Summary
Vi beskriver de forskellige skridt at implantat kronisk silicium sonder og registrere sted cellerne i mus, der er running hoved-fast på en cue-beriget løbebånd apparater.
Abstract
En vigtig forudsætning for at forstå hjernefunktion er identifikation af adfærd og celleaktivitet korrelerer. Silicium sonder er avancerede elektroder til storstilet elektrofysiologiske optagelse af neuronal aktivitet, men procedurerne for deres kroniske implantation er stadig underudviklet. Aktiviteten af hippocampus sted celler er kendt for at korrelere med et dyr position i miljøet, men de underliggende mekanismer er stadig uklare. For at undersøge sted celler, beskriver her vi et sæt af teknikker der spænder fra fabrikation af enheder for kronisk silicium sonde implantater til overvågning af sted felt aktivitet i en cue-beriget løbebånd apparater. En mikro-drev og en hat er bygget af montering og fastgørelse sammen 3D-trykt plast dele. En silicium sonden er monteret på micro-drive, renset og belagt med farvestof. En første operation udføres for at løse hat på kraniet af en mus. Lille vartegn er fabrikeret og knyttet til bælte af et løbebånd. Musen er uddannet til at køre hoved-fast på løbebåndet. En anden kirurgi udføres for at implantat silicium sonden i hippocampus, efter hvilke bredbånd elektrofysiologiske signaler registreres. Endelig, silicium sonden kan genvindes og renses til genbrug. En analyse af sted celleaktivitet i løbebånd afslører en mangfoldighed af feltet mekanismer, skitserer gavn af tilgangen.
Introduction
Silicium sonder præsentere flere fordele for elektrofysiologiske optagelser, herunder det faktum at de er designet med skarpe profiler minimere vævsskader og at de giver en præcis layout af tætpakkede optagelse websteder1, 2,3,4. De bruges til at studere forskellige systemer i forskellige arter, herunder mennesker3,5,6, med forskellige tilgange1,7. Men deres tilbagevendende brug er stadig relativt begrænset på grund af deres omkostninger, skrøbelighed, og det faktum, at praktiske metoder for kronisk eksperimenter der mangler8. De seneste fremskridt i 3D udskrivning teknologi har muliggjort den brugerdefinerede udformningen af enheder såsom mikro-drev og hoved-plader til at tillade en lettere håndtering af disse fine elektroder. I et første skridt, vil vi beskrive, hvordan man kan opbygge og bruge et sæt værktøjer, som vi har udviklet for implantation af kronisk silicium sonder14.
Mens sted celler er typisk studerede ved hjælp af frit flytte dyr kører i labyrinter, for nylig blev de også undersøgt i virtuelle miljøer15 og løbebånd apparatii9 (figur 1A). Disse eksperimentelle metoder giver den fordel, at dyr kan være hoved-tilbageholdende, at gøre brug af 2-foton mikroskop15, patch-clamp16og optrode9,10,11 teknikker lettere, ud over at give øget kontrol på dyrs adfærd og miljømæssige stikord12. I et andet trin, vil vi præsentere procedurerne for uddannelse mus og optagelse sted celleaktivitet i et løbebånd apparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle beskrevne metoder er blevet godkendt af Animal Care og brug Udvalget af Korea Institute of Science og Technology.
1. forberedelse af Micro-drev og elektrode
- montage micro-drive.
- Udskrive dele af mikro-drev (slider, krop og shell) 14 ved hjælp af en høj opløsning 3D printer. Sørg for at delene har ingen defekter.
- Fix skyderen i selve micro-drev med en skrue (størrelse 000-120 x 1/4).
- Lodde en møtrik (størrelse 000-120 000-120/64 Hex) på spidsen af skruen.
- Roterer skrue med uret for at flytte skyderen op eller mod uret at flytte det ned.
- Fix shell til kroppen med en skrue (størrelse 000-120 x 1/4).
- Montering sonden på micro-drive.
- Fastsætte mikro-drev i en vandret position under en kikkert mikroskop.
- Bruge en flad alligator klip med gummi polstring til grab flex kabel af silicium sonden, mens omhyggeligt afmontering sonde fra forsendelse kabinet med pincet. Fix alligatorer klip til en manipulator.
- Bruge manipulator, lå silicium sonden på skyderen micro-drive parallelt til bevægelsesretning.
- Påfør en dråbe af dental cement (stuetemperatur-hærdning akryl dental reparere materiale) at fastsætte sonde til skyderen. Korrekt sondens placering, hvis det har skiftet. Lim kan ikke anbefales da det hærder meget hurtigt og gør det vanskeligt at justere positionen elektrode.
- Fix sonde til C-indehaveren (stik indehaveren) stik med dental cement.
- Rengøring og anbringelse farvestof på sonden.
