Summary
En grundlæggende protokol at evaluere toksiciteten af kemikalier i en model dyr, Caenorhabditis elegans, er beskrevet. Metoden er nem og nyttig for udviklingen af lægemidler samt for risikovurderingen af forskellige miljøgifte.
Abstract
Toksikologisk evaluering er afgørende for at forstå virkningerne af kemikalier på levende organismer i grundforskning og anvendt biologiske videnskab felter. En ikke-pattedyr jord runde orm, Caenorhabditis elegans, er en værdifuld model organisme for toksikologi undersøgelser på grund af dens bekvemmelighed og manglende Dyreetik problemer sammenlignet med pattedyr animalsk systemer. I denne protokol, er en detaljeret procedure for toksikologisk evaluering af kemikalier i C. elegans beskrevet. Et klinisk anticancer lægemiddel, etoposide, som er rettet mod menneskelige topoisomerase II og hæmmer DNA-replikation af menneskelige kræftceller, blev valgt som model test kemiske. Alder-synkroniseret C. elegans æg blev udsat for enten dimethylsulfoxid (DMSO) eller etoposide, og derefter vækst af C. elegans blev overvåget hver dag i 4 dage af stereo-mikroskop observation. Det samlede antal æg lagt fra C. elegans behandlet med DMSO, eller etoposide var også tælles ved hjælp af stereo-mikroskop. Etoposide behandling væsentligt berørt den vækst og reproduktion af C. elegans. Ved sammenligning af det samlede antal æg lagt fra orme med forskellige behandling perioder med kemikalier, kan det besluttes, at reproduktiv toksicitet af kemikalier på C. elegans reproduktion er reversibel eller irreversibel. Disse protokoller kan være nyttige for både udviklingen af forskellige stoffer og risikovurdering af miljømæssige giftstoffer.
Introduction
Toksikologisk evaluering er afgørende for udviklingen af lægemidler, nutraceuticals, og cosmeceuticals samt risikovurdering af forskellige miljømæssige toksiner. Den gnavere model er en af de mest populære i vivo eksperimentelle systemer for denne toksikologi undersøgelse; Alternativt, ikke-pattedyr organismer såsom C. elegans er også almindeligt anvendt. Non-pattedyr toksikologisk evalueringsmodeller er fordelagtig på grund af ikke kun dyrenes etiske spørgsmål, men også deres bekvemmelighed og nytte i betragtning af omkostningseffektivitet, vedligeholde, hastighed og reproducerbarhed1,2 ,3,4.
C. elegans, en jord runde orm, er blevet udnyttet som en model dyr i forskellige grundlæggende og anvendt biologi og kemi forskning. Det er en 1 mm lange, gennemsigtig nematode, som blot vedligeholdes i fast eller flydende Nematode vækst medier (NGM) fodret med den bakterielle stamme Escherichia coli OP50. C. elegans har en kort levetid, og wild-type N2 C. elegans lægger ca 300 æg. Det er derfor let formeret skal anvendes som eksperimentelle materialer3,4,5. C. elegans har også været meget anvendt i de toksikologiske undersøgelser af mange stoffer og miljøgifte6,7,8,9.
Fordi mange anticancermedicin målrette hastigt dividere kræftceller, kan de også skade hurtigt dividere normale celler såsom knoglemarv, intestinale epitel og hårsækken celler. For eksempel målrette topoisomerase hæmmende anticancermedicin DNA replikation processen med kræftceller; Derfor, de også hæmme hurtigt dividere normale celler. Alle levende organisme har topoisomerases, og disse topoisomerase-hæmmere mest sandsynlige indvirkning miljømæssige økosystemer6,10,11. Således, en drug toksikologisk evaluering platform ved hjælp af en model dyr er værdifulde for både udviklingen af lægemidler og miljørisikovurderingen.
