tubo plástico no permite cualquier electrofisiología o la proyección de imagen de alta resolución sin quitar el cubreobjetos. Por lo tanto, este método se ha aplicado más a menudo posible a los estudios a largo plazo en el que se han hecho observaciones posteriores a la fijación8. Se describe aquí es un método que utiliza la técnica de cultivo de tubo de rodillo pero en tubos perforados hacia fuera con rodajas en cubre-objetos que pueden ser reflejada repetidamente durante el tiempo que las culturas se mantiene. El sistema cerrado no requiere ningún cambio medio para la proyección de imagen y utiliza photoetched cubreobjetos para proporcionar marcas fiduciales que permiten la proyección de imagen a gran aumento, después de días o semanas, los precisos campos anteriormente reflejados.
Aplicamos este método para examinar los cambios en el hipocampo de roedor, una región del cerebro importante en la memoria y el aprendizaje. El hipocampo de roedor a menudo se estudia como modelo para patológicas o relacionadas con la edad cambios observados durante el desarrollo de deterioro cognitivo9, como las que ocurren en AD. Nuestro método está particularmente bien adaptado para el estudio de los cambios patológicos que se desarrollan dentro de una sola rebanada con el tiempo en respuesta a cambios ambientales, tales como aumento de péptidos Aβ, que es característico de AD8. Una patología asociada con cerebro humano y roedor AD es la presencia de agregados de actina cofilin y varillas, los paquetes que contiene éste de filamentos de actina y cofilin están en una relación molar 1:110,11, 12. las barras se han observado en fijadas rebanadas de hipocampo de rata después del tratamiento de Aβ, así como dentro de un trozo de cerebro de roedor vivo expresando cofilin-GFP sometido a hipoxia8, y pueden contribuir a la disfunción sináptica en AD y accidente cerebrovascular. Aquí utilizamos este nuevo método de cultivo para observar la evolución temporal y distribución dentro de rebanadas de expresadas proteínas fluorescentes quiméricas exógenas introducidas por virus diferentes. Luego utilizamos la expresión específica neuronal de una construcción de reportero cofilin para seguir el desarrollo de la barra de cofilin y patología agregada en rebanadas hippocampal en respuesta al tratamiento con oligómeros de Aß soluble (Aβo).
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Protocol
Uso de animales sigue cría aprobado y protocolos de uso de animales que se ajusten al cuidado Animal y utilizar las pautas de la Universidad Estatal de Colorado.
Nota: El protocolo a continuación describe el método de preparación y cultura para la incubación a largo plazo y la proyección de imagen intermitente de rebanadas hippocampal. Una sola rebanada hippocampal se une a un cubreobjetos photoetched especialmente preparado con un coágulo de plasma, y luego el cubreobjetos se sellan en la parte plana de un tubo de rodillo perforado-hacia fuera, que se mantiene en una incubadora de rodillo. Se disuelven los coágulos de plasma con plasmina antes de la infección viral de la expresión de la proteína fluorescente y proyección de imagen de alta resolución. Un colorante vital neuronal fluorescente se utiliza para las neuronas dentro de las rebanadas de la imagen.
1. preparación del estante de tubo de rodillo
- Uso la plantilla se muestra en la figura 1A imprime al tamaño que se muestra en la barra de escala. Con un clavo, taladro pequeño (lo suficientemente grande para un marcador de punta fina) en la plantilla centrada en los agujeros.
- Fijar la plantilla en el fondo de un plato de cultivo de tejidos de 15 cm (diámetro nominal de 14 cm) y marque la posición de los agujeros. Repetir este proceso en un segundo plato.
- Con brocas para taladro diseñados para plásticos, perfore seis agujeros de diámetro de 1,5 cm en cada plato en una matriz hexagonal (4,8 cm centro a centro) con centros de agujero 2,5 cm desde el borde del plato. Perfore tres agujeros (3 mm de diámetro) 12 mm desde el borde que equidistantly se colocan entre dos de los agujeros más grandes como se muestra en la figura 1A.
- Con el fondo de cada plato uno frente al otro, coloque un tornillo de máquina largo de 2,5 pulgadas (3/16 de pulgada de diámetro) con una arandela plana por uno de los agujeritos, seguidos por una segunda arandela plana, una pieza de polietileno tubería (separador, 4,7 cm), otra arandela plana , el segundo plato de cultivo de tejidos, otra arandela plana, una arandela de bloqueo y una tuerca.
- Repita el paso 1.4 sobre los dos tornillos y apriete solamente libremente hasta que todos los tornillos de máquina. Luego apriete bien las tuercas.
- Trabajar los ojales (5/16 de pulgada espesor, diámetro de agujero de 5/8 pulgada) en los orificios del plato inferior para obtener el final tubo bastidor (figura 1B; se muestra con dos tubos). Coloque una etiqueta en cada estante con un número único.
2. preparación de los tubos del rodillo y cubreobjetos
- Hacer la plantilla para el taladrado en tubos roller
- Perfore un orificio de 1.5 cm 8 cm de profundidad en la zona centro de 2 x 4 x 5,5 pulgadas el bloque de madera en un ángulo tal que el lado plano del rodillo tubo voluntad ser casi paralelo con el bloque cuando se insertan (figura 2A).
- Agrande el orificio utilizando una lima redonda de madera para ampliar tanto el agujero para permitir la inserción del tubo de la forma cónica (tubos de rodillos son un poco más grandes de diámetro cerca del extremo de la tapa) (figura 2B).
- Taladrar un agujero vertical de 1,5 cm diámetro, 5.5 cm desde el lado del bloque y centrado sobre el agujero lateral (figura 2C).
- Cuando el agujero lateral es afilado lo suficiente, inserte un tubo del rodillo que está marcado en el punto deseado para centrar el agujero para el corte y coloque el tubo de modo que esté centrado el lugar marcado en el agujero vertical de 1,5 cm.
- Retire el tubo y mida la distancia desde el punto hasta el final del tubo. Marque esta distancia desde el centro del agujero en la plantilla e introduzca un clavo para proporcionar una parada para colocar correctamente el tubo de perforación (flecha en figura 2C).
- Utilice una sierra para cortar las uñas al ras con la superficie de un bloque de madera para evitar lesiones.
