Summary
Мы описываем различные шаги имплантата хронических кремниевых датчиков и записать место клетки мышей, которые работает голова исправлена на Кий обогащенный беговая дорожка аппарат.
Abstract
Важным условием для понимания функции мозга является определение поведения и соотносит клеточной активности. Кремния зонды являются передовыми электроды для крупномасштабных электрофизиологических записи нейронной активности, но по-прежнему развиты процедуры их хронических имплантации. Активность клеток гиппокампа место, как известно, коррелируют с позиции животного в окружающей среде, но основные механизмы по-прежнему неясны. Исследовать место клетки, здесь мы описываем набор методов, которые варьируются от изготовления устройств для хронических кремния зонд имплантаты для мониторинга активности поле место в аппарат кий обогащенный беговой дорожки. Микро привод и шляпу строятся установки и крепления вместе 3D-печатных пластиковых деталей. Зонд кремния монтируется на микро привода, уборка и покрыты краской. Первая операция выполняется исправить шляпу на череп мыши. Небольшие достопримечательности изготавливаются и придает ремня беговой дорожке. Мышь обучены выполнять голова исправлена на беговой дорожке. Вторая операция выполняется для имплантата кремния зонд в гиппокампе, после которого широкополосного электрофизиологических сигналов записываются. Наконец кремния зонд оправился и очищен для повторного использования. Анализ активности клеток место в беговой дорожке показывает разнообразие механизмов поля, изложением преимущество подхода.
Introduction
Кремния датчики представляют ряд преимуществ для электрофизиологических записей, включая тот факт, что они разработаны с острыми профили, минимизации повреждения тканей и что они представляют точную разметку из плотно упакованных записи сайтов1, 2,3,4. Они используются для изучения различных систем в разных видов, в том числе люди3,5,6, разнообразные подходы1,7. Тем не менее их повторного использования все еще сравнительно ограничено из-за их стоимости, хрупкость и тот факт, что удобные методы для хронических экспериментов хватает8. Последние достижения в технологии 3D печати сделали возможным индивидуальное проектирование устройств, таких как микро диски и головы пластины позволяют облегчить обработку этих деликатных электродов. В качестве первого шага мы опишем, как построить и использовать набор инструментов, которые мы разработали для имплантации хронической кремния зонды14.
В то время как место клетки обычно изучаются с использованием свободно перемещающихся животных в лабиринты, недавно они были также расследование в виртуальных средах15 и беговая дорожка apparatii9 (рис. 1A). Эти экспериментальные методы предлагают преимущество, что животные могут быть голова сдержанный, использования 2-Фотон Микроскоп15, патч хомут16и optrode9,10,11 методы проще, помимо усиления контроля на поведение животных и окружающей среды сигналы12. В качестве второго шага мы представим процедуры подготовки мышей и записи активности клеток место в аппарат беговой дорожки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
животное уход и использование Комитетом Корейский институт науки и технологии были утверждены все методы, описанные.
1. Подготовка микро привод и электрод
- Сборка микро привода.
- Печать части микро привода (слайдер, тело и оболочки) 14 с высоким разрешением 3D-принтер. Убедитесь, что детали имеют дефекты не.
- Исправить ползунок в организм микро привод с помощью винта (размер 000-120 x 1/4).
- Спаять гайка (размер 000-120 000-120/64 Hex) на кончик шурупа.
- Вращайте винт по часовой стрелке, чтобы переместить ползунок вверх или по часовой стрелке, чтобы переместить его.
- Исправить оболочки к телу с помощью винта (размер 000-120 x 1/4).
- Крепления зонда на микро привод.
- Исправить микро привод в горизонтальном положении под Микроскоп бинокулярный.
- Использовать плоский Аллигатор клип с резиновой прокладкой, чтобы захватить шлейфа зонда кремния, при этом тщательно отсоединение зонд из корпуса отгрузки с щипцами. Исправить Аллигатор клип манипулятора.
- С помощью манипулятора, заложить кремния зонд на ползунок микро привода, параллельно направлению движения.
- Применить капли стоматологического цемента (комнатной температуры полимеризации акрила Стоматологическая ремонт материала) исправить зонд для ползунка. Правильное положение зонда, если она изменилась. Клей не рекомендуется, поскольку он лечит очень быстро и делает ее трудно скорректировать положение электрода.
- Исправить разъему зонда к C-держатель (коннектор держатель) с стоматологического цемента.
- Чистка и положить краску на зонд.
