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Medicine

Caenorhabditis एलिगेंस के विकास और प्रजनन पर रसायनों के प्रभाव को मापने

Published: October 5, 2017 doi: 10.3791/56437
Automatic Translation
1, 1
1Systems Biotechnology Research Center, Korea Institute of Science and Technology

Summary

एक बुनियादी प्रोटोकॉल एक मॉडल पशु में रसायनों की विषाक्तता का मूल्यांकन करने के लिए, Caenorhabditis एलिगेंस, वर्णन किया गया है । विधि सुविधाजनक और फार्मास्यूटिकल्स के विकास के लिए उपयोगी के रूप में अच्छी तरह के रूप में विभिंन पर्यावरणीय प्रदूषकों के जोखिम के आकलन के लिए है ।

Abstract

विषाक्तता मूल्यांकन बुनियादी और एप्लाइड जैविक विज्ञान के क्षेत्रों में रहने वाले जीवों पर रसायनों के प्रभाव को समझने के लिए महत्वपूर्ण है । एक गैर स्तनधारी मिट्टी दौर कीड़ा, Caenorhabditis एलिगेंस, अपनी सुविधा और पशु नैतिकता के मुद्दों की कमी के कारण स्तनधारी पशु प्रणालियों के साथ तुलना में विषविज्ञान अध्ययन के लिए एक मूल्यवान मॉडल जीव है । इस प्रोटोकॉल में, C. एलिगेंस में रसायनों के विषाक्तता मूल्यांकन की एक विस्तृत प्रक्रिया बताई गई है । एक नैदानिक विरोधी दवा, etoposide, जो मानव तोपोइसोमेरसे द्वितीय लक्ष्य और मानव कैंसर कोशिकाओं के डीएनए प्रतिकृति रोकता है, एक मॉडल परीक्षण रासायनिक के रूप में चुना गया था. उंर-सिंक्रनाइज़ सी. एलिगेंस अंडे या तो dimethyl sulfoxide (DMSO) या etoposide, और फिर सी. एलिगेंस के विकास के लिए उजागर किया गया 4 दिनों के लिए हर दिन स्टीरियो माइक्रोस्कोप अवलोकन द्वारा निगरानी की गई । DMSO या etoposide के साथ इलाज करने वाले सी. एलिगेंस से रखी गई अंडों की कुल संख्या भी स्टीरियो माइक्रोस्कोप के इस्तेमाल से गिनी जाती थी. Etoposide उपचार के विकास और सी. एलिगेंसके प्रजनन को काफी प्रभावित करते हैं । रसायनों के विभिन्न उपचार के समय के साथ कीड़े से रखी अंडे की कुल संख्या की तुलना करके, यह तय किया जा सकता है कि C. एलिगेंस प्रजनन पर रसायनों के प्रजनन विषाक्तता प्रतिवर्ती या अपरिवर्तनीय है । इन प्रोटोकॉल विभिंन दवाओं और पर्यावरण विषालु के जोखिम के आकलन के विकास दोनों के लिए उपयोगी हो सकता है ।

Introduction

विषाक्तता मूल्यांकन फार्मास्यूटिकल्स, न्यूट्रास्यूटिकल्स, और cosmeceuticals के विकास के लिए आवश्यक है, साथ ही विभिंन पर्यावरणीय विषाक्त पदार्थों का जोखिम मूल्यांकन । इस विषविज्ञान अध्ययन के लिए vivo प्रयोगात्मक प्रणालियों में सबसे लोकप्रिय कुतर मॉडल में से एक है; वैकल्पिक रूप से, गैर स्तनधारी जीवों जैसे सी. एलिगेंस भी व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है । गैर स्तनधारी विषाक्तता मूल्यांकन मॉडल क्योंकि न केवल पशु नैतिक मुद्दों पर भी अपनी सुविधा और उपयोगिता लागत प्रभावशीलता, बनाए रखने, गति, और reproducibility1,2 पर विचार के लिए लाभकारी हैं ,3,4.

