Summary
我々 は、慢性シリコン プローブをインプラントしてキュー濃縮トレッドミル装置の実行の頭固定されているマウスの場所細胞を記録するための多様な手順を説明します。
Abstract
脳の機能を理解するための重要な前提条件は挙動の同定と細胞活性の相関します。シリコン プローブ、神経活動の大規模な電気生理学的記録用電極を高度な彼らの慢性的な注入の手順がまだ未発達。環境で動物の位置に関連付ける海馬場所細胞の活動が知られているが、根本的なメカニズムはまだ明確ではないです。場所細胞を調べるためには、ここで我々 は慢性的なシリコン プローブのデバイスの作製からキュー濃縮トレッドミル装置の場所フィールド活動の監視にインプラント技術のセットをについて説明します。マイクロ ドライブと帽子は、フィッティングとプラスチック部品の 3 D プリントを一緒に固定して構築されます。シリコン プローブ マイクロ ドライブにマウントされているが、洗浄、染料でコーティングします。最初手術を実行して、マウス頭蓋の帽子を修正します。目印を作製し、トレッドミルのベルトに接続されています。頭固定を実行するマウスを訓練トレッドミルで。2 番目の手術が次のブロード バンド電気生理学的信号を記録、海馬におけるシリコン プローブをインプラントに実行されます。最後に、シリコン プローブを回収し、再利用のためきれいです。トレッドミルの場所細胞の活動の分析では、アプローチのメリットをまとめた場所フィールド メカニズムの多様性を明らかにします。
Introduction
シリコン プローブの電気生理学的記録、彼らは組織の損傷や彼らが密集サイト1、録音の正確なレイアウトを提示する最小限に抑えるシャープなプロファイル設計されているという事実を含むいくつかの利点を提示します。 2,3,4。種、人間3,5,6、多様なアプローチ1,7を含む様々 なシステムの研究に使用されます。まだの反復使用は、コスト、脆弱性、および慢性的な実験のための便利なメソッドが8を欠けている事実のためまだ比較的限られています。3 D 印刷技術の最近の進歩は、これらのデリケートな電極の取り扱いを簡単にできるようにヘッド プレート マイクロ ドライブなどのデバイスのカスタム設計に可能にしました。最初のステップで構築し、慢性的なシリコン プローブ14術の開発したツールのセットを使用する方法を説明します。
場所細胞は通常、迷路の実行している自由に動く動物を用いて調べた、間最近彼らも調べた仮想環境15とトレッドミル apparatii9 (図 1 a)。これらの実験方法は、動物の頭-拘束可能、optrode9,10、11パッチ ・ クランプの16、2 光子励起顕微鏡15の活用利点を提供します。動物の行動と環境手がかりの12の拡張コントロールを提供することに加えて、簡単テクニック。2 番目のステップでは、マウスをトレーニングとトレッドミル装置の場所細胞の活動を記録の手順を紹介します。
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Protocol
説明のすべてのメソッドは、動物愛護と韓国科学技術研究所の使用委員会によって承認されている
。1 マイクロ ドライブと電極の準備
- マイクロ ドライブを組立。。
- マイクロ ドライブ (スライダー、ボディ、およびシェル) の部分は印刷 14 高解像度 3 D プリンターを使用しています。部品には欠陥がない確認します 。
- マイクロ ドライブ本体にネジ (000-120 x 1/4 サイズ) でスライダーを修正します 。
- ナットをはんだ付け (000-120 000-120/64 16 進サイズ) ネジの先端にします 。
- ネジを時計回りにスライダーを上または下に移動する反時計回りに回転します 。
- (000-120 x 1/4 サイズ) ネジで本体にシェルを修正します 。
- マイクロ ドライブにプローブを取り付けします。
- 双眼顕微鏡の下の水平方向の位置にマイクロ ドライブを修正します 。
- では、ゴム製の詰め物とフラットのワニ口クリップを使用して、慎重にピンセットで出荷のエンクロージャからプローブを切り離すにシリコン プローブのフレックス ケーブルをつかみます。マニピュレーターにワニ口クリップを修正します 。
- の動きの方向に平行マイクロ ドライブ スライダーのシリコン プローブを置く、マニピュレーターを使用しています 。
- は、歯科用セメントの滴を適用 (室温硬化アクリル歯科修復材料) スライダーにプローブを修正します。それがシフトしている場合は、プローブの位置を修正します。それは治療の非常に高速と電極の位置を再調整するが難しく、接着剤はお勧めできません 。
- 歯科用セメントと C ホルダー (コネクタ ホルダー) へのプローブのコネクタを修正します 。
- クリーニングとプローブに染料を入れてします。
- 修正マイクロ ドライブ/プローブ プローブ洗浄装置の群集。小さな発泡スポンジ (非滅菌綿棒) を回転 2 デバイスが備わっています。ギャップ調整はマニピュレーター 。
- 洗剤とスポンジを浸して 。
