Summary
Vi beskriver de olika stegen implantat kronisk kisel sonder och protokollföra plats celler i möss som är löpande huvud-fast på en cue-berikad löpband apparatur.
Abstract
En viktig förutsättning för att förstå hjärnans funktion är identifiering av beteende och cellernas aktivitet korrelerar. Silicon sonder är avancerade elektroder för storskaliga elektrofysiologiska inspelning av neuronal aktivitet, men förfarandena för sin kroniska implantation är fortfarande underutvecklad. Aktiviteten i hippocampus plats celler är känt att korrelera med djurets ställning i miljön, men de bakomliggande mekanismerna är fortfarande oklart. För att undersöka platsen celler, beskriver här vi en uppsättning tekniker som sträcker sig från tillverkning av enheter för kronisk kisel sonden implantat till övervakningen av plats fältet aktivitet i en cue-berikad löpband apparatur. En mikro-enhet och en hatt är byggda av montering och infästning tillsammans 3D-tryckt plastdelar. En silicon sond är monterad på mikro-enhet, rengöras och belagd med färgämne. En första operation utförs för att fixa hatten på skallen av en mus. Små sevärdheter är fabricerade och fäst bältet av ett löpband. Musen är utbildad att köra huvud-fast på löpbandet. En andra operation utförs för att implantatet kisel sonden i hippocampus, efter som bredband elektrofysiologiska signalerar registreras. Slutligen är kisel sonden återvinns och rengöras för återanvändning. Analysen av plats cellsaktivitet i löpbandet avslöjar en mångfald av fältet mekanismer, beskriver nyttan av metoden.
Introduction
Silicon sonder presentera flera fördelar för elektrofysiologiska recordings, inklusive det faktum att de är utformade med vassa profiler att minimera vävnadsskada och att de presenterar en exakt layout av tätt packade inspelning platser1, 2,3,4. De används för att studera olika system i olika arter, inklusive människor3,5,6, med olika metoder1,7. Men är deras återkommande användning fortfarande relativt begränsad på grund av deras kostnader, skörhet och det faktum att praktiska metoder för kronisk experiment saknar8. Senaste framstegen inom 3D tryckteknik har gjort möjligt anpassad utformning av enheter såsom mikro-enheter och huvudplåtar att tillåta en enklare hantering av dessa känsliga elektroder. I ett första steg kommer vi att beskriva hur att bygga och använda en uppsättning verktyg som vi har utvecklat för implantation av kronisk kisel sonder14.
Medan plats celler studeras normalt använda fritt rörliga djur kör i labyrinter, nyligen undersöktes de också i virtuella miljöer15 och löpband apparatii9 (figur 1A). Dessa experimentella metoder erbjuder fördelen att djur kan vara huvud-hindrade, att göra användningen av 2-foton Mikroskop15, patch-clamp16och optrode9,10,11 tekniker lättare, förutom att ge ökad kontroll på djurs beteende och miljö cues12. I ett andra steg kommer vi att presentera förfarandena för utbildning möss och registrerar plats cellsaktivitet i en löpband apparatur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alla metoder som beskrivs har godkänts av djur vård och användning kommittén av Korea Institute of Science och Technology.
1. förbereda Micro-drive och elektrod
- montering mikro-disken.
- Skriva ut delarna av mikro-enheten (slider, kropp och shell) 14 med en högupplöst 3D-skrivare. Kontrollera att delarna har inga defekter.
- Fixa reglaget in i mikro-drive kroppen med en skruv (storlek 000-120 x 1/4).
- Löda en mutter (storlek 000-120 000-120/64 Hex) på spetsen av skruven.
- Vrid skruven medurs för att flytta skjutreglaget upp eller moturs för att flytta den nedåt.
- Fixa skalet till kroppen med en skruv (storlek 000-120 x 1/4).
- Montera sonden på mikro-enhet.
- Fixa mikro-enheten i horisontellt läge under ett binokulärt Mikroskop.
- Använda en platt krokodilklämma med gummi stoppning för att greppa flex kabeln av kisel sonden, medan försiktigt lossa sonden från försändelsen inneslutningen med pincett. Fixa till alligator klippet i en manipulator.
- Använder manipulatorn, lay kisel sonden på skjutreglaget för mikro-drive, parallell till rörelseriktning.
- Applicera en droppe av dentala cement (rumstemperatur-härdning akryl dental reparera material) fixar sonden till reglaget. Korrigera sondens läge om det har skiftat. Lim rekommenderas inte eftersom det härdar mycket snabbt och gör det svårt att justera positionen elektrod.
- Fixa kopplingen av sonden till C-innehavaren (connector innehavaren) med dentala cement.
- Rengöring och sätta färg på sonden.