- Añadir clips de resorte en la parte inferior de la plantilla si hay una prensa del taladro con ranuras que permiten que sea anclada (figura 2D negro flecha). De lo contrario, use abrazaderas en C para sostener la plantilla firmemente en la prensa del taladro.
- Utilizando la plantilla descrita para sujetar y colocar un tubo de plástico cultura cara plana 11 cm con la cara plana hacia arriba (figura 2A), taladre un orificio de diámetro 6 mm con el centro de 1,0 cm de la parte inferior y centrada entre los lados del tubo.
Nota: Debe utilizarse una broca de taladro diseñada para plástico. - Con una herramienta giratoria de desbarbado, suavizar los bordes del agujero (figura 2E) y 4 ranuras en la parte interior borde del orificio (figura 2E, de la inserción) para facilitar el drenaje del agujero durante la rotación.
- Con un agujero de 12 mm perforar, cortar discos de diámetro de 12 mm de láminas de caucho no tóxico doble cara adhesivo silicon. Usando un sacador de papel de un agujero estándar (diámetro de 6 mm), haga un agujero en el centro de cada disco.
- Enjuague los tubos perforados con etanol al 70%, el aire los seque en un gabinete de seguridad biológica y para esterilizar los tubos y los discos perforados de adhesivo durante 40 minutos bajo la lámpara UV (30 W a una distancia promedio de 70 cm) en el gabinete de seguridad biológica.
- Vuelva a colocar los tubos y discos después de 20 minutos para que todas las superficies expuestas son esterilizadas. Bajo condiciones estériles, retire el blanco de un disco adhesivo y pegue el caucho de silicona en el exterior de un tubo, alineando los orificios (figura 2F).
PRECAUCIÓN: Para evitar la exposición Ultravioleta, use protección para los ojos y cerrar la caja antes de encender la lámpara Ultravioleta. - Limpiar 12 mm diámetro photoetched (100 centro número 1 mm cuadrados) cubreobjetos de cristal alemán. Sostenga suavemente el cubreobjetos con el fórceps y la inmersión en etanol absoluto, seguido por el agua, seguido de etanol absoluto y finalmente sumergir el cubreobjetos en una llama para quemar el etanol. Permiten el cubreobjetos que se enfríe.
- Sostiene el cubreobjetos con pinzas, sumerja en 3 aminopropyltriethoxysilane 2% en acetona por 10 s. Enjuague el cubreobjetos con agua ultrapura y déjela secar al aire.
- El cubreobjetos en papel de filtro estéril dentro de una seguridad biológica gabinete y gire a la luz en el ultravioleta. Exponer a cada lado del cubreobjetos por 20 min.
PRECAUCIÓN: Para evitar la exposición Ultravioleta, use protección para los ojos y cerrar la caja antes de encender la lámpara Ultravioleta.
3. hipocampo sector preparación
- Antes de comenzar la disección, preparar las mitades de hojas de afeitar de doble filos para el picador de tejido. Dobla las hojas a lo largo con cuidado con los dedos y ajustar a la mitad.
- Enjuague las mitades de la hoja con acetona, utilizando un hisopo de algodón para limpiarlos, seguido por enjuague en etanol absoluto y secado de aire.
Nota: El protocolo de cerebro sector cultura es independiente de cepa de rata, ratón o genotipo. Muchas líneas de ratón transgénico con diferentes fondos genéticos se han utilizado.
- Con pinzas, sujete el recortado cerebro posterior hacia arriba y lado ventral contra el lado de la placa de Petri para la estabilidad. Suavemente se burlan ausentes meninges alrededor de la línea media sagital y extirpar el tejido de cerebro medio usando un fórceps Dumont #5 con punta fino (figura 3C, círculo discontinua).
- Hacer dos cortes a lo largo de la parte del cerebro a lo abierto (figura 3C, líneas discontinuas). Una vez que el cerebro se coloca el lado dorsal hacia abajo y abierta de propagación, debe verse la fisura hipocampal (D,figura 3, flecha).
- Transferir el cerebro abierto de extensión a un pedazo de película plástica polychlorotrifluoroethylene y posición para cortar en el escenario de un chopper de tejido. Moje la hoja con glucosa GBSS y picar el hipocampo en rodajas gruesas de ~ 300 μm.
- Con una pipeta, enjuague el cerebro rebanado apagado la película plástica en un plato fresco 60 mm que contiene glucosa GBSS (figura 3E). Suavemente apriete y tease, con pinzas con punta finas, las meninges restantes y otros tejidos no hipocampo (figura 3F) de las láminas (figura 3G, H).
4. galjanoplastia rebanadas
- Una vez que han sido obtenidas de rodajas, Coloque 2 μl de plasma de pollo en el centro del lado photoetched de un cubreobjetos preparado. Se separó el plasma ligeramente para conseguir un lugar de 3-4 mm de diámetro.
Nota: El lado photoetched es el lado superior del cubreobjetos cuando se mira a través de un microscopio de disección, tales que los números están orientados correctamente. - Transferencia 1 rebanada del cerebro con una espátula estéril de punta estrecha (figura 4A) hasta el lugar de plasma (figura 4B). Utilice pinzas cerradas para mantener la rodaja en la punta de la espátula mientras levanta la rebanada de la GBSS/glucosa.
- Toque la espátula al plasma spot sobre el cubreobjetos y con unas pinzas cerradas, empuje la rodaja sobre el cubreobjetos.
- Mezcla 2.5 μl de plasma con 2.5 μl de la trombina en un tubo separado. Rápidamente Coloque 2.5 μl de esta mezcla sobre y alrededor de la rebanada y la pipeta hacia arriba y hacia abajo suavemente para mezclarlo (figura 4B).
Nota: El plasma se coagule dentro de 10-15 s, así que esto debe hacerse rápidamente. Si slice es un problema, mezclar 5 plasma μl con trombina μl 5 y 4-5 μL en el segmento, eliminar algunos después de mezclar para que la rodaja se encuentra sobre el cubreobjetos. - Quite el plástico transparente desde el lado expuesto del adhesivo de caucho de silicona previamente colocado en un tubo de rodillo y colocar el cubreobjetos con la rebanada del cerebro sobre el adhesivo alinear el segmento dentro del orificio (figura 4C).
- Para garantizar la adherencia, presionar suave, incluso para el cubreobjetos con el dedo pulgar presionando uniformemente el cubreobjetos y mantiene durante aproximadamente 1 minuto durante la transferencia para el gabinete de seguridad biológica.
