Summary
Sunulan işte kültür için değiştirilmiş silindir tüp yöntemi ve hassas photoetched coverslips üzerinde yeniden konumlandırma ile birçok hafta boyunca zaman zaman yüksek çözünürlüklü görüntüleme kemirgen beynin dilimler. Nöronal canlılığı ve dilim Morfoloji korunur. Sağlanan virüsler hücre tipi için belirli ifade kullanarak bu tamamen kapalı sistem uygulamaları.
Abstract
Kültürlü kemirgen beyin dilimler neurons ve glia birçok normal vivo içinde etkileşimlerinin tutar bir ortamda hücresel ve moleküler davranışını eğitim için yararlı olur. Transgenik fare hatları çeşitli veya viral vektörler kullanımı fluorescently tagged proteinler veya vahşi türü beyin dilimleri gazetecilere ifade için elde edilen dilimleri Floresans mikroskobu ile yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin verir. Beyin dilim dilim kültür gerçekleştirme olanağı ile birleştirerek, görüntüleme için çeşitli yöntemler geliştirilmiştir, ancak uzun süreler boyunca canlı dilimleri belirli hücreleri tekrarlayan yüksek çözünürlüklü görüntüleme sorunlarını yarattığı. Bu en iyi kapalı bir sistem kullanıcıları korumak ve çapraz kontaminasyonu önlemek için yapılır beri viral vektörler için eksojen proteinlerin ifadesi kullanıldığında bu özellikle doğrudur. Kapalı bir sistemde birçok hafta boyunca dilimleri tekrarlayan yüksek çözünürlükte görüntüleme için izin basit silindir tüp beyin dilim kültür yöntemine yapılan değişiklikleri rapor edilir. Photoetched coverslips dilimleri kültürü çalışmalarının hızla ve kesin zaman önce ve sonra farklı tedaviler içinde aynı alan görüntü için sahne yeniden konumlandırmak için indirgeme işaretleri kullanımına izin verir. Örnekler, belirli nöronal boyama ve değişiklikleri Hipokampal dilim mimarisinde gözlemlemek için ifade, viral aracılı nöronal deyim floresan proteinlerin ve cofilin patoloji gelişimi ile birlikte bu yöntemin kullanılması için gösterilir, hangi daha önce yanıt olarak amiloid-β (Aβ) peptid reaksiyonlar ile dilim tedavisi Alzheimer hastalığı (Ah) oluşur içinde gözlendi.
Introduction
Birincil kemirgen beyin bölgelerinden Disosiye nöronların uyaranlara yanıt-e doğru hastalık derecesinde gözlemlemek için araştırmacılar tarafından kullanılan önemli bir araç karıştığı kültürdür. Ancak, bu tür çalışmalar nöronlar sadece 2D ve onların gliyal destek sistemi olmadan görüntülemenin dezavantajı var. Ayrıca, içinde hangi o çok yüksek yoğunluklu (640 nöronlar/mm2 veya yüzey alanı yaklaşık % 16) şartları altında yetiştirilen sürece bir dendrite veya axon rasgele akıbet için daha kısa bir mesafe--dan onun hücre gövdesinden Hipokampal takip etmek imkansız hale nöronal canlılık 4 haftadan1yaşa bağlı patolojiler genişletilmiş çalışmaları için Disosiye kültürler kullanımını sınırlama, önemli ölçüde azalır. Kemirgen beyin hazırlanan dilimleri kültür hafta veya ay için bir organize hücre mimarisi ve canlılığı tutarak bu sınırlamalar üstesinden cazip bir seçenektir. Dilim kültür kemirgen beynin birçok farklı bölgeleri korumak için koşullar açıklanan2olmuştur.
İki ana yöntem yaygın beyin dilimleri uzun vadeli kültürü için kullanılan: Hava-sıvı arayüzey3 membranlar üzerinde kültür veya coverslips kapalı tüpler üzerinde kültür izin havalandırma4sağlamak için silindir kuluçka makinesine döndürmek için. Membranlar kültürlü dilimleri bir dik mikroskop ve su daldırma hedefleri5kullanarak yüksek çözünürlüklü Floresans mikroskobu ile doğrudan yansıması. Alternatif olarak, membranlar kültürlü dilimleri dendritik dikenleri bir ters mikroskop6kullanarak iyi çözünürlük elde etmek için cam alt yemekleri transfer edildi. Ancak, her iki yöntem membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri görüntüleme orta herhangi bir değişiklik yapılması ve antifungal ve/veya antibiyotik kirlenme5,6azaltmak veya önlemek için kullandığınız açık sistemlerdir. Mükemmel morfoloji ve hayatta kalma bir membran hava-orta arayüzüne dilimleri korumak, ama deneme sadece küçük hücre grupları takip ediyor sürece yüksek büyütmede tekrarlayan görüntüleme sırasında kesin konumlara dönen son derece zordur Floresan bir işaretleyici ifade ediyorum. Membranlar üzerinde yetiştirilen dilimleri viral aracılı ile ifade transgenes5,6kullanılmıştır, ancak, Biyogüvenlik protokolleri bir kapalı kültür sistemi için kullanılan bazı viral vektörler için istihdam gerekebilir Fluorescently ifade proteinler ve hücre fizyolojisi gazetecilere etiketledi. Ayrıca, daldırma hedefleri dekontaminasyon kültür5' te takip edilecektir örnek arasında gerektirir. Bir büyük uygulama membran arabirimi kültürlerin Elektrofizyoloji seferinde Puan7ile yüksek çözünürlüklü görüntülemede birleştiriyor.
Silindir tüp yöntemi ile coverslips plastik tüp içinde herhangi bir Elektrofizyoloji veya yüksek çözünürlüklü görüntü coverslip kaldırmadan izin vermez. Böylece, bu yöntem en sık hangi8sonrası fiksasyon gözlemler yapılmış olan uzun vadeli çalışmalar için uygulanmıştır. Burada açıklanan roller tüp kültür tekniği kullanır ama hkr kültürleri kadar uzun süre yansıması coverslips dilimleri ile delinmiş-out tüplerin üzerinde tutulan bir yöntemdir. Kapalı sistem görüntüleme için orta hiçbir değişiklik gerektirir ve photoetched coverslips günler ya da haftalar, sonra yüksek büyütmede daha önce görüntüsü hassas alanları görüntüleme izin indirgeme işaretleri sağlamak için kullanır.
Kemirgen hipokampüs, hafıza ve öğrenme dahil bir büyük beyin bölgesi değişiklikleri incelemek için bu yöntemi uygulamak. Kemirgen Hipokampus kez kognitif bozukluk9, reklam ortaya gibi gelişimi sırasında gözlenen patolojik veya yaşa bağlı değişiklikler için bir model olarak incelenmiştir. Bizim yöntemi AD8karakteristik olan tek bir dilim içinde Aβ peptidler, artışlar gibi çevresel değişiklikler zamanla geliştirmek patolojik değişiklikleri incelemek için özellikle uygundur. İnsan ve kemirgen reklam beyin ile ilişkili bir patoloji cofilin-aktin toplamları varlığı ve çubuklar, içinde cofilin ve aktin filamentleri ikinci içeren demetleri bir 1:1 molar oranı10,11', 12. çubuklar gözlemlenmiştir sabit dilimleri Aβ tedavi aşağıdaki farenin Hipokampus yanı sıra cofilin-GFP hipoksi8' e tabi ifade bir canlı kemirgen beyin dilim içinde ve onlar için bir reklam gördüm sinaptik disfonksiyon katkıda bulunabilir ve inme. Burada zaman ders ve dağıtım içinde ifade edilen eksojen chimeric floresan proteinler farklı virüsler tarafından tanıtılan dilim gözlemlemek için bu yeni kodlamayla yöntemi kullanın. Biz o zaman cofilin çubuk ve çözünür Aβ reaksiyonlar (Aβo) ile tedaviye yanıt Hipokampal dilimleri toplama patolojisi gelişimini takip etmek bir cofilin muhabir yapı nöronal belirli ifade kullanmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan kullanımı hayvan bakım ve kullanma yönergeleri, Colorado State Üniversitesi onaylı üreme ve uygun hayvan kullanım iletişim kuralları takip eder.