- Fix Microdrive/sonden assemblage på sonden-rengöring enheten. Enheten är utrustad med 2 små roterande skum svampar (icke-sterila kompresser). Justera mellanrummet av manipulatorn.
- Blöt tvättsvamp med rengöringsmedel.
- Långsamt flytta sonden upp och ner mellan de svampar, möjliggör en lätt beröring. Övervaka reningsprocessen under ett mikroskop.
- Spola sonden med destillerat vatten. Doppa sonden i alkohol för sterilisering.
- Tillämpa Dil (lipofila fluorescerande färgämne) på baksidan av Tringa-snäppor sondens, med en skum svabb. Detta gör att i ett senare skede visualisering av skaft platser i hjärnan.
- Montering hatten
- skriva ut delarna av hatten (huvud-platta kontakten innehavaren och cap) 14 med en 3D-skrivare. 3 delar passar ihop och bildar en sluten baslåda.
- Infoga nötter (storlek M2 och 00-90 00-90/4) i spåren av huvud-platta och fixa med lim och dentala cement.
- Sätt en bricka i spåret av den gemensamma jordbrukspolitiken och fixa med dentala cement.
2. Kirurgi för fixering av hatten på skallen
alla verktyg som används för kirurgi är steriliserade i förväg genom autoklavering. En torr värme pärlor enhet används Efterom sterilisera verktyg som blivit förorenat och måste steriliseras under operationen.
- Ange nivån för isofluran 4% för inledandet av anestesi. Placera musen i anestesi kammaren för 5 min.
- Installera musen i en stereotaxic apparat.
- Sänka isofluran till 1,5-2%. Justera nivån under operationen enligt djurens tillstånd, andning, och kropp temperatur 20.
- Tillämpa ögonsalva för ögonen.
- Raka hårbotten och rensa huvudet av djuret med antiseptisk (iodopovidone). Upprätthålla aseptiska förhållanden under alla steg i operationen.
- Injicera bupivakain (1 mg/kg) under hårbotten. Skär och ta bort del av parietala huden av mus huvud med fin sax för att exponera skallen vid kanterna. Använd saltlösning och en hemostatiska svamp att rengöra och styra blödning under operationen.
- Ta bort periostet med en skrapa verktyg.
- Hitta referenspunkter på skallen 21: bregma, lambda, koronala och sagittal suturen. Justera huvudet ' s vinkel längs den sagittala axeln så att den Bregma och lambda pekar är på samma höjd.
- Borra två hål (~0.5 mm diameter) i skallen för referens och marken elektroderna. Hålen ska vara ca 1 mm kaudalt och 1 mm i sidled av Lambda.
- Infoga marken och referens elektroderna (storlek 000-120 000-120/16 miniatyr rostfritt stål skruvar tråd-kopplat till stiftskontakter).
- Verkställ ultraviolett (UV) ljus limning dentin aktivare på skallen och sedan använda UV-ljus för 45-60 s.
- Applicera ett lager av dentala cement på kanterna av skallen. Undvika att sprida cement på hud och hår av mössen.
- Fixa en stereotaxic manipulator huvud-plattan och placera den över skallen. Långsamt Sänk huvud-plattan tills den vidrör något skallen och applicera dentala cement vid korsningen med skallen. Låt dentala cement botemedel för 15 min.
- Ta bort anestesi. Fixa en kontakt-hållare och en mössa på huvudet-plattan. Placera musen i sin bur efter ger en subkutan injektion av ketaprofen 5 mg/kg.
- Ge subkutan injektioner av ketaprofen 5 mg/kg för de två kommande dagar och övervaka noga för tecken på smärta. Möss som vanligtvis vaknar från anestesi inom 20-40 min. Hatt implantatet är relativt ljus (3,34 g), sådan som möss har inga problem att lyfta huvudet, kör i labyrinter och klättra på kanterna av deras hem bur.
3. Beteendevetenskaplig utbildning
- efter en efter kirurgi återhämtningsperiod på 7 dagar, börja begränsning av vatten vid 1 mL per dag.
- Att göra löpband bältet, skär en bit av sammet tyg (5 cm av 1-2 m) och fixa små föremål på den med varmt lim. Bifoga ett uppfördes objekt på kanterna av bältet för att inte störa rörelsen av musen.
- Fixa bältet på hjulen på löpbandet av suturering ihop de två ändarna.
- Installera musens huvud-fast i löpbandet genom att infoga och dra åt de två skruvarna av huvud-plattan i spåren av huvud-fixering plattan.
- Start utbildning musen för att köra huvud-hindrade på löpbandet för vatten belöning. Leverera vatten belöningen genom en slicka port. Inledningsvis sätta musen på löpbandet för perioder av 10 min, 3 gånger per dag.