सी. एलिगेंस, एक मिट्टी दौर कीड़ा, विभिंन बुनियादी और एप्लाइड बायोलॉजी और रसायन विज्ञान अनुसंधान में एक मॉडल पशु के रूप में शोषण किया गया है । यह एक 1 मिमी लंबे, पारदर्शी निमेटोड है, जो सिर्फ ठोस या तरल निमेटोड विकास मीडिया (NGM) बैक्टीरियल तनाव ई कोलाई OP50 के साथ खिलाया में बनाए रखा है । c. एलिगेंस एक लघु जीवन चक्र है, और जंगली प्रकार N2 सी एलिगेंस लगभग ३०० अंडे देता है । इसलिए, यह आसानी से प्रायोगिक सामग्री3,4,5के रूप में इस्तेमाल किया जा प्रचारित है । सी. एलिगेंस भी व्यापक रूप से कई दवाओं और पर्यावरण प्रदूषण के विषाक्तता अध्ययन में किया गया है6,7,8,9।

क्योंकि कई विरोधी दवाओं तेजी से कैंसर कोशिकाओं को विभाजित लक्ष्य, वे भी तेजी से इस तरह के अस्थि मज्जा, आंत्र उपकला, और बाल कूप कोशिकाओं के रूप में सामान्य कोशिकाओं को विभाजित नुकसान कर सकते हैं । उदाहरण के लिए, तोपोइसोमेरसे निरोधात्मक विरोधी दवाओं कैंसर कोशिकाओं के डीएनए प्रतिकृति प्रक्रिया को लक्षित; इसलिए, वे भी तेजी से बाधित सामांय कोशिकाओं को विभाजित । हर जीवित जीव topoisomerases है, और इन तोपोइसोमेरसे अवरोधकों सबसे अधिक संभावना प्रभाव पर्यावरण पारिस्थितिकी प्रणालियों6,10,11। इस प्रकार, एक दवा विषाक्तता मूल्यांकन एक मॉडल पशु का उपयोग कर मंच फार्मास्यूटिकल्स और पर्यावरण जोखिम मूल्यांकन के दोनों के विकास के लिए मूल्यवान है ।

इस अनुच्छेद में, हम विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करने के लिए etoposide की विषाक्तता का परीक्षण, जो एक नैदानिक विरोधी एजेंट है कि लक्ष्य तोपोइसोमेरसे द्वितीय, एक मॉडल के रूप में सी. एलिगेंसमें विषाक्त रासायनिक । इस प्रयोजन के लिए, हम शरीर के आकार की माप विधि और etoposide के साथ इलाज किया ग. एलिगेंस में रखी अंडे की कुल संख्या का वर्णन करेंगे ।

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Protocol

< p class = "jove_content" > नोट: संपूर्ण प्रयोग एक साफ़ पृथक प्रयोगशाला में किया जाना चाहिए जिसमें 20 & #176; C कम धूल के साथ और कीड़ा और बैक्टीरियल हैंडलिंग के दौरान संदूषण के ंयूनतम के साथ । इस प्रयोजन के लिए, प्रयोगों एक शराब दीपक की लौ के तहत किया जाना चाहिए या एक साफ बेंच का उपयोग ।

< p class = "jove_title" > 1. केमिकल टेस्ट के लिए ग. एलिगेंस और अंडा तैयार करने का रख-रखाव