Not: Aşağıdaki protokol uzun süreli inkübasyon ve Hipokampal dilimleri aralıklı görüntüleme için hazırlık ve kültür yöntemi açıklar. Tek bir Hipokampal dilim plazma pıhtı kullanarak bir özel olarak hazırlanan photoetched coverslip bağlı olduğu ve daha sonra coverslips bir silindir kuluçka makinesine korunur delinmiş-out silindir tüp düz tarafı üzerine mühürlü. Plazma pıhtı plasmin floresan protein ifade ve yüksek çözünürlükte görüntüleme için viral enfeksiyon önce ile çözülür. Bir floresan nöronal hayati boya nöronlar dilimleri içinde görüntü için kullanılır.
1. silindir tüp raf hazırlanması
- Şekil 1içindeA gösterilen şablonu kullan ölçek çubuğunda gösterilen boyutları için basılmış. Bir çivi ile küçük delikler (para cezası nokta kalem için yeterince büyük) delikleri merkezli şablon yumruk.
- Şablon 15 cm doku kültürü çanak (14 cm anma çapı) altta ayarlayın ve delikleri konumunu işaretleyin. İkinci bir tabak üzerinde bu işlemi yineleyin.
- Plastik üzerinde kullanılmak üzere tasarlanmış matkap ile altı 1.5 cm çapında altıgen bir dizi (4,8 cm Merkezden-merkeze) delik merkezleri çanak kenarından 2,5 cm olarak her yemeğin üzerinde delik. Üç (3 mm çapında) equidistantly Resim 1içindeAgösterildiği gibi daha büyük delikler ikisinin arasına yerleştirilen kenarından 12 mm delik.
- Her yemeğin dipleri ile bir 2,5 inç uzun makine vida (3/16 inç çapında) düz bir yıkayıcı bir ikinci düz çamaşır makinesi tarafından bir parça takip küçük delikler aracılığı ile yer, karşı karşıya polietilen boru (spacer, 4.7 cm), başka bir düz rondela , ikinci doku kültürü çanak, başka bir düz RONDELA, kilitleme bir çamaşır makinesi ve bir deli.
- 1.4 diğer iki makine vidaları ve tüm makine vidaları yerde olana sadece gevşek sıkma arasındaki adımları yineleyin. Sonra güvenli bir şekilde fındık sıkın.
- Son silindir tüp raf almak için alt çanak deliklere grommets (5/16 inç kalınlığında, 5/8 inç delik çapı) iş (şekil 1B; yerde iki tüp ile gösterilen). Bir etiket benzersiz bir sayı ile her raf yerleştirin.
2. silindir tüpleri ve Coverslips hazırlanması
- Silindir tüpler delik delme için jig yapma
- 1,5 cm 8 cm derin delik bir 2 x 4 x 5,5 inç ahşap blok böyle bir açıyla Merkezi tarafındaki silindir düz tarafı tüp takıldığında blok ile neredeyse paralel (Şekil 2A).
- Yuvarlak ahşap dosya kullanarak hem genişletmek ve konik tüp ekleme izin için delik delik büyütme (silindir boru çapı kap sonuna yakın biraz daha büyük) (Şekil 2B).
- Bir 1,5 cm Çap dikey, blok, tarafındaki 5.5 cm delik açıp yan delik (Şekil 2C) üzerinde ortalanmış.
- Yan delik yeterince konik zaman dilimi için delik ortalamak ve işaretli noktanın ortalanmış şekilde 1,5 cm dikey delik tüpü yerleştirin için istenilen noktada işaretlenmiş bir silindir tüp takın.
- Tüpü çıkarması ve tüp sonuna nokta mesafe ölçmek. Bu mesafeden jig delik ortasına işaretlemek ve doğru bir şekilde ( Şekil 2Cok) sondaj için tüp konumlandırmak için bir durağı sağlamak için bir çivi yerleştirin.
- Bir demir testeresi floş yaralanma önlemek için ahşap blok yüzeyli tırnak kesmek için kullanın.
- Varsa bir matkap basın izin Yuvaları (Şekil 2D siyah ok) demirlemiş jig dibinde bahar klip ekleyin. Aksi takdirde, C-kelepçeler jig matkap basın üzerine güvenli tutmak için kullanın.
- Jig kullanarak yukarıda açıklanan tutun ve (Şekil 2A) kadar düz tarafı ile düz yüzlü 11 cm plastik kültür tüp getirin, 6 mm çapında delik Merkezi alt 1.0 cm ile ve tüp iki taraf arasında ortalanmış.
Not: plastik için tasarlanmış bir matkap kullanılmalıdır. - Döner bir çapak alma aracı ile delik (Şekil 2E) kenarlarını düzeltmek ve iç 4 grooves yapmak kenar deliğin (Şekil 2E, iç metin) delik sırasında rotasyon boşaltma kolaylaştırmak için.
- Bir 12 mm delik yumruk, 12 mm çapında yuvarlak yüzey--dan non-toksik çift taraflı yapıştırıcı silikon plastik çarşaf kes. Bir standart bir kağıt bir delik (6 mm çap) kullanarak, her diskin ortasında bir delik açın.
- % 70 etanol ile açılmış tüpler durulama, hava onları biyolojik Emanet dolabı, Kuru ve tüpler ve delikli yapışkanlı diskler için biyolojik güvenlik kabin UV lambası (30 W 70 cm ortalama mesafe) altında 40 dk sterilize.
- Böylece tüm maruz yüzeylerde sterilize tüpler ve diskler 20 dk sonra yeniden konumlandırın. Steril koşullarda yapışkanlı bir diskten yedekleniyor beyaz akasındaki ve silikon kauçuk bir tüp delik (Şekil 2F) hizalama dışına yapıştırmayın.
Dikkat: UV Işınlarına maruz kalma önlemek için göz koruma giymek ve kabine UV lambası açmadan önce kapatın. - 12 mm çap photoetched (100 numaralı Merkezi 1 mm kareler) Alman cam coverslips temiz. Coverslips yavaşça Forseps ile tutun ve mutlak etanol suyu mutlak etanol tarafından tekrar, takip, takip, daldırma ve son olarak etanol yakmak için bir alev coverslips daldırma. Soğuması coverslips sağlar.
- Coverslips Forseps ile tutarak, %2 3-aminopropyltriethoxysilane aseton içinde içine daldırma için 10 s. durulama ultrasaf su ile coverslips ve hava kuru izin.
- Coverslips steril filtre kağıdı biyolojik bir güvenlik içinde kabine ayarla ve UV ışık açın. Coverslips 20 dk için her iki tarafında ortaya çıkarmak.
Dikkat: UV Işınlarına maruz kalma önlemek için göz koruma giymek ve kabine UV lambası açmadan önce kapatın.
3. Hipokampal dilim hazırlık
- Diseksiyon başlamadan önce iki ucu keskin jilet yarısı için doku helikopter hazırlayın. Bıçakları dikkatlice parmak ile boyuna katlayın ve ikiye oturtun.
- Bıçak yarım bir pamuklu çubukla temizlemek, mutlak etanol durulama tarafından takip ve kurutma hava kullanarak aseton ile yıkayın.
Not: Beyin dilim kültür fare ya da sıçan zorlanma veya genotip bağımsız iletişim kuralıdır. Birçok transgenik fare satırları farklı genetik kökenli kullanılmaktadır.
- Forseps ile istikrar için Petri kabına tarafına ventral yan ve kesilmiş beyin arka tarafa tutun. Yavaşça uzak meninkslerde sagittal orta hat çevresinde alay etmeyi ve ince uçlu Dumont #5 forseps (şekil 3C, kesik çizgili Daire) kullanarak orta dokuyu.
- Açık (şekil 3C, kesik çizgiler) yaymaya beyin kenarı boyunca iki kesim yapmak. Beyin dorsal yüzü aşağı ve yaymak açık yerleştirilir, Hipokampal fissür görünür olmalıdır (şekil 3D, ok).
- Formanın açık beyin polychlorotrifluoroethylene plastik film bir parça için transfer ve bir doku helikopter sahnede Dilimleme için konumlandırın. GBSS/glikoz bıçakla ıslak ve Hipokampus ~ 300 µm kalınlığında dilimler halinde doğrayın.
