Summary
Apresentado aqui é um método de tubo de rolo modificado para cultivo e intermitente de imagem de alta resolução do cérebro de roedor fatias muitas semanas com reposicionamento exacto em lamelas de photoetched. Viabilidade neuronal e morfologia da fatia são bem mantidos. Aplicações deste sistema completamente fechado usando vírus para expressão específica do tipo de célula são fornecidas.
Abstract
Fatias de cérebro de roedor cultivadas são úteis para estudar o comportamento de neurônios e glia em um ambiente que mantém muitas das suas interações normais na vivo celular e molecular. Fatias obtidas a partir de uma variedade de linhas de rato geneticamente modificado ou o uso de vetores virais para expressão de proteínas fluorescente etiquetadas ou repórteres em fatias de cérebro de tipo selvagem permitem imagens de alta resolução por microscopia de fluorescência. Embora vários métodos têm sido desenvolvidos para imagem fatias do cérebro, combinando cultura fatia com a capacidade de realizar imagens de alta resolução repetitiva de células específicas em fatias ao vivo durante longos períodos de tempo tem colocado problemas. Isto é especialmente verdadeiro quando os vetores virais são utilizados para a expressão de proteínas exógenas desde que isto é feito melhor em um sistema fechado para proteger os usuários e evitar a contaminação cruzada. Simples modificações feitas ao método de cultura rolo tubo cérebro fatia que permitem imagens de alta resolução repetitiva de fatias durante muitas semanas em um sistema fechado são relatadas. Cultivo de fatias em photoetched lamelas permite o uso de marcas fiduciais rapidamente e precisamente reposicionar o palco para o campo idêntico de imagem ao longo do tempo, antes e depois de tratamentos diferentes. Exemplos são mostrados para o uso desse método combinado com coloração neuronal específica e expressão para observar alterações em fatias hippocampal arquitetura, expressão neuronal mediada por viral de proteínas fluorescentes e o desenvolvimento de patologia cofilin, que anteriormente foi observada no hipocampo de doença de Alzheimer (AD) em resposta ao tratamento da fatia com oligômeros de peptídeo de amiloide-β (Aβ).
Introduction
Cultura primária de neurônios dissociadas de regiões do cérebro de roedor é uma importante ferramenta usada por pesquisadores para observar respostas para patologicamente implicado estímulos. No entanto, tais estudos têm a desvantagem de olhar para os neurônios em 2D única e sem seu sistema de apoio a glia. Além disso, a não ser crescidas sob condições de muito alta densidade (640 neurônios/mm2 ou cerca de 16% da superfície), no qual ele torna-se impossível acompanhar a consequência aleatória de um dendrito ou axônio para mais do que uma curta distância do corpo celular, hipocampo viabilidade neuronal durante 4 semanas diminui significativamente1, limitando o uso de culturas dissociadas de estendido estudos das patologias relacionadas com a idade. O cultivo de fatias preparadas a partir de cérebro de roedor é uma opção atraente que supera essas limitações, mantendo uma arquitetura organizada cell e viabilidade para semanas ou meses. As condições para a manutenção de muitas regiões diferentes do cérebro de roedor em fatia cultura foram descritos2.
Dois métodos principais são amplamente utilizados para a cultura a longo prazo de fatias de cérebro: cultivo nas membranas para a interface ar-líquido3 ou cultivo em lamelas em tubos fechados pode para girar em uma incubadora de rolo para fornecer aeração4. Fatias cultivadas nas membranas podem ser fotografadas diretamente com microscopia de fluorescência de alta resolução usando um microscópio vertical e de objectivos de imersão de água5. Alternativamente, fatias cultivadas nas membranas foram transferidas para pratos de fundo de vidro para obter uma boa resolução de espinhas dendríticas, usando um microscópio invertido6. No entanto, ambos os métodos de imagem fatias crescidas nas membranas são sistemas abertos que exigem mudanças de médio e costumam usam antifúngico e/ou antibióticos para evitar ou reduzir a contaminação5,6. Fatias de uma membrana na interface ar-médio mantêm excelente morfologia e sobrevivência, mas retornando para locais precisos durante repetitivo imaging na alta magnificação é extremamente difícil, a menos que a experiência está seguindo apenas pequenos grupos de células expressando um marcador fluorescente. Embora fatias cultivadas em membranas têm sido utilizadas com expressão viral mediada de transgenes5,6, protocolos de biossegurança podem exigir um sistema fechado de cultura ser empregado por certos vetores virais que são usados para expressando fluorescente etiquetado proteínas e repórteres da fisiologia celular. Além disso, objectivos de imersão exigem descontaminação entre amostras que será seguido em cultura5. Uma aplicação importante das culturas de interface da membrana é a combinação de imagem de alta resolução com eletrofisiologia em tempo único pontos7.
Método do tubo do rolo com lamelas dentro do tubo plástico não permite qualquer eletrofisiologia ou imagens de alta resolução sem remover a lamela. Assim, este método foi aplicado mais frequentemente para estudos de longo prazo em que a pós-fixação observações tenham sido feitas a8. Descrito aqui é um método que utiliza a técnica de cultura de tubo do rolo, mas nos tubos perfurados-out com fatias em lamelas que podem ser fotografadas repetidamente para contanto que as culturas é mantido. O sistema fechado não requer nenhuma mudança média para a imagem latente e utiliza as lamelas de photoetched para fornecer marcas fiduciais que permitem que a imagem em alta ampliação, após dias ou semanas, os campos precisos previamente fotografados.
Nós aplicamos esse método para examinar alterações em roedor hipocampo, uma região do cérebro importantes envolvido na aprendizagem e memória. O hipocampo de roedor frequentemente é estudado como um modelo para alterações patológicas ou relacionadas com a idade observada durante o desenvolvimento do impairment cognitive9, tais como aqueles que ocorrem no anúncio. Nosso método é particularmente adequado para estudar as alterações patológicas que se desenvolvem dentro de uma única fatia ao longo do tempo em resposta às mudanças ambientais, tais como aumentos de peptídeos Aβ, que é característica da AD8. Uma patologia associada com cérebro de AD de humanos e roedor é a presença de agregados de cofilin-actina e hastes, os último contendo feixes de filamentos no qual cofilin e actina são em um 1:1 relação molar10,11, 12. as hastes têm sido observadas em fixas fatias de hipocampo de ratos após o tratamento de Aβ, bem como dentro de uma fatia do cérebro de roedores vivos expressando GFP-cofilin submetida a hipóxia8, e eles podem contribuir para a disfunção sináptica vista em AD e acidente vascular cerebral. Aqui nós usamos este novo método de cultivo para observar a evolução temporal e distribuição dentro de fatias de exógenas quiméricoes fluorescentes proteínas expressas introduzidas por diferentes vírus. Então, nós utilizamos a expressão neuronal específica de uma construção de repórter de cofilin para acompanhar o desenvolvimento da haste cofilin e patologia agregada em fatias hippocampal em resposta ao tratamento com oligômeros Aβ solúveis (Aβó).
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Protocol
Uso de animais segue reprodutores aprovados e protocolos de uso de animais que se conformam ao cuidado Animal e usar as diretrizes da Colorado State University.
