Summary
Vi beskriver forskjellige trinnene til implantatet kronisk silisium sonder og registrere sted celler i mus som topp-fast på en stikkordet-beriket tredemølle apparater.
Abstract
En viktig forutsetning for å forstå hjernefunksjon er identifikasjonen av atferd og celle aktivitet samsvarer. Silisium sonder er avanserte elektroder for store elektrofysiologiske opptak neuronal aktivitet, men deres kronisk implantasjon prosedyrer er fortsatt underutviklet. Aktiviteten til hippocampus sted celler er kjent for å korrelere med et dyrs posisjon i miljøet, men de underliggende mekanismene er fortsatt uklart. For å undersøke stedet celler, beskriver her vi et sett av teknikker som spenner fra fabrikasjon av enheter for kronisk silisium sonde implantater til overvåking av sted-feltet aktivitet i en kø-beriket tredemølle apparater. En mikro-stasjon og en lue bygges ved montering og festing sammen 3D-trykt plastdeler. En silisium-sonde er montert på mikro-stasjonen, renset og belagt med fargestoff. En første operasjon utføres for å rette hatten på skallen med musen. Liten landemerker er fabrikkert og knyttet til beltet av en tredemølle. Musen er opplært til å kjøre hodet-fast på tredemølle. En andre kirurgi utføres for å implantatet silisium sonden prefiks, etter hvilke bredbånd elektrofysiologiske signaler er registrert. Endelig er silisium sonden gjenvunnet og renset for gjenbruk. Analyse av sted celle aktivitet i tredemøllen avslører et mangfold av sted-feltet mekanismer, skisserte fordelen av tilnærming.
Introduction
Silisium sonder presentere flere fordeler elektrofysiologiske opptak, inkludert det faktum at de er utformet med skarpe profiler minimere skade på vev og som de presenterer en presis utformingen av tett pakket opptak nettsteder1, 2,3,4. De brukes til å studere ulike systemer i ulike arter, inkludert mennesker3,5,6, med ulike tilnærminger1,7. Likevel er tilbakevendende bruken fortsatt relativt begrenset på grunn av deres kostnader, skjørhet og det faktum at praktiske metoder for kronisk eksperimenter mangler8. Nylige fremskritt innen 3D trykking teknologien har gjort mulig tilpasset utforming av enheter som mikro-stasjoner og hodet-plater tillate en enklere håndtering av disse delikate elektroder. I et første skritt, vil vi beskrive hvordan du bygger og bruke et sett med verktøy som vi har utviklet for implantering av kronisk silisium sonder14.
Mens sted cellene behandles vanligvis bruke fritt flytte dyr kjører i labyrinter, var nylig de også undersøkt i virtuelle miljøer15 og tredemølle apparatii9 (figur 1A). Disse eksperimentelle metoder tilbyr fordelen at dyr kan hodet-dempes, gjør bruk av 2-fotonet mikroskop15, patch-klemme16og optrode9,10,11 teknikker enklere, i tillegg til å tilby forbedret kontroll på dyr atferd og miljømessig stikkordene12. Under det andre trinnet, vil vi presentere prosedyrer for trening mus og innspillingen sted celle aktivitet i en tredemølle apparater.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
alle metodene beskrevet er godkjent av Animal Care og bruk komiteen av Korea Institutt for vitenskap og teknologi.
1. forberede Micro-stasjonen og elektroden
- montering det mikro-kjøre.
- Skrive ut deler av mikro-stasjonen (glidebryteren, kropp og shell) 14 høyoppløselig 3D skriveren. Kontroller delene har uten defekter.
- Fikse glidebryteren til selve micro-stasjonen med en skrue (størrelse 000-120 x 1/4).
- Loddetinn en mutter (størrelse 000-120 000-120/64 Hex) onto drikkepengene av skruen.
- Rotere skruen klokken å flytte glidebryteren opp eller klokken for å flytte det nedover.
- Fikse skallet kroppen med en skrue (størrelse 000-120 x 1/4).
- Montering sonden på mikro-stasjonen.
- Reparere mikro-stasjonen i vannrett stilling under kikkert mikroskop.
- Bruke en flat alligator klipp med gummi padding ta flex-kabelen av silisium sonde, under nøye frakobling sonden fra forsendelsen kabinettet med tang. Fastsette alligator klipp til en manipulator.
- Bruker manipulator, lå silisium sonden på glidebryteren for mikro-kjøre parallelt til bevegelsesretning.
- Legge dental sement (romtemperatur-herding akryl dental reparere materiale) å fastsette sonden til glidebryteren. Korrekt sonde plasseringen hvis flyttet. Limet er ikke anbefalt som det cures veldig fort og gjør det vanskelig å omstille elektrode plasseringen.