- Transfer pipet ile plastik film kapalı dilimlenmiş beyin GBSS/glikoz (şekil 3E) içeren bir taze 60 mm çanak içine sifonu çek. Nazikçe kapalı çimdik ve uzak, ince uçlu forseps, kalan meninkslerde ve (şekil 3G, H) dilimleri diğer sigara Hipokampal dokudan (şekil 3F) ile alay.
4. kaplama dilimleri
- Dilimleri aldıktan sonra tavuk plazma 2 µL hazır coverslip photoetched tarafında ortasına yerleştirin. Biraz bir 3-4 mm çap nokta elde etmek için plazma yayıldı.
Not: Photoetched yan coverslip böyle rakamlar doğru odaklı bir diseksiyon mikroskop görüntülendiğinde en iyi tarafı. - 1 beyin dilim bir steril dar uçlu spatula (şekil 4A) ile plazma noktanın üzerine (şekil 4B) aktarın. GBSS/glikoz dilimden kaldırma sırasında spatula ucunda dilimi tutmak için kapalı forseps kullanın.
- Plazma coverslip ve kapalı Forseps ile spot için spatula dokunmatik, dilim coverslip üzerine bas.
- Mix 2.5 µL plazma Trombin ayrı tüp içinde 2.5 µL ile. Hızlı bir şekilde bu karışımın içinde ve çevrede belgili tanımlık dilim ve damlalıklı yukarı ve aşağı 2,5 µL yavaşça karıştırarak (şekil 4B) yerleştirin.
Not: bunu hızlı bir şekilde yapmanız gerekir bu yüzden plazma içinde 10-15 s, pıhtısı. Dilim yapışma bir sorun ise, 5 µL plazma 5 µL Trombin ile karıştırın ve dilim dilim düz coverslip üzerinde yatıyor böylece karıştırma sonra bazı kaldırma, 4-5 µL kullanın. - Daha önce bir silindir tüp yapıştırılmış silikon kauçuk yapıştırıcı maruz tarafındaki kapsayan şeffaf plastik çıkarın ve coverslip ile beyin dilim dilim delik (şekil 4C) içinde hizalama yapıştırıcı üzerine yerleştirin.
- Yapışma sağlamak için yumuşak, coverslip ile eşit olarak coverslip aşağı tuşuna basıp biyolojik Emanet dolabı aktarma sırasında yaklaşık 1 dakika tutan başparmak için bile basınç uygulayın.
- Bir biyolojik Emanet dolabı, tam Neurobasal bir kültür ortamının (Tablo reçetesi) 0.8 mL her tüp (şekil 4D) ekleyin.
- Güvenli bir şekilde bir kelepçe tarafından düzenlenen bir steril pamuk tıkalı Pasteur pipet ile % 5 CO2/95% hava karışımının akışı. Silindir tüp gaz karışımı ile Temizleme ve pipet üzerinden çekilmiş gibi hızla tüp kap.
- Dilim numarasını ile tüplere etiket ve numara raf. Tüpler geometrik olarak dengeli sağlanması bir silindir raf yerleştirin. Tüpler tek sayıda ise, tüpler dengelemek için ekleyin.
- Silindir raf hakkında dönüm Silindirler ile 35 ° C silindir kuluçka makinesine rafları koyun 10-13 RPH (şekil 4E). Tüpler alt orta tutmak için tilt kuluçka makinesi geri yaklaşık 5° onun açık bir tahta üzerinde yükselterek.
- Dilim tedaviler ve gözlem tarihleri tüm bilgi kaydetmek için kullanılan bir elektronik tablo üzerine dilim ve tüp numarası girin.
- Üzerinde yaklaşık olarak kültür, 6 günde her tüpün 1 µL (0,002 U) aktif plasmin ekleyin.
- Pıhtı tamamen erimesi sonra (genellikle birkaç saat içinde), orta kaldırmak ve plasmin olmadan taze orta yerine. Gerekirse, dilimleri gecede plasmin ile inkübe ve orta ertesi gün değişti.
- Dilimleri genellikle en az 7-10 gün önce deneyler kullanımda inkübe. Orta Aspire edin ve günde 3 veya 4, 7 gün ve 7 günde bundan sonra üzerinde tekrar değiştirin.
5. Transgene ifade için Viral vektörler hazırlanması
Not: Transgenes dilim kültürlerin nöronlar içinde ifade ya beyin gelen genetiği kemirgenler veya transgene tanıtımı rekombinant çoğaltma eksik virüs enfeksiyonu elde edilir.Adenovirüse bakın (AV), adeno ilişkili virüs (AAV) ve rekombinant lentivirus vektörler tüm bizim Hipokampal dilim kültürlerde farklı floresan protein chimeras beyin dilimleri içinde ifade kullanılmıştır.
- Çoğaltma eksik AV RNA yöntemlerine göre ilgi ifade etmek için başka bir bölümünde13,14hazırlayın. Titresi virüsler bulaşıcı U/mL virally ifade bir protein bir antikor kullanarak seri seyreltme yöntemiyle için açıklanan14. Cofilin toplamları ve cofilin-aktin çubuk oluşumu, cofilin-R21Q-mRFP cDNA (plazmid #51279)16kullanmak gözlemlemek için.
Not: Sitomegalovirüs organizatörü birçok hücre türleri13seviyelerinde yüksek ifade sürüş için yararlıdır, ancak synapsin 1 organizatörü nöronal belirli ifade15için mükemmel bir seçim olduğunu. - AAV aktarımını co transfection tarafından viral E1 gene, yukarıda açıklanan17olarak,18tedarik HEK293 ambalaj hücrelere faiz gen içeren Plazmid ve rep/kapak plazmid ile veya olmadan yardımcı plazmid hazırlayın.
Not: Rekombinant AAV da konak hücre genomu19içine hedeflenen ekleme için yapılabilir. Transfer plazmid için içine bir synapsin organizatörü içeren AAV plazmid aşağı kalsiyum sensör GCaMP5G20klonlanmış bir etiketle C-terminal mRFP1 floresan protein (plazmid #50856) insan cofilin 1 kullanın. P2A kendi kendine sıyırmada peptit dizisi kodlama DNA parçası PCR GCaMP5G ve cofilin-RFP arasında tarafından ifade bir tek AAV transkript21her iki proteinlerin sağlamak için transfer plazmid hazırlanması sırasında eklenir. - Rekombinant lentivirus vektörler gen veya viral gag, pol, devir ve vsv-g genler üzerine böler karışımı ambalaj bir üçüncü kuşak lentivirus birlikte faiz ve entegrasyon sinyallerin cDNA içeren transfer plazmid co transfection hazırlayın üç ayrı plazmid22,23.
- Transfer plazmid için tek bir adım sistem24 klonlama synapsin organizatörü ve cofilin-R21Q-mRFP cDNA (dan plazmid #51279) pLKO.1-GFP (plazmid #30323) synapsin organizatörü ve cofilin-R21Q-mRFP hPGK eski yerine koymak ile içine düzenlemek için kullanın organizatörü ve GFP cDNA, anılan sıraya göre.
- Son plazmid HEK293T hücrelere yukarıda açıklanan23Kalsiyum fosfat tarafından transfect.
- Orta dört 10 cm yemeklerini toplamak, 150 K-kesme santrifüj yoğunlaştırıcıları kullanarak 500 µL konsantre ve sonra buz gibi hızlı sıvı azot içinde küçük aliquots son lentivirus-80 ° C'de depolamak. Hücreleri bulaşmasını için bir aliquot sadece bir kez çözülme.
- Ampirik olarak ifade transgenes enfeksiyon sonra virüs çeşitli birimler ile takip etmek bir dizi farklı dilim kültürler ayarlayarak istenen ifade derecesi elde etmek her virüs türü hacmi hazırlanan belirlemek.
Not: Genellikle 1-10 µL şunun dilim kullanılır.
6. dilim tedaviler
- Dilimleri ile virüs bulaşmasını
- Biyolojik Güvenlik düzeyi için vektör uygun virüs çalışmak için onaylanmış bir biyolojik güvenlik kabin çalışarak, bir aliquot (genellikle 1-10 µL) şunun tam orta 0.8 mL ile karıştırın.