Монтаж
- исправить Microdrive/зонд на зонд очистка устройства. Прибор оснащен 2 малых вращающихся пены губки (не стерильных тампонов). Отрегулируйте зазор манипулятором.
- Замочить губки с детергентами.
- Медленно перемещайте датчик вверх и вниз между губок, позволяя нежное прикосновение. Контролировать процесс очистки под микроскопом.
- Прополоскать зонд с дистиллированной водой. Окуните зонд в алкоголя для стерилизации.
- Применить Дил (липофильных флуоресцентных красителей) на задней части черенков зонд, с помощью пены тампоном. Это позволит в более поздней стадии визуализации хвостовик мест в головном мозге.
- Сборка шляпа
- Печать части Хат (руководитель плита, коннектор держатель и Кап) 14 с помощью 3D-принтера. 3-х частей сочетаются друг с другом для формирования герметичный корпус.
- Вставка гайки (размер м2 и 00-90 00-90/4) в слоты головы пластины и исправить с клеем и стоматологического цемента.
- Вставить шайбу в слот крышку и закрепите стоматологического цемента.
2. Хирургия для фиксации шляпу на череп
все инструменты, используемые для хирургии стерилизовать путем автоклавирования. Бусины устройство сухого тепла используется Радитого, чтобы стерилизовать инструменты, которые загрязняются и необходимо стерилизовать во время операции.
- Задать уровень изофлюрановая до 4% для начала наркоза. Поместите мышь в зале анестезии для 5 минут
- Установить указатель мыши в стереотаксического аппарата.
- Снизить уровень изофлюрановая до 1,5-2%. Отрегулируйте уровень во время операции по словам животных, частоту дыхания и тела температуры 20.
- Применять мазь глаза на глаз.
- Бритья головы и очистить голову животного с антисептиком (iodopovidone). Поддержание асептических условий в течение всех этапов операции.
- Придать бупивакаин (1 мг/кг) под кожу головы. Вырезать и удалить часть теменной кожи головы мыши, с помощью тонкой ножниц выставить череп на его краях. Используйте физиологического раствора и гемостатической губкой для очистки и контролировать кровотечение во время операции.
- Удаление надкостницы, с помощью инструмента скребок.
- Найти ориентиры на череп 21: bregma, лямбда, корональных и сагиттального шва. Настроить головку ' s, угол по сагиттальной оси таким образом, чтобы Bregma и lambda точки находятся на той же высоте.
- Просверлить два (~0.5 мм диаметр) в черепе для ведения и местах электродов. Отверстия должны быть примерно 1 мм хвостовой и 1 мм бокового лямбда-выражения.
- Вставить Справочник по городу и электроды (размер 000-120 000-120/16 миниатюрных нержавеющей стали винты проволока соединен разъема).
- Применить ультрафиолетового (УФ) света связывающих дентин активатор на черепе и затем применять УФ света для 45-60 s.
- Применить слой стоматологического цемента на краях черепа. Избежать распространения цемента на кожу и волосы мышей.
- Головы-пластина для стереотаксического манипулятора и разместите его над черепа. Медленно опустите голову пластины до тех пор, пока она слегка трогает череп и применять стоматологического цемента на стыке с черепом. Пусть лечения стоматологического цемента на 15 мин
- Удаление анестезии. Исправьте соединитель держатель и шапку на голову-пластину. Поместите мышь в своей клетке после давая подкожной инъекции ketaprofen 5 мг/кг
- Дать подкожной инъекции ketaprofen 5 мг/кг для двух ближайших дней и монитор тщательно для каких-либо признаков боли. Мышь обычно просыпаюсь от анестезии в течение 20-40 мин. Шляпа имплантата является относительно света (3,34 г), такие, что мышей не имеют проблем поднять голову, запустить в лабиринты и подняться по краям их дома Кейдж.
3. Поведенческие обучение
- после Послеоперационный восстановительный период 7 дней, запустите ограничение воды на 1 мл в день.
- Сделать ремня беговой дорожки, вырезать кусок бархата (5 см на 1-2 м) и исправить мелкие предметы на его с помощью горячего клея. Прикрепить возводимых объектов на краях пояса, чтобы не мешать движению мыши.
- Исправить пояса на колесах беговой дорожки, сшивания вместе двух концах.
- Установить мыши, голова исправлена в беговой дорожки, вставляя и затянув два винта пластины головы в пазы головы фиксация пластиной.