- Fikse koblingen av sonden til C-holderen (kontaktholderen) med dental sement.
- Rengjøring og sette farge på sonden.
- Fastsette Microdrive/sonden samling på sonden-rengjøring enhet. Enheten er utstyrt med 2 små roterende skum svamper (ikke-sterilt vattpinner). Justere gapet ved manipulatoren.
- Suge svampene med vaskemiddel.
- Sakte flytte proben opp og ned mellom svamper, slik at en mild berøring. Overvåke rengjøringen under et mikroskop.
- Skyll sonde med destillert vann. Dypp sonden i alkohol for sterilisering.
- Bruk Dil (lipofile fluorescerende farge) på baksiden av marrowbones av sonden, med en skum vattpinne. Dette vil tillate på et senere stadium visualisering av shank steder i hjernen.
- Montering hatten
- skrive ut deler av hatten (istykkerrevne kontakten og cap) 14 bruke en 3D-skriver. De 3 delene passer sammen til en forseglet kabinett.
- Sette inn nøtter (størrelse M2 og 00-90 00-90/4) i sporene istykkerrevne og fikse med lim og dental sement.
- Sett en skive i sporet i cap og fikse med dental sement.
2. Kirurgi for fiksering av hatten på skallen
alle verktøy som brukes for kirurgi er sterilisert på forhånd av autoklavering. En tørr perler enhet brukes forto sterilisere verktøy som blir forurenset og må steriliseres under operasjonen.
- Angi isoflurane til 4% for initiering av anestesi. Plassere musen i anestesi kammeret i 5 min.
- Installere musen i en stereotaxic apparater.
- Reduser isoflurane nivå til 1,5-2%. Justere nivået under operasjonen etter dyr staten, pustefrekvens, og kropp temperatur 20.
- Bruke øye ointment øynene.
- Barbere hodebunnen og ren leder av dyret med antiseptisk (iodopovidone). Opprettholde aseptiske forhold i alle trinnene i operasjonen.
- Sett inn bupivacaine (1 mg/kg) under skalpen. Skjær og Fjern del av parietal huden av mus hodet med fine saks for å avsløre skallen på kantene. Bruke saltholdig og en hemostatic svamp å rydde og kontrollere blødningen under operasjonen.
- Fjerne periosteum bruker en skrape verktøyet.
- Finne referansepunktene på skallen 21: bregma, lambda, Koronal og sagittal Sutur. Justere hodet ' s vinkel langs sagittal aksen slik at de Bregma og lambda poeng er på samme høyde.
- Bore to hull (~0.5 mm diameter) i skallen for referanse og bakken elektrodene. Hullene skal være ca 1 mm caudal og 1 mm lateral av Lambda.
- Sette inn bakken og referanse elektrodene (størrelse 000-120 000-120/16 miniatyr rustfritt stål skruer wire-koblet til pinnerskontakter).
- Bruk ultrafiolett (UV) lys liming dentin aktivator på skallen, og deretter bruker UV-lys for 45-60 s.
- Påfør et lag med dental sement på kantene av skallen. Unngå å spre sement på hud og hår av musene.
- Fikse hodet-platen til en stereotaxic manipulator, og plasser den over skallen. Sakte senke hodet-platen til det litt berører skallen og bruke dental sement i krysset med skallen. La dental sement kur for 15 min.
- Fjerne av bedøvelsen. Fikse et koblingen-holderen og en lue på hodet-platen. Sette musen i buret sitt etter gir en sub kutan injeksjon av ketaprofen 5 mg/kg utstyr
- Gi sub kutan injeksjoner av ketaprofen 5 mg/kg til to neste dager og skjermen nøye for alle kvittere av smerte. Mus vanligvis våkner bedøvelsen innen 20-40 min. Lue protesen er relativt lett (3.34 g), slik at mus har ingen problemer med å løfte hodet, kjøre i labyrinter og klatre på kantene av deres hjem bur.
3. Atferdsmessige trening
- etter en etter operasjonen restitusjonsperiode på 7 dager, begynner begrensning av vann på 1 mL per dag.
- å gjøre tredemølle beltet, klipp et stykke fløyel stoff (5 cm av 1-2 m) og fikse små objekter på det med varmt lim. Knytte reist objekter på kantene av beltet for ikke å forstyrre bevegelsene til musen.
- Rette beltet på hjulene på tredemøllen ved suturing sammen de to endene.
- Installere musen hodet-fast i tredemøllen ved innsetting og stramme de to skruene på hodet-platen inn i sporene på hodet-fiksering platen.
- Start opplæring musen for å kjøre hodet-behersket på tredemølle for vann belønning. Levere vann belønningen gjennom en slikk. Først legger musen på tredemølle for perioder 10 min, 3 ganger per dag.