- En un gabinete de seguridad biológica, agregar 0,8 mL de medio de cultivo A Neurobasal completado (Tabla de materiales) a cada tubo (figura 4D).
- Flujo de una mezcla de aire 95% de 5% CO2a través de una pipeta de Pasteur de la enchufada de algodón estéril sostenida firmemente por una abrazadera. Enjuagar el tubo del rodillo con la mezcla de gas y cerrar rápidamente el tubo, se retira de alrededor de la pipeta.
- Etiqueta los tubos con el número de sector y número de estante. Introduzca los tubos en un bastidor de rodillos, asegurando que estén equilibrados geométricamente. Si hay un número impar de los tubos, añadir tubos para equilibrar.
- Coloque las parrillas en una incubadora de rodillo de 35 ° C con los rodillos girando el bastidor de rodillo en sobre RPH de 10-13 (figura 4E). Para mantener el medio en la parte inferior de los tubos, inclinar la incubadora hacia atrás aproximadamente 5° levantando su frente en una mesa.
- Introduzca el número de corte y tubo sobre una hoja de cálculo, que se utiliza para registrar toda la información de tratamientos de corte y las fechas de observación.
- En aproximadamente el día 6 en la cultura, añadir 1 μl (0.002 U) de la plasmina activa a cada tubo.
- Después de que los coágulos se disuelven totalmente (generalmente dentro de algunas horas), quitarlo del medio y reemplazarlo con medio fresco sin plasmina. Si es necesario, rebanadas pueden incubarse con plasmina durante la noche y el medio cambió al día siguiente.
- Generalmente se incuban rebanadas durante al menos 7-10 días antes de su uso en experimentos. Aspirar el medio y sustituirlo en día 3 o 4, el día 7 y cada 7 días después de eso.
5. preparación de vectores virales para la expresión de transgenes
Nota: Expresión de transgenes en las neuronas del sector culturas se logra mediante el uso de los cerebros de los roedores modificados genéticamente o mediante la introducción del transgén por infección con virus deficientes recombinante replicación.Adenovirus (AV), virus adeno-asociados (AAV) y lentivirus recombinante vectores se todos han utilizado en nuestras culturas hippocampal de la rebanada para la expresión de quimeras de la proteína fluorescente diferente en rebanadas de cerebro.
- Preparar la replicación deficiente AV para expresar el RNA de interés según los métodos descrito en otra parte13,14. Título de los virus para U infecciosa/mL por el método de dilución seriada con un anticuerpo para una proteína viral expresada como describen14. Observar cofilin agregados y la formación de la barra de cofilin-actina, utilizar el cDNA de cofilin-R21Q-mRFP (plásmido #51279)16.
Nota: El sinapsina 1 promotor es una excelente expresión específica neuronal15, mientras que el promotor de citomegalovirus es útil para la conducción de los niveles de alta expresión en muchos tipos de la célula13. - Prepare AAV la transfección de la transferencia de plásmido que contiene el gen de interés y un plásmido rep/tapa, con o sin un plásmido helper, en las células HEK293 empaquetado, que suministrar el gen E1 viral, como se describió anteriormente17,18.
Nota: También es posible la inserción específica en el anfitrión célula genoma19AAV recombinante. El plásmido de transferencia, utilizamos cofilin humano 1 con una terminal C mRFP1 fluorescencia proteína etiqueta (plásmido #50856) clonada en un sinapsina que contienen el promotor AAV plásmido aguas abajo del sensor GCaMP5G calcio20. Un trozo de ADN que codifican la secuencia de péptido auto Hendedoras P2A se inserta por PCR entre GCaMP5G y cofilin-RFP durante la preparación del plásmido de transferencia para proporcionar expresión de ambas proteínas de una sola de transcripción AAV21. - Preparación de vectores recombinantes lentivirus por la transfección del plásmido de transferencia que contiene el gen o ADNc de interés e integración de señales, junto con un lentivirus de la tercera generación embalaje mezcla que divide el viral gag, pol, rev y los genes de vsv-g en tres plásmidos separados22,23.
- Para el plásmido de transferencia, utilice un solo paso sistema24 de clonación para ensamblar el promotor sinapsina y cDNA cofilin-R21Q-mRFP (del plásmido #51279) en pLKO.1-GFP (plásmido #30323), con el promotor sinapsina y cofilin-R21Q-mRFP reemplazando el hPGK promotor y cDNA GFP, respectivamente.
- Transfectar final plásmido en las células HEK293T por fosfato de calcio como se describió anteriormente23.
- Recoger medio de cuatro platos de 10 cm, concentrado a 500 μl con concentradores centrífugos de corte de 150K y almacenar los lentivirus final a-80 ° C en alícuotas pequeñas después de la rápida congelación en nitrógeno líquido. Descongelar una alícuota sólo una vez para infectar las células.
- Determinar empíricamente que el volumen de cada tipo de virus preparados para obtener el grado de expresión deseada al establecer un número de segmento diferentes culturas para seguir la expresión de los transgenes después de la infección con diferentes cantidades de virus.
Nota: Normalmente, se utiliza 1-10 μl de virus por rebanada.
6. rebanar los tratamientos
- Rebanadas de infección con el virus de
- Trabajar en un gabinete de seguridad biológico aprobado para el trabajo de virus en el nivel de seguridad biológica adecuado para el vector, mezclar una alícuota del virus (generalmente 1-10 μl) con 0.8 mL de medio completo.
- Aspire el medio de la rebanada utilizando una pipeta Pasteur estéril en una trampa de colección que contiene cloro. Una trampa de secundaria utiliza siempre entre la primera trampa y la fuente de vacío.
- Sustituir este medio con la alícuota que contiene virus preparada sobre retomar los tubos de cultivo de un estante y colocar en la incubadora.
- Después de 2-5 días de incubación de las láminas con el virus en el gabinete de seguridad biológica, quitarlo del medio que contiene el virus con una pipeta de transferencia estéril y colocar en una botella que contiene un agente antiviral aprobado para matar el virus.
- Tinción de neuronas con colorante vital
- Preparar y guardar alícuotas de colorante vital neuronal fluorescente25 μl 4 congelación rápida de alícuotas en nitrógeno líquido a una concentración de 100 μm y almacenar a-20 ° C. No congelar/descongelar el tinte más de una vez.
