Summary
Ein einfachen Protokolls zur Bewertung der Toxizität von Chemikalien in einem Modell Tier, Caenorhabditis Elegans, wird beschrieben. Die Methode ist praktisch und nützlich für die Entwicklung von Arzneimitteln sowie für die Risikobewertung von verschiedenen Umweltschadstoffe.
Abstract
Toxikologische Bewertung ist entscheidend für das Verständnis der Auswirkungen von Chemikalien auf lebende Organismen in Grundlagen- und angewandter Biologie Felder. Ein nicht-Säugetier-Boden runden Wurm Caenorhabditis Elegansist eine wertvolle Modellorganismus für die toxikologischen Untersuchungen wegen seiner Bequemlichkeit und Mangel an tierethische Probleme im Vergleich zu Säugetieren tierischen Systemen. In diesem Protokoll wird ein detailliertes Verfahren der toxikologischen Bewertung von Chemikalien in C. Elegans beschrieben. Eine klinische Krebsmedikament, Etoposid, die Ziele menschlichen Topoisomerase II und DNA-Replikation von menschlichen Krebszellen hemmt, wurde als Modell chemische Tests ausgewählt. Alter-synchronisierte C. Elegans Eiern Dimethyl Sulfoxid (DMSO) oder Etoposid ausgesetzt waren, und dann wurde das Wachstum von C. Elegans durch die Stereo-Mikroskop-Beobachtung jeden Tag für 4 Tage überwacht. Die Gesamtzahl von Eiern gelegt von C. Elegans mit DMSO behandelt oder Etoposid war auch durch das Stereo-Mikroskop gezählt. Etoposid Behandlung beeinflusst wesentlich das Wachstum und die Vermehrung von C. Elegans. Im Vergleich dazu kann die Gesamtzahl der Eiablage aus Worms mit verschiedenen Behandlungsdauer von Chemikalien, entschieden, dass die reproduktive Toxizität von Chemikalien auf die Reproduktion von C. Elegans reversibel oder irreversibel ist. Diese Protokolle möglicherweise hilfreich für die Entwicklung der verschiedenen Drogen und Risikobewertung der Umweltgifte.
Introduction
Toxikologische Bewertung ist wichtig für die Entwicklung von Arzneimitteln, Nutraceuticals, und Cosmeceuticals, sowie die Risikobewertung von verschiedenen Umweltgiften. Das Nagetiere Modell ist eines der beliebtesten in Vivo experimentelle Systeme für Toxikologie Studie; nicht-Säugetier-Organismen wie C. Elegans sind alternativ auch am meisten benutzt. Toxikologische Bewertung nicht-Säugetier-Modelle sind vorteilhaft, weil nicht nur tierische ethische Fragen aber auch ihre Komfort und Nützlichkeit unter Berücksichtigung von Wirtschaftlichkeit, Wartbarkeit, Schnelligkeit und Reproduzierbarkeit1,2 ,3,4.
C. Elegans, einen Boden runden Wurm, hat als Modell Tier in verschiedenen Grundlagen- und angewandter Biologie und Chemie Forschung ausgenutzt worden. Es ist ein 1 mm lang, transparente Nematoden, die einfach in fester oder flüssiger Nematoden Wachstum Medien (NGM) gefüttert mit den Bakterienstamm Escherichia coli OP50 beibehalten wird. C. Elegans hat einen kurzen Lebenszyklus und Wildtyp N2 C. Elegans legt ca. 300 Eiern. Daher ist es leicht propagiert, um als experimentelle Materialien3,4,5verwendet werden. C. Elegans hat auch in den toxikologischen Studien vieler Medikamente und Umweltgifte6,7,8,9verbreitet.
