Summary
Un protocollo di base per valutare la tossicità delle sostanze chimiche in un animale di modello, elegans di Caenorhabditis, è descritto. Il metodo è conveniente ed utile per lo sviluppo di prodotti farmaceutici anche per quanto riguarda la valutazione del rischio di vari inquinanti ambientali.
Abstract
Valutazione tossicologica è cruciale per la comprensione degli effetti delle sostanze chimiche sugli organismi viventi nei campi di scienze biologiche di base e applicata. Un suolo non mammiferi tondo verme Caenorhabditis elegans, è un organismo modello prezioso per gli studi di tossicologia grazie alla sua comodità e la mancanza di problemi di etica animale confrontato con sistemi animali mammiferi. In questo protocollo, è descritta una procedura dettagliata di valutazione tossicologica delle sostanze chimiche in c. elegans . Una clinica della droga anticancro, etoposide, che gli obiettivi umani topoisomerasi II e inibisce la replicazione del DNA delle cellule tumorali umane, è stata selezionata come un prodotto chimico di test del modello. Età-sincronizzato di c. elegans uova sono stati esposti a solfossido dimetilico (DMSO) o etoposide, e quindi la crescita di c. elegans è stata monitorata ogni giorno per 4 giorni tramite l'osservazione del microscopio stereo. Il numero totale di uova di cui da c. elegans trattati con DMSO o etoposide è stato contato anche utilizzando il microscopio stereo. Etoposide trattamento significativamente influenzato la crescita e la riproduzione di c. elegans. Tramite il confronto del numero totale di uova deposte da vermi con periodi differenti di trattamento di sostanze chimiche, può essere deciso che la tossicità delle sostanze chimiche sulla riproduzione di c. elegans è reversibile o irreversibile. Questi protocolli possono essere utili per sia lo sviluppo di varie droghe e valutazione del rischio di tossici ambientali.
Introduction
Valutazione tossicologica è essenziale per lo sviluppo di prodotti farmaceutici, nutraceutici e cosmeceutici, come pure la valutazione del rischio di varie tossine ambientali. Il modello di roditore è uno dei più popolari in vivo sistemi sperimentali per questo studio di tossicologia; in alternativa, gli organismi non derivanti da mammiferi come c. elegans sono anche ampiamente utilizzati. Modelli di valutazione tossicologica non derivanti da mammiferi sono favorevoli a causa non solo animale questioni etiche, ma anche la loro convenienza e utilità considerando il rapporto costo-efficacia, manutenibilità, velocità e riproducibilità1,2 ,3,4.
C. elegans, un suolo tondo verme, è stato sfruttato come animale modello in vari ricerca fondamentale e applicata, chimica e biologia. È un lungo 1 mm, trasparente nematode, che semplicemente è tenuto in solido o liquido Nematode crescita Media (NGM) alimentati con il ceppo batterico Escherichia coli OP50. C. elegans ha un ciclo di vita breve, e il selvaggio-tipo N2 c. elegans depone circa 300 uova. Di conseguenza, si propaga facilmente per essere utilizzati come materiali sperimentali3,4,5. C. elegans è stato anche ampiamente utilizzato negli studi tossicologici di molti farmaci e inquinanti ambientali6,7,8,9.
Poiché molti farmaci antitumorali destinazione rapida divisione delle cellule tumorali, essi possono anche danneggiare le cellule normali quali midollo osseo, epitelio intestinale e cellule del follicolo pilifero si dividono rapidamente. Ad esempio, farmaci antitumorali inibitori di topoisomerasi target il processo di replica del DNA delle cellule tumorali; di conseguenza, essi inibiscono anche le cellule normali si dividono rapidamente. Ogni organismo vivente ha le topoisomerasi e questi topoisomerase inibitori più probabile impatto ambientale degli ecosistemi6,10,11. Così, una piattaforma di valutazione tossicologica di droga utilizzando un animale modello è utile per sia lo sviluppo di prodotti farmaceutici e valutazione del rischio ambientale.
In questo articolo, descriviamo i protocolli dettagliati per testare la tossicità di etoposide, che è un agente anticancro di clinico che obiettivi topoisomerasi II, come un prodotto chimico tossico di modello c.elegans. Per questo scopo, descriveremo il metodo di misurazione della dimensione corporea e il numero totale di uova deposte in c. elegans trattati con etoposide.