  1. c. एलिगेंस N2 (var. ब्रिस्टल) पर एक NGM आगार प्लेट फेड के साथ जीना ई. कोलाई OP50 पर 20 & #176; ग < सुप class = "xref" > 12 , < सुप class = "xref" > 13 .
  2. या तो ब्लीच समाधान उपचार का उपयोग कर उम्र सिंक्रनाइज़ अंडे तैयार < सुप class = "xref" > 5 या टाइम एग बिछाने की विधि < सुप class = "xref" > 6 , < सुप class = "xref" > 14 , < सुप class = "xref" > 15 .
    नोट: अंडे की तैयारी से पहले, कोट etoposide-NGM प्लेट युक्त गर्मी के साथ निष्क्रिय ई. कोलाई OP50 के रूप में नीचे वर्णित है । गर्मी निष्क्रिय ई कोलाई OP50 ई. कोलाई की चयापचय गतिविधि को कम करने के लिए प्रयोग किया जाता है < सुप वर्ग = "xref" > 6 , < सुप क्लास = "xref" > 16 .
< p class = "jove_title" > 2. गर्मी की तैयारी-सूचनाको ई. कोलाई OP50 को ग. एलिगेंस विषाक्तता परीक्षण के दौरान

  1. डबल खमीर tryptone के ५०० मिलीलीटर (DYT) मध्यम के रूप में तालिका 1 में वर्णित तैयार है, और लगाना ई. कोलाई OP50 के एक एकल कॉलोनी पर संस्कृति a Luria-Bertani (LB) आगर प्लेट < सुप class = "xref" > 5 .
  2. ई. कोलाई OP50 एक झटकों की मशीन में 14 के लिए ३७ & #176; C और १५० rpm.
    3. ३,२२० x g और 20 & #176 पर 30 मिनट के लिए केंद्रापसारक के बाद
  3. ; C, सभी supernatant DYT मध्यम निकालें, और S-बफर के 25 मिलीलीटर के एक पूर्व मिश्रण जोड़ें, २५० & #181; l के 1 M MgSO 4 , और 25 & #181; l के 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल (इथेनॉल में भंग) । ये सारे समाधान बाँझ हैं.
  4. बैक्टीरिया reसस्पेंड और एक ५०-एमएल डिस्पोजेबल प्लास्टिक ट्यूब करने के लिए उन्हें हस्तांतरण ।
    5. गर्मी के लिए
  5. -निष्क्रियता, एक जल स्नान में reसस्पैंड ई. कोलाई OP50 के लिए 30 मिनट में ६५ & #176; C.
  6. ठंडा करने के लिए कमरे के तापमान और स्टोर पर 4 & #176; C तक उपयोग करें । यह एक महीने के लिए संग्रहीत किया जा सकता है ।
< p class = "jove_title" > 3. या तो 1% DMSO या ७५० & #181 युक्त NGM प्लेट तैयार करना; मी Etoposide