Nota: O protocolo abaixo descreve o método de preparação e cultura para a incubação a longo prazo e intermitente de imagem de fatias hippocampal. Uma única fatia hippocampal é anexada a uma lamela de photoetched especialmente preparado usando um coágulo de plasma, e em seguida as lamelas são seladas com o lado liso de um tubo perfurado-fora do rolo, que é mantido em uma incubadora de rolo. Coágulos de plasma são dissolvidos com plasmina antes da infecção viral para a expressão da proteína fluorescente e imagens em alta resolução. Um corante fluorescente de vital neuronal é usado para neurônios dentro as fatias de imagem.
1. preparação da cremalheira do tubo do rolo
- Uso o modelo mostrado na Figura 1um impresso para o tamanho mostrado na barra de escala. Com um prego, fazem pequenos furos (grandes o suficiente para um marcador de ponta fina) no modelo centrado sobre os buracos.
- Definir o modelo no fundo de um prato de cultura de tecidos de 15 cm (diâmetro nominal de 14 cm) e marque a posição dos furos. Repita isso em um segundo prato.
- Com brocas, projetadas para uso em plástico, faça 6 furos de diâmetro de 1,5 cm em cada prato em uma matriz de hexagonal (4,8 cm--centro), com centros de furo 2,5 cm da borda do prato. Faça três furos (3 mm de diâmetro) 12 mm da aresta que são colocados equidistantes entre dois dos maiores buracos como mostrado na Figura 1A.
- Com o fundo de cada prato frente para o outro, coloque um parafuso de máquina longa 2,5 polegadas (diâmetro de 3/16 de polegada) com uma arruela lisa através de um dos furos pequenos seguidos por uma segunda anilha plana, uma peça de polietileno tubos (espaçador, 4,7 cm), outra arruela plana , o segundo prato de cultura de tecidos, outra arruela plana, uma anilha e uma porca.
- Repita a etapa 1.4 sobre os outros dois parafusos de máquina e só vagamente apertando até que todos os parafusos de máquina são no lugar. Em seguida aperte bem as porcas.
- Trabalhar os ilhós (5/16 polegadas grosso, 5/8 de polegada buraco de diâmetro) nos orifícios do prato inferior para obter o tubo do rolo final cremalheira (Figura 1B; mostrada com dois tubos no lugar). Coloca um adesivo em cada rack com um número exclusivo.
2. preparação dos tubos de rolo e lamelas
- Fazendo o gabarito para a furação em tubos de rolo
- Faça um furo de 1,5 cm, 8 cm de profundidade no lado centro de um 2 x 4 x 5,5 polegadas bloco de madeira em um ângulo tal que o lado liso do rolo de tubo vai ser quase paralelo com o bloco quando inserido(Figura 2).
- Alargar o buraco usando uma lima redonda de madeira a ampliar e a conicidade do furo para permitir a inserção de tubo (tubos de rolo são ligeiramente maiores no diâmetro perto do fim da tampa) (Figura 2B).
- Um buraco de 1,5 cm de diâmetro vertical, 5,5 cm do lado do bloco e centrada sobre o furo lateral (Figura 2C).
- Quando o buraco de lado é afilado suficiente, inserir um tubo de rolo que está marcado no local desejado para o centro do buraco para a fatia e posicione o tubo para que o local marcado é centrado no buraco vertical 1,5 cm.
- Retire o tubo e meça a distância do ponto à extremidade do tubo. Marcar essa distância do centro do furo do gabarito e inserir um prego para fornecer uma paragem para posicionar corretamente o tubo de perfuração (seta na Figura 2C).
- Use uma serra para cortar a unha nivelada com a superfície do bloco de madeira para evitar lesões.
- Adicione clipes de mola na parte inferior do gabarito se não houver uma imprensa de broca com ranhuras que permitem que seja ancorado (Figura 2D preto seta). Caso contrário, use grampos para prender o gabarito com segurança para a furadeira.
- Utilizar o gabarito descrito acima para segurar e posicionar um tubo de plástico cultura 11cm face plana com o lado liso para cima(Figura 2), faça um furo de diâmetro de 6 mm com o centro de 1,0 cm da parte inferior e centrado entre os lados do tubo.
Nota: Deve ser usada uma broca projetada para plástico. - Com um giro sobre um eixo rebarbador, suavizar as arestas do furo(Figura 2)e fazer 4 ranhuras no interior borda do furo (Figura 2,E, de encastrar) para facilitar a drenagem do buraco durante a rotação.
- Com um furo de 12mm socar, corte discos de diâmetro 12 mm de folhas de borracha atóxica dupla face adesivo do silicone. Usando um padrão um papel furador (6 mm de diâmetro), faça um buraco no centro de cada disco.
- Lave os tubos perfurados com etanol a 70%, ar seco-los em uma câmara de segurança biológica e esterilize os tubos e os discos de adesivo perfurados por 40 min na lâmpada UV (30 W a distância média de 70 cm) a segurança microbiológica.
- Reposicione os tubos e discos depois de 20 min para que todas as superfícies expostas são esterilizadas. Sob condições estéreis, retire o fundo de um disco adesivo branco e apor a borracha de silicone para o exterior de um tubo, alinhando os orifícios (Figura 2-F).
Cuidado: Para evitar a exposição aos raios UV, use óculos de protecção e fechar o armário antes de ligar a lâmpada UV. - Limpe a 12 mm de diâmetro photoetched (100 centro numerado 1 mm quadrados) alemão as lamelas de vidro. Mantenha as lamelas suavemente com fórceps e mergulhe em etanol absoluto, seguido por água, seguida de etanol absoluto novamente e finalmente, mergulhe as lamelas em uma chama para queimar o etanol. Permitir que as lamelas esfriar.
- Segurando as lamelas com fórceps, mergulhar em 2% 3-aminopropyltriethoxysilane em acetona para 10 s. enxágue as lamelas com água ultrapura e deixar secar ao ar.
- Definir as lamelas em papel de filtro estéril dentro de uma câmara de segurança biológica do armário e ligar o UV luz. Expor a cada lado das lamelas por 20 min.
Cuidado: Para evitar a exposição aos raios UV, use óculos de protecção e fechar o armário antes de ligar a lâmpada UV.
3. hippocampal fatia preparação
- Antes de iniciar a dissecação, prepare as metades de lâminas de dois gumes para o helicóptero de tecido. Dobrar as lâminas longitudinalmente cuidadosamente com os dedos e partir ao meio.
- Enxágue as metades de lâmina com acetona, usando um cotonete de algodão para limpá-los, seguido de lavagem em etanol absoluto e secagem do ar.
Nota: O protocolo de cultura de fatia de cérebro é independente do mouse ou rato estirpe ou genótipo. Muitas linhas de rato transgénico com diferentes origens genéticas têm sido utilizadas.
- Com a pinça, segure a aparada cerebral posterior para cima e o lado ventral contra o lado da caixa de Petri para a estabilidade. Delicadamente tease meninges afastadas em torno da linha sagital mediana e remover o tecido do mesencéfalo usando um fórceps de Dumont #5 com ponta fino (Figura 3C, círculo tracejado).
- Fazer dois cortes nas laterais do cérebro para espalhá-lo aberto (Figura 3C, linhas tracejadas). Uma vez que o cérebro é colocado lado dorsal para baixo e aberto de propagação, a fissura hippocampal deve estar visível (Figura 3D, seta).
- Transferir o cérebro aberto de propagação para um pedaço de filme plástico Policlorotrifluoroetileno e posicioná-lo para cortar no palco de um helicóptero de tecido. Molhar a lâmina com SYNTHASE/glicose e pique o hipocampo em ~ 300 µm de espessura.