- Fix Microdrive/sonden assemblage på enheden sonde-rengøring. Enheden er udstyret med 2 små roterende skum svampe (ikke-steril svaberprøver). Juster afstanden ved manipulatoren.
- Blød svampe med vaskemiddel.
- Langsomt flytte sonden op og ned mellem svampe, giver en blid touch. Overvåge den rensning oparbejde under et mikroskop.
- Skylles sonden med destilleret vand. Dyp sonden i alkohol for sterilisation.
- Anvend Dil (lipofile fluorescerende farvestof) på bagsiden af skafter af sonden, med en skum vatpind. Dette vil tillade i en senere fase visualisering af skanken steder i hjernen.
- Montage hat
- udskrive dele af hat (hoved-plade, stik indehaveren og cap) 14 ved hjælp af en 3D-printer. De 3 dele passer sammen for at danne et lukket kabinet.
- Indsætte nødder (størrelse M2 og 00-90 00-90/4) i slots af hoved-plade og fix med lim og dental cement.
- Indsætte en skive i slot af fælles landbrugspolitik og fix med dental cement.
2. Kirurgi for fiksering af hatten på kraniet
alle værktøjer, der anvendes for kirurgi er steriliseret på forhånd ved autoklavering. Der anvendes en tør varme perler anordning forto sterilisere værktøjer, der bliver forurenet og skal steriliseres under operationen.
- Angive niveauet for isofluran til 4% for indledning af anæstesi. Sætte musen i anæstesi kammer i 5 min.
- Installere musen i et stereotaxisk apparatur.
- Nedsætte isofluran til 1,5-2%. Justere niveauet under operation efter dyrenes tilstand, vejrtrækning, og krop temperatur 20.
- Anvende øjet salve på øjnene.
- Barbere hovedbunden og rydde hovedet af dyret med antiseptisk (iodopovidone). Vedligeholde aseptiske betingelser under alle trin i operationen.
- Sæt bupivacaine (1 mg/kg) i hovedbunden. Skær og fjern del af parietal huden af mus hovedet ved hjælp af fine saks til at eksponere kraniet på kanterne. Brug saltvand og en hæmostatisk svamp til at rense og kontrollere blødning under operationen.
- Fjerne periosteum bruger en skraber værktøj.
- Finde referencepunkter på kraniet 21: bregma, lambda, koronale, og sagittal sutur. Justere hovedet ' s vinkel langs den sagittal akse der gør at de Bregma og lambda punkter i samme højde.
- Bore to huller (~0.5 mm diameter) i kraniet for reference og jorden elektroderne. Hullerne skal være ca 1 mm caudale og 1 mm lateral af Lambda.
- Indsætte jorden og reference elektroder (størrelse 000-120 000-120/16 miniature rustfrit stål skruer wire-koblet til bens stik).
- Anvend ultraviolet (UV) lys limning dentin aktivator på kraniet og derefter anvende UV-lys til 45-60 s.
- Anvender et lag af dental cement på kanten af kraniet. Undgå at sprede cement på hud og hår af musene.
- Lave hoved-plade til et stereotaxisk manipulator og Placer det over kraniet. Langsomt sænke hoved-plade, indtil det rører lidt kraniet, og Anvend dental cement i krydset med kraniet. Lad dental cement kur i 15 min.
- Fjerne anæstesi. Lave en stik-indehaveren og en cap på hovedet-pladen. Sætte musen i sit bur efter at have givet en sub-kutant injektion af ketaprofen 5 mg/kg
- Give sub-kutant injektioner af ketaprofen 5 mg/kg for de to næste dage og overvåge nøje for eventuelle tegn på smerte. Mus typisk vågne op fra anæstesi indenfor 20-40 min. Hat implantatet er relativt lys (3,34 g), således at mus har ingen problemer med at løfte deres hoved, køre i labyrinter og klatre på kanterne af deres hjem bur.
3. Behavioral uddannelse
- efter en post-kirurgi opsving periode på 7 dage, starte begrænsning af vand på 1 mL per dag.
- At gøre løbebånd bælte, skære et stykke af fløjl stof (5 cm af 1-2 m) og løse små objekter på det ved hjælp af hot lim. Vedhæfte rejst objekter på kanterne af bælte for ikke at blande sig med bevægelse af musen.
- Fix bæltet på hjulene på løbebånd ved suturering sammen de to ender.
- Installere musen hovedet fast på løbebånd ved indsættelse og stramme de to skruer af hoved-pladen ind i åbningerne af hoved-fiksering plade.
- Start træning musen til at køre hoved-tilbageholdende på løbebånd til vandet belønning. Levere vand belønning gennem en slikke port. I første omgang, sætte musen på løbebåndet i perioder på 10 min, 3 gange om dagen.