  1. दो साफ २०० मिलीलीटर कांच की बोतलें तैयार करते हैं । NaCl के ०.६ ग्राम, peptone के ०.५ ग्राम, आगर के ३.४ ग्राम, और आसुत जल के १९५ मिलीलीटर, और एक बोतल के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी जोड़ें । अंय खाली बोतल के लिए एक चुंबकीय सरगर्मी जोड़ें ।
  2. आटोक्लेव इन दो बोतलों पर 15 मिनट के लिए १२१ & #176; सी, और फिर एक पानी स्नान में 30 मिनट के लिए ५५ & #176; c.
    3. में बोतलों के नीचे ठंडा
  3. जोड़ ०.२ एमएल के 1 M CaCl 2 , ०.२ मिलीलीटर की 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल, ०.२ मिलीलीटर की 1 मीटर MgSO 4 , और 1 मीटर की 5 मिलीलीटर केपीओ 4 (ये सभी समाधान बाँझ होते हैं) और फिर उन्हें एक हॉट प्लेट पर चुंबकीय चमचे से मिलाकर ५५ & #176; C.
  4. एक ही मात्रा (१०० मिलीलीटर प्रत्येक) के साथ दो बोतलों में मिश्रित NGM माध्यम विभाजित । अगले, एक बोतल के लिए DMSO के 1 मिलीलीटर जोड़ें, यह फिर से मिश्रण चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर । अंय बोतल में एक पानी स्नान में स्टोर ५५ & #176 अगले कदम तक; सी । प्रत्येक ३५ x 10 मिमी 2 पेट्री डिश के लिए DMSO-युक्त माध्यम के Aliquot 3 मिलीलीटर । लगभग ३३ DMSO-युक्त NGM प्लेटें इस चरण से बनाई जा सकती हैं.
  5. चुंबकीय सरगर्मी का उपयोग कर अन्य बोतल मिश्रण, ७५ मिमी etoposide (DMSO में भंग शेयर) की 1 मिलीलीटर जोड़ने, फिर से मिश्रण, और aliquot प्रक्रिया (चरण ३.४) दोहराएँ. लगभग ३३ etoposide (७५० & #181; M)-युक्त NGM प्लेटें इस चरण से बनाई जा सकती हैं.
    नोट: संबंधित पिछले पेपर < सुप वर्ग में = "xref" > 6 , हमने परीक्षण किया 0, २५०, ५००, और १,००० & #181; M of etoposide. उस आंकडे के आधार पर हमने इस पत्र में etoposide गुनी के ७५० & #181; M को चुना.
  6. लगभग 3 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर उन्हें छोड़ने के द्वारा कमरे के तापमान के लिए रासायनिक युक्त NGM प्लेटों शांत नीचे, और 4 & #176 पर उन्हें स्टोर; C उपयोग तक.
    नोट: प्रकाश-संवेदनशील रसायनों के मामले में प्रकाश प्रेरित अपघटन को कम करने के लिए प्रकाश ब्लॉक ।
    नोट: वैकल्पिक रूप से, अंडा बिछाने परख, जो दो अलग रासायनिक उपचार की स्थिति के रूप में नीचे वर्णित का उपयोग किया जा सकता है के लिए रसायनों के बिना एक सामांय NGM प्लेट बनाते हैं ।
  7. Add १०० & #181; गर्मी के निष्क्रिय ई. कोलाई OP50 (के रूप में खंड 2 में वर्णित) और प्रत्येक NGM प्लेट पर फैल गया । एक में रातोंरात शुष्क करने की अनुमति दें c. एलिगेंस मशीनी पर 20 & #176; c रासायनिक परीक्षण के लिए.
< p class = "jove_title" > 4. माप का ग. एलिगेंस वृद्धि

  1. स्थानांतरण आयु-सिंक्रनाइज़ C. एलिगेंस अण्डे की NGM प्लेट के साथ पूरक 1% DMSO या ७५० & #181; M etoposide.
  2. c. एलिगेंस एक मशीन में 20 & #176; c 4 दिनों के लिए । एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप का उपयोग कर कीड़े का पालन करें, और हर दिन सूक्ष्म छवियों ले. आमतौर पर 20X आवर्धन (1x उद्देश्य लेंस, 2x ज़ूम इज़ाफ़ा, और 10x ऐपिस लेंस) C. एलिगेंस के विकास के अवलोकन के लिए उपयुक्त है । भी कीड़ा आकार अंशांकन के लिए माइक्रोस्कोप चरण माइक्रोमीटर की एक सूक्ष्म छवि ले लो.
    नोट: भुखमरी विषाक्तता परीक्षण को प्रभावित करता है । इसलिए, पर्याप्त बैक्टीरिया के साथ फ़ीड या & #160 को समायोजित; हस्तांतरित ग. एलिगेंस शुरुआत में एग नंबर । भुखमरी की संभावना को बाहर करने के लिए 3 दिनों तक निरीक्षण करें ।
  3. सॉफ्टवेयर का उपयोग कर हर समय बिंदु पर DMSO या etoposide के साथ इलाज ग. एलिगेंस ImageJ के शरीर की लंबाई को मापने.
    नोट: प्रत्येक नमूना माप के लिए, ५० वर्म सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए पर्याप्त हैं ।
    1. ImageJ, माइक्रोस्कोपी स्टेज खोल माइक्रोमीटर इमेज (& #39; फाइल & #39; & #8594; & #39; खुला & #39;).
      नोट: माइक्रोमीटर छवि और वर्म छवियां (चरण ४.२) समान आवर्धन होना चाहिए ।
    2. १,००० & #181; m का उपयोग कर माइक्रोमीटर अंशांकन छवि पर एक पंक्ति खींचें & #39; सीधी रेखा & #39; टूल.
    3. Click & #39; श्लेष & #39; & #8594; & #39; सेट केल & #39; और इनपुट १,००० और & #181; मी इन द & #39; चचा दूरी & #39; बॉक्स और & #39; लंबाई की इकाई & #39; बॉक्स, क्रमशः । चेक & #39; ग्लोबल & #39; र click & #39; ओके & #39;.
    4. खोलें (& #39; फ़ाइल & #39; & #8594; & #39; open & #39;). & #39 का उपयोग करके प्रत्येक वर्म की सुविधा के साथ एक रेखा आरेखित करना; मुक्तहस्त रेखा & #39; उपकरण । क्लिक करके शरीर की लम्बाई का डेटा प्राप्त करें & #39; श्लेष & #39; & #8594; & #39; नाप & #39;.
    5. ५० वर्म्स के लिए इन चरणों को दोहराएँ ।
< p class = "jove_title" > 5. ग. एलिगेंस अंडा बिछाने की परख