- Начала подготовку мыши для запуска головы задержанной на беговой дорожке для воды вознаграждение. Доставить воду вознаграждение через порт лизать. Первоначально, поместите мышь на беговой дорожке на периоды 10 мин, 3 раза в день.
- Как мышь получает используется для фиксации головы и начинает двигаться пояса (обычно после ~ 3 дней), увеличение учебной сессии продолжительностью до 30 мин. После 2-3 недели, некоторые мыши запустить более чем 100 испытания в 30 мин (суда, будучи полное вращение пояса).
- Выбрать мышей, показаны лучшие поведенческих спектакли для записи экспериментов.
4. Имплантация кремния зонда
- Положите мышь под наркозом.
- Установите мышь в стереотаксического аппарата путем фиксации головы пластины. Чистота поверхности черепа с saline.
- Найти стереотаксического маркеры: bregma, лямбда, корональных и сагиттального шва. Измерить расстояние до точки вставки и Марк it.
- Сверла кости тщательно до тех пор, пока она становится тонкой и прозрачной. Смочите и чистый с физиологического раствора в процессе бурения.
- Осторожно снимите разбавленной кости и дура материи, с помощью силы точностиPS. Держать поверхности мозга мокрые с saline все время.
- Исправить сборка зонд Microdrive/кремния для стереотаксического манипулятора. Принесите кремния зонд чуть выше краниотомии. Винт держателя соединитель зонд кремния для головы пластина.
- Подключите усилитель и земли/Справочник электродов записи. Мышь с алюминиевой фольги для защиты от шума электро магнитного щита. Начало записи системы для мониторинга электрической активности мозга.
- Медленно щуп кремния в мозг, используя микроманипулятор. Непрерывно проверить электрические сигналы, путешествовал манипулятора расстояние и хвостовик зонда (убедитесь, что они проникают в мозг). Деятельность является видимым в коре пока белого вещества под относительно молчит. Деятельность группы появляется когда черенки прикасаться пирамидальной слой гиппокампа. С этого момента, отозвать зонда 200 мкм кремния (используйте следующий день микро привод, довести хвостовик обратно в пирамидальной слой).
- Покрытие поверхности головного мозга со смесью воска костей и минерального масла.
- Исправить микро привод для головы плита с использованием стоматологического цемента. Пусть лечения стоматологического цемента на 15 мин. Затем отсоедините микро привод от стереотаксического манипулятора и наденьте шляпу обратно на.
- Положите мыши обратно в его клетке и дать подкожной инъекции ketaprofen 5 мг/кг. Проверьте наличие любых признаков боли. Эта операция является гораздо менее инвазивна, чем первый и мышей обычно активны в течение 45 мин после того, как они пробуждения от анестезии. Однако, пусть мыши восстановить весь день, как кремний зонд необходимо стабилизировать в головном мозге.
5. Запись
- установки мыши головы исправлена на беговой дорожке. Снять шляпу гл
- Подключить усилитель записи и начните запись.
- В первый день, используйте микро привод для перемещения зонда кремния в пирамидальной слой гиппокампа. Каждый поворот по часовой стрелке винт перемещает хвостовик 200 мкм глубже. Отрегулируйте положение хвостовик медленно (~ 20-50 мкм, в то время) до появления пульсации колебания 13 и единица активности.
- В ближайшие дни, настроить положение голени и ждать ~ 1 час перед записью гиппокампа активность, в то время как мышь работает на поясе. Для поддержания качества сигнала хорошую запись на несколько дней, удалить жесткие объекты и низкий потолок от мыши ' s клетке, чтобы свести к минимуму вероятность шляпу натыкается на твердых поверхностях.
6. Восстановление зонд
- Положите мышь под наркозом.
- Установите мышь в стереотаксического аппарата путем фиксации головы пластины. Снять шляпу гл
- Принесите стереотаксического манипулятор чуть выше микро привод. Исправьте микро привод манипулятора. Отвинтите держатель разъема от головы пластины. Удалите винт, соединяющий оболочки и тела микро-привода.
- Под наблюдением бинокулярный микроскоп, медленно потяните вверх микро привод/кремния зонд сборка с стереотаксического манипулятора, оставив часть кожуха.