I denne artikel vil beskrive vi de detaljerede protokoller for at teste giftigheden af etoposide, som er en klinisk anticancer agent at mål topoisomerase II, som en model giftige kemikalie i C. elegans. Til dette formål, vil vi beskrive målemetode kropsstørrelse og det samlede antal æg lagt i C. elegans behandlet med etoposide.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bemærk: hele forsøget skal udføres i en ren isolerede laboratorium ved 20 ° C med lav støv og minimering af forurening under orm og bakteriel håndtering. Til dette formål, forsøg skal udføres under flammen af et alkohol lampe eller ved hjælp af en ren bænk.
1. vedligeholdelse af C. elegans og æg forberedelse til den kemiske Test
- Bevar C. elegans N2 (var. Bristol) på en NGM agar plade fodret med live E. coli OP50 ved 20 ° C 12 , 13.
- Forbered alder-synkroniseret æg ved hjælp af enten blegemiddel løsning behandling 5 eller tiden æg æglæggende metode 6 , 14 , 15.
Bemærk: før ægget forberedelse, pels etoposide-holdige NGM plade med varme-inaktiverede E. coli OP50 som beskrevet nedenfor. Varme-inaktiverede E coli OP50 bruges til at minimere den metaboliske aktivitet af E. coli 6 , 16.
2. Udarbejdelse af varme-inaktiverede E. coli OP50 feed C. elegans under toksicitetsundersøgelse
- forberede 500 mL af dobbelt gær trypton (DYT) medium som beskrevet i tabel 1 og podes en enkelt koloni af E. coli OP50 kulturperler på en Luria-Bertani (LB) agar plade 5.
- Ruger E. coli OP50 i en rystende inkubator for 14 h ved 37 ° C og 150 rpm.
- Efter centrifugering i 30 min. ved 3220 x g og 20 ° C, skal du fjerne alle supernatanten DYT medium og tilføje en pre blanding af 25 mL af S-buffer, 250 µL 1 M MgSO 4 og 25 µL af 5 mg/mL kolesterol (opløst i ethanol). Alle disse løsninger er sterile.
- Resuspend bakterier og overføre dem til en engangs plast rør 50 mL.
- For varme-inaktivering, Inkuber den resuspenderede E. coli OP50 i et vandbad til 30 min. ved 65 ° C.
- Køle ned til stuetemperatur og opbevares ved 4 ° C indtil brug. Dette kan opbevares i op til en måned.
3. Forberedelse af NGM plader der indeholder enten 1% DMSO eller 750 µM Etoposide
- Forbered to rene 200 mL glasflasker. Tilføje 0,6 g NaCl, 0,5 g af pepton, 3,4 g agar, og 195 mL destilleret vand og en magnetomrører til én flaske. Tilføje en magnetomrører til andre tomme flasken.
- Autoklave disse to flasker for 15 min ved 121 ° C, og derefter køle ned flasker i vandbad til 30 min. ved 55 ° C.
- Tilsættes 0,2 mL 1 M CaCl 2, 0,2 mL af 5 mg/mL kolesterol, 0,2 mL 1 M MgSO 4 og 5 mL 1 M KPO 4 (alle disse løsninger er sterile) og derefter blande dem af magnetiske omrøring på en varm tallerken på 55 ° C.
- Inddeler den blandede NGM medium i to flasker med samme volumen (100 mL). Dernæst tilsættes 1 mL af DMSO til én flaske, bland det igen ved hjælp af magnetiske omrøring. Gemme andre flasken i et vandbad ved 55 ° C indtil det næste skridt. Alikvot 3 mL af hver 35 x 10 mm 2 petriskål DMSO-holdige mellemlang. Cirka 33 DMSO-holdige NGM plader kan gøres fra dette trin.
- Bland andre flasken ved hjælp af magnetiske omrøring, tilsættes 1 mL af 75 mM etoposide (stock opløst i DMSO), blandes igen, og Gentag den alikvote procedure (trin 3,4). Cirka 33 etoposide (750 µM)-indeholdende NGM plader kan gøres fra dette trin.