- Para etiquetar las neuronas para visualización por microscopía de fluorescencia, descongele una alícuota del colorante vital neuronal y diluir 4 ml de medio completo de Neurobasal (concentración final de tinte es 100 nM).
- Retire el medio de rebanadas por la aspiración (o con una pipeta si el medio contiene virus) y reemplazarlo con 0,8 mL de medio conteniendo colorante vital neuronal de 100 nM. Regresa las rebanadas al aparato de rodillos en la incubadora.
- Después las rebanadas de 2 h de incubación, aspirar el medio que contiene el tinte y reemplazarlo con 0,8 mL de medio completo fresco en un gabinete de seguridad biológica.
Nota: El etiquetado de las neuronas en rebanadas con colorante vital requiere varias horas de incubación. Las primeras imágenes se toman generalmente 24 h después del tratamiento de tinte. Aunque las neuronas están marcadas específicamente, no hay fluorescencia del fondo que declina durante 2-3 días para dar mejor imagen neuronal. Intensidad del colorante vital declina después de 72 h. - Para seguir cambios en la morfología de la rebanada con el tiempo, cambiarle las rebanadas cada 7 días.
7. cortar la proyección de imagen
- Rebanadas de vista en un microscopio invertido. Para imágenes de fluorescencia más brillantes, a las 24 h antes de la proyección de imagen, cambio de medio de cultivo con medio de Neurobasal A completo sin el indicador de pH rojo de fenol.
Nota: Para los experimentos divulgados aquí, rebanadas son vistas en un microscopio de fluorescencia confocal de disco giratorio invertido equipado con una codificación lineal x, y etapa con piezo z control y una cámara digital de alta resolución sensible. - El tubo con la cultura de la rebanada que se desliza el soporte del tubo a la medida (figura 5A), que se coloca en el adaptador de fase (figura 5B), para mantener el cubreobjetos perpendicular de los aparatos de tubo de rodillo de transferencia el objetivo y mantener el corte en la misma orientación durante las sesiones de proyección de imagen repetitivas en intervalos largos.
- Empuje el control deslizante en el adaptador de etapa apretado en el tubo para mantener el tubo en posición (figura 5B).
Nota: Datos del titular de tubo, adaptador de la etapa, y calentador puede consultarse en: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Nota: Estas posiciones off-set de la marca fiducial permiten localización constante de la misma ubicación de cubreobjetos cuando se desliza el segmento aunque la x original, y configuración de la marca fiducial cambia cuando el adaptador de tubo o etapa se quitan y se sustituye.
Nota: Los planos de imagen generalmente se obtienen a intervalos de 0.5 μm a 2 μm, dependiendo del tamaño y la resolución deseada de las características de la imagen. Creación de una imagen 3D de calidad requiere que características se extienden sobre varios planos de adquisición y así para visualizar características más pequeñas, más pequeños intervalos se requieren entre planos.
Nota: Sesiones de proyección de imagen la mayoría informaron aquí en 18 min/rebanada. Sin embargo, nosotros hemos reflejado algunas rebanadas de diez o más veces e incluso como largo como 40 min en una sola sesión, sin daño aparente en la supervivencia a largo plazo de la rebanada.
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Representative Results
Para determinar la precisión con marcas fiduciales pueden utilizarse para crear una nueva imagen de las mismas células dentro de los mismos campos con el tiempo, examinamos rebanadas en photoetched cubreobjetos (figura 6A). Las neuronas se visualizaron mediante tinción con un colorante vital (100 nM para 2 h; no se mancha las células no neuronales), que desaparece de las neuronas con el tiempo sin dañar las células25. Identificamos un fiducial marca en una sola cuadrícula (figura 6A, B), encontró una región de neuronas de marcado tinte vitales 24 h después de etiquetar, registró la x y compensar las posiciones de la marca fiducial (figura 6B) y recogido, utilizando un objetivo de X 60, pilas de imagen confocal de esta región, repetir la proyección de imagen en 4 días consecutivos. Las imágenes de máxima proyección de un montón de imagen de 30 μm en la misma ubicación se muestran (figura 6C-F). Aunque algunos cambios morfológicos ocurren dentro de la región durante 4 días, las células idénticas (varios de los cuales están marcados) pueden ser seguidas en el tiempo. La intensidad de fluorescencia del colorante vital disminuyó con el tiempo pero las neuronas todavía eran claramente identificables 4 días después de etiquetar. Aunque la mayoría de la fluorescencia del colorante vital neuronal era difuso en el citoplasma, algunas manchas punteadas siempre se observó, que llegó a ser más sensible como fondo fluorescencia declinada. En sectores insalubres, una tinción punteada de células no neuronales también fue observada como rebanadas se deterioró. Estos resultados demuestran que las células identificadas en rodajas pueden ser reflejadas repetitivamente utilizando marcas fiduciales para encontrarlos.
Para examinar cambios dependientes del tiempo en la organización neuronal y viabilidad en rodajas durante cultura de largo plazo, hemos seguido las mismas rodajas durante 5 semanas, etiquetado con colorante vital neuronal fluorescente una vez por semana 24 h antes de la proyección de imagen. Múltiples rondas de tinción con este colorante vital sobre varias semanas aumento de la acumulación de agregados. Neuronas en rebanadas recién plateados que todavía estaban en coágulos de plasma fueron cargadas con el tinte y reflejada en un día en vitro (1 DIV). Las rebanadas mismo fueron reflejadas otra vez semanal por 5 semanas. Imágenes obtenidas en una sola rebanada con un objetivo de 4 x se muestran (figura 7A-E). Las capas de células piramidales de las regiones CA y DG se etiquetan brillantemente cuando excitó a 488 nm y fluorescencia de emisión medidos en > 620 nm. Durante un período de 5 semanas de observación 19 rebanadas, rebanadas de tres salieron el cubreobjetos y otros dos perdieron su morfología típica y opacos, un indicio de su muerte. Por lo tanto, debe considerarse una tasa de supervivencia de alrededor del 70% de la experimentos y rebanadas extras prepararon para asegurar a un número adecuado para el análisis. Rodajas se prepararon en un ajuste de espesor nominal en la chopper de tejido de 300 μm. Después de 5 semanas en cultura, medimos el espesor de corte por proyección de imagen neuronales vitales manchado de tinte rebanadas de cubreobjetos para arriba a través de la rebanada con el objetivo de aceite de 40 X en un microscopio confocal de disco giratorio. Se produjo pérdida de foco de las neuronas en un promedio de 257 nm (n = 5 rodajas con múltiples localizaciones por rebanada), demostrando que muy poco adelgazamiento de la rebanada había ocurrido desde el momento de la galjanoplastia. Nosotros podríamos no medir con precisión el espesor de la rebanada por microscopía de fluorescencia en el momento de la galjanoplastia porque el colorante vital atrapado en el coágulo de plasma dio fluorescencia difusa lo que es difícil de medir con precisión la posición en que se produjo la pérdida de foco. Sin embargo, imágenes en 3D de las neuronas dentro de rebanadas se obtienen fácilmente en rodajas después de retira el coágulo de plasma. La rebanada DIV 21, se muestra en la ampliación baja en figura 7F, fue fotografiada con un objetivo X 60 en un microscopio confocal (pasos de 1 μm) 3 días después de haber cargado con el colorante vital neuronal. Se construyó una imagen 3D de 60 μm de los planos focales (figura 7G). Las neuronas y sus procesos de neurita que están etiquetados con el colorante vital se pueden seguir en 3D. Morfología y estructura 3D de las rebanadas fueron cuidadas durante al menos 3 meses, y los tiempos más largos fueron utilizados en el estudio actual.