- Steril bir Pasteur pipet çamaşır suyu içeren bir koleksiyon tuzağa kullanma dilim ortamından Aspire edin. İkincil bir tuzak her zaman ilk tuzak ve vakum kaynak arasında kullanılır.
- Virüs içeren aliquot yukarıda hazırlanan bu orta yerine, kültür tüpleri bir raf için dönün ve kuluçka makinesine koyun.
- 2-5 gün virüs biyolojik güvenlik kabin dilimlerle kuluçka sonra steril transfer pipet ile virüs içeren orta çıkarın ve virüs öldürmek için onaylanmış bir antiviral ajan içeren bir şişe içine yerleştirin.
- Nöronların hayati boya boyama
- Hazırlamak ve floresan nöronal hayati boya25 aliquots aliquots sıvı azot 100 µM bir konsantrasyon, hızlı dondurma 4 µL depolayabilirsiniz ve bunlar-20 ° C'de depolayın Donma/boya birden çok kez çözülme değil.
- Floresans mikroskobu tarafından nöronlar görselleştirme için etiket, bir aliquot nöronal hayati boya, buzlarını ve tam Neurobasal ortamda 4 ml seyreltik (son boya konsantrasyonu olduğunu 100 nM).
- Orta dilimleri kaldırmak aspirasyon (veya ortam virüs içeriyorsa bir transfer pipet ile) ve eski yerine koymak o ile 0.8 mL 100 nM nöronal hayati boya içeren orta. Dilimleri silindir aparatı kuluçka dönün.
- 2 h için dilimleri kuluçka sonra boya içeren orta Aspire edin ve 0.8 mL biyolojik güvenlik kabin taze tam orta yerine.
Not: hayati boya dilimlerle nöronlarda etiketlerine göre kuluçka birkaç saat gerektirir. İlk görüntüler genellikle boya tedaviden sonra 24 h alınır. Nöronlar özel olarak etiketlenir olsa daha iyi nöronal görüntüleme vermek için 2-3 gün içinde düşüşler arka plan floresan. Hayati boya yoğunluğu 72 h sonra azalır. - Zaman içinde dilim Morfoloji değişiklikleri takip etmek, her 7 günde dilimleri etiketlemek.
7. dilim görüntüleme
- Ters bir mikroskop görünüm dilimleri. En parlak Floresans görüntüleme, görüntüleme önce 24 h kültür orta fenol Red pH göstergesi olmadan tam Neurobasal A orta ile değiştirin.
Not: rapor burada deneyler için dilimleri bir doğrusal kodlanmış donatılmış bir ters dönen disk confocal Floresans mikroskobu üzerinde görüntülenen x, y sahne piezo z kontrolü ve hassas bir yüksek çözünürlüklü dijital fotoğraf makinesi ile. - Transfer silindiri tüp cihazları coverslip dik tutmak için sahne bağdaştırıcısı (şekil 5B), yerleştirilen özel yapım tüp sahibi (şekil 5A), için yansıması için dilim kültür ile tüp Amaç ve uzun aralıklarında tekrarlanan görüntüleme oturumları sırasında aynı yönde dilim korumak.
- Kaydırıcıyı sahne bağdaştırıcısında tüp (şekil 5B) pozisyonda tutmak için tüp karşı sıkı bas.
Not: Ayrıntılar tüp sahibinin sahne bağdaştırıcısı ve ısıtıcı erişilebilir: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Not: Bu off-set pozisyonlar indirgeme Mark tutarlı zaman dilimi görüntüsü, aynı coverslip konumunu saptayarak izin orijinal x, y indirgeme işareti değişir olsa bile ne zaman tüp veya sahne bağdaştırıcısı kaldırılır ve değiştirilir.
Not: Görüntü uçaklar genellikle boyutu ve görüntü özellikleri çözünürlüğe bağlı olarak 2 µm için 0.5 µm aralıklarıyla elde edilir. Kaliteli 3D görüntü oluşturmak için görüntü özelliklerini edinme birden çok düzlem üzerinde genişletmek ve çok daha küçük özellikleri görmek için daha küçük aralıklar uçaklar arasında gerekli olan gerekir.
Not: Çoğu görüntüleme oturumları burada altında 18 dk/dilim olduğunu bildirdi. Ancak, on veya daha fazla kez ve hatta bazı dilimleri görüntüsü dilimin uzun vadeli hayatta belirgin zarar vermeden tek bir oturumda 40 dk sürece.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
İndirgeme işaretleri nasıl doğru belirlemek için kullanılması gereken zaman içinde aynı alanları aynı hücrelerde reimage için biz photoetched coverslips (şekil 6A) yetiştirilen dilimleri incelenir. Nöronlar görselleştirildiği hayati bir boya ile boyama (100 nM için 2 h; sigara nöronal hücre leke değil), hangi kaybolur neurons zamanla hücreler25zarar vermeden. Biz bir indirgeme tespit etiketleme sonra bir bölge hayati boya etiketli nöronların 24 h bulundu işareti, bir tek kılavuz kare (şekil 6A, B), kaydedilen x ve y ofset indirgeme işareti (şekil 6B) pozisyonlardan ve toplanan, 60 X amaç görüntüleme 4 gün üst üste üzerinde yinelenen bu bölgenin confocal görüntü yığınları kullanarak. Aynı konumda alınan 30 µm görüntü yığını maksimum projeksiyon görüntüleri (şekil 6C-F) gösterilir. Bazı morfolojik değişiklikler 4 gün içinde bölgede rastlanmasa da, (hangi birkaç işaretlenir) aynı hücreler zamanla izlenebilir. Hayati boya floresan yoğunluğu zamanla azaldı ama nöronlar hala etiketleme sonra açıkça tanımlanabilir 4 gün vardı. Nöronal hayati boya floresan çoğu rağmen sitoplazma içinde yaygın bazı punctate boyama her zaman, daha kolay oldu gözlendi olarak azalmış floresan arka plan. Sağlıksız dilimler halinde punctate nöronal olmayan hücreleri boyama da kötüleşti dilimler görülmüştür. Bu sonuçlar dilimleri içinde tanımlanan hücreleri hkr onları bulmak için indirgeme işaretleri kullanarak yansıması olduğunu göstermektedir.
Nöronal organizasyon ve canlılığı dilimleri içinde zamana bağımlı değişiklikleri sırasında uzun vadeli kültürünü incelemek için aynı dilim 5 hafta boyunca, haftada bir kez 24 saat önce görüntüleme floresan nöronal hayati boya ile etiketleme takip ettik. Birkaç hafta içinde bu hayati boya boyama birden fazla mermi toplamları birikimi artar. Hala plazma pıhtı olduğunu taze kaplama dilimleri içinde neurons boya ile dolu ve bir gün vitro (1 DIV) görüntüsü. Aynı dilimleri yeniden haftalık 5 hafta boyunca görüntüsü. Tek bir dilim bir 4 x amacı ile elde edilen görüntüler (Şekil 7A-E) gösterilir. CA ve DG bölgeleri piramit hücre katmanları parlak ölçü vasıl 488 nm ve floresan emisyon, heyecanlı zaman etiketli > 620 nm. Bir 5 haftalık süre içinde 19 dilimleri gözlemleme, üç dilim coverslip geldi ve diğer iki onların tipik Morfoloji kaybetti ve opak, oldu onların ölüm belirtisi. Böylece, bir sağkalım oranı yaklaşık % 70 deneyler için düşünülmelidir ve analiz için yeterli bir sayı sağlamak ilave dilimleri hazır. Dilimleri 300 µm doku helikopter bir nominal kalınlık ayarında hazırlanmıştır. Kültür 5 hafta sonra görüntüleme nöronal hayati boya lekeli dilimleri kadar coverslip 40 X Petrol amaçta dönen disk confocal mikroskop ile dilim üzerinden gelen tarafından dilim kalınlığı ölçülür. Odak nöronların kaybı oluştu 257 ortalama nm (n = 5 dilim dilim kullanılan birden çok yeri ile), o çok az dilim inceltme gösteren kaplama andan oluştu. Biz doğru dilim kalınlığı Floresans mikroskobu tarafından plazma pıhtı entrapped hayati boya doğru odak kaybı oluştuğu konum ölçmek üzere diffüz Floresans verdi çünkü kaplama sırasında ölçmek değil. Ancak, nöronlar dilimleri içinde 3 boyutlu görüntüleri kolayca plazma pıhtı kaldırıldıktan sonra dilimler halinde elde edilir. Şekil 7F, düşük büyütmede gösterilen 21 DIV dilim nöronal hayati boya ile yükledikten sonra 3 gün confocal mikroskop (1 µm adım) 60 X amaçta ile görüntüsü. 60 µm 3D görüntü odak uçaklar (Şekil 7G) inşa edilmiştir. Nöronlar ve hayati boya ile etiketlenir neurite süreçlerinin 3D takip edilebilir. Morfoloji ve 3D dilimleri yapısını en az 3 ay içinde bakımlı ve en uzun süreleri geçerli çalışmada kullanılmıştır.