Bemærk: I de sammenlignede tidligere papir- 6 vi testede 0, 250, 500 og 1.000 µM af etoposide. Baseret på disse data, vi valgte den 750 µM af etoposide dosis i dette papir. - Cool ned de kemiske-holdige NGM plader til stuetemperatur ved at lade dem ved stuetemperatur i ca 3 timer, og gemme dem på 4 ° C indtil brug.
Bemærk: I tilfælde af lysfølsomme kemikalier, blokere lys til at minimere lys-induceret nedbrydning.
Bemærk: Du kan eventuelt gøre en normal NGM plade uden kemikalier til æglægning assay, der kan udføres ved hjælp af to forskellige kemisk behandling betingelser, som beskrevet nedenfor. - Tilsættes 100 µL af varme-inaktiverede E. coli OP50 (som beskrevet i afsnit 2) og fordelt på hver NGM plade. Tillad at tørre natten over i en C. elegans inkubator ved 20 ° C for den kemiske test.
4. Måling af C. elegans vækst
- overførsel alder-synkroniseret C. elegans æg til NGM pladen suppleres med 1% DMSO eller 750 µM etoposide.
- Incubate C. elegans i en inkubator ved 20 ° C i 4 dage. Observere ormene ved hjælp af et stereo mikroskop, og tage mikroskopiske billeder hver dag. Normalt er 20 X forstørrelse (1 X mål linse, 2 X zoom forstørrelse og 10 X okular linse) passende for vækst observationen af C. elegans. Også tage et mikroskopisk billede af mikroskop objektsmikrometeret for orm størrelse kalibrering.
Bemærk: Sult påvirker toksicitets-test. Derfor fodrer med tilstrækkelig bakterier eller justere den overførte C. elegans æg numre i begyndelsen. Observere indtil 3 dage til at udelukke muligheden for sult. - Måle C. elegans behandlet med DMSO eller etoposide på hvert tidspunkt, bruger ImageJ software kropslængde.
Bemærk: Til hver prøve måling, 50 orme er tilstrækkelig for den statistiske analyse.- I ImageJ, åbne mikroskop fase mikrometer billede (' fil ' → ' åbne ').
Bemærk: Mikrometer billede og ormen billeder (trin 4.2) skal være den samme forstørrelse. - Trækker en linje af 1.000 µm på mikrometer kalibrering billede ved hjælp af ' lige linje ' værktøj.
- Klik ' analyser ' → ' sat skala ' og input 1.000 og µm i den ' kendt afstand ' boks og ' enhed af længde ' kasse, henholdsvis. Check ' Global ' og klik på ' OK '.
- Åbne orm billeder (' fil ' → ' åbne '). Tegne en linje langs funktionen af hver orm ved hjælp af ' Freehand linje ' værktøj. Få kroppen længde data ved at klikke på ' analyser ' → ' foranstaltning '.
- Gentag disse skridt for 50 orme.
- I ImageJ, åbne mikroskop fase mikrometer billede (' fil ' → ' åbne ').
5. C. elegans æg æglæggende Assay
- Incubate alder-synkroniseret æg på NGM plade der indeholder DMSO eller etoposide til 64 h (før første fødsel) indtil den unge voksne fase ved 20 ° C.
Bemærk: Det er valgfrit at bruge orme fra vækst måle-eksperimenter. Det er praktisk at gøre væksten måling og æg æglæggende assay sammen. - Overføre 5 voksne orme til den nye NGM plader uden kemikalier (betingelse 1, kemisk behandling inden for en bestemt periode af tid, fra æg til unge voksne fase) eller nye NGM pladen som indeholder det samme kemiske forbehandling (tilstand 2, kontinuerlig eksponering af kemikalier gennem den samlede forsøgsperioden), og derefter inkuberes dem i 24 h.
Bemærk: Det anbefales at gøre replikater ved hjælp af 3-5 NGM plader for hver behandling; disse replikater kan bruges til statistiske analyser. - Overføres til den nye NGM plade som beskrevet ovenfor, og Tæl antallet af æg hver dag. Tæl de orme, der kravlede ud, døde og blev internt hatched.