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Protocol
Nota: l'intero esperimento deve essere eseguita in un laboratorio isolato pulito mantenuto a 20 ° C con basso accumulo di polvere e con riduzione al minimo della contaminazione durante la movimentazione batterica e vite senza fine. Per questo scopo, esperimenti devono essere eseguiti sotto la fiamma di una lampada di alcol o utilizzando un banco pulito.
1. manutenzione di c. elegans e uovo preparazione per il Test di chimica
- Maintain c. elegans N2 (var. Bristol) su una piastra di agar NGM alimentata con live OP50 Escherichia coli a 20 ° C 12 , 13.
- Preparare uova di età-sincronizzati utilizzando candeggina soluzione trattamento 5 o il tempo delle uova di covata metodo 6 , 14 , 15.
Nota: prima di preparazione di uovo, cappotto con la piastra NGM etoposide-contenente inattivati OP50 Escherichia coli come descritto di seguito. E. coli inattivati OP50 è utilizzato per ridurre al minimo l'attività metabolica di e. coli 6 , 16.
2. Preparazione di inattivati Escherichia coli OP50 al Feed C. elegans durante la prova di tossicità
- preparare 500 mL di terreno di doppio lievito tryptone (DYT) come descritto nella tabella 1 e inoculare una singola colonia di e. coli OP50 coltivati su un agar di Luria-Bertani (LB) piastra 5.
- Incubare il OP50 di Escherichia coli in un incubatore d'agitazione per 14 h a 37 ° C e 150 giri/min.
- Dopo centrifugazione a 3.220 x g e a 20 ° C per 30 minuti, rimuovere il surnatante tutto DYT mezzo e aggiungere una pre-miscela di 25 mL di buffer di S, 250 µ l di 1 M MgSO 4 e 25 µ l di colesterolo 5 mg/mL (disciolto in etanolo). Tutte queste soluzioni sono sterile.
- Risospendere i batteri e trasferirli in un tubo di plastica usa e getta da 50 mL.
- Per l'inattivazione termica, incubare il sedimento OP50 di Escherichia coli in un bagnomaria per 30 min a 65 ° C.
- Raffreddare fino a temperatura ambiente e conservare a 4 ° C fino all'utilizzo. Questo può essere immagazzinato per fino a un mese.
3. Preparazione di NGM piastre contenenti sia 1% DMSO o 750 µM Etoposide
- preparare due bottiglie di vetro pulito 200 mL. Aggiungere 0,6 g di NaCl, 0,5 g di peptone, 3,4 g di agar agar e 195 mL di acqua distillata e un agitatore magnetico per una bottiglia. Aggiungere un agitatore magnetico per altre la bottiglia vuota.
- Bottiglie di autoclave questi due per 15 min a 121 ° C e quindi raffreddare le bottiglie in un bagno d'acqua per 30 minuti a 55 ° C.
- Aggiungere 0,2 mL di 1 M CaCl 2, 0,2 mL di colesterolo 5 mg/mL, 0,2 mL di 1 M MgSO 4 e 5 mL di 1 M KPO 4 (tutte queste soluzioni sono sterili) e poi mescolarle mediante agitazione magnetica su una piastra calda a 55 ° C.
- Dividere il mezzo NGM misto in due bottiglie con lo stesso volume (100 mL ciascuno). Successivamente, aggiungere 1 mL di DMSO per una bottiglia, mescolarlo nuovamente utilizzando l'agitazione magnetica. Conservare l'altra bottiglia in un bagno di acqua a 55 ° C fino al passaggio successivo. Aliquotare 3 mL di terreno contenenti DMSO a ogni 35 x 10 mm 2 piastra di Petri. Circa 33 contenenti DMSO NGM piastre possono essere realizzate da questo passaggio.
- Mescolare l'altra bottiglia utilizzando l'agitazione magnetica, aggiungere 1 mL di 75mm etoposide (stock dissolto in DMSO), mescolare di nuovo e ripetere la procedura di aliquota (punto 3.4). Circa 33 etoposide (750 µM)-contiene tavole NGM può essere fatto da questo passaggio.