Daha önce görüntülü bir pozisyon morfolojisi önemli değişiklikler de bazı dilimler halinde oluştu bu hareketin dilimin üzerinde coverslip düşündüren yer alabilir. Kesinlikle, görüntüleme arasında daha uzun aralıklarla üzerinde yansıma alanında hücreleri önceki görüntüleme oturumlarda gözlenen olanlar aynıydı kesinlikle bilmek daha zor oldu. Böylece, nöronal canlılığı bakımlı ama bunun hayati boya etiketli dilimleri aynı konumda 60 x amacı ile 4 hafta (şekil 8) kapsayan haftalık aralıklarla alınan confocal yığınları maksimum projeksiyon görüntüleri göster Ne zaman fotoğraf oturumları arasında uzun zaman aralıkları ile elde edilen zaman içinde belirli bir neuron tespit etmek zordur. Muhtemelen bir görüntü yığınında kaydırarak gözlenen yerelleştirilmiş grupları hücrelerde olduğu gibi ile birden fazla fluorophores etiketli hücreleri desen daha kolay tanınan olurdu.
Biz AV, AAV ve rekombinant lentiviral Vektörler, her farklı floresan Etiketler ifade veya kullanarak kullanma dilim infektivite göre farklı viral vektörler giriş neurons Hipokampal dilimleri eksojen genlerin kullanışlılığı değerlendirmek için farklı rehberleri sürücü ifade için. AV (2 x 107 bulaşıcı U/dilim) cofilin-mRFP bir güçlü, hücre içi belirli CMV organizatörü arkasında ifade coverslips kültürlü 9 hafta olmuştu bir fare Hipokampal dilim bulaştırmak için kullanıldı. Cofilin-mRFP ifade gibi bir 4 x amacı (Şekil 9A) ile dilim çevre etrafında en gergin ifade ile 5 gün sonrası enfeksiyon dilimle boyunca bulundu. Cofilin-mRFP ifade dilim içindeki hücreleri de bazı parlak punctate boyama ile 20 bir X amaç (Şekil 9B) ile tespit edilmiştir ve aynı zamanda ifade nöronlar ve nöronal olmayan hücreleri diffüz. Kültür (8 hafta sonrası enfeksiyon) 17 hafta sonra kendiliğinden cofilin-çubuklar bazı hücrelerde, muhtemelen wild türü cofilin-mRFP (Şekil 9C)26,27overexpression tarafından tahrik oluşmuş.
Biz de gösterdi AAV (1010 parçacıklar) dilimleri ifade için kullanılan.9 hafta kültür AAV, hangi tercüme polyprotein21, bağlayıcı içinde GCaMP5-cofilin-mRFP ifadesi ile kendi kendine sıyırmada P2A peptit dizisi nöronal belirli synapsin organizatörü sürdü ile enfekte dilim görüntüleri yakalanan 8 edildi hafta sonrası enfeksiyon (17 hafta kültür). GCaMP5 ve cofilin-mRFP ifade nöronlarda bazı cofilin çubuklar/toplamları (Şekil 9D-F) kurdu. Çubuklar/toplamları floresan yoğunluğu çok güçlü bir diffüz cofilin mRFP çok az Floresans tam doygunluk dikkat edilmesi ve çubuklar cofilin floresan görüntünün çiçek açması oldu. Spontan cofilin çubuklar içinde vahşi tipi cofilin-floresan protein chimeras aşırı ifade26,27oldu, aynı zamanda nöronların10vurguladı nöronlarda görünür. Hangi infektivite14 ve AAV titresi belirlemek için kullanılan parçacık sayısı olarak belirlenir, titreleri, adenovirus, üzerinde dayalı yaklaşık 100-500 kat daha yüksek parçacık sayıda AAV yaklaşık aynı infektivite elde etmek için gerekli olan / AV. için karşılaştırıldığında dilimleri ifade
Rekombinant lentivirus-aracılı ifade dilimleri floresan proteinlerin takip etmek, dilimleri 6 sayı 1, 3, 10 ve 30 µL aliquots rekombinant lentivirus nöronal belirli ifade (synapsin faktörü) cofilin-R21Q-mRFP, hasta, canlı bir hücre sonda cofilin-aktin çubuk oluşumu16için Imaging olarak geliştirilmiştir. Dilimleri nöronal hayati boya 11 DIV, etiketli ve boya ve cofilin-R21Q-mRFP ifade 12 ve 14 DIV. üzerinde belirli bölgelerde görüntüsü Virüs 30 µL aliquot ile enfekte dilim görüntüleme için hayatta değildi ama onaylatılacak dilimleri tedavi ile diğer birimlerin virüs mRFP bir doz bağımlı ifadesi gösterdi. Şekil 10 1 µL ve lentivirus 6 ve 8 gün sonrası enfeksiyon, 10 µL ile enfekte dilim görüntüleri gösterir. İki farklı dilim birden fazla bölgesini nöronların hayati boya ve mRFP ifade ile işbirliği için boyama sayısal. Dilimleri için lentivirus 1 µL ile enfekte nöronlar yaklaşık % 28'i 6 gün sonrası enfeksiyon, %85 8 gün sonrası enfeksiyon tarafından artmaktadır, mRFP dile getirdi. Lentivirus 10 µL ile enfekte dilimler için nöronlar yaklaşık % 58 %86 8 gün sonrası enfeksiyon tarafından artmaktadır 6 gün sonrası enfeksiyon, mRFP dile getirdi. Böylece, lentivirus 1 µL yaygın dilim infektivite ve nöronal ifade tarafından 8 gün sonrası enfeksiyon sağlamak için yeterli idi.
Bu kültür sistemi cofilin patoloji, aşağıdaki geliştirilmesinde yararlı olduğunu ispat için cofilin-R21Q-mRFP nöronlar içinde ifade etmek için lentivirus ile enfekte dilimleri tedavi edilmemiş veya çeşitli konsantrasyonları ile tedavi kalmıştı (1 µM, 333 nM ve 100 nM), Kuluçka formu reaksiyonlar28geçirmiş sentetik insan Aβ protein. Önceki çalışmalarda sonuçlarından gösterdi bu sentetik Aβo Disosiye Hipokampal nöronlar29,30,%3125'e kadar cofilin-aktin çubuklar ikna etmek. Aβ 1 µM konsantrasyon ile tedavi tüm üç dilim ise tüm araç tedavi dilimleri (kontrol) ve bu tedavi ile 333 coverslip ilk 24 h dan gevşemiş nM ve 100 nM konsantrasyonları Aβ hayatta onlar takip edildi iki hafta için. Aynı hücresel bölgelerde (CA1, CA3 ve DG) bir dilim 100 nM Aβo ile tedavi edildi birkaç gün içinde (60 x amaç) görüntüsü. Lentivirus cofilinR21Q-mRFP tahrik synapsin ifade etmek için 6 DIV bulaşmış olduğunu kontrol dilimleri yaygın hücresel mRFP ifade tarafından 15 DIV (Şekil 11A) vardı. 100 nM Aβo 14 DIV maruz ve 15 DIV yansıma dilimleri dağılımın cofilin-R21Q-mRFP punctate, her iki çubuk yapıları ve toplamları (Şekil 11B) şeklinde görünen oldu gösterdi. Bu yapıların Aβ-tedavi ( Şekil 11Bhücrelerinin aynı alanda olanŞekil 11C,) sonra daha da önemli 6 gün oldu. Nöronal hücre somas (Şekil 11D) nerede birçok yerde neurites içinde zengin, cofilinR21Q-mRFP punctate ve çubuk benzeri bir dizi geliştirdi ( Şekil 11Coklar), cofilin-aktin dağıtımıyla benzer çubuklar daha önce Aβ tedavi nöronların kültür29,30,31neurites içinde rapor. Böylece, kültür ve Hipokampal dilim gözlemlemek için bu yeni yöntem-ecek bırakmak kullanıcı hangi cofilin toplar ve çubuklar formu hücrelerinin uzun vadeli canlılığı ve patoloji reversibility kolayca çeşitli aşamalarında gelişme ve için belirlemek için doz-yanıt ölçümleri engellemek ya da daha fazla vivo içindecofilin patoloji oluşumu ters reaktifler gerçekleştirmek-tarihlerde hücresel organizasyon.