  1. ६४ ज (पहले जन्म से पहले) के लिए NGM या DMSO युक्त etoposide प्लेट पर आयु-सिंक्रनाइज़ अंडे की मशीन, 20 & #176 पर युवा वयस्क मंच तक; C.
    नोट: यह वृद्धि माप प्रयोगों से कीड़े का उपयोग करने के लिए वैकल्पिक है. यह वृद्धि माप और अंडा बिछाने परख एक साथ करने के लिए सुविधाजनक है ।
  2. हस्तांतरण 5 नए NGM प्लेटों को रसायनों के बिना वयस्क कीड़े (1 शर्त, समय की एक निश्चित अवधि के भीतर रासायनिक उपचार, अंडे से युवा वयस्क चरण के लिए) या नए NGM एक ही रासायनिक उपचार युक्त प्लेट (2 शर्त, निरंतर जोखिम के समग्र प्रायोगिक अवधि के माध्यम से रसायन), और फिर उंहें 24 घंटे के लिए मशीन
    नोट: यह प्रत्येक उपचार के लिए 3-5 NGM प्लेटों का उपयोग कर प्रतिकृति बनाने के लिए सिफारिश की है; इन प्रतिकृतियों सांख्यिकीय विश्लेषण के लिए उपयोग किया जा सकता है ।
  3. ऊपर वर्णित के रूप में नई NGM प्लेट को हस्तांतरण, और हर दिन अंडे की संख्या की गणना । कीड़े कि बंद क्रॉल गिनती, मर गया, और आंतरिक हैच थेed.
  4. इन चरणों को दोहराने जब तक कीड़े कोई और अंडे देना, आमतौर पर 5 दिनों में ।
  5. प्रत्येक थाली से कीड़ा प्रति रखी अंडे की संख्या की गणना, और 5 दिनों के लिए इन मूल्यों हर दिन राशि निर्धारित अंडे की कुल संख्या का निर्धारण करने के लिए ।
    नोट: बाहर क्रॉल और आंतरिक गणना से रची गई कीड़ों की संख्या को छोड़ दें.