Nota: In correlato precedente carta 6, abbiamo testato 0, 250, 500 e 1.000 µM di etoposide. Base a tali dati, abbiamo scelto il 750 µM di etoposide dose in questo paper. - Cool giù le piastre NGM contenenti sostanze chimiche a temperatura ambiente lasciandoli a temperatura ambiente per circa 3 h e conservarli a 4 ° C fino all'utilizzo.
Nota: Nel caso di prodotti chimici sensibili alla luce, bloccare la luce per ridurre al minimo la decomposizione indotta dalla luce.
Nota: Facoltativamente, rendere un piatto normale di NGM senza prodotti chimici per l'analisi, che può essere eseguita utilizzando due diversi trattamenti chimici condizioni come descritto di seguito di deposizione delle uova. - Aggiungere 100 µ l di e. coli OP50 inattivati al calore (come descritto nella sezione 2) e pubblicizza su ogni piastra NGM. Lasciar asciugare durante la notte in un'incubatrice di c. elegans a 20 ° C per il test chimico
4. Misura della crescita di c. elegans
- trasferimento l' età-sincronizzato di c. elegans uova alla piastra NGM completata con 1% DMSO o 750 µM etoposide.
- Incubare c. elegans in un incubatore a 20 ° C per 4 giorni. Osservare i vermi utilizzando un microscopio stereo e prendere le immagini al microscopio ogni giorno. Solitamente 20 ingrandimenti (obiettivo obiettivo 1x, ingrandimento zoom 2x e obiettivo oculare 10x) sono adatto per l'osservazione di crescita di c. elegans. Anche prendere un'immagine microscopica di micrometro per microscopio per la calibrazione di dimensione verme.
Nota: Inedia riguarda il test di tossicità. Di conseguenza, nutrire con batteri sufficienti o regolare il trasferito c. elegans uovo numeri all'inizio. Osservare fino a 3 giorni per escludere la possibilità di morire di fame. - Misurare la lunghezza di corpo di c. elegans trattati con DMSO o etoposide in ciascun punto di tempo utilizzando il software ImageJ.
Nota: Per ogni misurazione del campione, 50 vermi sono sufficienti per l'analisi statistica.- In ImageJ, aprire l'immagine al microscopio fase micrometro (' File ' → ' aperto ').
Nota: L'immagine di micrometro e immagini di vite senza fine (passo 4.2) devono essere lo stesso ingrandimento. - Trascinare una linea di 1.000 µm sull'immagine di calibrazione del micrometro utilizzando ' linea retta ' strumento.
- Clic ' Analyze ' → ' Imposta scala ' e 1.000 e µm in ingresso il ' noto distanza ' casella e ' unità di lunghezza ' scatola, rispettivamente. Verifica ' Global ' e fare clic su ' OK '.
- Aprire le immagini di vite senza fine (' File ' → ' aperto '). Disegnare una linea lungo la caratteristica di ogni verme utilizzando ' linea a mano libera ' strumento. Ottenere i dati di lunghezza del corpo facendo ' Analyze ' → ' misura '.
- Ripetere questi passaggi per 50 worm.
- In ImageJ, aprire l'immagine al microscopio fase micrometro (' File ' → ' aperto ').
5. C. elegans uovo posa Assay
uova- Incubare l'età-sincronizzati sul NGM piastra contenente DMSO o etoposide per 64 h (prima della nascita prima) fino allo stadio adulto giovane a 20 ° C.
Nota: È facoltativo utilizzare i vermi da esperimenti di misura la crescita. È conveniente fare la misura di crescita e uovo saggio posa insieme.
Piastre di - trasferire 5 vermi adulti per il nuovo NGM senza prodotti chimici (condizione 1, trattamento chimico entro un certo periodo di tempo, dalle uova alla fase adulta giovane) o nuova piastra NGM contenente il pretrattamento chimico stesso (condizione 2, l'esposizione continua di prodotti chimici attraverso il periodo sperimentale nel complesso) e poi li Incubare per 24 h.
Nota: Si consiglia di rendere replica utilizzando piastre NGM 3-5 per ogni trattamento; questi replica può essere utilizzato per l'analisi statistica. - Trasferire alla nuova piastra NGM come descritto sopra e contare il numero di uova ogni giorno. Contare i vermi che strisciò fuori, è deceduto ed erano internamente tratteggioa cura di
- Ripetere questi passaggi fino a quando i vermi non più uova, solitamente in 5 giorni.