- Som musen vænner sig til hoved-fiksering og begynder at flytte bælte (typisk efter ~ 3 dage), øge træningspasset varighed til 30 min. Efter 2-3 uger, nogle mus kører mere end 100 forsøg i 30 min (en prøveversion er en fuld rotation af selen).
- Vælg de mus viser de bedste adfærdsmæssige forestillinger for optagelse eksperimenter.
4. Implantation af silicium Probe
- sætte musen under anæstesi.
- Installere musen i den stereotaxisk apparatur ved fastsættelse af hoved-pladen. Rengør kraniet overfladen med saltvand.
- Finde stereotaxisk markører: bregma, lambda, koronale, og sagittal sutur. Måle afstanden til punktet for indsættelse og markere den.
- Bor knoglen forsigtigt indtil det bliver tynd og gennemsigtig. Fugte og rense med saltvand mens boring.
- Forsigtigt fjerne tyndet knoglen og Dura sagen ved hjælp af præcision kraftPS. Holde hjernen overfladen vådt med saltvand hele tiden.
- Fix Microdrive/silicon sonde assemblage til et stereotaxisk manipulator. Bringe silicium sonden lige over kraniotomi. Skrue silicium sonde stik indehaveren til hoved-plade.
- Tilslut optagelse forstærker og jorden/reference elektroderne. Skjold mus med aluminiumsfolie til at beskytte mod elektromagnetisk støj. Start optagelse system til at overvåge den elektriske aktivitet i hjernen.
- Indsætter langsomt silicium sonde ind i hjernen, ved hjælp af micromanipulator. Løbende kontroller af elektriske signaler, manipulator tilbagelagt afstand og skafter af sonden (Sørg for de trænge ind i hjernen). Enhed aktivitet er synlige i cortex, mens den hvide substans nedenunder er forholdsvis tavs. Enhed aktivitet vises igen, når shanks røre den pyramideformede lag af hippocampus. Fra dette punkt, trække silicium sonde 200 µm (brug mikro-drev den næste dag at bringe skanken tilbage i den pyramideformede lag).
- Dække overfladen af hjernen med en blanding af knogle voks og mineralsk olie.
- Fastsætte mikro-drev til hoved-pladen ved hjælp af dental cement. Lad dental cement kur i 15 min. Derefter løsne mikro-drevet fra den stereotaxisk manipulator og sætte hat hætten tilbage på.
- Sætte musen tilbage i sit bur og give en sub-kutant injektion af ketaprofen 5 mg/kg. Kontrollere for eventuelle tegn på smerte. Denne operation er langt mindre invasiv end den første og mus er typisk aktiv indenfor 45 min efter de vække-oppe fra anæstesi. Men lad musen inddrive en hel dag som silicium sonden skal stabilisere i hjernen.
5. Optagelse
- installere musen hoved-fast på løbebåndet. Fjerne hat cap.
- Forstærker optagelse og starte optagelsen.
- På den første dag, bruge mikro-drev til at flytte silicium sonde ind i den pyramideformede lag af hippocampus. Hver uret omdrejning af skruen flytter shanks 200 µm dybere. Justere positionen skanken langsomt (~ 20-50 µm ad gangen) indtil ripple svingninger 13 og enhed aktivitet vises.
- På de næste dage, tune skanken holdning og vente ~ 1 h før optagelsen af hippocampus aktivitet mens musen løber på bæltet. For at opretholde god optage signalkvalitet i flere dage, fjerne hårde genstande og lavt loft fra musen ' s bur at minimere chancen for hatten støder ind i hårde overflader.
6. Inddrive sonden
- sætte musen under anæstesi.
- Installere musen i den stereotaxisk apparatur ved fastsættelse af hoved-pladen. Fjerne hat cap.
- Bringe den stereotaxisk manipulator lige over mikro-drev. Fastsætte mikro-drev til manipulatoren. Skru stik indehaveren fra hoved-plade. Fjern skruen forbinder shell og kroppen af mikro-drevet.
- Under kikkert mikroskop tilsyn, langsomt trække op den mikro-drev/silicon sonde assemblage med den stereotaxisk manipulator, efterlod en del shell.
- Rense silicium sonden med rengøring enheden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mus blev først uddannet til at køre på en to meter lang bælte stikord (figur 1 c). Efter elektrode implantation, en ny bælte af samme længde, men præsentere 3 par stikord blev installeret på løbebånd, for at generere allocentric rumlige repræsentationer12,14. Bredbånd signaler blev optaget på en samplingfrekvens på 30.000 Hz, ved hjælp af en 250-kanals optagelse system (forstærker bord med USB interface bord og skræddersyede Labview interface) og to silicium sonder (figur 1A, 4 skafter, 8 sider pr. tand) implanteret i CA1 og CA3 (figur 1B). Enheder blev fundet ved hjælp af en tærskel funktion på high-pass filtreret signaler (0,8-5 kHz). Celle isolation blev udført ved hjælp af en semi-automatiske spike sortering metode15,16,17. Frem/tilbage bevægelse af løbebåndet var overvåges ved hjælp af LED og foto-sensor par og indspillet af digitalt input kanaler af registreringssystemet.