- Som musen blir brukt til hodet-fiksering og begynner å flytte beltet (vanligvis etter ~ 3 dager), øke treningsøkten varighet til 30 min. Etter 2-3 uker, noen mus kjøre mer enn 100 studier på 30 min (en prøve å være en full rotasjon av beltet).
- Velg mus viser de beste opptreden forestillingene for opptak eksperimenter.
4. Implantering av silisium Probe
- legger musen under narkose.
- Installere musen i stereotaxic apparatet ved å feste hodet-platen. Flaten skallen med saltvann.
- Finne stereotaxic markører: bregma, lambda, Koronal og sagittal Sutur. Mål avstanden til punktet innsetting og merke den.
- Bore benet nøye før det blir tynn og gjennomsiktig. Fukte og rense med saltvann under boring.
- Forsiktig fjerne tynnet benet og Dura saken bruke presisjon maktPS. Holde hjernen overflaten våt med saltvann hele tiden.
- Fikse Microdrive/silisium sonde forsamlingen til en stereotaxic manipulator. Bringe silisium sonden like over craniotomy. Skru silisium sonde kontakt abonnenten til hodet-plate.
- Koble til opptak forsterker og bakken/referanse elektrodene. Skjerme musen med aluminiumsfolie for å beskytte mot elektromagnetisk støy. Starte innspillingen systemet for å overvåke elektrisk aktivitet i hjernen.
- Sakte inn silicon sonden hjernen ved hjelp av micromanipulator. Kontinuerlig Sjekk de elektriske signalene og manipulator reiste avstanden til shanks av sonden (Kontroller at de er gjennomtrengende i hjernen). Enhet aktivitet vises i cortex mens white saken under er relativt stille. Enhet aktivitet på nytt til shanks berører pyramideformet laget av hippocampus. Fra dette punktet, trekke silisium sonde 200 µm (bruk mikro-stasjonen neste dag å bringe skaft tilbake i pyramideformet laget).
- Dekker overflaten av hjernen med en blanding av bein voks og mineralolje.
- Reparere mikro-stasjonen til hodet-plate ved hjelp av dental sement. La dental sement kur for 15 min. Deretter koble mikro-stasjonen fra den stereotaxic manipulatoren og sette lue hetten på.
- Setter musen tilbake i buret sitt og gi en sub kutan injeksjon av ketaprofen 5 mg/kg. Se etter alle kvittere av smerte. Denne operasjonen er mye mindre invasiv enn den første mus er vanligvis aktive innen 45 minutter etter at de vekker av bedøvelsen. Men la musen gjenopprette en hel dag som silisium sonden trenger å stabilisere i hjernen.
5. Opptak
- installere musen hodet-fast på tredemølle. Fjern lue kapittel
- Koble opptak forsterkeren og starte innspillingen.
- På den første dagen, bruker micro-stasjonen for å flytte silisium sonden til pyramideformet laget av hippocampus. Hvert mot klokken omdreining av skruen flytter shanks 200 µm dypere. Juster akselen posisjon sakte (~ 20-50 µm samtidig) til rippel svingninger 13 og enhet aktivitet vises.
- På de neste dagene, tune akselen posisjon og vente ~ 1 h før innspillingen hippocampus aktiviteten mens musen kjører på beltet. For å opprettholde god opptak signalkvalitet i flere dager, fjerne hard emner og lave tak fra musa ' s buret for å minimere sjansen hatten støter harde flater.
6. Gjenopprette sonden
- legger musen under narkose.
- Installere musen i stereotaxic apparatet ved å feste hodet-platen. Fjern lue kapittel
- Ta stereotaxic manipulatoren like over mikro-stasjonen. Reparere mikro-stasjonen til manipulatoren. Løsne kontakten abonnenten hodet-platen. Ta ut skruen connecting skall og kroppen av mikro-stasjonen.
- Under kikkert mikroskop tilsyn, sakte trekker opp mikro-stasjon/silisium sonde forsamlingen med den stereotaxic manipulatoren, etterlot delen skall.
- Rengjør silisium sonde med rengjøring enheten.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
En mus ble først opplært til å kjøre på en to meter lang belte uten signaler (figur 1 c). Etter elektrode implantasjon, et nytt belte med samme lengde, men presenterer 3 par signaler ble installert på tredemølle, for å generere allocentric romlige representasjoner12,14. Bredbånd signaler ble registrert på en samplingsfrekvens på 30 000 Hz, med en 250-kanals innspillingssystem (forsterker bord med USB grensesnittet styret og skreddersydde Labview grensesnitt) og to silisium sonder (figur 1A, 4 shanks, 8 områder per shanks) implantert CA1 og CA3 (figur 1B). Enheter ble oppdaget funksjonen en terskel på høypass-filtrerte signaler (0,8-5 kHz). Cellen aisolering det ble utført en halvautomatisk topp sortering metoden15,16,17. Forover eller bakover bevegelse tredemølle ble overvåket med LED og foto-sensor par og registrert av digitale innspill kanaler av innspillingen.