- Calcolare il numero di uova deposte a vite senza fine da ogni piatto e sommare questi valori ogni giorno per 5 giorni determinare il numero totale di uova deposte.
Nota: Escludere il numero di vermi che strisciò fuori ed internamente covato dal calcolo.
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Representative Results
Il trattamento di etoposide (24-96 h) ha ritardato significativamente la crescita di c. elegans. Dopo 96 h di incubazione, etoposide-trattati worm è cresciuto a 0,86 mm di lunghezza del corpo, mentre i vermi veicolo-trattati è cresciuto a 1,04 mm (Figura 1). Ritardo della crescita è stata osservata anche apparentemente sotto osservazione stereo microscopio (Figura 2). Abbiamo iniziato a vedere le uova dai vermi veicolo-trattati a 72 h di incubazione. D'altra parte, le uova sono state osservate dopo 96 h del trattamento di etoposide. Da questi dati, abbiamo speculato che etoposide trattamento ritardato il tempo di nascita primo di c. elegans.
Oltre al ritardo di deposizione delle uova, etoposide trattamento ha fatto diminuire significativamente il numero totale di uova deposte a vite senza fine (Figura 3). La tossicità riproduttiva, la diminuzione del numero totale di uovo dal trattamento di etoposide, è stata osservata quando i giovani vermi adulti sono stati coltivati in presenza (Figura 3B) o assenza (Figura 3A) del trattamento continuo etoposide. Non c'erano differenze significative tra i vermi di controllo-trattati in entrambe le circostanze sperimentali. Il numero totale di uova da vermi trattati per un certo periodo di tempo (dalle uova alla fase adulta giovane) non era significativamente differente da quello di vermi continuamente trattati con etoposide. Per questo confronto, l'analisi statistica è stata effettuata da unidirezionale analisi della varianza (ANOVA) seguita da test di confronto più di Tukey.
Figura 1: Misura della crescita in c. elegans trattati con etoposide. Età-sincronizzato elegans del c. le uova sono state coltivate su piastre NGM completati con DMSO (1%, il controllo del veicolo) o etoposide (750 µM) per h. 24-96 microfotografie (illustrati nella Figura 2) sono stati presi ogni giorno, e la lunghezza del corpo è stata misurata utilizzando Software ImageJ. I dati sono espressi come la media ± deviazione standard (SD) (n = 50, 50 worm al gruppo). p < 0,01, per differenze significative tra il trattamento di controllo ed etoposide di veicolo in ogni momento. L'analisi statistica è stata effettuata usando dello studente t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Immagini del microscopio Stereo di c. elegans trattati con etoposide. C. elegans sono stati trattati come descritto in Figura 1 (barra della scala = 1 mm). Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Numero totale di uova di cui da c. elegans trattati con etoposide. Età-sincronizzato elegans del c. le uova sono state incubate su piastre NGM contenenti DMSO (1%, il controllo del veicolo) o l'etoposide (750 µM) per 64 h. Successivamente, il numero totale di uova deposte è stato osservato in assenza (A) o presenza (B) di continuo trattamento chimico per 5 giorni. Vermi sono stati trasferiti tutti i giorni per la normale piastra NGM (A), o piastra NGM completati con gli stessi prodotti chimici: 1% DMSO o etoposide (750 µM) (B). Il numero di uova deposte è stato contato e diviso per il numero totale di vermi ogni giorno per calcolare il numero di uova deposte a vite senza fine. Tutti i numeri di uova a vite senza fine sono stati sommati per 5 giorni. I dati sono espressi come media ± SD da esperimenti quadruplicate. p < 0,01, per differenze significative tra il trattamento di controllo ed etoposide di veicolo. L'analisi statistica è stata effettuata usando dello studente t-test. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
| Agarizzati di normale NGM – 1.000 mL per la manutenzione e l'analisi senza trattamento chimico continuo la deposizione delle uova |
| 1. aggiungere 2,5 g di peptone, 3 g di NaCl, 17 g di agar e 975 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro. |
| 2. sterilizzare in autoclave per 15 min a 121 ° C. |