Weil viele Krebsmedikamente schnell teilenden Krebszellen richten, können sie auch Schaden, sich schnell teilenden normale Zellen wie Knochenmark, Darmepithel und Haarfollikelzellen. Zum Beispiel gezielt Topoisomerase hemmenden Krebsmedikamente der DNA-Replikation werden von Krebszellen; Daher hemmen sie auch, sich schnell teilenden normale Zellen. Jeder lebende Organismus hat Adenin und diese Topoisomerase-Hemmer am ehesten Einfluss Umwelt Ökosysteme6,10,11. Somit ist eine Droge toxikologische Bewertung Plattform mit einem Modell Tier wertvoll für die Entwicklung von Arzneimitteln und Umweltverträglichkeitsprüfung.
In diesem Artikel beschreiben wir die detaillierte Protokolle, um der Toxizität von Etoposid, die einen klinischen Anti-Krebs-Agent ist, dass Ziele Topoisomerase II, als Modell giftige Chemikalie in C. Eleganszu testen. Zu diesem Zweck beschreiben wir die Messmethode von Körpergröße und die Gesamtzahl der Eiablage in C. Elegans mit Etoposid behandelt.
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Protocol
Hinweis: das gesamte Experiment muss in einem sauberen isolierten Labor gehalten bei 20 ° C mit staubarme und Minimierung der Kontamination während der Wurm und bakterielle Behandlung durchgeführt werden. Zu diesem Zweck Experimente unter die Flamme eine Alkohol-Lampe oder mit einem sauberen Werkbank durchgeführt werden müssen.
1. Wartung von C. Elegans und Ei-Vorbereitung auf die chemische Prüfung
- pflegen C. Elegans N2 (var. Bristol) weiterleben einer NGM Nährbodenplatte gefüttert mit E. Coli OP50 bei 20 ° C 12 , 13.
- Vorbereiten Alter synchronisiert Eiern entweder Bleichen Lösung Behandlung 5 oder die Zeit Ei Verlegung Methode 6 , 14 , 15.
Hinweis: vor dem Ei Zubereitung, Mantel die Etoposid-haltigen NGM-Platte mit Hitze-E. Coli OP50 wie unten beschrieben inaktivierten. Hitze-inaktivierten E coli OP50 wird verwendet, um die metabolische Aktivität von E. Coli 6 , 16 minimieren.
2. Vorbereitung von Hitze-inaktivierten e.coli OP50 Feed C. Elegans während Toxizitätstest
- 500 mL doppelte Hefe Tryptone (DYT) Medium vorzubereiten, wie in Tabelle 1 beschrieben, und eine einzige Kolonie von E. Coli OP50 kultiviert auf impfen ein Luria-Bertani (LB) Agar Platte 5.
- E. Coli OP50 in einem schütteln Inkubator für 14 h bei 37 ° C und 150 u/min inkubieren.
- Nach Zentrifugation für 30 min bei 3.220 x g und 20 ° C, alle überstehenden DYT Medium zu entfernen, und fügen Sie eine Pre-Mischung von 25 mL S-Puffer, 250 µL 1 M MgSO 4 und 25 µL 5 mg/mL Cholesterin (gelöst in Ethanol). Alle diese Lösungen sind steril.
- Die Bakterien aufzuwirbeln und übertragen Sie sie auf eine 50 mL Einweg-Kunststoff-Rohr.
- Für die Hitzeinaktivierung brüten die resuspendierte E. Coli OP50 in einem Wasserbad für 30 min bei 65 ° c
- Abkühlen auf Raumtemperatur und Store bei 4 ° C bis zur Verwendung. Dies kann bis zu einem Monat gelagert werden.
3. Vorbereitung der NGM Platten enthält entweder 1 % DMSO oder 750 µM Etoposid
- bereiten zwei saubere 200 mL Glasflaschen. Eine Flasche 0,6 g NaCl, 0,5 g Pepton, 3,4 g Agar, 195 mL destilliertem Wasser und einem Magnetrührer hinzufügen. Die leere Flasche ein Magnetrührer hinzufügen.