Şekil 1: Silindir tüp raf hazırlanması. (A)15 cm doku kültürü çanak dipleri delme için delik pozisyonlar işaretleme için şablon. Şekilde gösterilen ölçek çubuğunun boyutunu yazdırıldıysa, biçilmiş kaftan ve gösterilen delik delme için bir 15 cm kültür tabak açık pozisyonları işaretlemek için kullanılan. (B) iki tüp takılı silindir tüp raf tamamlandı. Her raf Raf üstünde kolayca görünür bir etiket numaralandırılmıştır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Resim 2 : Silindir kültür tüpleri hazırlanması. (A)açık görüntülemek bir jig tüp 6 mm delik delme için bir matkap basın üzerinde takılı silindir tüp. Kesikli çizgi içinde jig düz taraflı silindir tüp konumunu gösterir. (B) ucuna eklenen tüp ile jig görüntülemek ve delik uyumlu bit matkap. (C) 6 mm matkap tüplerini silindir dışarı sondaj için jig delik en iyi görünümü.Beyaz ok tüpler konumlandırma için bir durak olarak eklenen kesme çivi konumunu gösterir ve siyah Çift Kişilik bit hizalamasını çizgilerdir. Jig altındaki güvenli yüklü Klipler (siyah ok) o zaman sondaj pozisyonda tutmak (D) bahar tüpler. (Sonra delik delme, bir çapak alma aracı ile kenarları düzgünleştirilir ve oluklar (delik görüntülendi diseksiyon mikroskop iç metin gösterir) deliğin iç tarafında kesilirE) orta delikten sırasında tüp rotasyon boşaltma geliştirmek için. (F) kültür tüp coverslip bağlı olacak silikon kauçuk yapıştırıcı bir delik için hizalı deliği. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 3: Hipokampal beyin dilimleri hazırlanması. Bir diseksiyon mikroskop gösteren ile çekilen fotoğraflar:(a)olduğu gibi fare beyin. Pozisyon ön ve beyincik kaldırmak için kesim mavi kesik çizgiler olarak gösterilir. (B) ön ve beyincik çıkarıldıktan sonra. B beyin parçası (C) 90 ° ile arka bölge (beyincik doğru) yukarı dönük olacak şekilde Kuzey değil. Parça çanak yan yanındaki konumlandırma kalan Hipokampus, talamus ve hipotalamus uzak alay (Mavi Çizgili Daire) orta kaldırılması ile yardımcı olur. Forseps (mavi kesik çizgiler) ile iki kesim kalan parçanın Hipokampus düz yaymak için her iki hemisferlerin üzerinden içeren izin. (D) düzleştirilmiş beyin damar Hipokampal fissür (mavi ok) çalışan gösterilen bir parça. Bu doku üzerinde plastik film yerleştirilir ve kesikli çizgi yönünde Dilimleme için doku helikopter aktarılır. (E) GBSS/glikoz için döndürülen sonra yarısından biraz fazlasını Hipokampus gösterilen doku dilimlenmiş. (F) son diseksiyon oluşur ve Hipokampal olmayan malzeme çıkarmak için dilim Temizleme. Son temizlik sonra (birkaç yüzenG) dilimleri. (H) büyütülmüş fotoğraf aktarmak için coverslip tek bir dilim. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 4 : Kaplama ve kuluçka dilimler. (A) A fare Hipokampal dilim kültür çanak ücretsiz çözümden kaldırmak için pens ucu kullanarak bir spatula ucunda kaldırılır. (B) dilimi düz bir photoetched ortasına yerleştirilir ve 12 mm coverslip tavuk plazma 2 µL tedavi ve bir 1:1 plazma/Trombin karışımı başka bir 2.5 µL pıhtı oluşturmak için eklenir. (Pıhtı ayarlandıktan sonraC) (yaklaşık 1-2 dk), silikon kauçuk yapıştırıcı daire silindir Tube kapsayan kaldırılır ve coverslip deliğe; merkezli pıhtı ile konumlandırılmış coverslip yerde bir başparmak ile preslenmiş ve (D) Ekle tam kültür ortamının 0.8 mL 1 dk. için pozisyon düzenlenen sonra. (E) silindir orta tüpler dibinde tutmak için 5 ° yatırmak için yükseltilmiş ön ile sahipleri büyük roller İnkübatör içinde tüp. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 5: Silindir boru tutucu ve sahne plaka kuluçka makinesi. (A)öyle ki coverslip korunur görüntüleme için pozisyon tüp konumlandırır boru tutucu. (B) boru tutucu bir mikroskop sahne adaptör plaka monte. Kaydırıcıları tarafında tüp görüntüleme için güvenli bir şekilde tutun. (C) sahne bağdaştırıcısı boru tutucu ve yan panelleri ile termoelektrik sıcaklık denetleyiciye bağlı içeren Isıtma şeritler eklendi. Bir kez tüpler monte ve konumlandırılmış, katı bir top kutusuna sıcaklık görüntüleme sırasında korumaya yardımcı olmak için eklenebilir. Turuncu tel ısıl ipucu bu. Tasarım ve sahne bağdaştırıcısı ve ısıtıcı bulabilirsiniz için planları: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 6 : Aynı hücreleri yinelenen görüntüleme için indirgeme işaretlerinin kullanılması. (A)Hipokampal dilim ile 4 x objektif ve parlak alan aydınlatma görüntülendi gelişeceğini subiculum (kuyruk) ile photoetched coverslip (1 mm kareler) üzerinde. Plastik rulo tüp eğriliği kılavuz görselleştirme geliştirir bir eğik aydınlatma oluşturmasına yardımcı olur. Konumu ve 60 X alanın boyutunu gösterir. (B) A görünümünü indirgeme mark Meydanı 34 4 alt ucu olarak bulmak için bir 20 x amacı ile aynı dilim. Y ve x uzaklıklar tekrarlanarak daha yüksek büyütme confocal görüntüleme için istenen kutusunun Merkezi bulmak için gösterilir. (C-F) 13 DIV bir 60 x hedefi kullanarak ve 4 gün üst üste üzerinde (14-17 DIV) 30 µm projeksiyon resim yapma görüntüsü nöronal hayati boya etiketli bir dilim. Aynı nöronların her gün görüntüsü. Çekirdeğin bulunduğu her üç nöronların farklı bir sembol ile işaretlenir. Onlar daha kolay görüntü yığınları ile kendi 3B konumlandırma değiştikçe hafifçe kaydırarak tanımlanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 7 : Nöronal hayati boya dilimlerle nöronlarda Imaging. (A)nöronal hayati boya 24 h 4 X amacı ile kaplama sonra alınan plazma pıhtı dilimi lekeli. Boya (100 nM) zaman dilimi ilk silindir boru tutucu içinde yerleştirilir ve 2 h sonra yıkanmış eklendi.Subiculum etrafında pıhtı Hipokampus kıvrılmış. (B-E) Tarafından 6 DIV eklendi plasmin pıhtı dağılması dilimi hayati boya öncesinde görüntüleme haftalık aralıklarla 24 h 5 kere yeniden yüklendi. Gösterilen resimler toplanan 8, 21, 28 ve 35 DIV (B-E, sırasıyla). (F) Hipokampal dilim 3 hafta boyunca kültürlü ve nöronal hayati boya 24 h 4 X amacı ile görüntülemede öncesinde lekeli. (G) F 1 µm aralıklarla alınan 61 uçaklar 3D bir görünümünü gösteren olduğu gibi aynı dilim görüntülerde Confocal yığını. Nöronal hayati boya açıkça neurites ve hücre vücut etiketleri ama çekirdek söz konusu değildir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 8 : Tekrarlayan nöronların dilimin tek bir konumda 4 haftadan Imaging. 