| 3. raffreddare in un bagno di acqua a 55 ° C per 30 minuti e quindi aggiungere 1 mL di 1 M CaCl2, 1 mL di colesterolo 5 mg/mL (disciolto in etanolo), 1 mL di 1 M MgSO4, 25 mL di KPO4. |
| 4. mescolare con agitazione magnetica e poi aliquota in capsule di Petri (piatti 90 x 15 mm per la manutenzione; piatti2 35 x 10 mm per il dosaggio di deposizione delle uova). |
| 5. conservare le piastre NGM a 4 ° C fino all'utilizzo. |
| Media DYT per la coltivazione di Escherichia coli OP50 – 500 mL |
| 1. Aggiungi Estratto di 2,5 g di NaCl, 5 g di lievito, 8 g di peptone, e 485 mL di acqua distillata in un matraccio di Erlenmeyer. |
| 2. sterilizzare in autoclave per 15 min a 121 ° C. |
| 3. raffreddare e conservare a temperatura ambiente fino all'utilizzo. |
| S-tampone – 1.000 mL |
| 1. aggiungere 5,85 g di NaCl, 6 g di KH2PO4, 1g di K2HPO4e 987 mL di acqua distillata in una bottiglia di vetro. |
| 2. regolare il pH della soluzione a 6.0. |
| 3. autoclave per 15 min a 121 ° C. |
| 4. raffreddare e conservare a temperatura ambiente fino all'utilizzo. |
Tabella 1: Ricette della cultura crescita media e buffer.
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Discussion
In questo articolo, descriviamo la valutazione della tossicità delle sostanze chimiche in c. elegans, un nematode del terreno, utilizzando etoposide come un esempio di tossico. Per questo scopo, abbiamo utilizzato due condizioni sperimentali. Nel primo set, c. elegans sono state coltivate su etoposide contenente tavole dalle uova alla fase adulta giovane, e quindi i vermi sono stati ammessi a deporre le uova sulle piastre di NGM normale senza prodotti chimici. Nel secondo set sperimentali, c. elegans continuamente sono stati trattati con etoposide durante il periodo intero sperimentale. Tramite il confronto dei numeri uovo tra le due condizioni sperimentali, possiamo decidere se la tossicità riproduttiva dei composti testati era reversibile o irreversibile. Etoposide ha fatto diminuire significativamente il numero totale di uova deposte in entrambe le circostanze sperimentali (Figura 3). Questi dati implicita che il pretrattamento di etoposide durante i primi stadi di crescita era sufficiente per indurre il danno degli organi riproduttivi, tra cui germe di gonade cellule6; Basato su questi dati, potremmo Speculiamo che il trattamento di etoposide irreversibilmente ha indotto tossicità riproduttiva in c. elegans.
Oltre a c. elegans esperimenti descritti in questo articolo di metodo, altre tossicità test come la durata del test14,15, osservazione microscopica della gonade cellule germinali6,17, misurazione del tasso di pompaggio pharyngeal e movimento analisi18,19 può essere utilizzato anche per la valutazione della tossicità chimica in c. elegans. In vitro in coltura di linee cellulari umane, cellule primarie, cellule staminali e cultura sferoide 3D sono altre opzioni possibili per valutare la tossicità di vari prodotti chimici per aumentare il limite di c. elegans esperimenti1, 6,20,21.
Anche se c'è conservazione evolutiva di geni essenziali in c. elegans, l'organismo non mammiferi è differente dagli esseri umani in termini di sequenze proteiche, il digestivo e sistemi intestinale, metabolismo, nonché esso manca di molti geni. Pertanto, mammiferi gli esperimenti sugli animali e test clinici sono necessari per la completa valutazione della tossicità delle sostanze chimiche. Tuttavia, considerando i vantaggi della convenienza e questioni etiche degli animali, una piattaforma di test di tossicità di c. elegans sarà una soluzione utile e pratica per la valutazione tossicologica di vari prodotti chimici.
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Disclosures
Gli autori non hanno nulla a rivelare.
Acknowledgments
Questo studio è stato sostenuto dall'assegno di ricerca intramurale Korea Institute of Science e Technology (2E27513) e l'alta sul valore aggiunto cibo tecnologia sviluppo programma (IPET) finanziato il Ministry of Agriculture, Food and Rural Affairs (315067-03).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
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