- Autoklaven diese beiden Flaschen für 15 min bei 121 ° C, und dann abkühlen die Flaschen in einem Wasserbad für 30 min bei 55 ° c
- 0,2 mL 1 M CaCl 2, 0,2 mL von 5 mg/mL Cholesterin, 0,2 mL 1 M MgSO 4 und 5 mL 1 M KPO-4 (alle diese Lösungen sind steril) hinzufügen und mischen sie dann durch magnetische rühren auf einer heißen Platte bei 55 ° c
- Unterteilen das gemischte NGM-Medium in zwei Flaschen mit dem gleichen Volumen (100 mL). Anschließend eine Flasche fügen Sie 1 mL DMSO hinzu, mischen Sie es erneut mit der magnetischen rühren. Speichern Sie die andere Flasche in einem Wasserbad bei 55 ° C erst im nächsten Schritt. Aliquoten 3 mL DMSO-haltige Mittel-bis jeweils 35 x 10 mm 2 Petrischale. Ca. 33 DMSO-haltige NGM Platten können von diesem Schritt gemacht werden.
- Mischen die andere Flasche mit der magnetischen rühren, fügen Sie 1 mL 75 mM Etoposid (bestand in DMSO gelöst) nochmals mixen und die aliquoten wiederholen (Schritt 3.4). Ca. 33 Etoposid (750 µM)-mit NGM Platten von diesem Schritt gemacht werden kann.
Hinweis: In der korrelierten zurück Papier 6 testeten wir 0, 250, 500 und 1.000 µM von Etoposid. Basierend auf diesen Daten, wir entschieden uns für die 750 µM Etoposid Dosis in diesem Papier. - Cool hinunter die Chemikalie-haltigen NGM Platten auf Raumtemperatur durch verlassen sie bei Raumtemperatur für ca. 3 h und bei 4 ° C bis zur Verwendung aufbewahren.
Hinweis: Im Falle von lichtempfindlichen Chemikalien zu blockieren, Licht, Licht-induzierten Zersetzung zu minimieren.
Hinweis: Stellen Sie optional eine normale NGM-Platte ohne Chemikalien für die Eiablage Assay, die mit zwei verschiedenen chemischen Behandlungsbedingungen wie unten beschrieben durchgeführt werden kann. - Hinzufügen 100 µL der Hitze-inaktivierten e.coli OP50 (wie beschrieben in Abschnitt 2) und auf jeder NGM Platte verteilen. Lassen Sie über Nacht trocknen in einem C. Elegans Inkubator bei 20 ° C für die chemischen Test
4. Messung von C. Elegans Wachstum
- Übertragung Alter synchronisiert C. Elegans Eiern auf der NGM-Platte ergänzt mit 1 % DMSO oder 750 µM Etoposid.
- Inkubieren C. Elegans in einem Inkubator bei 20 ° C für 4 Tage. Beobachtet die Würmer mit einem Stereo-Mikroskop, und mikroskopische Bilder jeden Tag. 20 X Vergrößerung (1 X Objektiv, 2 X Zoom-Vergrößerung und 10 X Okular) eignet sich in der Regel für die Beobachtung des Wachstums von C. Elegans. Auch eine mikroskopische Bild Mikroskop Bühne Mikrometer für die Kalibrierung Wurm Größe nehmen.
Hinweis: Hunger betrifft die Toxizitätstest. Daher füttern mit ausreichend Bakterien oder passen Sie die übertragenen C. Elegans Ei Zahlen am Anfang. Bis 3 Tage Hunger auszuschließen beobachten. - Messen die Körperlänge von C. Elegans mit DMSO oder Etoposid zu jedem Zeitpunkt mit ImageJ-Software behandelt.
Hinweis: Für jede Probenmessung reichen 50 Würmer für die statistische Auswertung.- In ImageJ, öffnen Sie das Mikroskopbild Bühne Mikrometer (' Datei ' → ' öffnen ').
Hinweis: Die Mikrometer Bild und Wurm Bilder (Schritt 4.2) müssen die gleiche Vergrößerung. - Ziehen Sie eine Linie von 1.000 µm Mikrometer Kalibrierung Bild mit ' geraden ' Tool.