Gjennomsnittlig 148±35 celler (mean±s.e.m) kan bli isolert i hver økt, blant annet 38.4±3.5% viste tydelig sted feltet aktivitet (figur 2). Feltene sted var relativt stabil i mange studier, enten den første dagen av opptak (figur 2A) eller etter flere dager med eksponering for cued beltet (figur 2B og figur 2C). Ulike typer av romlig representasjoner forholdet. Noen celler viste gjentatt sted felt korrelert med identiteten til signaler (figur 2A), mens andre celler viste en unik plass feltet (figur 2C)12. Derfor kan vi registrere hippocampus sted celler over flere dager og identifisere et mangfold av sted-feltet mekanismer, to viktig informasjon for å studere mekanismer og dynamikk knyttet romlige navigasjon, læring og hukommelse.
Figur 1: Silicon sonde og tredemølle apparater. (A) skaft og nettsted oppsett av silisium probe. (B) implantasjon området. (C) tredemølle apparater og oppsett av signaler på beltet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: kronisk opptak av sted celler. (A) fargekodet representasjon av plass (øverst), spike auto-correlogram (nederst til venstre) og spike bølgeformer (nederst til høyre) for en celle eksempel spilt inn på dag 1. (ABC) Samme som (A) for cellene eksempler registrert på 3 (B) og dagen 5 (C). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Kronisk opptak av neuronal aktivitet er avgjørende for å forstå nevrale prosesser for eksempel hippocampus sted. Vår tilnærming til utføre kronisk silisium sonde implantantation skiller seg fra andre metoder7,18,19,20 av det faktum at det er relativt enkelt å gjenopprette elektrode pakken på slutten av eksperimentet. Mens sted cellene behandles vanligvis fritt flytte forhold, tredemølle apparatet ikke bare vesentlig forenkler eksperimentell design og dataanalyse, dessuten gir forskere å granske plass feltet mekanismer i minimal sammenhenger under mange repetisjoner stereotype dyr baner12. Det er også mye enklere å bygge enn virtuell virkelighet systemer, siden det bare krever 3D-trykt hjul, endimensjonal bevegelsessensorer og en microcontroller.
Stabil sted feltet aktivitet kunne spilles over mange dager, en viktig forutsetning for å undersøke langsiktige nettverk dynamikken knyttet til læring. Noen problemer bør vurderes i denne forbindelse. Først kan prosessene av hjernen vev degenerasjon og arr formasjonen rundt silikon sonder selv generere langsiktig variasjoner i aktivitet mønstre. Det er derfor viktig for alle kirurgiske prosedyrer gjøres nøye for å skade minimal hjernen vev og blod fartøy. Det andre, er det relativt vanskelig å spore individuelle celler over dager, på grunn av elektroden driver i hjernen14. I denne forbindelse imaging teknikker som to-fotonet mikroskopi og mikro-endoskopi kan være bedre egnet, som cellen identitet kan spores fra morfologi og romlig konfigurasjonen celler21,22,23 . De lar også en større avkastning på sikt av antall celler registrert og gi direkte informasjon om cellen genet uttrykk24. Bildeteknikker er imidlertid ganske invasiv når dypt hjernen regioner er opptatt og kan ikke løse enkelt handling potensialer som de i hovedsak stole på kalsium signaler. Derfor kan en optimal løsning for longitudinelle studier være å kombinere både optisk og elektrofysiologiske tilnærminger.
Endelig er det verdt å merke seg at settet med teknikker vi har beskrevet kan være lett å manøvrere i andre typer elektrode, inkludert Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) og optrodes11,25 , 26, og kan brukes i en rekke eksperimentelle modeller enn hippocampus sted celler. Med raske utviklingen i 3D-trykking teknologien bør ytterligere forbedring og tilpasning av opptak og atferdsmessige enheter bli mer enkel og tilgjengelig for laboratorier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne ikke avsløre.
Acknowledgments
Dette arbeidet ble støttet av Korea-instituttet for vitenskap og teknologi institusjonelle Program (prosjekter nr. 2E26190 og 2E26170) og menneskelige Frontier Science programmet (RGY0089/2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | Recording electrode |
| Recording system | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| 3D printer | Asiga | Pico Plus 27 | High resolution printer for micro-drive |
| 3D printer | Stratasys | Mojo | Lower resolution printer for hat components |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Model 963 | |
| Binocular microscope | Leica | M60 | |
| Treadmill apparatus | We build them |
References
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
- Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180 (2016).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531 (2017).
- Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
- Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
- Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
- Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
- Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
- Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012 (2013).