- Som musen vänjer sig huvud-fixering och börjar flytta bältet (vanligtvis efter ~ 3 dagar), öka träningspasset varaktighet till 30 min. Efter 2-3 veckor, några möss kör mer än 100 studier i 30 min (en rättegång att vara en full rotation av bältet).
- Välja möss visar de bästa beteendemässiga föreställningarna för inspelning experiment.
4. Implantation av den Silicon Probe
- sätta musen under anestesi.
- Installera musen i den stereotaxic apparaten genom att fastställa huvud-plattan. Rengöra skalle ytan med saltlösning.
- Hitta stereotaxic markörer: bregma, lambda, koronala och sagittal suturen. Mät avståndet till anslutningar och markera den.
- Borra benet försiktigt tills det blir tunn och transparent. Fukta och rent med koksaltlösning under borrningen.
- Försiktigt bort tunnas benet och Dura frågan använder precision kraftPS. Håll hjärnan ytan våt med koksaltlösning hela tiden.
- Fixa det Microdrive/silicon sonden sällskapet till en stereotaxic manipulator. Ta silicon sonden precis ovanför kraniotomi. Skruva fast kisel sondhållaren kontakten till huvud-plattan.
- Ansluter inspelning förstärkare och marken/referens elektroderna. Sköld musen med aluminiumfolie att skydda från elektromagnetisk buller. Starta inspelningssystemet för att övervaka den elektriska aktiviteten i hjärnan.
- In långsamt kisel sonden i hjärnan med hjälp av micromanipulator. Kontinuerligt kontrollera de elektriska signalerna, manipulator reste avståndet och Tringa sondens (kontrollera att de genomträngande i hjärnan). Förbandsverksamheten är synlig i cortex, medan den vita substansen under är relativt tyst. Förbandsverksamheten igen när Tringa rör pyramidal lagret av hippocampus. Från denna punkt, dra tillbaka den kisel probe 200 µm (använda mikro-enheten nästa dag för att återföra shanken till pyramidal lagret).
- Täcka ytan av hjärnan med en blandning av ben vax och mineralolja.
- Fixa mikro-enheten till huvud-plattan med dentala cement. Låt dentala cement botemedel för 15 min. Sedan loss mikro-enheten från stereotaxic manipulatorn och sätta hatt locket igen.
- Sätta musen tillbaka i sin bur och ger en subkutan injektion med ketaprofen 5 mg/kg. Kontrollera för tecken på smärta. Denna operation är mycket mindre invasiv än den första och möss är vanligtvis aktiva inom 45 min efter de vakna från anestesi. Men låt musen återställa en hel dag eftersom kisel sonden behöver stabilisera i hjärnan.
5. Inspelning
- Installera musen huvud-fast på löpbandet. Ta bort den hatt Tredjemansavtalet
- Anslut förstärkaren inspelning och starta inspelningen.
- Den första dagen, använda mikro-enheten för att flytta sonden kisel till pyramidal lagret av hippocampus. Varje skruven moturs vridning flyttas den skaft 200 µm djupare. Justera shanken position långsamt (~ 20-50 µm i taget) tills rippel svängningar 13 och enheten aktivitet visas.
- På de kommande dagarna, finjustera positionen skaft och vänta ~ 1 h innan inspelningen Hippocampus aktiviteten medan musen körs på bältet. För att bibehålla bra inspelning signalkvalitet i flera dagar, ta bort hårda föremål och låga tak från mus ' s buren för att minimera chansen hatten stöter i hårda ytor.
6. Att återställa sonden
- sätta musen under anestesi.
- Installera musen i den stereotaxic apparaten genom att fastställa huvud-plattan. Ta bort den hatt Tredjemansavtalet
- Ta stereotaxic manipulatorn precis ovanför mikro-enheten. Fixa mikro-disken till manipulatorn. Skruva loss kontakten innehavaren från huvud-plattan. Ta bort skruven ansluta shell och kroppen av mikro-disken.
- Under binokulära Mikroskop övervakning, långsamt dra upp den mikro-enhet/silicon sonden assemblage med den stereotaxic manipulatorn, lämnar den shell delen bakom.
- Rent kisel sonden med rengöring enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mus utbildades först att köra på en två meter lång bälte saknar cues (figur 1 c). Efter elektrod implantation, ett nytt bälte av samma längd men presentera 3 par ledtrådar installerades på löpbandet, för att generera allocentric rumsliga representationer12,14. Signaler bredband spelades vid en samplingsfrekvens på 30.000 Hz, med en 250-kanals inspelningssystem (förstärkare board med USB-gränssnittskortet och skräddarsydda Labview gränssnitt) och två kisel sonder (figur 1A, 4 skaft, 8 platser per skaft) implanteras i CA1 och CA3 (figur 1B). Enheter som hittades med en tröskel funktion på högpass filtrerade signaler (0,8-5 kHz). Cell isolering utfördes med hjälp av en semi-automatisk spike sortering metod15,16,17. Framåt/bakåt rörelse i löpbandet övervakades med LED och foto-sensor par och inspelad av digitala ingående kanaler för inspelningssystemet.