- Klicken Sie ' Analyze ' → ' Skala eingestellt ' und geben Sie 1.000 und µm in der ' Entfernung bekannt ' Feld und ' Längeneinheit ' box, bzw.. Überprüfen Sie ' Global ' und klicken Sie auf ' OK '.
- Öffnen Sie die Wurm-Bilder (' Datei ' → ' offene '). Zeichnen Sie eine Linie entlang des Features jeder Wurm mit ' Freihandlinie ' Werkzeug. Der Körper Längendaten zu erhalten, indem Sie auf ' Analyse ' → ' Maßnahme '.
- Wiederholen Sie diese Schritte für 50 Würmer.
- In ImageJ, öffnen Sie das Mikroskopbild Bühne Mikrometer (' Datei ' → ' öffnen ').
5. C. Elegans Ei Verlegung Assay
- Inkubation der Alter-synchronisierte Eiern auf der NGM Platte mit DMSO oder Etoposid für 64 h (vor der Geburt des ersten Kindes) bis zum jungen Erwachsenen Stadium bei 20 ° c
Hinweis: Es ist optional, die Würmer aus dem Wachstumsversuchen Messung zu verwenden. Es ist bequem, die Messung von Wachstum und Ei Verlegung Assay zusammen. - Transfer 5 Erwachsenen Würmer, die neue NGM Platten ohne Chemikalien (Bedingung 1, chemische Behandlung innerhalb einer bestimmten Frist Zeit, aus den Eiern zu jungen Erwachsenen Stadium) oder neue NGM Platte enthält die gleiche chemische Vorbehandlung (Bedingung 2, kontinuierliche Exposition des Chemikalien durch die insgesamt experimentelle Periode), und dann inkubieren sie 24 Std.
Hinweis: Es empfiehlt sich, Wiederholungen mit 3-5 NGM Platten für jede Behandlung zu machen; Diese Wiederholungen können für statistische Auswertungen verwendet werden. - Auf die neue NGM-Platte zu übertragen, wie oben beschrieben, und die Anzahl von Eiern täglich. Zählen Sie die Würmer, die aus kroch, starben und wurden intern LukeHg.
- Wiederholen Sie diese Schritte, bis die Würmer nicht mehr, in der Regel innerhalb von 5 Tagen Eiablage.
- Berechnen Sie die Anzahl von Eiern pro Wurm aus jeder Platte gelegt, und addieren Sie diese Werte jeden Tag für 5 Tage, um die Gesamtzahl der Eiablage festzustellen.
Anmerkung: Ohne die Anzahl der Würmer, die gecrawlt aus- und intern aus der Berechnung geschlüpft.
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Representative Results
Die Behandlung von Etoposid (24-96 h) verzögert deutlich das Wachstum von C. Elegans. Nach 96 h Inkubation wuchs Etoposid behandelt Würmer auf 0,86 mm Körperlänge, während das Fahrzeug behandelt Würmer bis 1,04 mm (Abbildung 1) wuchs. Retardiertes Wachstum wurde offenbar auch unter Stereomikroskop Beobachtung (Abbildung 2) beobachtet. Wir begannen zu Eiern aus dem Fahrzeug behandelt Worms bei 72 h Inkubationszeit zu sehen. Auf der anderen Seite wurden Eiern nach 96 h Etoposid Behandlung beobachtet. Aus diesen Daten spekulierten wir, dass Etoposid Behandlung die Geburt erstmals von C. Elegans verzögert.