- Com uma pipeta de transferência, irrigue o cérebro fatiado fora do filme plástico em um prato fresco 60 mm contendo SYNTHASE/glicose (Figura 3E). Delicadamente, beliscar fora e provocar, com pinça de ponta fina, as restantes meninges e outros tecidos não-hipocampo (Figura 3F) do rodelas (Figura 3G, H).
4. chapeamento fatias
- Uma vez fatias foram obtidos, coloque 2 µ l de plasma de galinha no centro do lado de photoetched de uma lamela preparado. Espalhe o plasma ligeiramente para alcançar um lugar de diâmetro de 3 a 4 mm.
Nota: O photoetched de lado é o lado superior da lamela quando visto através de um microscópio de dissecação, tal que os números são orientados corretamente. - Transferi 1 fatia de cérebro com uma espátula de ponta estreita-estéril(Figura 4)para o lugar de plasma (Figura 4B). Use pinça fechada para manter a fatia na ponta da espátula enquanto levanta a fatia do SYNTHASE/glicose.
- Toque a espátula para o plasma mancha na lamela e com a pinça fechada, empurre a fatia no sentido da lamela.
- Mix de 2,5 µ l de plasma com 2,5 µ l de trombina em um tubo separado. Rapidamente coloque 2,5 µ l dessa mistura sobre e em torno da fatia e pipetar acima e para baixo suavemente para misturar (Figura 4B).
Nota: Irá coagular o plasma dentro de 10-15 s, então isso deve ser feito rapidamente. Se a fatia de adesão é um problema, misturar 5 plasma µ l com 5 trombina µ l e usar 4-5 µ l na fatia, removendo alguns após a mistura para que a fatia situa-se no sentido do lamela. - Remova o plástico transparente cobrindo desde o lado exposto do adesivo de borracha do silicone anteriormente Aposto em um tubo de rolo e colocar a lamela com a fatia do cérebro para o adesivo, alinhando a fatia dentro do buraco (Figura 4C).
- Para assegurar uma aderência, macio, aplica pressão para a lamínula com o polegar pressionando a lamela para baixo uniformemente e segurando-o por cerca de 1 min enquanto transferi-lo para a câmara de segurança biológica.
- Em uma câmara de segurança biológica, adicione 0,8 mL de meio de cultura completo Neurobasal A (Tabela de materiais) para cada tubo (Figura 4-D).
- Fluxo de uma mistura de ar 5% CO295% através de uma pipeta de Pasteur algodão-conectado estéril fixa por uma pinça. Lave o tubo do rolo com a mistura de gás e cap rapidamente o tubo como sua retirada do próximo a pipeta.
- Rotule os tubos com o número de fatias e rack de número. Inserir os tubos em um rack de rolo, garantindo que eles são geometricamente equilibrados. Se houver um número ímpar de tubos, adicione os tubos para equilibrar.
- Coloque as prateleiras em uma incubadora de rolo de 35 ° C com rolos girando a cremalheira do rolo no sobre RPH 10-13 (Figura 4E). Para manter a média no fundo dos tubos, inclinação da incubadora volta aproximadamente 5°, aumentando a sua frente em uma placa.
- Digite o número de fatia e tubo em uma planilha, que é usado para gravar todas as informações de datas de observação e tratamentos de fatia.
- Em aproximadamente dia 6, na cultura, adicione 1 µ l (0.002 U) de plasmina ativa a cada tubo.
- Após a formação de coágulos dissolver completamente (geralmente dentro de algumas horas), retire o meio e substituí-lo por meio fresco sem plasmina. Se necessário, as fatias podem ser incubadas com plasmina durante a noite e o meio mudou no dia seguinte.
- Fatias geralmente são incubadas pelo menos 7-10 dias antes da utilização em experimentos. Aspire médio e substituí-lo no dia 3 ou 4, novamente no dia 7 e posteriormente a cada 7 dias.
5. preparação de vetores virais para a expressão do Transgene
Nota: Expressão de transgenes em neurônios das culturas fatia é conseguida usando cérebros de roedores geneticamente modificados ou introduzindo o transgene infecção com vírus deficiente de replicação recombinante.Adenovírus (AV), vírus adeno-associado (AAV) e vetores de lentivirus recombinantes foram todos utilizados em nossas culturas hippocampal fatia para expressão de quimeras de diferentes proteínas fluorescentes em fatias de cérebro.
- Prepare-se13,14replicação deficiente AV para expressar o RNA de interesse de acordo com os métodos descrito em outro lugar. Título do vírus para infecciosa U/mL, pelo método de diluição serial usando um anticorpo para uma proteína virally expressa como descrito14. Para observar cofilin agregados e formação de haste cofilin-actina, utilizam o cDNA cofilin-R21Q-mRFP (plasmídeo #51279)16.
Nota: O synapsin 1 promotor é uma excelente escolha para expressão neuronal específica15, Considerando que o promotor citomegalovírus é útil para a condução de níveis de alta expressão em muitos tipos de célula13. - Prepare AAV transfection co de transferência do plasmídeo contendo o gene de interesse e um plasmídeo rep/cap, com ou sem um plasmídeo ajudante, em células HEK293-embalagens, que abastecem o gene viral de E1, como descrito anteriormente17,18.
Nota: AAV recombinante também pode ser feita para alvo inserção no genoma celular hospedeiro19. Para o plasmídeo de transferência, usamos cofilin humana 1 com um C-terminal mRFP1 fluorescência proteína tag (plasmídeo #50856) clonado em um synapsin contendo promotor AAV plasmídeo a jusante do cálcio sensor GCaMP5G20. Um pedaço de DNA a sequência de peptídeo P2A Self chicotada de codificação é inserido pelo PCR entre GCaMP5G e cofilin-RFP durante a preparação do plasmídeo a transferência para fornecer a expressão de ambas as proteínas de um único vírus adeno-associados transcrição21. - Prepare vectores recombinantes lentivirus, co transfeccao de plasmídeo de transferência que contém o gene ou cDNA de sinais de interesse e de integração, juntamente com uma terceira geração de lentivirus embalagem mistura que divide a mordaça viral, pol, rev e genes de vsv-g para três diferentes plasmídeos22,23.
- Para o plasmídeo de transferência, use um único passo clonagem sistema24 para montar o promotor synapsin e cofilin-R21Q-mRFP cDNA (do plasmídeo 51279 #) em pLKO.1-GFP (plasmídeo #30323), com o promotor de synapsin e cofilin-R21Q-mRFP, substituindo o hPGK promotor e GFP cDNA, respectivamente.
- Transfect o plasmídeo final em células HEK293T pelo fosfato de cálcio, como descrito anteriormente,23.
- Recolher a média de quatro pratos de 10 cm, concentrar a 500 µ l usando concentradores centrífugos 150K-corte e armazenar o lentivirus final a-80 ° C em pequenas alíquotas após congelamento rápido em nitrogênio líquido. Descongele uma alíquota apenas uma vez para infectar as células.
- Determine empiricamente que o volume de cada tipo de vírus preparado para atingir o grau de expressão desejado pela criação de um número de culturas diferentes fatia a seguir a expressão dos transgenes após infecção com vários volumes de vírus.
Nota: Normalmente, 1-10 µ l de vírus é usado por fatia.