- は、穏やかなタッチをできるように、スポンジの間ゆっくりプローブを上下に移動します。顕微鏡下でクリーニング プロセスを監視します 。
- は、蒸留水でプローブをすすいでください。アルコールで殺菌のためのプローブを浸漬します 。
- 適用 Dil (脂溶性色素)、プローブのシャンクスの背中に泡綿棒を使用します。これは後の段階で脳のシャンク位置の可視化を許可します 。
- 帽子を組み立てる
- (ヘッド プレート、コネクタ ホルダーとキャップ) の帽子の部分は印刷 14 3 D プリンターを使用します。密封されたエンクロージャを形成する 3 つの部分が一緒に収まるです 。
- ヘッド プレートと歯科用セメントと接着剤で修正のスロット ナッツ (M2 と 00-90 00-約/4 サイズ) を挿入します 。
- キャップのスロットに洗濯機を挿入して、歯科用セメントで固定します 。
2。帽子の頭蓋骨固定用手術
手術に使用されるすべてのツールは、オートクレーブに入れることによってあらかじめ滅菌されています。乾熱ビーズ デバイスを使用 forto 滅菌が汚れて、手術中に滅菌する必要がありますツール
。- は、麻酔の開始のための 4% にイソフルランのレベルを設定します。5 分間麻酔チャンバーにマウスを入れて
- 脳定位固定装置でマウスをインストールします 。
- は、1.5-2% にイソフルラン レベルを減らします。動物状態、呼吸数、に応じて手術中にレベルを調整し、体の温度 20 。
- 目に眼軟膏を適用します 。
- 頭皮を剃る清潔消毒剤 (iodopovidone) の動物の頭に。手術のすべての手順で無菌状態を維持します 。
- 頭皮下注射ブピバカイン (1 mg/kg)。カットし、その端の頭蓋骨を公開する高級はさみを使用してマウスの頭の頭頂部の皮膚の一部を削除します。きれいにし、手術中に出血を制御する生理食塩水と止血スポンジを使用します 。
- 骨膜スクレーパー ツールを使用してを削除します 。
- スカル 21 参照点を見つける: 前、ラムダ、冠状断、矢状縫合。頭を調整 ' 前とラムダ点は同じ高さで、その矢状軸角度の s.
- は、参照と地上の電極の頭蓋骨の 2 つの穴 (~0.5 mm 径) をドリルします。ラムダの尾 1 mm と 1 mm の穴を約する必要があります 。
- 地面と参照電極 (サイズ 000-120 000-120/16 ミニチュア ステンレス鋼ねじピン コネクタに線結合) を挿入します 。
- 適用紫外線 (UV) 頭蓋の象牙質の活性剤を接合し UV ライト 45 60 s. を適用
- は、頭蓋骨の端に歯科用セメントの層を適用します。肌とマウスの毛にセメントを感染を避けるためです 。
- は固定装置用マニピュレーターにヘッド プレートを修正し、頭蓋骨の上に配置します。ゆっくりヘッド プレートを下げるまでには若干、頭蓋骨を触れるし、頭蓋骨との接合部で歯科用セメントを適用します。15 分のための歯科用セメント治療をしましょう
- は、麻酔を削除します。コネクタ ホルダーとキャップ ヘッド プレートを固定します。Ketaprofen の皮下注射を与えた後、檻の中でマウスを置く 5 mg/カット
- は、ketaprofen の皮下注射を与える 2 つの次の日、痛みの兆候を慎重にモニターの 5 mg/kg。マウスは通常 20-40 分以内麻酔から目覚めます。帽子インプラントは比較的光 (3.34 g)、マウス、ホーム ケージの端に自分の頭を持ち上げ、迷路で実行、登るにトラブルのないような 。
3。行動トレーニング
- 後 7 日の手術後の回復期間は、1 日あたり 1 mL の水の制限を開始します 。 トレッドミル ベルトをするため
- はベルベットの生地 (1-2 m で 5 cm) の部分をカットし、ホット接着剤を使用して小物を修正します。マウスの動きを妨害しないためにベルトの端に建てられたオブジェクトをアタッチします 。
- 2 つの端を一緒に縫合してトレッドミルの車輪でベルトを修正します 。
- 頭固定プレートのスロットにヘッド プレートの 2 本のネジを差し込んで締めて、トレッドミルで頭固定マウスをインストールします 。
- 頭拘束水の報酬のためのトレッドミル上で実行するマウスのトレーニング開始。なめるポートを介して水報酬を提供します。当初は、1 日 3 回、10 分間トレッドミル上にマウスを置く 。
- マウスの頭固定するために使用を取得します (~ 3 日) 後で通常ベルトを移動を開始すると増加、トレーニング期間の 30 分。2 〜 3 週間後いくつかのマウスは 30 分 (ベルトの完全な回転をする試み) で 100 以上の試験を実行します 。
- 記録実験のための最高の行動パフォーマンスを示すマウスを選択します 。
4。シリコン プローブの注入
- 麻酔下マウスを配置します 。
- は、ヘッド プレートを固定することによって、脳定位固定装置にマウスをインストールします。生理食塩水で頭蓋骨の表面をきれいにします 。
- 脳定位固定装置のマーカーを見つける: 前、ラムダ、冠状断、矢状縫合。挿入の点までの距離を測定し、それをマーク