- Du gentage disse trin indtil orme lægger ikke flere æg, normalt i 5 dage.
- Beregne antallet af æg lagt per worm fra hver plade, og summerer disse værdier hver dag i 5 dage til at bestemme det samlede antal æg lagt.
Bemærk: Udelukke antallet af orme, der kravlede ud og internt udklækket fra beregningen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Behandling af etoposide (24-96 h) betydeligt forsinket vækst af C. elegans. 96 h inkubation voksede etoposide-behandlet orme til 0,86 mm i kropslængde, mens ormene køretøj-behandlede voksede til 1,04 mm (figur 1). Væksthæmning var øjensynlig også observeret under stereo-mikroskop observation (figur 2). Vi begyndte at se æg fra ormene køretøj-behandlet på 72 h inkubation. På den anden side blev æg observeret efter 96 h af etoposide behandling. Fra disse data spekulerede vi at etoposide behandling forsinket fødsel første gang af C. elegans.
Ud over forsinkelsen af æglægning, faldt etoposide behandling betydeligt det samlede antal æg lagt per worm (figur 3). Reproduktionstoksicitet, faldet i samlede æg antallet af etoposide behandling, blev observeret, når de unge voksne orme var kulturperler i (figur 3B) eller ej (figur 3A) af kontinuerlig etoposide behandling. Der var ingen signifikant forskel mellem ormene kontrol-behandlet både eksperimentelle betingelser. Det samlede antal æg fra orme behandles for en bestemt periode (fra æg til den unge voksne fase) var ikke signifikant forskellig fra worms løbende behandlet med etoposide. For denne sammenligning, blev statistisk analyse udført af en-vejs variansanalyse (ANOVA) efterfulgt af den Tukey flere sammenligning test.
Figur 1: Måling af vækst i C. elegans behandlet med etoposide. Alder-synkroniseret C. elegans æg blev dyrket på NGM plader suppleret med DMSO (1%, køretøj kontrol) eller etoposide (750 µM) for 24-96 h. mikrofotografier (vist i figur 2) blev taget hver dag, og kroppen længde blev målt ved hjælp af ImageJ software. Dataene, der er udtrykt i gennemsnit ± standardafvigelse (SD) (n = 50, 50 orme pr. gruppe). p < 0,01 for betydelige forskelle mellem køretøj kontrol og etoposide behandling på hvert tidspunkt. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Stereo-mikroskop billeder af C. elegans behandlet med etoposide. C. elegans blev behandlet som beskrevet i figur 1 (skalalinjen = 1 mm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Samlede antal æg lagt fra C. elegans behandlet med etoposide. Alder-synkroniseret C. elegans æg blev udruget på NGM plader der indeholder DMSO (1%, køretøj kontrol) eller etoposide (750 µM) for 64 h. Næste, det samlede antal æg lagt blev observeret i fravær (A) eller (B) tilstedeværelsen af kontinuerlig kemisk behandling i 5 dage. Orme blev overført hver dag til den normale NGM plade (A), eller NGM plade suppleret med de samme kemikalier: 1% DMSO eller etoposide (750 µM) (B). Antallet af æg lagt blev optalt og divideret med det samlede antal orme hver dag for at beregne antallet af æg lagt pr. orm. Alle numre af æg pr orm blev sammenfattet i 5 dage. Dataene, der er udtrykt som den gennemsnit ± SD fra forsøgsbetingelse eksperimenter. p < 0,01 for betydelige forskelle mellem køretøj kontrol og etoposide behandling. Statistiske analyser blev udført ved hjælp af Student's t-test. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
| Normal NGM agar medier – 1.000 mL til vedligeholdelse og æglægning assay uden løbende kemisk behandling |
| 1. tilføje 2,5 g af pepton, 3 g NaCl, 17 g agar og 975 mL destilleret vand i en glasflaske. |
| 2. autoklave i 15 min ved 121 ° C. |