6. fatia tratamentos
- Infectando as fatias com vírus
- Trabalhando em uma câmara de segurança biológica aprovada pelo trabalho de vírus no nível de segurança biológica adequado para o vetor, misture uma parte alíquota do vírus (geralmente 1-10 µ l) com 0,8 mL de meio completo.
- Aspire o meio da fatia usando uma pipeta Pasteur estéril em uma armadilha de coleção contendo água sanitária. Uma armadilha secundária é usada sempre entre a primeira armadilha e a fonte de vácuo.
- Substituir este meio com alíquota contendo vírus preparada acima, retornar os tubos de cultura para uma cremalheira e colocar na incubadora.
- Depois de 2-5 dias de incubação as fatias com vírus a segurança microbiológica, remover o meio contendo vírus com uma pipeta de transferência estéril e colocá-lo em um frasco contendo um agente antiviral aprovado para matar o vírus.
- Coloração de neurônios com corante vital
- Preparar e armazenar alíquotas de corante vital neuronal fluorescente25 por µ l 4 congelação rápida das alíquotas em nitrogênio líquido a uma concentração de 100 µM e armazenar estas a-20 ° C. Não congelar/descongelar o corante mais de uma vez.
- Para rotular os neurônios para visualização por microscopia de fluorescência, descongelar uma alíquota do corante vital neuronal e diluir 4 ml em meio Neurobasal completo (concentração final de tintura é 100 nM).
- Remover o meio de fatias por aspiração (ou de uma pipeta de transferência se o meio contém vírus) e substituí-lo com 0,8 mL do meio de contendo o corante vital neuronal de 100 nM. Retorne as fatias para o aparelho de rolo na incubadora.
- Após incubação as fatias por 2 h, Aspire o meio contendo corante e substituí-lo com 0,8 mL de meio fresco completo, em uma câmara de segurança biológica.
Nota: Rotulagem de neurônios em fatias com corante vital requer várias horas de incubação. As primeiras imagens são geralmente tomadas 24h após tratamento com corante. Embora os neurônios são rotulados especificamente, há fluorescência de fundo que declina durante 2-3 dias para dar a melhor imagem neuronal. Intensidade do corante vital declina após 72 h. - Para acompanhar as mudanças na morfologia da fatia ao longo do tempo, reclassificar as fatias cada 7 dias.
7. fatia de imagem
- Fatias de vista de um microscópio invertido. Para mais brilhantes imagens de fluorescência, a 24 h antes da imagem latente, troca de meio de cultura com meio Neurobasal A completo sem o indicador de pH vermelho de fenol.
Nota: Para as experiências aqui relatadas, fatias são vistas em um microscópio de fluorescência confocal de disco giro invertido equipado com um linear codificado x, y palco com piezo z controle e uma câmera digital de alta resolução sensível. - Transferir o tubo com a cultura de fatia a criação da imagem do aparelho do tubo do rolo para o titular do tubo sob medida (Figura 5A), que é colocado no adaptador de fase (Figura 5B), para manter a lamela perpendicular o objetivo e manter a fatia na mesma orientação durante as sessões de imagem repetitivas ao longo de intervalos de tempo.
- Empurre a chave deslizante no adaptador de palco apertado contra o tubo para segurar o tubo na posição (Figura 5B).
Nota: Detalhes do titular do tubo, adaptador de palco, e aquecedor pode ser acessado em: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/.
Nota: Estas posições off-set da marca fiducial permitem identificação consistente da mesma localização da lamela, quando a fatia é imaginada, mesmo que o original x, y configuração da marca fiducial muda quando o adaptador de tubo ou estágio será removido e substituído.
Nota: Aviões de imagem geralmente são obtidas em intervalos de 0,5 µm a 2 µm, dependendo do tamanho e a resolução desejada, os recursos de imagem. Criando uma imagem 3D de qualidade exige que características da imagem estendem ao longo de vários planos de aquisição, e então para visualizar características menores, intervalos menores são necessários entre aviões.
Nota: a maioria das sessões de imagem relataram aqui estavam sob 18 min/fatia. No entanto, podemos ter fotografado algumas fatias de dez ou mais vezes e até mesmo como longo como 40 min em uma única sessão, sem dano aparente na sobrevivência a longo prazo da fatia.
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Representative Results
Para determinar exatamente como marcas fiduciais podem ser utilizadas para recriar as mesmas células dentro das mesmas áreas ao longo do tempo, nós examinamos fatias cultivadas em photoetched lamelas (Figura 6A). Os neurônios foram visualizados por coloração com um corante vital (100 nM para 2h; não mancha células não-neuronais), que desaparece de neurônios ao longo do tempo, sem prejudicar as células25. Nós identificamos um fiducial marca em um quadrado de grade simples (Figura 6A, B), encontrou uma região de neurônios de tingir-etiquetados vitais 24 h após a rotulagem, gravou o x e y compensar as posições das marcas fiduciais (Figura 6B) e recolhidos, usando um objectivo X 60, pilhas de imagem confocal desta região, repetindo a imagem em 4 dias consecutivos. As imagens de projeção máxima de uma pilha de 30 µm imagem tirada no mesmo local são mostradas (Figura 6C-F). Apesar de algumas mudanças morfológicas ocorrem dentro da região ao longo de 4 dias, as células idênticas (vários dos quais são marcados) podem ser seguidas ao longo do tempo. A intensidade da fluorescência do corante vital declinou ao longo do tempo, mas os neurônios ainda eram claramente identificáveis 4 dias depois da rotulagem. Embora a maioria da fluorescência do corante vital neuronal era difusa no citoplasma, algumas manchas punctate sempre observou-se, que se tornou mais perceptível como fundo fluorescência diminuída. Em fatias insalubres, uma coloração punctate de células não-neuronais também foi observada como fatias deteriorou-se. Estes resultados demonstram que as células identificadas em fatias podem ser repetidamente fotografadas usando marcas fiduciais encontrá-los.
Para examinar alterações dependentes de tempo na organização neuronal e viabilidade dentro de fatias durante a cultura a longo prazo, nós seguimos as fatias mesmas durante 5 semanas, etiquetando com corante fluorescente de vital neuronal, uma vez por semana, 24 h antes de imagem. Várias rodadas de coloração com o corante vital ao longo de várias semanas de acumulação aumento dos agregados. Neurônios dentro recentemente chapeados fatias que estavam ainda em coágulos de plasma foram carregados com corante e fotografaram em um dia em vitro (1 DIV). As fatias mesmas foram fotografadas novamente semanalmente por 5 semanas. Imagens obtidas de uma única fatia com um objectivo de 4x são mostradas (Figura 7A-E). As camadas de célula piramidal do CA e DG regiões são rotuladas brilhantemente quando excitado em 488 nm e fluorescência de emissão medidos em > 620 nm. Durante um período de 5 semanas de observação 19 fatias, três fatias saiu a lamela e outros dois perderam sua morfologia típica e tornou-se opaco, uma indicação de sua morte. Assim, uma taxa de sobrevivência de cerca de 70% para experiências deve ser considerada, e fatias extra preparado para garantir um número adequado para análise. As fatias foram preparadas em um ajuste de espessura nominal no helicóptero do tecido de 300 µm. Após 5 semanas em cultura, medimos a espessura da fatia de imagem neuronais vitais manchadas de tinta fatias da lamela acima através da fatia com um objectivo de óleo X 40 em um microscópio confocal de disco girando. Perda de foco dos neurônios ocorreu em uma média de 257 nm (n = 5 fatias com múltiplos locais usados por fatia), demonstrar que muito pouco afinamento da fatia tinha ocorrido desde o tempo do chapeamento. Nós poderíamos não medir com precisão a espessura da fatia por microscopia de fluorescência aquando do chapeamento porque o corante vital aprisionado no coágulo plasma deu fluorescência difusa, tornando difícil de medir com precisão a posição na qual ocorreu a perda de foco. No entanto, imagens 3D dos neurônios dentro de fatias são facilmente obtidas em fatias após o coágulo de plasma é removido. A fatia DIV 21, mostrado na ampliação baixa no Figura 7F, foi fotografada com um objetivo X 60 em um microscópio confocal (passos de 1 µm) 3 dias após o carregamento com o corante vital neuronal. Uma imagem 3D de 60 µm foi construída a partir dos aviões focais (Figura 7G). Neurônios e seus processos de axônio que são rotulados com o corante vital podem ser seguidos em 3D. Morfologia e estrutura 3D de fatias foram bem conservados durante pelo menos 3 meses, e as vezes mais longas foram utilizadas no estudo atual.