30 µm confocal görüntü yığınları hayati boya etiketli dilimleri 12, 20, 30 ve 40 DIV, alınan hücrelerden (konumlandırma tarafından) aynı alanın maksimum projeksiyon görüntüleri (A-D, sırasıyla). Sürekli uzun zaman dilimlerini projeksiyon görüntüler üzerinde tek tek hücreleri tespit etmek zordur. Ancak, bu uzun süre içinde bile sık sık görüntü yığınları ile kaydırarak kimlik aynı hücre mümkün değildir veya 3D görüntü oluşturmak, Şekil 7' dekiGgösterildiği gibi döndürülebilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 9 : Viral-aracılı ifade ve floresan proteinlerin görüntüleme. 9 hafta boyunca kültürlü ve adenovirus cofilin-mRFP bir CMV organizatörü arkasında ifade etmek için ile enfekte(a)Hipokampal dilim. İfade 5 gün sonrası enfeksiyon dilimle boyunca bulundu ancak Floresans dilim çevre en parlak. (B) aynı dilim dilim 20 X amacı ile görüntülendiğinde içinde daha derin hücrelerdeki ifade gösterdi. 20 resim yığını bir projeksiyon 2 µm arayla aralıklı görüntüdür. (C) aynı dilim kültür (8 hafta sonrası enfeksiyon) 17 hafta sonra incelenmiş ve cofilin mRFP 40 X amacı ile alınan bu projeksiyon resim 23 resim, 3 µm ayrı, 70 µm yığınının dan görüldüğü gibi çubuk şeklinde toplamları gözlendi. (D-F) 9 hafta kültür, bir GCaMP5 - ifade bir AAV ile enfekte fare Hipokampal dilim (P2A) - cofilin - mRFP synapsin bir organizatörü arkasında. Floresans 10 gün sonra kırmızı ve yeşil kanal içinde görünür. (D) GCaMP5, kalsiyum hassas muhabir, (E) ifade gösteren birçok cofilin içeren çubuklar ve (F) bir bindirme görüntü dilim bir uçak görüntüsü. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 10 : Cofilin-R21Q-mRFP rekombinant lentiviral Vektörler ile enfekte nöronlar içinde synapsin Organizatör tarafından tahrik ifade. Algılama zayıf Floresans sinyalinin ilk 3-4 gün sonrası enfeksiyon virüs 10 µL kullanma hakkında tarafından görülmektedir ve 5-6 gün, (E) 60 x amacı ile alınan bu görüntüleri görüldüğü gibi kullanılabilir hale gelir. İfadesi aynı düzeyi 1 µL virüs ile ulaşmak için uzun sürer rağmen 8 gün sonrası enfeksiyon tarafından nöronlar (hayati boya etiketli) benzer yüksek oranda ifade cofilin-R21Q-mRFP. Nöronlar sadece % 27 1 µL (A, B) ile 6 gün sonrası enfeksiyon, mRFP floresan için olumlu idi ancak bu % 85 (C, D) 8 gün arttı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Şekil 11 : Fare Hipokampal dilimleri Aβ cofilin oligomer kaynaklı patolojisi. Tüm görüntüleri 30 µm görüntüsü olarak alınan bir 60 x amacı ile yerleştirir ve maksimum projeksiyon görüntü olarak gösterilir. Dilimleri 6'cofilin-R21Q-mRFP ile enfekte DIV. (A) 15 DIV dilim tedavi araç (Aβooluşturmak için kullanılan DMSO/HAMS F12 orta) ile 14 DIV üzerinde. (B) dilim 15 DIV 100 nM Aβoile tedavi. (C) 20 DIV almış ve (D) nöronal hayati boya etiketli bir bindirme olarak gösterildiği gibi B aynı alanda. Oklar neurites ama kaç hücre organları içeren dilim bölgede cofilin toplamları ve çubuklar, doğrusal dizilerini gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Burada açıklanan roller tüp yöntemi uzun vadeli kültür ve dilimlenmiş beyin dokusunun yüksek çözünürlüklü canlı görüntüleme olanağı sağlar. Bir dilim tekniği gibi burada montaj ve bakım dilim olduğunu. Dilim yapışma, destek Coverslip kaplama teşvik neurites akıbet ve hücre dilim dışarı geçiş güçlendirerek dilim inceltme; Böylece, bu yüzeylerde kullanımı kaçınılmalıdır. 3-aminopropyltriethoxysilane ile tedavi kadehte üzerine amino grupları ekleme dilimleri bağlılık gelişmiş, ama çok az ya da çok fazla tavuk plazma coverslip üzerinde de dilim kaybı için önde gelen bağlılık sorunlara neden olabilir. Uygun yapışma için gerekli plazma hacmi kültürlü beyin dilim boyutuna bağlıdır ve böylece alanında fare beyin dilimleri yaklaşık 4 kat daha büyük olan fare Hipokampal dilimler için daha büyük. Çok fazla plazma altında dilim pıhtılaşır, hücre adezyon coverslip için Engelli olduğunu ve böylece konumunu değiştirir veya tamamen ayırır plasmin ile tedavi dilimi gevşetin. Ancak, çok az pıhtı plazmada dönme kuluçka ilk birkaç gün boyunca dilim kaybına neden. 39 dilimler içeren bir son denemede üç kayıp vardı ama bazıları bu kayıp Dilimleme işlemi sırasında gerçekleşen dilim hasar neden olmuş. Yine de, genellikle yaklaşık % 50 tahmini sayıdan daha fazla dilim deney için gerekli hazırlayın. İkinci önde gelen Kültür sorunları orta coverslip mühür çevresinde kaçağı nedeni. Coverslips sıkıca en az 1 dk. için pozisyon için mühür yapıştırılması sonra tutulur zaman bu sorunu kötüleştirir. Büyük olasılıkla baskı uygulamak için kullanılan başparmak sıcaktan yapışma tamamlamak yardımcı olur. Meydana gelen sızıntı kez küçük hava kanalları diseksiyon mikroskopla görülebilir coverslip altında geçer. Bunlar genellikle uzun süreli başparmak baskı kullanma üzerine kaybolur. Kültürler yavaş sızıntı nedeniyle yaklaşık % 2 kaybı beklenebilir ve böylece kadar kültürler viral enfeksiyonlar gerçekleştirmeden önce ayarladıktan sonra 10 gün beklemek önerilir. Aşırı başparmak baskı, özellikle de düzensiz üretilen coverslip arasında da çatlamak coverslip neden olabilir. Kırılma bir konudur, tüpler aşağı düz bir lastik mouse pad bir kuluçka makinesine ısındı üzerine basarak daha da basınç arasında coverslip sağlamak için yardımcı olabilir.
Daha önce açıklanan yöntemleri beyin dilim kültür membranlarda vasıl hava-sıvı arayüzey (açık sistem) veya bir kapalı plastik tüp (kapalı sistem) içinde bir cam coverslip için uzun vadeli dilim hayatta kalmak için çok etkili olmakla birlikte, her yöntemin onun güçlü vardır ve zayıf. Dilim kültürler üzerinde membranlar hava sıvı arayüzü kombine Elektrofizyolojik çalışmalar için avantajlı daldırma hedefleri için yüksek çözünürlüklü görüntü7ile ama tam alan için hücre bulma açısından dezavantajları var zaman ve potansiyel kullanıcı pozlama ve objektif kirlenme viral aracılı gen ekspresyonu kullanırken alınıyor. Virüslerin transgenes ifade nerede kirlenme in mikroskop objektif bir sorun değil daha güvenli ve daha kolay kapalı bir sistem içinde gerçekleştirmek kullanılır. Elektrofizyolojik çalışmalar için müsait değildir, ancak bizim değiştirilmiş silindir tüp yöntemi için yüksek çözünürlüklü düşsel, dilimin erişim sağlar.