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Representative Results

etoposide (24-96 एच) के उपचार में काफी सी. एलिगेंसके विकास को मंद कर । मशीन के ९६ एच के बाद, etoposide-इलाज कीड़े शरीर की लंबाई में ०.८६ मिमी की वृद्धि हुई है, जबकि वाहन का इलाज कीड़े १.०४ मिमी (चित्रा 1) के लिए बढ़ी । विकास मंदता भी जाहिरा तौर पर स्टीरियो माइक्रोस्कोप अवलोकन (चित्रा 2) के तहत मनाया गया । हम वाहन से अंडे देखने के लिए शुरू कर दिया-गर्मी की ७२ एच में कीड़े का इलाज किया । दूसरी ओर, अंडे etoposide उपचार के ९६ ज के बाद मनाया गया । इन आंकड़ों से, हमने अटकलें लगाई कि etoposide उपचार के पहले जंम के समय में देरी हुई C. एलिगेंस।

अंडा बिछाने की देरी के अलावा, etoposide उपचार काफी कीड़ा (चित्रा 3) प्रति रखी अंडे की कुल संख्या में कमी आई । प्रजनन विषाक्तता, etoposide उपचार द्वारा कुल अंडा संख्या की कमी मनाया गया था जब युवा वयस्क कीड़े उपस्थिति (चित्र 3 बी) या अनुपस्थिति में प्रसंस्कृत थे (चित्राएक सतत etoposide उपचार के) । दोनों प्रयोगात्मक शर्तों के तहत नियंत्रण इलाज कीड़े के बीच कोई महत्वपूर्ण मतभेद थे । समय की एक निश्चित अवधि के लिए इलाज किया कीड़े से अंडे की कुल संख्या (अंडे से युवा वयस्क चरण के लिए) के कीड़े से है कि लगातार etoposide के साथ इलाज से अलग नहीं था । इस तुलना के लिए, सांख्यिकीय विश्लेषण प्रसरण का एक-तरफ़ा विश्लेषण द्वारा किया गया था (ANOVA) Tukey के एकाधिक तुलना परीक्षण के बाद ।

Figure 1
चित्रा 1: etoposide के साथ इलाज किया C. एलिगेंस में विकास की माप. उंर-सिंक्रनाइज़ सी. एलिगेंस अंडे NGM प्लेटों पर DMSO (1%, वाहन नियंत्रण) या etoposide (७५० µ मीटर) 24-96 h. Photomicrographs ( चित्रा 2में दिखाया गया) हर दिन लिया गया था के साथ पूरक थे, और शरीर की लंबाई का उपयोग कर मापा गया था ImageJ लागेको हो । डेटा मतलब ± मानक विचलन (एसडी) (n = ५०, प्रति समूह ५० कीड़े) के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । * प्रत्येक समय बिंदु पर वाहन नियंत्रण और etoposide उपचार के बीच महत्वपूर्ण अंतर के लिएp & #60; ०.०१ सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टीपरीक्षण का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: एलिगेंस के स्टीरियो माइक्रोस्कोप छवियों etoposide के साथ इलाज किया । C. एलिगेंस चित्रा 1 (स्केल बार = 1 mm) में वर्णित के रूप में इलाज किया गया । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 3
चित्रा 3: etoposide के साथ इलाज किया सी. एलिगेंस से रखी अंडे की कुल संख्या । आयु-सिंक्रनाइज़ किए गए C. एलिगेंस अंडे NGM प्लेट्स पर DMSO (1%, वाहन नियंत्रण) या etoposide (७५० µ m) ६४ h के लिए मशीन थे । अगले, रखी अंडे की कुल संख्या (एक) या उपस्थिति (5 दिनों के लिए सतत रासायनिक उपचार केबी) के अभाव में मनाया गया । कीड़े सामान्य NGM प्लेट (ए), या NGM प्लेट एक ही रसायनों के साथ पूरक के लिए हर दिन स्थानांतरित किया गया: 1% DMSO या etoposide (७५० µ मीटर) (बी). रखी अंडों की संख्या की गणना की गई और कीड़ों की प्रति रखी अंडों की संख्या को परिकलित करने के लिए हर दिन कीड़ों की कुल संख्या से विभाजित किया गया. कीड़ा प्रति अंडे की सभी संख्या 5 दिनों के लिए अभिव्यक्त किया गया । डेटा quadruplicate प्रयोगों से मतलब ± एसडी के रूप में व्यक्त कर रहे हैं । *p & #60; ०.०१, वाहन नियंत्रण और etoposide उपचार के बीच महत्वपूर्ण अंतर के लिए । सांख्यिकीय विश्लेषण छात्र के टीपरीक्षण का उपयोग किया गया था । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