Grandes mudanças na morfologia de posição anteriormente imagem também ocorreram em algumas fatias, sugerindo que esse movimento da fatia na lamela pode ter lugar. Certamente, ao longo de intervalos mais longos entre imagem tornou-se mais difícil saber com certeza que as células no campo sendo fotografada eram idênticas aos observados em sessões anteriores de imagem. Assim, imagens de projeção máxima de pilhas confocal de vitais tingir-etiquetados fatias adquiridas no local idêntico com o objectivo de 60 x semanalmente, abrangendo 4 semanas (Figura 8) mostram que a viabilidade neuronal está bem conservada, mas que é é difícil identificar um neurônio específico ao longo do tempo quando imagens são obtidas com o tempo os intervalos de tempo entre as sessões. Presumivelmente o padrão das células rotulado com múltiplos fluorophores seria mais facilmente reconhecido, como são células em grupos localizados quando observado por percorrer uma pilha de imagem.
Para avaliar a utilidade de diferentes vetores virais para introdução de genes exógenos nos neurônios de fatias hippocampal, comparamos a infecciosidade fatia usando AV, AAV e vetores de Lentivirus recombinantes, cada expressando diferentes etiquetas fluorescentes ou usando diferentes promotores de expressão de unidade. AV (2 x 107 U infecciosa/fatia) expressar cofilin-mRFP por trás de um promotor específico de CMV forte, não-celular foi usado para infectar uma fatia hippocampal do rato que tinha sido cultivadas 9 semanas em lamelas. Expressão de cofilin-mRFP foi encontrada em toda a fatia na pós-infecção 5 dias, com a expressão mais intensa em torno da periferia de fatia, como observado com um objectivo de 4x (Figura 9A). Células dentro da fatia, expressando cofilin-mRFP também foram observadas com um objetivo X 20 (Figura 9B) com algum brilhante coloração punctate e também difundem a expressão em neurônios e células não-neuronais. Depois de 17 semanas em cultura (pós-infecção de 8 semanas), espontâneas cofilin-hastes formou-se em algumas células, presumivelmente impulsionada pela superexpressão de tipo selvagem de26,cofilin-mRFP (Figura 9C)27.
Também demonstrámos que AAV (1010 partículas) poderiam ser usadas para a expressão em fatias.Imagens de fatias infectadas com 9 semanas na cultura com AAV, em que um promotor de synapsin neuronal específico dirigi expressão de GCaMP5-cofilin-mRFP com uma sequência de peptídeo P2A Self chicotada o vinculador da poliproteína traduzidos21, foram capturados 8 infecção pós de semanas (17 semanas em cultura). Nos neurônios expressando o GCaMP5 e cofilin-mRFP, algumas hastes cofilin/agregados formados (Figura 9D-F). A intensidade da fluorescência dos cilindros/agregados era tão forte que foi observada pouca fluorescência de um cofilin-mRFP difusa sem saturação completa e florescimento da imagem cofilin fluorescência das hastes. Hastes de espontânea cofilin aparecem nos neurônios em que quimeras do selvagem-tipo cofilin-fluorescente proteína tem sido excessivamente expresso26,27, bem como em salientou neurônios10. Com base em títulos de adenovírus, que são determinados com base em infecciosidade14 e as contagens de partículas para a determinação do título AAV, dobra de cerca de 100 a 500 números mais altos de partículas de AAV são necessárias para obter aproximadamente a mesma infecciosidade / expressão em fatias comparado para Av..
Para seguir recombinante mediada por lentivirus expressão de proteínas fluorescentes em fatias, fatias foram infectadas em 6 DIV com 1, 3, 10 e 30 alíquotas µ l de uma recombinação lentivirus para expressão neuronal específica (promotor synapsin) do cofilin-R21Q-mRFP, desenvolvido como uma célula viva imagem sonda para cofilin-actina haste formação16. Fatias foram rotuladas com o corante vital neuronal de 11 DIV e fotografadas em regiões específicas para a tintura e a expressão de cofilin-R21Q-mRFP na DIV. 12 e 14 A fatia infectada com a alíquota de 30 µ l de vírus não sobreviveu para a imagem latente, mas três vias fatias tratadocom com os outros volumes do vírus mostraram uma expressão de dose-dependente de mRFP. A Figura 10 mostra imagens de fatias infectadas com 1 µ l e 10 µ l de lentivirus na pós-infecção dias 6 e 8. Várias regiões de duas fatias diferentes foram quantificadas para coloração co de neurônios com o corante vital e expressão de mRFP. Para fatias infectadas com 1 µ l de lentivirus, cerca de 28% dos neurônios expresso mRFP a pós-infecção 6 dias, aumentando-se a 85% por pós-infecção 8 dias. Para fatias infectadas com 10 µ l de lentivirus, cerca de 58% dos neurônios expresso mRFP a pós-infecção 6 dias, aumentando para 86% por pós-infecção 8 dias. Assim, 1 µ l do lentivirus foi suficiente para fornecer ampla fatia infecciosidade e expressão neuronal por pós-infecção 8 dias.
Para demonstrar que este sistema de cultura é útil no seguinte desenvolvimento de patologia cofilin, fatias infectadas com lentivirus para expressar cofilin-R21Q-mRFP em neurônios foram deixadas não tratada ou tratada com diferentes concentrações (1 µM, 333 nM e 100 nM) de humano Aβ proteína sintética que tinha sofrido de incubação a forma oligómeros28. Resultados de estudos anteriores demonstraram que sintético Aβó induzir hastes cofilin-actina em até 25% de neurônios hippocampal dissociada29,30,31. Todos os três fatias tratadas com a concentração de 1 µM de Aβ se soltou da lamela nas primeiras 24 horas, Considerando que todo o veículo tratados fatias (controle) e aqueles tratados com o 333 nM e 100 nM as concentrações de Aβ sobreviveram durante as duas semanas que foram seguidos. Foram as mesmas regiões celulares (DG, CA3 e CA1) numa fatia tratados com 100 nM Aβó imaginada (objetivo de x 60) durante vários dias. Fatias de controle que foram infectadas em 6 DIV com lentivirus para expressar synapsin conduzido cofilinR21Q-mRFP tinham mRFP celular difusa expressão por 15 DIV (Figura 11A). Fatias expostos a 100 nM Aβó em 14 DIV e fotografada no DIV 15 mostraram que a distribuição de cofilin-R21Q-mRFP se tornou punctate, aparecendo em ambos haste em forma de estruturas e agregados (Figura 11B). Estas estruturas se tornou ainda mais proeminentes 6 dias depois Aβ-tratamento (Figura 11C, que é o mesmo campo de células como Figura 11B). Em muitos lugares ricos em neuritos onde somas de célula neuronal são ausentes (Figura 11D), punctate e haste-como matrizes de cofilinR21Q-mRFP desenvolveram (setas na Figura 11C), semelhante à distribuição dos cofilin-actina as hastes anteriormente reportadas nos neuritos de Aβ-Tratado de neurônios em cultura29,30,31. Assim, este novo método de cultivo e observando fatias hippocampal permitirá que os usuários determinar a viabilidade a longo prazo das células que cofilin agrega e forma de barras e a reversibilidade da patologia em vários estágios de desenvolvimento e que facilmente realizar medições de dose-resposta em reagentes que podem bloquear ou reverter a formação de cofilin patologia em um mais na vivo-como organização celular.