Grandes cambios en la morfología de una posición previamente reflejada también ocurrieron en algunos sectores, sugiriendo eso movimiento de la rodaja sobre el cubreobjetos puede tener lugar. Ciertamente, durante intervalos más largos entre la proyección de imagen se convirtió en más difícil saber con certeza que las células en el campo se va a examinar eran idénticas a las observadas en anteriores sesiones de proyección de imagen. Por lo tanto, imágenes de máxima proyección de confocales pilas de rebanadas de marcado tinte vitales adquiridas en la misma ubicación con el objetivo de 60 x a intervalos semanales que abarca 4 semanas (figura 8) muestran que bien se mantiene la viabilidad neuronal, sino que es difícil identificar una neurona específica con el tiempo cuando se obtienen imágenes con largos intervalos de tiempo entre sesiones. Probablemente el patrón de células con múltiples fluoróforos sería más fácilmente reconocible, como son las células en grupos localizados cuando observado desplazándose por una pila de imágenes.
Para evaluar la utilidad de diferentes vectores virales para la introducción de genes exógenos en las neuronas del hipocampales rebanadas, comparamos la infectividad de la rebanada con AV y AAV recombinantes vectores lentivirales, cada uno expresando diferentes etiquetas fluorescentes o con diferentes promotores para la expresión de la unidad. AV (2 x 107 infecciosa U/slice) expresando cofilin-mRFP detrás de un promotor de CMV específico fuerte, células no se utilizó para infectar a una rebanada de hipocampo de ratón que había sido cultivadas 9 semanas en cubreobjetos. Expresión de cofilin-mRFP se encontró a lo largo de la rebanada en 5 días post-infección, con expresión más intensa alrededor de la periferia de la rebanada como observar con un objetivo de 4 x (figura 9A). Células dentro de la rebanada expresando cofilin-mRFP también fueron observadas con el objetivo X 20 (figura 9B) con algunas manchas punteadas brillante y difusión también expresión en las neuronas y las células no neuronales. Después de 17 semanas en la cultura (8 semanas tras la infección), barras de cofilin espontáneas habían formado en algunas células, conducido probablemente por sobreexpresión de tipo salvaje cofilin-mRFP (figura 9C)26,27.
También demostramos que AAV (1010 partículas) podrían ser utilizadas para la expresión en rebanadas.Imágenes de rodajas infectadas en 9 semanas en cultura con AAV, en que un promotor sinapsina específico neuronal condujo expresión de GCaMP5-cofilin-mRFP con una secuencia de péptido auto Hendedoras de P2A en el vinculador de la poliproteína traducido21, fueron capturados 8 infección después de semanas (17 semanas en la cultura). En las neuronas que expresan el GCaMP5 y cofilin-mRFP, algunas barras/agregados de cofilin formado (figura 9D-F). La intensidad de fluorescencia de los barras/agregados fue tan fuerte que podría observarse fluorescencia muy pequeña de un difuso cofilin-mRFP sin saturación completa y floreciente de la imagen de fluorescencia cofilin de barras. Espontánea cofilin barras aparecen en neuronas que quimeras de la proteína cofilin-fluorescente de tipo salvaje han sido sobreexpresados26,27, así como en subrayar las neuronas10. Basado en los títulos de los adenovirus, que se determinan sobre la base de infectividad14 y las cuentas de partícula utilizadas para determinar el título AAV, doblez de unos 100 a 500 números más altos de partículas de AAV se necesitan para obtener aproximadamente la misma infectividad / expresión en rebanadas en comparación con AV.
Para seguir la expresión mediada por lentivirus recombinante de proteínas fluorescentes en rebanadas, rodajas infectaron 6 DIV con 1, 3, 10 y 30 alícuotas de μl de un lentivirus recombinante para la expresión específica neuronal (sinapsina promotor) de cofilin-R21Q-mRFP, desarrollado como una célula viva imagen sonda para cofilin-actina barra formación16. Rodajas fueron marcadas con colorante vital neuronal en DIV 11 y reflejadas en regiones específicas para el tinte y la expresión de cofilin-R21Q-mRFP en 12 y 14 DIV. El segmento infectado con la alícuota de 30 μl de virus no sobrevivió para la proyección de imagen pero triplicados rodajas trataron con los otros volúmenes del virus mostraron una expresión dependiente de la dosis de mRFP. La figura 10 muestra imágenes de rodajas infectadas con 1 μl y 10 μl de lentivirus en 6 y 8 días post-infección. Se cuantificaron las regiones múltiples de dos segmentos diferentes para la tinción de neuronas con el colorante vital y la expresión de mRFP conjuntamente. Para rodajas infectadas con 1 μl de lentivirus, aproximadamente un 28% de las neuronas expresan mRFP en 6 días post-infección, aumentando al 85% en 8 días post-infección. Para rodajas infectadas con 10 μl de lentivirus, alrededor del 58% de las neuronas expresan mRFP en 6 días post-infección, aumenta hasta el 86% por 8 días post-infección. Así, 1 μl de los lentivirus fue suficiente darle slice extendida infectividad y expresión neuronal por 8 días post-infección.