| 3. køle ned i et vandbad i 30 min. ved 55 ° C, og derefter tilsættes 1 mL af 1 M CaCl2, 1 mL af 5 mg/mL kolesterol (opløst i ethanol), 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL KPO4. |
| 4. Bland med magnetisk omrøring, og derefter prøve i petriskåle (90 x 15 mm retter til vedligeholdelse, 35 x 10 mm2 retter til æglægning assay). |
| 5. Opbevar NGM plader ved 4 ° C indtil brug. |
| DYT medie til dyrkning af E. coli OP50-500 mL |
| 1. Tilføj 2,5 g NaCl, 5 g gær extract, 8 g af pepton, og 485 mL destilleret vand i en Erlenmeyerkolbe. |
| 2. autoklave i 15 min ved 121 ° C. |
| 3. køle ned og opbevares ved stuetemperatur indtil brug. |
| S-buffer – 1.000 mL |
| 1. Tilføj 5.85 g NaCl, 6 g KH2PO4, 1 g K2HPO4og 987 mL destilleret vand i en glasflaske. |
| 2. Juster pH af løsningen på 6.0. |
| 3. autoklave i 15 min ved 121 ° C. |
| 4. køle ned og opbevares ved stuetemperatur indtil brug. |
Tabel 1: Receipes kultur vækst medier og buffere.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel vil beskrive vi toksicitet evaluering af kemikalier i C. elegans, en jord nematode, ved hjælp af etoposide som et giftstof eksempel. Til dette formål brugte vi to forsøgsbetingelser. I det første sæt, C. elegans blev dyrket på etoposide indeholdende plader fra æg til den unge voksne fase, og derefter orm fik lov til at lægge æg på normale NGM plader uden kemikalier. I det andet eksperimentelle sæt, blev C. elegans løbende behandlet med etoposide gennem hele forsøgsperioden. Ved sammenligning af æg numre mellem de to forsøgsbetingelser, kan vi beslutte, om reproduktiv toksicitet af de testede forbindelser var reversibel eller irreversibel. Etoposide faldt betydeligt det samlede antal æg lagt på både eksperimentelle betingelser (figur 3). Disse data underforstået at forbehandling af etoposide i den tidlige vækst fase var tilstrækkelig til at fremkalde skader på reproduktive organer, herunder gonade Kim celler6; baseret på disse data, kunne vi spekulere, at etoposide behandling uigenkaldeligt induceret reproduktionstoksicitet i C. elegans.
Ud over de C. elegans eksperimenter beskrevet i artikelen metode, tests andre toksicitet såsom levetiden assay14,15, mikroskopiske observation af gonade kønsceller6,17, måling af svælg pumpe sats, og bevægelse analyse18,19 kan også bruges til evaluering af kemiske toksicitet i C. elegans. In vitro kulturperler menneskelige cellelinjer, primærelementer, stamceller og 3D klumpformet kultur er andre muligheder for at vurdere toksiciteten af forskellige kemikalier til at forøge begrænsning af C. elegans eksperimenter1, 6,20,21.
Selv om der er evolutional bevarelse af væsentlige gener i C. elegans, ikke-pattedyr organisme er forskellige fra mennesker i form af protein sekvenser, i mave og tarm systemer, metabolisme, samt det mangler mange gener. Derfor, pattedyr dyreforsøg og kliniske forsøg er nødvendige for den fulde vurdering af toksiciteten af kemikalier. Dog overvejer fordelene ved den bekvemmelighed og animalske etiske spørgsmål, vil en C. elegans toksicitet test platform være en nyttig og praktisk løsning til den toksikologiske evaluering af forskellige kemikalier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Denne undersøgelse blev støttet af Korea Institut for videnskab og teknologi murene forskning tilskud (2E27513) og den høje Value Added mad teknologi udvikling Program (IPET) finansieret af Ministeriet for landbrug, fødevarer og landdistriktspørgsmål (315067-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
- Blomme, E. A., Will, Y. Toxicology strategies for drug discovery: present and future. Chem. Res. Toxicol. 29 (4), 473-504 (2016).