Figura 1: Preparação de cremalheira do tubo do rolo. (A) modelo para a marcação das posições de furo para perfurar os fundos de prato de cultura de tecidos de 15 cm. Se a figura é impresso para o tamanho da barra de escala mostrada, pode ser cortado e usado para marcar as posições em um prato de cultura de 15 cm para fazer os furos mostrados. (B) concluída a cremalheira do tubo do rolo com dois tubos inseridos. Cada rack é numerado em uma etiqueta facilmente visível na parte superior do rack. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2 : Preparação dos tubos de cultura rolo. (A) frente Ver os do rolo tubo inserido em um gabarito em uma imprensa de broca para perfurar o furo de 6 mm no tubo. Linha tracejada mostra a posição do tubo do rolo de face plana no jig. (B) final ver do gabarito com o tubo inserido e alinhados sobre furo de broca. (C) vista superior do furo no gabarito para perfurar tubos de rolo com uma broca de 6 mm.Seta branca mostra a posição da corte unha inserida como uma parada para posicionamento das tubulações e linhas duplas pretas são para alinhamento de bits. (D) primavera clipes (seta preta) instalados firmemente na parte inferior do gabarito para segurá-lo na posição quando perfurar tubos. (E) após perfuração do buraco, as bordas são alisadas com um rebarbador e sulcos são cortados no lado interno do furo (baixo-relevo mostra o buraco visto através de um microscópio de dissecação) para melhorar a drenagem médio do buraco durante a rotação do tubo. (F) cultura do tubo com o orifício alinhado para um buraco no adesivo de borracha de silicone, ao qual será anexada a lamela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: Preparação de fatias hippocampal cérebro. Fotos tiradas com uma exibição de microscópio de dissecação: cérebro de rato intacto (A). Posição dos cortes para remover o prosencéfalo e o cerebelo são mostrados como linhas tracejadas azuis. (B) após a remoção do prosencéfalo e cerebelo. (C) pedaço do cérebro de B é invertido a 90 ° com a região posterior (em direção ao cerebelo) virada para cima. Ajuda a posicionar a peça ao lado do lado do prato com a remoção do mesencéfalo (círculo azul tracejado) que pode ser provocado longe o restante hipocampo, tálamo e hipotálamo. Dois cortes com o fórceps (azuis linhas tracejadas) permitir que a parte restante contendo o hipocampo de ambos os hemisférios para propagar-se plana. (D) o cérebro achatado peça mostrando o vaso sanguíneo que corre ao longo da fissura hippocampal (seta azul). Este tecido é colocado em película plástica e transferido para o helicóptero de tecido para cortar na direção da linha tracejada. (E) fatiado tecido mostrando um pouco mais da metade do hipocampo após SYNTHASE/glicose a ser devolvidos. (F) última dissecção do hipocampo e limpeza das fatias para remover o material não-hippocampal. (G) flutuante várias fatias após a limpeza final. (H) foto alargada de uma única fatia para a transferência de lamela. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4 : Fatias de chapeamento e incubação. (A), A fatia de hippocampal do rato é retirada o prato de cultura na ponta de uma espátula, usando a ponta da pinça para ajudar a levantá-lo livre da solução. (B), a fatia é colocado horizontalmente no centro de um photoetched e a lamela de 12 mm 2 µ l de plasma de galinha e outra 2,5 μL de uma mistura 1:1 plasma/trombina é adicionado para gerar um coágulo. (C) após o coágulo é definido (cerca de 1-2 min), o revestimento é removido o círculo de adesivo de borracha do silicone em um tubo do rolo e a lamela é posicionada com o coágulo centrado no orifício; em seguida, lamela é pressionada no lugar com um polegar e mantida em posição por cerca de 1 min. Add (D) 0,8 mL de meio de cultura completo. (E) rolo tubo titulares dentro de uma incubadora de rolo grande com a parte frontal levantada para inclinação 5 ° para manter o meio na parte inferior dos tubos. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Titular do tubo do rolo e incubadora de placa de fase. (A) titular de tubo que posiciona o tubo tal que a lamela é mantida em posição para a imagem latente. (B) titular do tubo montado em uma placa de adaptador de palco de microscópio. Cursores do lado Segure o tubo firmemente para a imagem latente. (C) fase adaptador com os painéis de porta e lateral do tubo adicionado contendo tiras de aquecimento, conectadas a um controlador de temperatura termoelétricos. Uma vez que os tubos são montados e posicionados, um top sólido à caixa pode ser adicionado para ajudar a manter a temperatura durante a imagem latente. Fio laranja é a pista do termopar. Planos para o projeto e construção do aquecedor e adaptador de estágio estão disponíveis em: https://vpr.colostate.edu/min/custom-machining/roller-tube-holder/. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6 : Usando marcas fiduciais para imagens repetitivas de células mesmas. (A) Hippocampal fatia em photoetched lamela (quadrados de 1 mm) com subiculum desdobrado (cauda) vista com iluminação de campo brilhante e objetiva de 4x. Curvatura do tubo do rolo plástico ajuda a criar uma iluminação oblíqua que melhora a visualização da grade. A caixa mostra a posição e o tamanho de um campo X 60. (B), A exibição da mesma fatia com um objectivo de 20 x para encontrar a marca fiducial como a ponta da parte inferior do 4 da Praça 34. Os deslocamentos y e x são mostrados para reproducibly localizar o centro da caixa desejada para a imagem latente confocal de maior ampliação. (C–F) Uma fatia rotulada com corante vital neuronal, que 13 DIV foi fotografada usando um objectivo de 60 x e fazer uma imagem de projeção de 30 µm em 4 dias consecutivos (14-17 DIV). Neurônios idênticos foram fotografados todos os dias. A posição do núcleo em cada um dos três neurônios é marcada com um símbolo diferente. Eles são mais facilmente identificados por rolagem através de pilhas de imagem como suas mudanças de posição 3D ligeiramente. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7 : Imaging neurônios em fatias com um corante vital neuronal. (A) corante vital Neuronal manchado fatia no coágulo de plasma tomada 24 h após o chapeamento com objetivo de X 4. Corante (100 nM) foi adicionado quando a fatia foi primeiro colocada no suporte do tubo do rolo e desbotada 2h mais tarde.Subiculum é enrolado ao redor do hipocampo no coágulo. (B–E) Após a dissolução do coágulo pela plasmina adicionada às 6 DIV, a fatia foi recarregada 5 vezes com o corante vital 24 h antes da imagem latente em intervalos semanais. Imagens mostradas foram coletadas no 8, 21, 28 e 35 DIV (B–E, respectivamente). (F) fatias Hippocampal cultivadas por 3 semanas e corados com corante vital neuronal 24 h antes da imagem com o objectivo de X 4. (G) Confocal pilha de imagens na mesma fatia como F mostrando uma vista 3D de 61 aviões tomadas em intervalos de 1 µm. Corante vital neuronal claramente rotula tanto neuritos e corpo celular, mas ele é excluído do núcleo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 8 : Repetitivo dos neurônios em um único local da fatia de imagem durante 4 semanas. Imagens de projeção máxima de 30 µm pilhas de imagem confocal do mesmo campo de células (por posicionamento) de vitais tingir-etiquetados fatias tiradas no 12, 20, 30 e 40 DIV (A–D, respectivamente). É difícil identificar repetidamente células individuais para os prazos mais longos em imagens de projeção. No entanto, mesmo durante estes longos períodos, identificação das mesmas células é muitas vezes possível por percorrer as pilhas de imagem ou criação de imagens 3D que pode ser girada, como mostrado na Figura 7G. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 9 : A expressão mediada por Viral e a imagem latente de proteínas fluorescentes. (A) fatias Hippocampal cultivadas por 9 semanas e infectados com o vírus adenoide para expressar cofilin-mRFP por trás de um promotor de CMV. Expressão foi encontrada em toda a fatia no pós infecção 5 dias mas fluorescência era mais brilhante perto da periferia de fatia. (B) mesma fatia mostrou expressão nas células mais profundas dentro da fatia, quando visto com objetivo de X 20. Imagem é que uma projeção de uma pilha de 20 imagens espaçadas 2 µm separados. (C) a mesma fatia foi examinado após 17 semanas na cultura (pós-infecção de 8 semanas) e cofilin mRFP foi observada em agregados de haste em forma de como pode ser visto nesta imagem de projeção de um 70 µm pilha de 23 imagens, 3 µm separados, tiradas com um objectivo X 40. (D–F) Fatia de hippocampal do rato infectada com 9 semanas na cultura com um AAV expressando uma GCaMP5-(P2A) - cofilin - mRFP por trás de um promotor de synapsin. Fluorescência era visível em canais vermelho e verdes após 10 dias. Uma imagem de nenhum avião da fatia mostrando a expressão de GCaMP5 (D), um repórter de cálcio sensíveis, (E) muitas hastes contendo cofilin e (F) uma superposição de imagem. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 10 : Expressão de cofilin-R21Q-mRFP, impulsionado por um promotor synapsin em neurônios infectados com vetores de Lentivirus recombinantes. Detecção de um sinal fraco fluorescência é observado pela primeira vez por sobre pós-infecção 3-4 dias, usando 10 µ l de vírus e torna-se utilizável por 5-6 dias, (E) como pode ser visto nestas imagens adquiridas com um objectivo de 60 x. Embora leva mais tempo para atingir os mesmos níveis de expressão com 1 µ l de vírus, por pós-infecção 8 dias, uma elevada percentagem semelhante dos neurônios (corante vital rotulado) foram expressando o cofilin-R21Q-mRFP. Apenas 27% dos neurônios foram positivas para mRFP fluorescência no pós-infecção de 6 dias com 1 µ l (A, B), mas isso aumentou para 85% (C, D) por 8 dias. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 11 : Patologia de cofilin induzida por oligómero Aβ em fatias hippocampal do rato. Todas as imagens tomadas como imagem de 30 µm pilhas com um objectivo de 60 x e são mostrados como imagens de projeção máxima. As fatias foram infectadas com cofilin-R21Q-mRFP em 6 DIV. fatia de (A) 15 DIV tratados em 14 DIV com veículo (DMSO/PRESUNTOS F12 médio usado para gerar Aβó). (B) fatia 15 DIV tratados com 100 nM Aβó. (C) mesmo campo como B tomadas em 20 DIV e mostrado em (D) como uma superposição com a etiqueta de corante vital neuronal. Setas mostram lineares matrizes cofilin agregados e hastes na região da fatia contendo neuritos mas alguns corpos celulares. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
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Discussion
Método do tubo do rolo aqui descrito permite cultivo a longo prazo e de alta resolução de imagem ao vivo do tecido cerebral em fatias. Um grande problema com a técnica de fatia como aplicado aqui é na montagem e manutenção de fatias. Revestimentos de lamela que oferecem suporte a adesão de fatia, promover fatia desbaste, aumentando a consequência natural de neuritos e migração de células fora da fatia; assim, evitamos o uso destes substratos. A inserção de grupos aminoácidos para o vidro por tratamento com 3-aminopropyltriethoxysilane melhorado a aderência das fatias, mas muito pouco ou demais plasma de galinha na lamela também pode causar problemas de aderência, levando à perda de fatia. O volume de plasma necessário para aderência adequada depende do tamanho da fatia cerebral cultivadas e, portanto, é maior para fatias hippocampal do rato, que são cerca de 4 vezes maiores em área do que fatias de cérebro de rato. Se muito plasma coagula sob a fatia, aderência de célula para a lamela é prejudicada e tratamento com plasmina afrouxará a fatia para que ele muda de posição ou desconecta completamente. No entanto, muito pouco plasma no coágulo pode levar a perda de fatia durante os primeiros dias de rotação na incubadora. Em um recente experimento envolvendo 39 fatias, três foram perdidas, mas alguns desses perdido podem ter resultado de fatia danos ocorridos durante o processo de corte. No entanto, preparamos geralmente cerca de 50% mais fatias do que o número estimado necessário para o experimento. A segunda principal causa de problemas de cultura é o escapamento do meio em torno do selo da lamela. Este problema agrava-se quando as lamelas não realizam-se firmemente em posição pelo menos 1 min após aposição-los para o selo. Calor do polegar usado para aplicar pressão provavelmente ajuda a completar a adesão. Escapamento que ocorre muitas vezes é através de canais de ar minúsculos sob a lamela que pode ser observado com um microscópio de dissecação. Estes geralmente desaparecem após usando pressão prolongada do polegar. Perda de cerca de 2% das culturas devido ao escapamento lenta pode ser esperada e, portanto, é aconselhável esperar 10 dias após a criação das culturas antes de executar a infecções virais. Pressão do polegar excessiva, especialmente se produziu desigualmente sobre a lamela, também pode causar a lamela de crack. Se quebra é uma edição, pressionar os tubos no chão em um mouse pad de borracha aquecido em uma incubadora pode ajudar a fornecer mais pressão em lamela.
Anteriormente descritos métodos para cultura de fatia do cérebro em membranas na interface ar-líquido (sistema aberto) ou em uma lamela de vidro dentro de um tubo de plástico selado (sistema fechado) são muito eficazes para a sobrevivência a longo prazo da fatia, mas cada método tem seus pontos fortes e pontos fracos. Fatia de culturas nas membranas na interface ar-líquido são vantajosas para Estudos eletrofisiológicos combinados com objectivos de imersão para geração de imagens de alta resolução7, mas têm desvantagens no que diz respeito a encontrar o campo exato de células para recriação no tempo e a exposição potencial do usuário e a contaminação objectiva ao usar a expressão gênica viral mediada. Uso de vírus para expressão de transgenes é mais seguro e mais fácil de executar em um sistema fechado onde a contaminação dos objetivos microscópio não é um problema. Nosso método de tubo modificado rolo dá acesso da fatia para geração de imagens de alta resolução, embora não seja passível de Estudos eletrofisiológicos.