Ett genomsnitt av 148±35 celler (mean±s.e.m) kunde isoleras i varje session, bland vilka 38.4±3.5% visade tydlig plats fältet aktivitet (figur 2). Fälten plats var relativt stabila över många prövningar, i antingen första dagen inspelning (figur 2A) eller efter flera dagar av exponering för cued bältet (figur 2B och figur 2 c). Olika typer av rumsliga representationer kunde urskiljas. Vissa celler visade upprepade placera fält korrelerade med identitet för ledtrådar (figur 2A), medan andra celler visade en unik plats fältet (figur 2 c)12. Därför kunde vi spela Hippocampus plats celler över flera dagar och identifiera en mångfald av fältet mekanismer, två viktiga förutsättningar för att studera mekanismer och dynamics associerade med spatial navigering, inlärning och minne.
Figur 1: Silicon löpband och sond apparaten. (A) skaft och webbplats layout av kisel sond. (B) implanteringsstället. (C) löpband apparater och layout av ledtrådar på bältet. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: kronisk inspelning av plats celler. (A) färgkodade representation av placera fält (överst), spike auto-korrelogrammetoder (nederst till vänster) och spike vågformer (nederst till höger) för en cell exempel inspelade på dag 1. (B-C) Samma som (A) för celler exempel inspelade på dag 3 (B) och dag 5 (C). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk inspelning av neuronal aktivitet är avgörande för att förstå neurala processer såsom Hippocampus placera fält. Vår metod att utföra kronisk kisel sond implantantation skiljer sig från andra metoder7,18,19,20 genom det faktum att det är relativt enkelt att återställa elektrod paketet på slutet av experimentet. Medan plats celler studeras normalt i fritt rörliga villkor, löpband apparaten inte bara avsevärt förenklar experimentell design och analys av data, det låter också forskare att granska fältet mekanismer i minimal sammanhang under många upprepningar av stereotypa djur banor12. Det är också mycket enklare att bygga än virtuell verklighet system, eftersom det endast krävs 3D-tryckta hjul, endimensionell rörelsesensorer och en mikrokontroller.
Stabil plats fältet aktivitet kunde registreras över många dagar, en viktig förutsättning för att utreda den långsiktiga nätverk dynamics är associerad med lärande. I detta avseende övervägas vissa frågor. Först, processerna av hjärnans vävnad degeneration och ärr bildas runt silikon sonderna kan själva generera långsiktiga variationer i aktivitetsmönster. Det är därför viktigt för alla kirurgiska ingrepp göras noggrant för att orsaka minimala skador på hjärnans vävnader och blodkärl. Andra, det är relativt svårt att spåra enskilda celler över dagar, på grund av elektroden drivor i hjärnan14. I detta avseende imaging tekniker såsom två-foton mikroskopi och mikro-endoskopi kan vara bättre lämpade, som cell identitet kan spåras från morfologi och rumsliga konfiguration celler21,22,23 . De tillåter också en större avkastning på sikt av antalet celler registreras och ger direkt information om cellen gen uttryck24. Avbildningstekniker är dock ganska invasiv när djupa hjärnregioner är berörda och kan inte lösa enda handlingspänningar som de främst förlita sig på kalcium signaler. En optimal lösning för longitudinella studier kan därför vara att kombinera både optisk och elektrofysiologiska metoder.
Slutligen är det värt att notera att uppsättningen tekniker som vi har beskrivit kan vara lätt att anpassa för andra typer av elektrod, inklusive Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) och optrodes11,25 , 26, och kan användas i en rad experimentella modeller än Hippocampus plats celler. Med de snabba framsteg i 3D-printing technology, bör ytterligare förbättring och anpassning av inspelning och beteendemässiga enheter bli mer och mer enkel och tillgänglig för labben.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har något att avslöja.
Acknowledgments
Detta arbete stöds av i Korea Institute of Science och Technology institutionella Program (projekt nr 2E26190 och 2E26170) och den Human Frontier Science Program (RGY0089/2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | Recording electrode |
| Recording system | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| 3D printer | Asiga | Pico Plus 27 | High resolution printer for micro-drive |
| 3D printer | Stratasys | Mojo | Lower resolution printer for hat components |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Model 963 | |
| Binocular microscope | Leica | M60 | |
| Treadmill apparatus | We build them |
References
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
- Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180 (2016).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531 (2017).
- Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
- Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
- Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
- Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
- Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
- Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012 (2013).