- Lilienblum, W., et al. Alternative methods to safety studies in experimental animals: role in the risk assessment of chemicals under the new European Chemicals Legislation (REACH). Arch. Toxicol. 82 (4), 211-236 (2008).
- Honnen, S. Caenorhabditis elegans as a powerful alternative model organism to promote research in genetic toxicology and biomedicine. Arch. Toxicol. , In Press (2017).
- Hunt, P. R. The C. elegans model in toxicity testing. J. Appl. Toxicol. 37 (1), 50-59 (2017).
- Porta-de-la-Riva, M., Fontrodona, L., Villanueva, A., Ceron, J. Basic Caenorhabditis elegans methods: synchronization and observation. J. Vis. Exp. (64), e4019 (2012).
- Lee, S. Y., Kim, J. Y., Jung, Y. J., Kang, K. Toxicological evaluation of the topoisomerase inhibitor, etoposide, in the model animal Caenorhabditis elegans and 3T3-L1 normal murine cells. Environ. Toxicol. 32 (6), 1836-1843 (2017).
- Imanikia, S., et al. The application of the comet assay to assess the genotoxicity of environmental pollutants in the nematode Caenorhabditis elegans. Environ. Toxicol. Pharmacol. 45, 356-361 (2016).
- Guo, X., et al. Perfluorooctane sulfonate exposure causes gonadal developmental toxicity in Caenorhabditis elegans through ROS-induced DNA damage. Chemosphere. 155, 115-126 (2016).
- Allard, P., Kleinstreuer, N. C., Knudsen, T. B., Colaiacovo, M. P. A C. elegans screening platform for the rapid assessment of chemical disruption of germline function. Environ. Health Perspect. 121 (6), 717-724 (2013).
- Singh, S., Sharma, B., Kanwar, S. S., Kumar, A. Lead phytochemicals for anticancer drug development. Front. Plant Sci. 7, 1667 (2016).
- Kang, K., et al. A novel topoisomerase inhibitor, daurinol, suppresses growth of HCT116 cells with low hematological toxicity compared to etoposide. Neoplasia. 13 (11), 1043-1057 (2011).
- Chaudhuri, J., Parihar, M., Pires-daSilva, A. An introduction to worm lab: from culturing worms to mutagenesis. J. Vis. Exp. (47), e2293 (2011).
- Zarse, K., et al. Impaired insulin/IGF1 signaling extends life span by promoting mitochondrial L-proline catabolism to induce a transient ROS signal. Cell Metab. 15 (4), 451-465 (2012).
- Sutphin, G. L., Kaeberlein, M. Measuring Caenorhabditis elegans life span on solid media. J. Vis. Exp. (27), e1152 (2009).
- Weimer, S., et al. D-Glucosamine supplementation extends life span of nematodes and of ageing mice. Nat. Commun. 5, 3563 (2014).
- Schmeisser, S., et al. Neuronal ROS signaling rather than AMPK/sirtuin-mediated energy sensing links dietary restriction to lifespan extension. Mol. Metab. 2 (2), 92-102 (2013).
- Parodi, D. A., Damoiseaux, R., Allard, P. Comprehensive assessment of germline chemical toxicity using the nematode Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (96), e52445 (2015).
- Hahm, J. H., et al. C. elegans maximum velocity correlates with healthspan and is maintained in worms with an insulin receptor mutation. Nat. Commun. 6, 8919 (2015).
- Nussbaum-Krammer, C. I., Neto, M. F., Brielmann, R. M., Pedersen, J. S., Morimoto, R. I. Investigating the spreading and toxicity of prion-like proteins using the metazoan model organism C. elegans. J. Vis. Exp. (95), e52321 (2015).
- Schmidt, B. Z., et al. In vitro acute and developmental neurotoxicity screening: an overview of cellular platforms and high-throughput technical possibilities. Arch. Toxicol. 91 (1), 1-33 (2017).
- Fey, S. J., Wrzesinski, K. Determination of drug toxicity using 3D spheroids constructed from an immortal human hepatocyte cell line. Toxicol. Sci. 127 (2), 403-411 (2012).
