Summary
モデル動物、線虫、化学物質の毒性を評価する基本的なプロトコルを説明します。メソッドは、便利で様々 な環境汚染物質のリスク評価については医薬品の開発に有用です。
Abstract
毒性評価は、基礎・応用生物科学の分野で生きている有機体の化学物質の影響を理解するために重要です。ラウンド非哺乳類土壌線虫ワームはその利便性と哺乳類動物システムに比べ動物倫理の欠如のための毒物学の貴重なモデル生物です。このプロトコルでは、線虫で化学物質の毒性評価の詳細な手順を説明します。臨床抗癌性の薬剤は、ヒトのトポイソメラーゼ II を対象とし、ひと癌細胞の DNA 複製を阻害する、エトポシドは、化学のテスト モデルとして選ばれました。年齢同期線虫卵がジメチルスルホキシド (DMSO) やエトポシドにさらされた、線虫の成長は毎日 4 日間によって監視ステレオ顕微鏡観察。卵の総数はc. の elegans DMSO 処理からレイアウトやエトポシドは実体顕微鏡を使用しても数えられました。エトポシド治療には、成長と再生、C. elegansの著しい影響を受けます。ちなみにワームから化学物質の別の治療期間と卵の総数のことが判断できる可逆か不可逆的なc. の elegans再現における化学物質の生殖毒性であります。これらのプロトコルは両方様々 な薬の開発と環境有害物質のリスク評価のために有用かもしれない。
Introduction
毒性学的評価は、医薬品、栄養補助食品、機能性化粧品の開発だけでなく、様々 な環境汚染物質のリスク評価に不可欠です。齧歯動物モデルであるこの毒性試験用実験システム生体内で最も人気のあります。また、線虫などの非哺乳類生物も広く使われています。非哺乳類の毒性評価モデルは動物の倫理的な問題だけでなく、その利便性と経済性、保守性、速度、および再現性1,2 を考慮した有用性のため有益です。 ,3,4。
線虫 c. エレガンス、土ワーム、ラウンドが様々 な基礎・応用生物学と化学の研究ではモデル動物として悪用されています。それは長さ 1 mm、透明の線虫の固体または液体線虫成長メディア (NGM)エシェリヒア属大腸菌OP50 細菌のひずみうんざりを単に維持されています。線虫が短いライフ サイクルと野生型の N2 の線虫は、約 300 の卵を産みます。そこで、実験材料3,4,5として使用する簡単に伝達されます。また、線虫は、多くの薬物や環境汚染物質6,7,8,9の毒性学的研究で広く使用されています。
多くの抗がん剤は、がん細胞が急速に分裂をターゲットとするため、急速に骨髄、消化管上皮、毛包細胞などの正常の細胞分裂にも被害が。たとえば、トポイソメラーゼ阻害抗がん剤ターゲット癌細胞の DNA 複製過程したがって、彼らはまた、急速に通常の細胞分裂を阻害します。すべての生きている有機体では、topoisomerases、これらトポイソメラーゼ阻害剤ほとんど影響環境生態系6,10,11をご利用あり。したがって、モデル動物を用いた薬物毒性評価プラットフォームは、貴重な医薬品の開発に環境リスク評価です。
この記事で私たちは線虫モデルの有毒化学物質としてそのターゲット トポイソメラーゼ II、臨床抗悪性腫瘍剤であるエトポシドの毒性をテストする詳細なプロトコルを説明します。このため、体の大きさと線虫エトポシドで治療中に産んだ卵の合計数の測定法について述べる.
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Protocol
注: 全体の実験は 20 ° c 低発塵、ワーム、バクテリア処理時の汚染の最小化と維持きれいな分離研究室で行う必要があります。この目的のため、アルコール ランプやクリーン ベンチを使用しての炎の下で実験を行う必要があります
。1 線虫 の卵化学テストに備えてメンテナンス
- 維持 線虫 N2 (とブリストル) 20 ° C でうんざり NGM 寒天プレート ライブ エシェリヒア属大腸菌 OP50 12。 , 13.