Para demostrar que este sistema de cultivo es útil en el desarrollo siguiente de cofilin patología, cortes infectados con lentivirus para expresar cofilin-R21Q-mRFP en neuronas quedaron sin tratar o tratadas con diferentes concentraciones (1 μm, 333 nM y 100 nM) de humano Aβ proteína sintética que había experimentado la incubación a forma oligómeros28. Los resultados de estudios anteriores demostraron que de Aß sintéticoo inducir barras cofilin-actina en hasta un 25% de las neuronas hippocampal disociado29,30,31. Todos los tres sectores tratados con 1 concentración μm de Aβ vinieron con el cubreobjetos en las primeras 24 h, mientras que todos los vehículos trataron rebanadas (control) y aquellos con el 333 nM y 100 nM concentraciones de Aβ sobrevivieron durante las dos semanas que siguieron. Fueron las mismas regiones celulares (CA1, CA3 y DG) en una rebanada con 100 nM Aβo imagen (objetivo de x 60) durante varios días. Sectores de control que fueron infectados en 6 DIV con lentivirus para expresar sinapsina impulsado por cofilinR21Q-mRFP tenían expresión de mRFP celular difusa por 15 DIV (figura 11A). Sectores expuestos a 100 nM Aβo DIV 14 y reflejada en la 15 DIV demostraron que la distribución de cofilin-R21Q-mRFP se convirtió en punteado, que aparecen en ambas cañas en forma de estructuras y agregados (figura 11B). Estas estructuras se convirtieron aún más prominentes 6 días después del Aβ-tratamiento (figura 11C, que es el campo mismo de las células como figura 11B). En muchos lugares ricos en neurites que somas neuronales de la célula están ausentes (figura 11D), punteadas y barra-como arreglos de discos de cofilinR21Q-mRFP desarrollaron (flechas en figura 11C), similar a la distribución de la actina cofilin barras divulgado previamente dentro de neuritas de las neuronas tratan de Aβ en cultura,29,30,31. Así, este nuevo método de cultivo y observación de rebanadas hippocampal permitirá a los usuarios a determinar la viabilidad a largo plazo de las células en forma de barras y que cofilin agregados y la reversibilidad de la patología en las distintas etapas de desarrollo y fácilmente realizar mediciones de respuesta a la dosis de reactivos que pueden bloquear o revertir la formación de la patología de cofilin en una más en vivo-como organización celular.
Figura 1: Preparación del estante de tubo de rodillo de. (A) plantilla para marcar las posiciones de los orificios para la perforación de los fondos de plato de cultivo de tejidos de 15 cm. Si la figura se imprime en el tamaño de la barra de escala que se muestra, puede cortar y utilizado para marcar las posiciones en una placa de cultivo de 15 cm para la perforación de los orificios mostrados. (B) completa bastidor de tubo de rodillo con dos tubos insertados. Cada estante está numerada en una etiqueta visible en la parte superior de la rejilla. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2 : Preparación de los tubos de rodillos cultura. Vista frontal (A) el tubo insertado en una plantilla en una prensa del taladro para perforar el agujero de 6 mm en el tubo. Línea discontinua que muestra la posición del tubo del rodillo de cara plana en la plantilla. (B) vista de la plantilla con el tubo insertado y broca alineadas sobre el orificio. (C) vista superior del orificio de la plantilla para perforación de tubos de rodillos con una broca de 6 mm.Flecha blanca indica la posición del corte clavo insertado como una parada para el posicionamiento de los tubos y líneas dobles negras son para la alineación de las mismas. (D) primavera clips (flecha negra) instalados firmemente en la parte inferior de la plantilla para mantenerla en posición al perforar los tubos. (E) después de taladrar el agujero, se suavizan los bordes con una herramienta de desbarbado y ranuras se cortan en la cara interna del agujero (recuadro muestra el agujero ve a través de un microscopio de disección) para mejorar el drenaje medio del agujero durante la rotación del tubo. (F) cultura del tubo con el orificio alineado con un agujero en el adhesivo de goma de silicona, a que se sujetará el cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Preparación de rebanadas del cerebro hippocampal. Fotos tomadas con una demostración del microscopio de disección: (A) de cerebro de ratón intacto. Posición de los cortes para remover el cerebro anterior y el cerebelo se muestran como líneas discontinuas azules. (B) después del retiro del cerebro anterior y el cerebelo. (C) pedazo de cerebro de B se gira 90 ° con la región posterior (hacia el cerebelo) hacia arriba. Posicionamiento de la pieza junto al lado del plato ayuda a la eliminación del mesencéfalo (círculo azul discontinua) que puede ser ridiculizado distancia restante hipocampo, tálamo e hipotálamo. Dos cortes con el fórceps (líneas discontinuas azules) permiten el pedazo restante que contiene el hipocampo de ambos hemisferios a extenderse completamente. (D) el cerebro aplastado pieza mostrando el vaso sanguíneo que corre a lo largo de la fisura del hipocampo (flecha azul). Este tejido se coloca en película de plástico y trasladado a la chopper de tejido para cortar en la dirección de la línea de trazos. (E) cortado mostrando un poco más de la mitad del hipocampo tras ser devueltos a la GBSS/glucosa del tejido. (F) la disección Final de hipocampo y limpieza de los cortes para eliminar material no hippocampal. (G) flotando varias rebanadas después de limpieza final. (H) foto ampliada de una sola rebanada para traslado al cubreobjetos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4 : Chapado y incubación. Slice hipocampo de ratón (A) A se retira de la placa de cultivo en la punta de una espátula con la punta de fórceps para ayudar a levantar de la solución. (B) el segmento se coloca en el centro de un photoetched y tratados 12 mm cubreobjetos de 2 μl de plasma de pollo y se agrega otro 2,5 μl de una mezcla 1:1 plasma/trombina para generar un coágulo. (C) después de que el coágulo se establece (1-2 min.), se retira la cubierta del círculo adhesivo de caucho de silicona en un tubo de rodillo y se coloca el cubreobjetos con el coágulo centrado en el orificio; luego el cubreobjetos es había presionado en el lugar con un pulgar y en posición durante aproximadamente 1 minuto (D) agregar 0,8 mL de medio de cultivo completo. (E) rodillo tubo titulares dentro de una incubadora de rodillo grande con el frente levantado para inclinación de 5 ° para mantener el medio en la parte inferior de los tubos. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Soporte de tubo de rodillo y etapa placa incubadora. (A) sostenedor del tubo que se coloca el tubo que el cubreobjetos se mantiene en posición para la proyección de imagen. (B) soporte tubo montado en una placa de adaptador microscopio de la platina. Deslizadores en el lado Sujete el tubo firmemente para la proyección de imagen. Etapa (C) adaptador con el tubo soporte y los paneles laterales que contienen tiras de calefacción conectadas a un controlador de temperatura termoeléctrico ha añadido. Una vez que los tubos montados y colocados, puede añadirse una sólida tapa a la caja para ayudar a mantener la temperatura durante la proyección de imagen. Cable naranja es el termopar. Planes para el diseño y construcción del adaptador de la etapa y el calentador están disponibles en: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6 : Uso de marcas fiduciales imagen repetitiva de las células de la misma. (A) slice Hippocampal en photoetched cubreobjetos (cuadrados de 1 mm) con subiculum desplegado (cola) consultado 4 x iluminación campo objetivo y brillante. Curvatura del tubo del rodillo plástico ayuda a crear una iluminación oblicua que mejora la visualización de la rejilla. El cuadro muestra la posición y el tamaño de un campo de 60 X. (B) una vista del mismo segmento con un objetivo 20 x para encontrar la marca fiducial como la punta de la parte inferior de la 4 de la Plaza 34. Los desplazamientos y y x se muestran reproducible localizar el centro de la caja deseada para la proyección de imagen confocal de mayor aumento. (C–F) Una rebanada con colorante vital neuronal que 13 DIV fue fotografiada con un objetivo de 60 x y hacer una imagen de proyección de 30 μm en 4 días consecutivos (DIV 14-17). Las neuronas idénticas fueron imágenes cada día. La posición del núcleo en cada una de las tres neuronas está marcada con un símbolo diferente. Son más fácilmente identificados desplazándose a través de pilas de imágenes como sus cambios de posición 3D un poco. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7 : Proyección de imagen las neuronas en rebanadas con un colorante vital neuronal. (A) Neuronal colorante vital manchado rebanada en coágulo de plasma tomada 24 horas después de chapado con el objetivo de 4 X. Tinte (100 nM) se añadió cuando el segmento primero fue colocado en el soporte del tubo de rodillo y lavar 2 h más tarde.Subiculum es rizado alrededor del hipocampo en el coágulo. (B–E) Tras la disolución del coágulo por plasmina en 6 DIV, el segmento fue reloaded 5 veces con el colorante vital 24 h antes de la proyección de imagen a intervalos semanales. Imágenes que se muestran se obtuvieron 8, 21, 28 y 35 DIV (B–E, respectivamente). (F) Hippocampal cultivadas durante 3 semanas y teñido con colorante vital neuronal 24 h antes de la proyección de imagen con el objetivo de 4 X. (G) pila Confocal de imágenes en el mismo segmento como en F , mostrando una vista 3D de 61 aviones tomados a intervalos de 1 μm. Colorante vital neuronal claramente etiquetas neuritas y cuerpo de la célula pero es excluido del núcleo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 8 : Repetitivas imágenes de neuronas en un solo sitio de la rodaja en 4 semanas. Imágenes de la proyección máxima de 30 pilas de imagen confocal μm del campo mismo de las células (colocando) de rebanadas de marcado tinte vitales en 12, 20, 30 y 40 DIV (A–,D, respectivamente). Es difícil repetitivamente identificar células individuales sobre los marcos de tiempo más largo en imágenes de proyección. Sin embargo, incluso durante estos largos períodos, identificación de las células del mismo es a menudo posible desplazándose por las pilas de la imagen o imágenes en 3D del edificio se puede girar, como se muestra en la figura 7G. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 9 : Expresión Viral-mediada y la proyección de imagen de proteínas fluorescentes. (A) rebanada Hippocampal cultivadas durante 9 semanas e infectados con adenovirus para expresar cofilin-mRFP detrás de un promotor del CMV. Expresión se encontró a lo largo de la rebanada en 5 días post-infección pero fluorescencia fue más brillante cerca de la periferia de la rebanada. (B) mismo segmento demostró la expresión en las células más profundas dentro de la división cuando se mira con objetivo 20 X. La imagen es que una proyección de una pila de 20 imágenes espaciadas aparte 2 μm. (C) el mismo segmento fue examinado después de 17 semanas en la cultura (8 semanas tras la infección) y mRFP cofilin observó en agregados en forma de barra como se ve en esta imagen de la proyección de una pila de μm 70 de 23 imágenes, 3 μm aparte, con un objetivo 40 X. (FdeD–) Rebanada de hippocampal ratón infectado en 9 semanas en cultura con un AAV expresando una GCaMP5-(P2A) - cofilin - mRFP detrás de un promotor sinapsina. Fluorescencia era visible en los canales rojos y verdes después de 10 días. Una imagen de plano único de la rebanada con la expresión de GCaMP5 (D), un reportero sensibles del calcio, (E) muchas barras que contienen cofilin y (F) una superposición de imagen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 10 : Expresión de cofilin-R21Q-mRFP conducida por un promotor sinapsina en las neuronas infectadas con vectores lentivirales recombinantes. Detección de una señal de fluorescencia débil se observó por primera vez por sobre 3-4 días post-infección con 10 μl de virus y se convierte en usable por 5-6 días, (E) como se ve en estas imágenes obtenidas con un objetivo de 60 x. Aunque tarda más en alcanzar los mismos niveles de expresión con 1 μl de virus, por 8 días post-infección un alto porcentaje similar de neuronas (colorante vital etiquetado) fueron expresando el mRFP cofilin-R21Q. Sólo el 27% de las neuronas eran positivo para el mRFP fluorescencia en 6 días post-infección con 1 μl (A, B) pero esto aumentó al 85% (C, D) por 8 días. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 11 : Patología de cofilin oligómero inducida por Aß en rebanadas de hipocampo de ratón. Todas las imágenes tomadas como 30 μm imagen pilas con un objetivo de 60 x y se muestran como imágenes de máxima proyección. Infectaron a rodajas con cofilin-R21Q-mRFP en 6 DIV. rebanada DIV (A) 15 tratados en 14 DIV con vehículo (medio de DMSO/jamones F12 para generar Aβo). (B) rebanada 15 DIV tratados con 100 nM Aβo. (C) mismo campo como B tomadas en 20 DIV y se muestra en (D) como una superposición con la etiqueta del colorante vital neuronal. Las flechas muestran matrices lineales de cofilin agregados y cañas en la región de la rebanada que contiene neuritas pero algunos cuerpos de la célula. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