Gennemsnit af 148±35 celler (mean±s.e.m) kunne være isoleret i hver session, blandt hvilke 38.4±3.5% viste klart sted felt aktivitet (figur 2). Felterne sted var forholdsvis stabilt på tværs af mange forsøg, i enten den første dag af optagelse (figur 2A) eller efter flere dages udsættelse for cued bælte (figur 2B og figur 2 c). Forskellige typer af rumlige repræsentationer kunne skimtes. Nogle celler viste gentagne sted felter korreleret med identiteten af stikord (figur 2A), mens andre celler viste et unikt sted felt (figur 2 c)12. Dermed, vi kunne optage hippocampus sted celler over flere dage og identificere en mangfoldighed af feltet mekanismer, to vigtige forudsætninger for at studere de mekanismer og dynamics forbundet med rumlige navigation, indlæring og hukommelse.
Figur 1: silicium sonde og løbebånd apparater. (A) skaft og site layout af silicium sonde. (B) Implantation site. (C) løbebånd apparater og layout af stikord på bæltet. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: kronisk optagelse af sted celler. (A) farvekodede repræsentation af sted felter (top), spike auto-correlogram (nederst til venstre) og spike bølgeformer (nederst til højre) for en celle eksempel registreret på dag 1. (B-C) Samme som (A) for celler eksempler optaget på dag 3 (B) og dag 5 (C). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk optagelse af neuronal aktivitet er afgørende for at forstå neurale processer såsom hippocampus sted felter. Vores tilgang til at udføre kronisk silicium sonden implantantation adskiller sig fra andre metoder7,18,19,20 ved, at det er relativt enkelt at inddrive pakken elektrode på forsøgets afslutning. Mens sted celler er typisk studerede i frit flytte betingelser, løbebånd apparater ikke kun betydeligt forenkler eksperimentelle design og dataanalyse, det giver også mulighed for forskere at granske felt mekanismer i minimal sammenhænge under mange gentagelser af stereotype animalske baner12. Det er også langt enklere at bygge end virtual reality systemer, da det kun kræver 3D-trykt hjul, endimensional bevægelsessensorer og en microcontroller.
Stabilt sted felt aktivitet kunne registreres over mange dage, en vigtig forudsætning for at undersøge de langsigtede netværk dynamics forbundet med learning. I forbindelse bør nogle spørgsmål overvejes. Først, processerne af hjernens væv degeneration og ar dannelsen omkring silikone sonder kan selv generere langsigtede variationer i aktivitet mønstre. Det er derfor vigtigt, at alle kirurgiske procedurer skal gøres omhyggeligt for at forårsage minimal skade på hjernen væv og blod fartøjer. Det andet er det relativt vanskeligt at spore individuelle celler over på hinanden følgende dage, på grund af elektrode driver i hjernen-14. I denne henseende, imaging teknikker, såsom to-foton mikroskopi og mikro-endoskopi kan være bedre egnet, som cellen identitet kan spores fra morfologi og rumlig konfiguration celler21,22,,23 . De giver også mulighed for et større udbytte på sigt af antallet af celler, registreres og giver direkte oplysninger om celle gen udtryk24. Billeddiagnostiske teknikker er dog ganske invasive, når dyb hjerneregioner er bekymret og ikke kan løse enkelt handling potentialer, som de hovedsagelig afhængige calciumsignaler. Derfor, en optimal løsning for longitudinelle studier kunne være at kombinere både optisk og elektrofysiologiske metoder.
Endelig er det værd at bemærke, at sæt af teknikker, vi har beskrevet kan være let at tilpasse til andre typer af elektrode, herunder Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) og optrodes11,25 , 26, og kan bruges i en række eksperimentelle modeller end hippocampus sted celler. Med den hurtige fremskridt i 3D-udskrivning teknologi, bør en yderligere forbedring og tilpasning af optagelse og adfærdsmæssige enheder blive mere ligetil og tilgængelige for labs.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ikke noget at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af Korea Institute of Science og Technology institutionelle Program (projekter No. 2E26190 og 2E26170) og Human Frontier Science Program (RGY0089/2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | Recording electrode |
| Recording system | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| 3D printer | Asiga | Pico Plus 27 | High resolution printer for micro-drive |
| 3D printer | Stratasys | Mojo | Lower resolution printer for hat components |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Model 963 | |
| Binocular microscope | Leica | M60 | |
| Treadmill apparatus | We build them |
References
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
- Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180 (2016).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531 (2017).
- Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
- Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
- Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
- Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
- Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
- Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012 (2013).