- 準備時代同期の卵のいずれかを使用して漂白ソリューション治療 5 または時間卵産卵法 6 , 14 , 15
。 注: 前に卵の準備、エトポシド含む NGM プレートの熱不活化下記のとおり エシェリヒア属大腸菌 OP50 コート。熱不活性 大腸菌 OP50 大腸菌 6 , 16 の代謝活動を最小限に抑えるために使用します 。
2。熱不活性 大腸菌 の作製フィード OP50 C. elegans 毒性試験中に
- は表 1 で説明したようにダブル酵母トリプトン (DYT) 媒体の 500 mL を準備し、上で培養した 大腸菌 OP50 単一コロニーを接種します。ルリア ベルターニカミラ (LB) 寒天プレート 5 。
- インキュベート 14 h は、37 ° C、150 rpm の振動インキュベーターの エシェリヒア属大腸菌 OP50 。
- 3,220 × g と 20 ° C で 30 分間遠心分離後すべて培養上清中の DYT 媒体を削除し、25 ml S バッファー、1 M MgSO 4 の 250 μ L および 5 mg/mL コレステロール (エタノールに溶解) を 25 μ l 添加前の混合物を追加。すべてのこれらのソリューションは滅菌します 。
- 細菌を再懸濁します、50 mL の使い捨て可能なプラスチック製のチューブにそれらを転送します 。
- 、再懸濁に孵化させなさい熱不活化、65 で 30 分間水浴の エシェリヒア属大腸菌 OP50 ° C
- クールな部屋の温度と使用するまで 4 ° c の店に。これまで 1 ヶ月保存できます 。
3。NGM プレートを含むいずれかの 1 %dmso や 750 μ M の準備エトポシド
- 準備 2 きれいな 200 mL ガラス瓶。1 つのボトルに, 塩化ナトリウム 0.6 g、ペプトン、マグネチックスターラーと 195 mL の蒸留水、寒天、3.4 g の 0.5 g を追加します。他の空ボトルに磁性攪拌器を追加します 。
- 121 ° C、55、30 分クールダウン水浴中にボトルで 15 分間オートクレーブこれら 2 つボトル ° C
- 1 M CaCl 2 の 0.2 mL、5 mg/mL コレステロールの 0.2 mL、1 M MgSO 4、0.2 mL、1 M KPO 4 (すべてのこれらのソリューションは、滅菌) 5 mL を追加し、55 でホット プレート上の磁気攪拌によるそれらをミックス ° C
- は、混合 NGM 媒体を同じボリューム (100 mL) を 2 本に分割します。次に、1 つのボトルに 1 mL の DMSO を追加、再び磁気攪拌を使用してそれをミックスします。次のステップまでの 55 ° C の水浴中他のボトルを格納します。各 35 x 10 mm 2 シャーレに DMSO 含有培地の分注 3 mL。このステップから約 33 DMSO 含有 NGM プレートを行うことができます 。
- 磁気攪拌を使用して他のボトルをミックス、エトポシド 75 mM (ストック DMSO に溶解) の 1 つの mL を追加、もう一度、ミックス、分注の手順 (手順 3.4)。約 33 エトポシド (750 μ M)-この手順で NGM プレートを含む可能です
。 注: 相関以前紙 6、我々 はテスト 0、250、500、およびエトポシドの 1,000 μ M。そのデータに基づいて、我々 は本稿でエトポシド投与量の 750 μ M を選んだ 。
- クール NGM プレートは化学を含む部屋の温度の下で約 3 時間、室温でそれらを残して、使用するまで 4 ° C で保存します
。 注: 光に敏感な化学物質の場合光誘起分解を最小限に抑えるための光をブロックします
。 メモ: 必要に応じて、アッセイは、以下のように 2 つの異なる化学治療条件を使用して実行することができますに産卵のため化学物質がなければ通常 NGM プレートをください 。
- 追加 100 μ L の (セクション 2) として熱不活化 エシェリヒア属大腸菌 OP50、NGM の各板に普及します。化学試験の 20 ° C に c. の elegans のインキュベーターで一晩乾燥できるように
4。線虫 c. エレガンス の成長の測定
- 750 μ M エトポシドまたは 1 %dmso を添加した NGM プレートに転送時代同期の 線虫 卵します 。
- 4 日間の 20 ° c の定温器で加温 線虫。実体顕微鏡を用いたワームを観察し、顕微鏡画像を毎日取る。通常 20 倍の倍率 (1 X 対物レンズ、2 倍のズーム倍率 10 X 接眼レンズ レンズ) は c. の elegans の成長観察に適しています。またワームのサイズ校正用顕微鏡ステージ マイクロメータの顕微鏡像を取る
。 注: 飢餓毒性試験に影響します。したがって、十分な細菌をフィード転送 線虫 を調整したり先頭で番号の卵します。飢餓の可能性を除外する 3 日まで観察します 。
- DMSO や ImageJ ソフトウェアを使用して各時点でエトポシドで治療の c. の elegans の体長を測定します
。 注: 各サンプル測定 50 ワームは統計分析のために十分な。- ImageJ では、顕微鏡ステージ マイクロメータのイメージを開く (' ファイル ' → ' を開く ').