सामांय NGM आगर मीडिया-रखरखाव के लिए १,००० मिलीलीटर, और अंडा सतत रासायनिक उपचार के बिना परख बिछाने
1. peptone के २.५ ग्राम, NaCl के 3 ग्राम, आगर के 17 ग्राम, और एक गिलास बोतल में आसुत पानी की ९७५ मिलीलीटर जोड़ें ।
2. १२१ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव ।
3. ५५ डिग्री सेल्सियस पर 30 मिनट के लिए एक जल स्नान में नीचे ठंडा, और फिर 1 एम के 1 मिलीलीटर CaCl2, 5 मिलीग्राम/एमएल कोलेस्ट्रॉल की 1 मिलीलीटर (इथेनॉल में भंग), 1 मीटर MgSO4, केपीओ4के 25 मिलीलीटर की 1 मिलीलीटर जोड़ें ।
4. चुंबकीय सरगर्मी के साथ मिश्रण, और फिर पेट्री व्यंजन (९० x 15 मिमी के रखरखाव के लिए व्यंजन में aliquot; अंडा बिछाने के लिए ३५ x 10 मिमी2 व्यंजन परख) ।
5.4 डिग्री सेल्सियस पर NGM प्लेटों का उपयोग तक स्टोर ।
ई. कोलाई OP50 की खेती के लिए DYT मीडिया-५०० मिलीलीटर
1. NaCl के २.५ जी, खमीर निकालने के 5 जी, peptone के 8 ग्राम, और एक Erlenmeyer कुप्पी में आसुत जल के ४८५ मिलीलीटर जोड़ें ।
2. १२१ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव ।
3. शांत हो जाओ और कमरे के तापमान पर स्टोर का उपयोग करें जब तक ।
एस बफर-१,००० मिलीलीटर
1. Add ५.८५ g of NaCl, 6 g of KH2पीओ4, 1 जी के K2HPO4, और आसुत जल की ९८७ मिलीलीटर एक गिलास बोतल में ।
2. ६.० करने के लिए समाधान के पीएच समायोजित करें ।
3. १२१ डिग्री सेल्सियस पर 15 मिनट के लिए आटोक्लेव ।
4. शांत हो जाओ और कमरे के तापमान पर स्टोर का उपयोग करें जब तक ।

तालिका 1: संस्कृति वृद्धि मीडिया और बफ़र्स की receipes ।

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Discussion

इस अनुच्छेद में, हम सी. एलिगेंस, एक मिट्टी निमेटोड में रसायनों के विषाक्तता मूल्यांकन का वर्णन, एक विषैले उदाहरण के रूप में etoposide का उपयोग कर । इस प्रयोजन के लिए, हम दो प्रयोगात्मक शर्तों का इस्तेमाल किया । पहले सेट में सी. एलिगेंस के पास अंडों से प्लेट युक्त etoposide पर युवा वयस्क अवस्था में उगाए जाते थे, और फिर कीड़े को बिना रसायनों के सामान्य NGM प्लेटों पर अंडे देना की अनुमति दी जाती थी. द्वितीय प्रयोगात्मक सेट में, सी. एलिगेंस पूरे प्रायोगिक अवधि के दौरान etoposide के साथ लगातार इलाज किया गया । दो प्रयोगात्मक शर्तों के बीच अंडे की संख्या की तुलना करके, हम तय कर सकते है कि परीक्षण यौगिकों के प्रजनन विषाक्तता प्रतिवर्ती या अपरिवर्तनीय था । Etoposide काफी दोनों प्रयोगात्मक शर्तों (चित्रा 3) के तहत रखी अंडे की कुल संख्या में कमी आई । इन आंकड़ों में निहित है कि जल्दी विकास के चरण के दौरान etoposide के उपचार प्रजनन अंगों को नुकसान प्रेरित करने के लिए पर्याप्त था, gonad रोगाणु कोशिकाओं सहित6; इन आंकड़ों के आधार पर, हम अटकलें है कि etoposide उपचार अचल में प्रजनन विषाक्तता प्रेरित सकता है सी. एलिगेंस।