Dilim kültür koşulları kemirgen beyin2sahip pek çok bölge için kurulmuş olan, ama burada biz kullanmak tek Hipokampus çünkü en çok çalışılmış beyin bölgeden biridir ve Hipokampus içinde meydana gelen değişiklikler çalışmaları büyük ilgi kognitif bozukluk. Piramit hücre katmanları CA ve DG bölgelerin kendi kuruluş kültür birkaç hafta içinde tutmak ve kolayca morfolojik görülebilmektedir. Nöronal canlılığı ve organizasyon Hipokampal dilimleri içinde ay gün süreler üzerinden izlemek için kullanılmak üzere izin, ancak aynı zamanda Floresans özellikleri olan bir yeni geliştirilen floresan nöronal canlılığı marker25, kullanılan diğer birçok floresan proteinler ve gazetecilere kullanımı ile uyumlu. NeuO Floresan25için değil en iyi olmasına rağmen biz NeuO 488 nm ve ölçü emisyon, heyecanlandırmak > 617 nm. Photoetched coverslips indirgeme izleri aynı hücreleri hkr kültür birçok gün içinde bulmak yardımcı oldu ve birçok hafta boyunca görüntü dilimleri aynı bölgelerinde izin verdi. Hemen hemen hiçbir önemli dilimlerini inceltme değiştirilmiş cam coverslips kültür, hangi için biz dilim kalınlığı ölçümleri elde en uzun süresi noktası 5 haftada sırasında oluştu.
AV, AAV ve rekombinant lentivirus vektörler de dilimleri eksojen genlerinde ifade ettikleri için çalışır. Lentivirus nöronal belirli Organizatör ile çok yüksek bir oranda ifade almak için özellikle yararlı (> % 85) nöronların 8 gün sonrası enfeksiyon içinde. Ayrıca, biz insan reklam10,11 ve fare reklam modelleri32 overexpressing Aβ bilişsel açıkları gelişimi ile ilişkili cofilin-aktin çubuk patoloji ile tedavi dilim kültürlerde izlenebilir göster nispeten düşük konsantrasyonlarda (100 nM) sentetik insan Aβo. Biz gelecekteki uygulamalar bu yöntemin cofilin-aktin çubuk patoloji ve/veya birçok nörolojik bozukluklar33olarak ortaya doğru dendritik omurga anomalileri tersine çevirmek için yeni tedavi karakterize içerecektir öngörülüyor.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: a review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Gähwiler, B. H. Organotypic monolayer cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 4 (4), 329-342 (1981).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Long-term imaging of neuronal circuits in organotypic hippocampal slice cultures. Nat Protoc. 1 (3), 1223-1226 (2006).
- Roo, M. D., Ribic, A. Analyzing structural plasticity of dendritic spines in organotypic slice culture. Methods Mol Biol. 1538, 277-289 (2017).
- Lee, K. F. H., Soares, C., Thivierge, J. -P., Béīque, J. -C. Correlated synaptic inputs drive dendritic calcium amplification and cooperative plasticity during clustered synapse development. Neuron. 89 (4), 784-799 (2016).
- Davis, R. C., Maloney, M. T., Minamide, L. S., Flynn, K. C., Stonebraker, M. A., Bamburg, J. R. Mapping cofilin-actin rods in stressed hippocampal slices and the role of cdc42 in amyloid-beta-induced rods. J Alzheimers Dis. 18 (1), 35-50 (2009).
- Clark, R. E., Squire, L. R. Similarity in form and function of the hippocampus in rodents, monkeys, and humans. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, Suppl 2 10365-10370 (2013).
- Minamide, L. S., Striegl, A. M., Boyle, J. A., Meberg, P. J., Bamburg, J. R. Neurodegenerative stimuli induce persistent ADF/cofilin-actin rods that disrupt distal neurite function. Nature Cell Biol. 2 (9), 628-636 (2000).
- Rahman, T., et al. Cofilin rods and aggregates concur with tau pathology and the development of Alzheimer's disease. J Alzheimers Dis. 42 (4), 1443-1460 (2014).
- Bamburg, J. R., Bernstein, B. W. Actin dynamics and cofilin-actin rods in Alzheimer disease. Cytoskeleton(Hoboken). 73 (9), 477-497 (2016).
- He, T. C., Zhou, S., da Costa, L. T., Yu, J., Kinzler, K. W., Vogelstein, B. A simplified system for generating recombinant adenoviruses. Proc Natl Acad Sci U S A. 95 (5), 2509-2514 (1998).
- Minamide, L. S., et al. Production and use of replication-deficient adenovirus for transgene expression in neurons. Methods Cell Biol. 71, 387-416 (2003).
- Kügler, S., Kilic, E., Bähr, M. Human synapsin 1 gene promoter confers highly neuron-specific long-term transgene expression from an adenoviral vector in the adult rat brain depending on the transduced area. Gene Ther. 10 (4), 337-347 (2003).
- Mi, J., et al. A genetically encoded reporter for real-time imaging of cofilin-actin rods in living neurons. PLOS ONE. 8 (12), 83609 (2013).
- Wang, L., Blouin, V., Brument, N., Bello-Roufal, M., Francois, A. Production and purification of recombinant adeno-associated vectors. Methods Mol Biol. 807, 361-404 (2011).
- Matsushita, T., et al. Adeno-associated virus vectors can be efficiently produced without helper virus. Gene Therapy. 5 (7), 938-945 (1998).
- Ward, P., Walsh, C. E. Targeted integration of rAAV vector into the AAVS1 region. Virology. 433 (2), 356-366 (2012).
- Akerboom, J., et al. Optimization of a GCaMP calcium indicator for neural activity imaging. J Neurosci. 32 (40), 13819-13840 (2012).
- Kim, J. H., et al. High cleavage efficiency of a 2A peptide derived from porcine teschovirus-1 in human cell lines, zebrafish and mice. PLOS ONE. 6 (4), 18556 (2011).
- Benskey, M. J., Manfredsson, F. P. Lentivirus production and purification. Methods Mol Biol. 1382, 107-114 (2016).
- Huang, L., Chen, C. Autoprocessing of human immunodeficiency virus type 1 protease miniprecursor fusions in mammalian cells. AIDS Res Ther. 7, 27 (2010).
- Bordat, A., Houvenaghel, M. C., German-Retana, S. Gibson assembly: an easy way to clone polyviral full-length infectious cDNA clones expressing an ectopic VPg. Virol J. 12, 89 (2015).
- Er, J. C., et al. NeuO: a fluorescent chemical probe for live neuron labeling. Angew Chem Int Ed Engl. 54 (8), 2242-2246 (2015).
- Bernstein, B. W., Chen, H., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Formation of actin-ADF/cofilin rods transiently retards decline of mitochondrial potential and ATP in stressed neurons. Am J Physiol Cell Physiol. 291 (5), 828-839 (2006).
- Cichon, J., et al. Cofilin aggregation blocks intracellular trafficking and induces synaptic loss in hippocampal neurons. J Biol Chem. 287 (6), 3929-3939 (2012).
- Stine, W. B. Jr, Dahlgren, K. N., Krafft, G. A., LaDu, M. J. In vitro characterization of conditions for amyloid-beta peptide oligomerization and fibrillogenesis. J Biol Chem. 278 (13), 11612-11622 (2003).
- Maloney, M. T., Minamide, L. S., Kinley, A. W., Boyle, J. A., Bamburg, J. R. Beta-secretase-cleaved amyloid precursor protein accumulates at actin inclusions induced in neurons by stress or amyloid beta: a feedforward mechanisms for Alzheimer's disease. J Neurosci. 25 (49), 11313-11321 (2005).
- Davis, R. C., et al. Amyloid beta dimers/trimers potently induce cofilin-actin rods that are inhibited by maintaining cofilin phosphorylation. Mol Neurodegener. 6, 10 (2011).
- Walsh, K. P., et al. Amyloid-β and proinflammatory cytokines utilize a prion protein-dependent pathway to activate NADPH oxidase and induce cofilin-actin rods in hippocampal neurons. PLOS ONE. 9 (4), 95995 (2014).
- Woo, J. A., et al. RanBP9 at the intersection between cofilin and Aβ pathologies: rescue of neurodegenerative changes by RanBP9 reduction. Cell Death Disease. , 6 (2015).
- Shaw, A. E., Bamburg, J. R. Peptide regulation of cofilin activity in the CNS: a novel therapeutic approach for treatment of multiple neurological disorders. Pharmacol Ther. 175, 17-27 (2017).