メモ: マイクロメータのイメージとワーム イメージ (ステップ 4.2) は、同じ倍率である必要があります 。
- を使用してマイクロメータ校正画像を 1,000 μ m のラインをドラッグ ' 直線 ' ツール 。
- クリック ' 分析 ' → ' 縮尺の設定 ' 入力 1,000 μ m におよび、' 距離を知られている ' ボックスと ' 長さの単位 '] ボックスに、それぞれ。チェック ' グローバル ' クリック ' OK '.
- がワームの画像を開く (' ファイル ' → ' オープン ')。使用して、各ワームの特徴に沿って線を引く ' フリーハンド ' ツール。クリックして本体長さデータを取得 ' 分析 ' → ' メジャー '.
- 50 ワームのこの手順を繰り返します 。
- ImageJ では、顕微鏡ステージ マイクロメータのイメージを開く (' ファイル ' → ' を開く ').
5。線虫 卵産卵アッセイ
、NGM- 歳同期加温卵プレート含む DMSO または 64 h エトポシド (初産) の前に 20 の若い大人の段階まで ° c.
注: それは成長測定実験からワームを使用するオプションです。成長の測定を行うし、卵産卵アッセイの一緒にすると便利です 。
無農薬 (条件 1、化学処置の若い大人の段階に卵からの時間の一定期間内) - 新しい NGM に転送 5 成虫プレートまたは同じ化学的前処理 (条件 2、連続投与を含む新しい NGM プレート全体的に実験期間を通して化学物質)、し、それらをインキュベートして 24 時間
それぞれの治療のため 3-5 NGM プレートを使用してレプリケートする勧めします注意。統計分析のためこれらの複製を使用できます 。
- は、前述のように、新しい NGM プレートに転送し、毎日卵の数をカウントします。逃げ出した、死亡した、内部的にハッチしていました、ワームをカウントします。編
- ワームは、通常 5 日間で、ない卵を産むまでこれらの手順を繰り返します 。
- 各板からワームあたりの産卵数を計算し、毎日卵の総数を決定する 5 日間のこれらの値を合計します
。 注: 除外クロール ワームの数そして内部的に計算から孵化します 。
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Representative Results
エトポシド (24-96 h) の治療は大幅線虫 c. エレガンスの成長を遅らせた。1.04 mm (図 1) に成長した車両処理ワーム培養 96 時間後エトポシド ワームは 0.86 mm 本体長さに増加。発育不良もどうやら、ステレオ顕微鏡観察 (図 2) の下で観察されました。72 時間で車両扱いワームからの卵を目にしました。その一方で、エトポシド療法の 96 時間後卵が観察されました。これらのデータから私達はc. の elegansの最初の出生時間をエトポシド治療に遅れると推測。
産卵の遅延に加えてエトポシド治療では、ワーム (図 3) 当りの産卵数が減少。若い成虫の有無 (図 3 b) 連続エトポシド治療の有無 (図 3 a) で培養した頃、生殖毒性、エトポシド処理による総卵数の減少が観察されました。両方の実験条件下でワームを制御処理間に有意差はありませんでした。一定期間の治療を (若い大人の段階に卵) からワームから卵の総数は、エトポシド投与ワームの著しく異なるでした。この比較のため一方向の分散分析 (ANOVA) 続いてテューキーの多重比較検定で統計解析を行った.
図 1: c. の elegansの成長の測定処理エトポシド。線虫 c. エレガンスの時代に同期した DMSO (車両制御、1%) を添加した NGM プレートに卵が育ったやエトポシド (750 μ M) 24-96 h. 顕微鏡写真 (図 2に示すように) は、毎日、撮影されたボディの長さを測定しました。ImageJ ソフトウェア。データは、平均 ± 標準偏差 (SD) として表現される (n = 50、1 グループあたり 50 ワーム)。p < 0.01、各時点での車両コントロールとエトポシド治療の間に大きな違い。学生のtを使用して統計分析を行った-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: c. の elegansのステレオ顕微鏡画像処理エトポシド。図 1に示すようにc. の elegansが扱われた (スケールバー = 1 mm)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: c. の elegansエトポシドで治療からレイアウトする卵の合計数。線虫 c. エレガンスの時代に同期した DMSO (1%、車両制御) を含む NGM プレート培養卵または 64 h のエトポシド (750 μ M)。次に、総産卵数は、(A) (B) の有無の 5 日間連続化学処理で観察されました。ワームは、通常 NGM プレート (A)、または同じ化学物質を添加した NGM 板に毎日を移された: 1 %dmso やエトポシド (750 μ M) (B)。産卵数はカウントされ、ワームあたり産卵数計算する毎日ワームの合計数で割った値します。ワーム当たりの卵数は 5 日間の加算されました。データは, 実験から平均 ± SD として表されます。p < 0.01、車両コントロールとエトポシドの治療の間に大きな違い。学生のtを使用して統計分析を行った-テストします。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 通常 NGM 寒天-メンテナンス、および産卵連続化学処理なしの試金のための 1,000 mL |
| 1. ガラスの瓶にペプトンの 2.5 g、塩化ナトリウム 3 g、17 g の寒天、975 mL の蒸留水を追加します。 |
| 2. 121 ° C で 15 分間オートクレーブ |