- は、薄いと透明になるまで慎重に骨をドリルします。湿らせ、生理食塩水できれいに掘削中です 。
- は、間伐の骨と精密力を用いた硬膜問題を慎重に取り外しますps のすべての時間を生理食塩水で濡れている脳の表面を維持します 。
- は、固定装置用のマニピュレーター、マイクロ ドライブ/シリコン プローブ群集を修正します。シリコン プローブ、開頭のすぐ上をもたらします。ヘッド プレートにシリコン プローブ コネクタ ホルダーのネジします 。
- では、録音アンプと接地/基準電極を接続します。電磁ノイズの影響から保護するためにアルミ箔でマウスをシールドします。脳の電気的活動を監視する記録システムを起動します 。
- は、マニピュレーターを使用して脳にシリコン プローブをゆっくりと挿入します。電気信号、マニピュレーターの旅の距離、およびプローブのシャンクスを継続的にチェック (彼らは、脳の貫通を確認してください)。ユニットの活動は、下にある白質は比較的サイレント皮質に表示されます。ユニットの活動には、シャンクの海馬の錐体層に触れるときが再び表示されます。この時点から、シリコン プローブ 200 μ m を撤回 (錐体層にシャンクを戻すためにマイクロ ドライブを次の日使用).
- 骨ワックスと鉱物油の混合物で、脳の表面を覆うです 。
- は、歯科用セメントを使用してヘッド プレートにマイクロ ドライブを修正します。15 分のための歯科用セメント治療をしましょう。固定装置用のマニピュレーターからマイクロ ドライブを切断し、キャップをつける 。
- は、そのケージに戻ってにマウスを置くし、ketaprofen の皮下注射 5 mg/kg。痛みの兆候を確認します。この手術は、最初の 1 つよりもはるかに少ない侵襲とマウスが 45 分以内通常アクティブ後彼らが麻酔からウェイク アップ。ただし、マウス シリコン プローブが脳内を安定させる必要があると、全体の 1 日を回復することです 。
5。記録
- インストール マウス ヘッド固定トレッドミルで。帽子時価ベースの株主を削除
- 録音アンプを接続し、録音を開始します 。
- 海馬の錐体層にシリコン プローブを移動するマイクロ ドライブを使用して、最初の日に。ネジの反時計回りにターンごとにシャンクス 200 μ m より深い移動します。ゆっくりとすねの位置を調整 (20 ~ 50 μ m ずつ) リップル振動 13 とユニット活動が表示されるまで 。
- 次の日にシャンク位置を調整、ベルトの上にマウスが実行されている間に海馬の活動を記録する前に ~ 1 h を待ちます。数日間の良好な記録信号品質を維持するためにハード オブジェクトを削除し、マウスから天井を低 ' ハード面にバンプを帽子チャンスを最小限に抑えるため s ケージ 。
6。プローブを回復する
- 麻酔下マウスを配置します 。
- は、ヘッド プレートを固定することによって、脳定位固定装置にマウスをインストールします。帽子時価ベースの株主を削除
- は、マイクロ ドライブの真上固定装置用のマニピュレーターをもたらします。マニピュレーターにマイクロ ドライブを修正します。ヘッド プレートからコネクタ ホルダーを外します。シェルとマイクロ ドライブの本体を接続するネジを削除します 。
- の背後にあるシェル部分を残して固定装置用のマニピュレーターを持つマイクロ ドライブ/シリコン プローブ群集をゆっくり引き上げて双眼顕微鏡監修します 。
- 洗浄装置とシリコン プローブをきれいします 。
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Representative Results
マウスは最初キュー (図 1) に欠けている 2 メートルの長いベルト上で、訓練されました。次の電極注入、同じ長さの新しいベルトが、キューの 3 つのペアを提示は、呈示空間表現12,14を生成するために、トレッドミルにインストールされました。広帯域信号が 250 チャンネル録音システム (アンプ基板上の USB インタ フェース ボードとカスタムメイドの Labview インタ フェース) と 2 つのシリコン プローブ (図 1 a、4 シャンク シャンクあたり 8 サイト) 注入を使用して、30,000 Hz のサンプリング レートで録音されました。CA1、CA3 (図 1 b)。ユニットは、高域通過フィルター処理された信号にしきい値関数を用いて検出された (0.8 5 kHz)。並べ替え方法15,16,17半自動のスパイクを使用してセルの分離を行った。トレッドミルの前方/後方への動きが LED を使用して監視して録音システムの入力チャンネルをデジタルで記録フォト センサー カップルします。