Estabeleceram-se as condições de cultura fatia para muitas regiões do cérebro de roedor2, mas aqui nós utilizamos o hipocampo só porque é uma das regiões do cérebro mais amplamente estudados e as mudanças que ocorrem no hipocampo são de grande interesse em estudos de comprometimento cognitivo. As camadas de célula piramidal das regiões CA e DG mantêm sua organização ao longo de várias semanas em cultura e podem ser facilmente observadas morfologicamente. Podemos ter utilizado um recém-desenvolvido viabilidade neuronal fluorescente marcador25, que tem propriedades de fluorescência que permitem que ele seja usado para monitorar viabilidade neuronal e organização dentro de fatias hippocampal durante períodos de dias a meses, mas também é compatível com o uso de muitas outras proteínas fluorescentes e repórteres. Embora não ideal para NeuO de fluorescência25, nós pode excitar no NeuO em 488 nm e medida a emissão em > 617 nm. Fiduciais marcas sobre as lamelas de photoetched ajudaram a localizar as mesmas células repetidamente ao longo de muitos dias de cultura e nos permitiram regiões idênticas de imagem das fatias durante muitas semanas. Praticamente sem diluição significativa das fatias ocorreu nas lamelas de vidro modificado durante 5 semanas em cultura, ponto de tempo mais longo para o qual obtivemos medições de espessura da fatia.
AV, AAV e vectores recombinantes lentivirus funcionam bem para expressar genes exógenos em fatias. Lentivirus com um promotor específico neuronal é particularmente útil para a obtenção de expressão em uma percentagem muito elevada (> 85%) de neurônios dentro pós-infecção 8 dias. Além disso, mostramos que a patologia de haste cofilin-actina associada com o desenvolvimento de déficits cognitivos em humanos AD10,11 e Aβ superexpressão do mouse AD modelos32 pode ser monitorizada em fatia de culturas tratada com relativamente baixas concentrações (100 nM) de sintética humana Aβó. Vislumbramos que futuras aplicações deste método irão incluir caracterizando novas terapias para reverter a patologia de haste cofilin-actina e/ou anormalidades de espinha dendrítica correto que ocorrem em muitas doenças neurológicas33.
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Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Bottoms from 15 cm culture dishes | VWR Scientific | 25384-326 | |
| Phillips Head Machine Screws (#10-32) | Ace Hardware | 2.5" long and 3/16" in diameter | |
| Flat Washers #10 | ACE Hardware | ||
| Machine Screw Nuts (#10-32) | ACE Hardware | ||
| Rubber Grommets | ACE Hardware | 5/16", thick; 5/8", hole diameter; 1.125", OD | |
| Polyethylene tubing (5/16"; OD, 3/16"; ID) | ACE Hardware | Cut to 1.8" length | |
| Lock Washer #10 | ACE Hardware | ||
| Drill Press, 5 speed | Ace Hardware | ProTech Model 1201 | |
| Nunclon Delta Flat-Sided Tubes | VWR | 62407-076 | |
| Drill bits, 3 mm, 6 mm and 15 mm | Ace Hardware | Diablo freud brand | Drill bits for cutting plastic. |
| Drill bits for wood, 1.5 cm and 1 mm | Ace Hardware | ||
| Wood file, 1/4" round | Ace Harware | ||
| Spring clips, 16 mm snap holder | Ace Hardware | ||
| Swivel Head Deburring Tool, 5" | Ace Hardware | 26307 | |
| Adhesive Silicone Sheet (Secure Seal) | Grace Bio-Labs | 666581 | 0.5 mm Thickness |
| 6 mm hole punch | Office Max | ||
| 12 mm hole punch | thepunchbunch.com | ||
| 70% Ethanol | |||
| Phototeched Coverslips, 12 mm diameter | Bellco Glass, Inc. | 1916-91012 | |
| Bunsen Burner | |||
| Absolute Ethanol | |||
| Nanopure Water | |||
| 3-aminopropyltriethoxylane | Sigma-Aldrich | A3648 | |
| Acetone | Sigma-Aldrich | 179124 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| McIlwain Tissue Chopper | Ted Pella, Inc. | 10180 | |
| Double Edge Razor Blades | Ted Pella, Inc. | 121-6 | |
| Whatman Filter Paper | VWR | 28450-182 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| Poly-chloro-trifluoro-ethylene (Aclar) | Ted Pella, Inc. | 10501-10 | Cut into 5.8 cm diameter circles |
| #21 Surgical Blade | VWR Scientific | 25860-144 | |
| #5 Dumont Forceps | Fine Science Tools | 11251-30 | |
| Spatula, stainless with tapered end | VWR | 82027-518 | |
| Gey's Balanced Salt Solution | Sigma-Aldrich | G9779 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Chicken Plasma | Cocalico Biologicals | 30-0300-5L | Rehydrate in sterile water, centrifuge at 2500 x g 30 min at 4 °C, quick freeze aliquots in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
| Thrombin, Topical (Bovine) | Pfizer | Thrombin-JMI | Quick freeze aliquots in liquid nitrogen at 1,000 international units/mL in diluent provided and store at -80°C. Use at 250 units/mL. |
| Cell Roller System | Bellco Biotech | SciERA | |
| Roller Incubator | Forma | Model 3956 | |
| N21-MAX | ThermoFisher Scientific | AR008 | |
| Pen/Strep (100X) | ThermoFisher Scientific | 15140122 | |
| 200 mM Glutamine | ThermoFisher Scientific | 25030081 | |
| Glucose | ThermoFisher Scientific | 15023-021 | 25% (w/v) Solution, 0.2 mm filter sterilized |
| Neurobasal A | ThermoFisher Scientific | 10888-022 | Complete Medium: 48 mL Neurobasal A, 1 mL N21-MAX, 0.625 mL 200 mM Glutamine, 0.180 mL 25% Glucose, 0.250 mL 100x pen/strep. |
| Third generation lentivirus packaging | Life Technologies | K4975-00 | |
| 159 K cutoff centrifugal filters (Centricon) | EMD Millipore | ||
| Lentiviral cloning system (InFusion) | Clonetech | ||
| Plasmids 30323, 50856, 51279 | Addgene | ||
| Neuronal cell viability dye (NeuO) | Stemcell technologies | 1801 | Thaw once and quick freeze in 4 µL aliquots. Store at -20 °C |
| Inverted microscope | Olympus | IX83 | |
| Microscope objectives | Olympus | air: 4X, 20; oil: 40X, 60X, | |
| Spinning disc confocal system | Yokagawa | CSU22 | |
| Microscope EMCCD camera | Photometrics | Cascade II | |
| Linear encoded (x,y), piezo z flat top stage | ASI | ||
| Microscope lasers and integration | Intelligent Imaging Innovations | ||
| HEK293T cells | American Type Culture Collection | CRL-3216 | |
| Human Plasmin | Sigma Aldrich | P1867 | 0.002 U/mL in 0.1% bovine serum albumin (0.2 mm filter sterilized), quick freeze in liquid nitrogen and store at -80 °C. |
References
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evage, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
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