| 3. 55 ° C で 30 分間湯せんでクールダウンし、1 M CaCl2の 1 mL、(エタノールに溶解) 5 mg/mL コレステロールの 1 mL、1 mL 1 M MgSO4、KPO4の 25 の mL を追加します。 |
| 4. ペトリ皿 (維持のため 90 × 15 mm 料理; 35 x 10 mm2皿で産卵の試金) に電磁攪拌し因数と混ぜます。 |
| 5. 使用するまで 4 ° C、NGM プレートを格納します。 |
| エシェリヒア属大腸菌OP50-500 mL の耕作のための DYT メディア |
| 1. 2.5 g, 塩化ナトリウム 5 g 酵母のエキス、ペプトン、の 8 g と 485 mL 三角フラスコに蒸留水を追加します。 |
| 2. 121 ° C で 15 分間オートクレーブ |
| 3. クールダウンし、使用するまで常温で保存します。 |
| S バッファー-1,000 mL |
| 1. ガラス瓶の中に塩化ナトリウム 5.85 g、KH2PO4の 6 g、K2HPO4の 1 g と 987 mL の蒸留水を追加します。 |
| 2. 6.0 に溶液の pH を調整します。 |
| 3. 121 ° C で 15 分間オートクレーブ |
| 4. クールダウンし、使用するまで常温で保存します。 |
表 1: 培養の成長媒体およびバッファーのレシピ。
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Discussion
この記事ではc. の elegans、土壌線虫毒性物質の例としてエトポシドの使用中の化学物質の毒性評価をについて説明します。このため、2 つの実験条件を使用しました。最初のセットで線虫若い大人の段階に卵からプレートを含むエトポシドで栽培し、ワームは、化学物質なしの通常 NGM プレートに卵を産むを許されました。2 番目の実験セットにc. の elegansは全実験期間を通じてエトポシドと継続的に扱われました。比較する 2 つの実験条件の間卵数テスト化合物の生殖毒性が可逆か不可逆かどうかを判断できます。エトポシド (図 3) の両方の実験条件下での卵の総数が減少します。これらのデータ暗示、エトポシドの初期成長段階での前処理は生殖器官への損傷を誘発する十分ななどの生殖腺胚細胞6;これらのデータに基づいて、我々 はエトポシド治療を線虫で生殖毒性不可逆的誘発したこと推測するかもしれません。
メソッドこの資料に記載されている線虫実験、に加えて他の毒性テスト寿命測定14,15, 生殖腺胚細胞6,17、顕微鏡観察など線虫における化学的毒性評価のための測定咽頭の排気速度と運動解析18,19を使用もできます。3 D 回転楕円体文化幹細胞、初代培養細胞の in vitro培養ひと細胞は、様々 な化学物質の毒性を評価するための他の可能なオプションは、線虫実験1の制限を強化 6,20,21。
線虫の必須遺伝子の進化的保全が、哺乳類以外の生物がタンパク質配列の点で人間とは異なる、消化器および腸システム、代謝、それと同様に多くの遺伝子が不足しています。したがって、化学物質の毒性の完全な評価のため、哺乳類の動物実験および臨床試験が必要です。ただし、利便性と動物の倫理的な問題の利点を考慮してプラットフォームのテスト線虫毒性は様々 な化学物質の毒性評価のための有用かつ実用的なソリューションになります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
本研究は、韓国科学技術研究所の学内研究助成 (2E27513) と、高付加価値食品技術開発プログラム (IPET) 省の農業、食糧および田園出来事 (315067-03) によって資金を供給によって支持されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Agar | Affymetrix, USA | 10906 | |
| Caenorhabditis elegans N2 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | Wild type | |
| Cholesterol | Sigma, USA | C3045 | |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma, USA | D2650 | |
| Escherichia coli OP50 | Caenorhabditis Genetics Center (CGC) | ||
| Etoposide | Sigma, USA | E1383 | |
| Image J software (ver 1.4) | Natinoal Institute of Health, USA | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
| Microscope camera | Jenopitk, Progress Gryphax, Germany | ||
| Peptone | Merck, USA | 107213 | |
| 35 × 10 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10035 | |
| 90 × 15 mm Petri dish | SPL Life Sciences, South Korea | 10090 | |
| Stereo microscope | Nikon, Japan | SMZ800N | |
| Yeast extract | Becton Dickinson, USA | 212750 |
References
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