El método de tubo de rodillo que se describe aquí permite el cultivo a largo plazo y la proyección de imagen en alta resolución del tejido de cerebro en rodajas. Un problema importante con la técnica de corte aplicado aquí es en el montaje y mantenimiento de las rebanadas. Recubrimientos de cubreobjetos que apoyan la adhesión de la rebanada, promover la rebanada adelgazamiento por aumento de la extensión de neuritas y la migración de las células de la rodaja; así, evitamos la utilización de estos sustratos. La inserción de grupos aminos en el vidrio por el tratamiento con 3 aminopropyltriethoxysilane mejora la adherencia de las rebanadas, pero plasma de pollo demasiado o muy poco sobre el cubreobjetos también puede causar problemas de adherencia conduce a la pérdida de la rebanada. El volumen de plasma necesario para la correcta adherencia es dependiente en el tamaño de la rebanada del cerebro cultivados y así es mayor en rebanadas hippocampal rata, que son aproximadamente 4 veces mayores en área que rodajas de cerebro de ratón. Si demasiado plasma coagula bajo la división, adhesión celular a cubreobjetos se deteriora y tratamiento con plasmina aflojará la rebanada para cambia de posición o se desprende totalmente. Sin embargo, muy poco plasma en el coágulo puede conducir a pérdida de segmento durante los primeros días de la rotación en la incubadora. En un experimento reciente con 39 láminas, tres se perdieron pero algunas de esas perdidas pudieron haber resultado de rebanada daños ocurridos durante el proceso de corte. Sin embargo, suelen preparar rebanadas más que la cantidad estimada necesitan para el experimento de cerca del 50%. La segunda causa de problemas de la cultura es fuga de medio alrededor del sello del cubreobjetos. Este problema se agrava cuando el cubreobjetos no se mantienen firmemente en posición durante al menos 1 minuto después de la colocación del sello. Calor desde el pulgar usado para aplicar presión probablemente ayuda a completar la adhesión. Fugas que se producen a menudo es a través de los canales de aire pequeño bajo el cubreobjetos que se observan con un microscopio de disección. Estos suelen desaparecerán al uso de presión con el pulgar prolongado. Pérdida de alrededor del 2% de culturas debido a la lenta fuga puede esperarse y así se recomienda esperar 10 días después de la creación de las culturas antes de realizar las infecciones virales. Presión con el pulgar excesivo, especialmente si se producen irregularmente en el cubreobjetos, también puede causar el cubreobjetos crackear. Si la rotura es un problema, presionar los tubos abajo de plano sobre una alfombrilla de caucho calentada en una incubadora puede ayudar a proporcionar aún más presión en el cubreobjetos.
Descrito métodos para la cultura de la rebanada de cerebro en las membranas en la interfase aire-líquido (sistema abierto) o en un cubreobjetos de cristal dentro de un tubo de plástico sellado (sistema cerrado) son muy eficaces para la supervivencia a largo plazo de la rebanada, pero cada método tiene sus fortalezas y debilidades. Culturas de Slice en las membranas en la interfase líquido aire son ventajosas para los estudios electrofisiológicos combinados con objetivos de inmersión de alta resolución de imagen7, pero tienen desventajas en cuanto a encontrar el campo exacto de las células para supercomputadoras en el tiempo y exposición del usuario potencial y contaminación objetivo cuando se usa la expresión génica mediada por virus. Uso de virus para la expresión de los transgenes es más seguro y más fácil de realizar en un sistema cerrado donde la contaminación de los objetivos del microscopio no es un problema. Nuestro método de tubo de rodillo modificado da acceso de la rebanada para proyección de imagen de alta resolución, aunque no es favorable a los estudios electrofisiológicos.
Condiciones de cultivo del sector se han establecido para muchas regiones del cerebro de roedores2, pero aquí utilizamos hipocampo sólo porque es una de las regiones del cerebro más ampliamente estudiados y cambios que se producen en el hipocampo son de gran interés en los estudios de deterioro cognitivo. Las capas de células piramidales de las regiones CA y DG mantienen su organización durante varias semanas en la cultura y pueden observarse fácilmente morfológicamente. Hemos utilizado una nueva viabilidad neuronal fluorescente marcador25, que tiene propiedades de fluorescencia que permiten ser utilizado para monitorear la viabilidad neuronal y organización en rebanadas hippocampal durante períodos de días a meses, pero también es compatible con el uso de muchas otras proteínas fluorescentes y reporteros. Aunque no óptimo para NeuO fluorescencia25, podemos excitar en el NeuO a 488 nm y medida de emisión en > 617 nm. Marcas fiduciales en el cubreobjetos photoetched ayudó a localizar las células del mismo repetitivamente durante muchos días de cultura y nos permitieron a regiones idéntica imagen de las rodajas durante muchas semanas. Prácticamente no significativa reducción de las rodajas de ocurrió en el cubreobjetos de vidrio modificado durante 5 semanas en la cultura, el momento más largo para los que se obtuvieron mediciones de espesor de la rebanada.
AV, AAV y lentivirus recombinante vectores funcionan bien para expresar genes exógenos en rebanadas. Lentivirus con un promotor específico neuronal es particularmente útil para la obtención de la expresión en un porcentaje muy alto (> 85%) de las neuronas dentro de 8 días post-infección. Por otra parte, nos muestran que la patología de la barra de cofilin-actina asociada con el desarrollo de déficits cognitivos en humanos AD10,11 y Aß overexpressing ratón anuncio modelos32 puede ser monitoreada en las culturas rebanada tratados con relativamente bajas concentraciones (100 nM) de Aβ humano sintéticoo. Nuestra visión es que las aplicaciones futuras de este método incluyen caracterización de nuevas terapias para revertir la patología de la barra de cofilin-actina o anormalidades de la espina dorsal dendrítica correcta que se producen en muchos trastornos neurológicos33.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
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