सी. एलिगेंस प्रयोगों के अलावा इस विधि लेख में वर्णित, उम्र परख14,15, gonad रोगाणु कोशिकाओं के सूक्ष्म अवलोकन के रूप में अन्य विषाक्तता परीक्षण6,17, ग्रसनी पंपिंग दर की माप, और आंदोलन विश्लेषण18,19 भी सी. एलिगेंसमें रासायनिक विषाक्तता मूल्यांकन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है । इन विट्रो में प्रसंस्कृत मानव कोशिका लाइनों, प्राथमिक कोशिकाओं, स्टेम सेल, और 3 डी अंडाकार संस्कृति विभिन्न रसायनों की विषाक्तता के मूल्यांकन के लिए अन्य संभव विकल्प हैं C. एलिगेंस प्रयोगों1की सीमा बढ़ाने के लिए, 6,20,21.

यद्यपि सी. एलिगेंसमें आवश्यक जीनों के विकासात्मक संरक्षण है, गैर स्तनधारी जीव प्रोटीन दृश्यों, पाचन और आंत्र प्रणालियों, चयापचय, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से यह कई जीन की कमी के संदर्भ में मनुष्यों से अलग है । इसलिए, स्तनधारी पशु प्रयोगों और नैदानिक परीक्षणों रसायनों की विषाक्तता के पूर्ण मूल्यांकन के लिए आवश्यक हैं । हालांकि, सुविधा और पशु नैतिक मुद्दों के फायदों को ध्यान में रखते हुए, एक सी. एलिगेंस विषाक्तता परीक्षण मंच विभिन्न रसायनों के विषाक्तता मूल्यांकन के लिए एक उपयोगी और व्यावहारिक समाधान हो जाएगा ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस अध्ययन में कोरिया इंस्टीट्यूट ऑफ साइंस एण्ड टेक्नोलॉजी अंदर रिसर्च ग्रांट (2E27513) तथा कृषि, खाद्य एवं ग्रामीण कार्य मंत्रालय (315067-03) द्वारा वित्तपोषित उच्च मूल्य वर्धित खाद्य प्रौद्योगिकी विकास कार्यक्रम (IPET) का समर्थन किया गया ।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agar Affymetrix, USA 10906
Caenorhabditis elegans N2 Caenorhabditis Genetics Center (CGC) Wild type
Cholesterol Sigma, USA C3045
Dimethyl sulfoxide Sigma, USA D2650
Escherichia coli OP50 Caenorhabditis Genetics Center (CGC)
Etoposide Sigma, USA E1383
Image J software (ver 1.4) Natinoal Institute of Health, USA https://imagej.nih.gov/ij/
Microscope camera Jenopitk, Progress Gryphax, Germany
Peptone Merck, USA 107213
35 × 10 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10035
90 × 15 mm Petri dish SPL Life Sciences, South Korea 10090
Stereo microscope Nikon, Japan SMZ800N
Yeast extract Becton Dickinson, USA 212750

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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<em>Caenorhabditis एलिगेंस</em> के विकास और प्रजनन पर रसायनों के प्रभाव को मापने
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Lee, S. Y., Kang, K. Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (128), e56437, doi:10.3791/56437 (2017).

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