148±35 セル (mean±s.e.m) の平均値は、セッションごとに、その中で 38.4±3.5% を示した明確な場所フィールド活動 (図 2) で分離できること。場所フィールドは (図 2 a) を記録するまたはキュー ベルト (図 2 b 図 2) への暴露の数日後の最初の日いずれかでの多くの試験の間で比較的安定していた。空間的な表現の種類が識別できる可能性があります。いくつかのセルは他のセルを示したユニークな場所フィールド (図 2)12(図 2 a)、キューの id を関連付けるフィールドを繰り返し配置を示した。したがって、我々 数日間海馬場所細胞を記録し、場所フィールド機構、メカニズムと空間ナビゲーション、学習、およびメモリに関連するダイナミクスを研究するための 2 つの重要な必需品の多様性を識別します。
図 1: シリコン プローブ及びトレッドミル装置。(A) シリコン プローブのシャンクとサイトのレイアウト。(B) 注入サイト。(C) トレッドミル装置とベルトにおける手がかりのレイアウト。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 場所細胞の慢性記録します。(A) 色分け場所フィールド (top) の表現、スパイク自動コレログラム (左下)、セルの例は 1 日目の記録波形 (右下) をスパイクします。(B ・ C)(A) セルの例の場合と同様は日 3 (B) と (C) 5 の日に記録されました。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
神経の慢性的な録音は海馬場所フィールドなど神経プロセスを理解することにとって重要です。慢性的なシリコン プローブ implantantation を実行へのアプローチがで電極パッケージを回復する比較的簡単だという事実によって他の方法7,18,19,20から自分自身を区別します。実験終了。場所細胞が通常自由に移動で勉強している間トレッドミル装置条件は実験デザインとデータ解析にのみ大幅簡素化、ことができます中に最小限のコンテキストでフィールド メカニズムを精査する研究者型にはまった動物軌道12の多くの繰り返し。また、3 D プリント ホイール、一次元センサーとマイコンがだけ必要なので仮想現実システムよりも構築するはるかに簡単です。
安定した場所フィールド活動は、何日と学習に伴う長期ネットワーク動態を調査するための重要な前提条件にも記録可能性があります。この点で、いくつかの問題を検討してください。まず、シリコン プローブ周りの脳組織変性と瘢痕形成のプロセス可能性があります自体を生成する長期変動活動パターンで。つまり、脳の組織に与えるダメージを最小限を発生すると血管は慎重に行われるすべての手術のため重要であります。第二に、比較的脳14電極ドリフトのため連日、個々 のセルを追跡することは困難です。この点で、適したイメージング技術 2 光子顕微鏡やマイクロ内視鏡検査が良いかもしれないよう、セルとしてアイデンティティの形態と細胞21,22,23 の空間構成からたどることができます。.また、セル数の言葉のより大きい収穫記録し、細胞遺伝子式24について直接的な情報を提供できます。ただし、イメージング技術はかなり侵襲脳深部領域懸念している、彼らは主にカルシウム信号に依存単一活動電位を解決ことはできません。したがって、縦方向の研究に最適なソリューションは、光学的・電気生理学的なアプローチを組み合わせてするかもしれない。
最後に、それは一連の技術については電極、Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) optrodes11,25などの他の種類に簡単に適応できることは注目に値する,26日、海馬場所細胞以外の実験モデルの範囲で使用できます。3 D 印刷技術の速い進歩、簡単でラボにアクセス可能なさらなる改善と記録と行動のデバイスをカスタマイズする必要がありますになります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品は、韓国科学技術機関プログラム (プロジェクト号 2E26190 と 2E26170) とフロンティア科学人間 (RGY0089/2012 年) によって支えられました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | Recording electrode |
| Recording system | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| 3D printer | Asiga | Pico Plus 27 | High resolution printer for micro-drive |
| 3D printer | Stratasys | Mojo | Lower resolution printer for hat components |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Model 963 | |
| Binocular microscope | Leica | M60 | |
| Treadmill apparatus | We build them |
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