Neben der Verzögerung der Eiablage sank Etoposid Behandlung deutlich die Gesamtzahl der Eiablage pro Wurm (Abbildung 3). Die Reproduktionstoxizität, der Rückgang der insgesamt Ei Anzahl von Etoposid Behandlung wurde beobachtet, wenn die jungen Erwachsenen Würmer in der Gegenwart (Abb. 3 b) oder ohne (Abbildung 3A) kontinuierliche Etoposid Behandlung kultiviert wurden. Es gab keine signifikanten Unterschiede zwischen der Kontrolle behandelt Würmer unter beiden Versuchsbedingungen. Die Gesamtzahl von Eiern aus Worms (aus Eiern, die jungen Erwachsenen Stadium) für einen bestimmten Zeitraum hinweg behandelt war nicht signifikant verschieden von der Würmer, die kontinuierlich mit Etoposid behandelt. Für diesen Vergleich wurde die statistische Analyse von Einweg Varianzanalyse (ANOVA) gefolgt von der Tukey mehrere Vergleichstest durchgeführt.
Abbildung 1: Messung des Wachstums in C. Elegans behandelt mit Etoposid. Alter-synchronisierte C. Elegans Eiern wurden auf NGM Platten ergänzt mit DMSO (1 %, die Fahrzeugkontrolle) angebaut oder Etoposid (750 µM) für 24-96 h Oberflächenmustern (siehe Abbildung 2) wurden jeden Tag und die Körperlänge gemessen wurde, mit ImageJ-Software. Die Daten sind als Mittelwert ± Standardabweichung (SD) ausgedrückt (n = 50, 50 Würmer pro Gruppe). p < 0,01 für signifikante Unterschiede zwischen der Fahrzeug-Kontrolle und Etoposid Behandlung zu jedem Zeitpunkt. Statistische Auswertung erfolgte mittels des Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 2: Stereo-Mikroskop-Bilder von C. Elegans behandelt mit Etoposid. C. Elegans wurden behandelt, wie in Abbildung 1 beschrieben (Maßstab = 1 mm). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
Abbildung 3: Total Anzahl von Eiern gelegt von C. Elegans mit Etoposid behandelt. Alter-synchronisierte C. Elegans Eizellen wurden auf NGM Platten mit DMSO (1 %, die Fahrzeugkontrolle) inkubiert oder Etoposid (750 µM) für 64 h. Als nächstes wurde die Gesamtzahl der Eiablage in Abwesenheit (A) oder (B) Vorhandensein kontinuierliche chemische Behandlung 5 Tage lang beobachtet. Würmer wurden täglich zu den normalen NGM Platte (A) oder NGM-Platte mit der gleichen Chemikalien ergänzt: 1 % DMSO oder Etoposid (750 µM) (B). Die Anzahl der gelegten Eiern wurde gezählt und geteilt durch die Gesamtzahl der Würmer täglich zur Berechnung der Anzahl der Eiablage pro Wurm. Die Zahlen von Eiern pro Wurm waren für 5 Tage zusammengefasst. Die Daten sind als Mittelwert ± SD aus vierfach Experimenten ausgedrückt. p < 0,01 für signifikante Unterschiede zwischen der Fahrzeug-Kontrolle und Etoposid Behandlung. Statistische Auswertung erfolgte mittels des Student t-test. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.
| Normale NGM Agar Medien – 1.000 mL für Wartung und Eiablage Assay ohne kontinuierliche chemische Behandlung |
| 1. schreibe 2,5 g Pepton, 3 g NaCl, 17 g Agar und 975 mL destilliertem Wasser in einer Glasflasche. |
| (2) Autoklaven für 15 min bei 121 ° C. |
| (3) in einem Wasserbad für 30 min bei 55 ° C kühlen Sie ab, und fügen Sie 1 mL 1 M CaCl2, 5 mg/mL Cholesterin (gelöst in Ethanol) 1 mL, 1 mL 1 M MgSO4, 25 mL KPO-4. |
| 4. Mischen Sie sich mit magnetischen rühren und dann aliquoten in Petrischalen (90 x 15 mm Schalen für die Wartung, 35 x 10 mm2 Gerichte für die Eiablage Assay). |
| 5. speichern Sie die NGM-Platten bei 4 ° C bis zur Verwendung. |
| DYT Medien für den Anbau von E. Coli OP50 – 500 mL |
| 1. Fügen Sie 2,5 g NaCl, 5 g Hefe-Extrakt, 8 g Pepton, und 485 mL destilliertem Wasser in einen Erlenmeyerkolben. |
| (2) Autoklaven für 15 min bei 121 ° C. |
| 3. kühlen Sie lassen ab und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern. |
| S-Puffer – 1.000 mL |
| (1) fügen Sie 5,85 g NaCl, 6 g KH2PO4, 1 g K2HPO4und 987 mL destilliertem Wasser in einer Glasflasche. |
| 2. Stellen Sie den pH-Wert der Lösung auf 6.0. |
| (3) Autoklaven für 15 min bei 121 ° C. |
| 4. kühlen Sie lassen ab und bis zur Verwendung bei Raumtemperatur lagern. |
Tabelle 1: Rezepte von Nährmedien Wachstum und Puffer.
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Discussion
In diesem Artikel beschreiben wir die Toxizität Bewertung von Chemikalien in C. Elegans, ein Boden-Nematoden mit Etoposid als vergiftendes Beispiel. Zu diesem Zweck haben wir zwei Versuchsbedingungen verwendet. In der ersten Reihe C. Elegans auf Etoposid mit Platten aus Eiern, die jungen Erwachsenen Stadium angebaut wurden, und dann durften die Würmer zur Eiablage auf normalen NGM-Platten ohne Chemikalien. In der zweiten experimentellen Gruppe wurden C. Elegans kontinuierlich mit Etoposid während der gesamten Probezeit behandelt. Im Vergleich der Ei Zahlen zwischen den beiden experimentellen Bedingungen, können wir entscheiden, ob die reproduktive Toxizität der getesteten Verbindungen reversiblen oder irreversiblen war. Etoposid verringerte sich deutlich die Gesamtzahl der Eiablage unter beiden Versuchsbedingungen (Abbildung 3). Diese Daten impliziert, dass Vorbehandlung von Etoposid während der frühen Wachstumsphase war ausreichend, um den Schaden zu reproduktiven Organen auslösen, einschließlich Gonade Keim Zellen6; anhand dieser Daten können wir spekulieren, dass Etoposid Behandlung irreversibel Reproduktionstoxizität in C. Elegansinduziert.
Neben der C. Elegans Experimente in dieser Methode Artikel beschrieben testet andere Toxizität wie z. B. die Lebensdauer assay14,15, mikroskopische Beobachtung der Gonade Keimzellen6,17, Messung der pharyngealen Förderrate und Bewegung Analyse18,19 kann auch für die Bewertung der chemischen Toxizität in C. Elegansverwendet werden. In Vitro kultivierten humanen Zelllinien, primäre Zellen und Stammzellen 3D Sphäroid Kultur sind andere möglichen Optionen für die Bewertung der Toxizität von verschiedenen Chemikalien, die Begrenzung von C. Elegans Experimente1zu vermehren, 6,20,21.
Zwar gibt es evolutionäre Erhaltung der wesentlichen Gene in C. Elegans, der nicht-Säugetier-Organismus unterscheidet sich von Menschen in Bezug auf die Proteinsequenzen, den Magen und Darm Systeme, Stoffwechsel, sowie es fehlt viele Gene. Daher sind Säugetier-Tierversuchen und klinischen Studien für die umfassende Bewertung der Toxizität von Chemikalien benötigt. Angesichts der Vorteile der Bequemlichkeit und tierischen ethische Fragen werden ein C. Elegans Toxizitätstests Plattform jedoch eine nützliche und praktische Lösung für die toxikologische Bewertung der verschiedenen Chemikalien.
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Disclosures
Die Autoren haben nichts preisgeben.
Acknowledgments
Diese Studie wurde unterstützt durch das Korea Institute of Science and Technology intramuralen Forschungsstipendium (2E27513) und die hohe Mehrwertsteuer Food Technologie Entwicklung Programm (IPET) gefördert durch das Ministerium für Landwirtschaft, Food and Rural Affairs (315067-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
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