- Почистить кремния с устройство очистки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Мышь был сначала обучить работать на два метра длиной пояса лишенный сигналы (рис. 1 c). После имплантации электродов, новый ремень той же длины, но представляя 3 пары подсказки был установлен на беговой дорожке, чтобы генерировать аллоцентрическом пространственных представлений12,14. Широкополосные сигналы были записаны на дискретизации 30 000 Гц, используя систему 250-канальная запись (усилитель доска с платы USB интерфейс и по индивидуальному заказу Labview интерфейс) и два кремния зонды (рис. 1A, 4 хвостовик, 8 сайтов на хвостовик) имплантированных в СА1 и CA3 (рис. 1B). Единицы были обнаружены с помощью функции порог на отфильтрованные ВЧ-сигналов (0,8-5 кГц). Изоляция клетки была выполнена с использованием полуавтоматического Спайк, сортировка методом15,16,17. Движение вперед/назад беговой дорожке контролируется с помощью LED и фото датчик пары и записаны входных цифровых каналов записи системы.
В среднем 148±35 клеток (mean±s.e.m) могут быть изолированы в каждой сессии, среди которых 38.4±3.5% показал ясно место поля деятельности (рис. 2). Место поля были относительно стабильными через многие испытания, либо начальный день записи (рисунок 2A) или после нескольких дней воздействия снабженные ремня (рис. 2B и 2 c рисунок). Можно выделить различные типы пространственных представлений. Некоторые клетки показали неоднократные место поля коррелирует с удостоверением сигналы (рисунок 2A), в то время как другие клетки показали уникальное место поля (рис. 2 c)12. Таким образом мы могли бы записать Нейроны гиппокампа места в течение нескольких дней и выявить разнообразие механизмов поля, двумя важными инструментами, необходимыми для изучения механизмов и динамики, связанные с пространственной навигации, обучения и памяти.
Рисунок 1: кремния зонд и беговая дорожка аппарат. (A) хвостовика и сайт макет кремния зонда. (B) сайт имплантации. (C) аппарат беговая дорожка и расположение подсказки на поясе. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: хронические запись место клеток. (A) цветом представление место поля (вверху), Спайк auto-correlogram (внизу слева) и Спайк сигналов (внизу справа) на примере ячейки, записанные на 1 день. (B-C) Же, как (A) для клетки примеры записаны на день 3 (B) и день 5 (C). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Хронический записи активности нейронов имеет решающее значение для понимания нервные процессы такие как гиппокампа место поля. Наш подход для выполнения хронических кремния зонд implantantation отличается от других методов7,18,19,20 , тот факт, что это довольно просто восстановить пакет электрода на в конце эксперимента. В то время как место клетки обычно изучаются в свободно перемещающихся условий, беговая дорожка аппарат не только существенно упрощает экспериментальный дизайн и анализ данных, он также позволяет исследователям анализировать поле механизмы в минимальной контекстах во время много повторов стереотипных траекторий животных12. Это также намного проще построить, чем систем виртуальной реальности, так как он только требует 3D-печати колеса, одномерный датчики и микроконтроллер.
Стабильное место поля деятельности могут быть записаны в течение многих дней, важным условием для изучения долгосрочной динамики сети, связанные с обучением. В этой связи следует рассматривать некоторые вопросы. Во-первых процессы формирования мозга ткани дегенерация и шрам вокруг силиконовые зонды могут сами генерировать долгосрочные колебания в деятельности структуры. Поэтому важно для всех хирургических процедур сделать тщательно, чтобы вызвать минимальное повреждение тканей мозга и кровеносные сосуды. Во-вторых это довольно трудно отслеживать отдельные клетки над дней подряд, из-за сугробы электродов в мозг14. В этой связи методы визуализации, такие как двух Фотон микроскопии и микро эндоскопия может быть лучше подходит, как клетки личность можно проследить от морфологии и пространственной конфигурации клетки21,22,23 . Они также позволяют большей доходности в перспективе количество клеток Записанная и предоставлять прямую информацию о выражения гена клетки24. Однако методы визуализации вполне инвазивные, когда глубокие мозга обеспокоены и не удается разрешить один потенциалы действия, как они главным образом полагаться на сигналы кальция. Таким образом оптимальное решение для продольных исследований может быть сочетание оптических и электрофизиологические подходов.
Наконец стоит отметить, что набор методов, которые мы описали могут быть легко адаптированы для других типов электродов, в том числе Neuropixels (https://www.janelia.org/lab/harris-lab-apig) и optrodes11,25 , 26и может использоваться в диапазоне экспериментальных моделей помимо клеток гиппокампа место. Быстрый прогресс в технологии 3D-печати дальнейшее совершенствование и настройки устройств записи и поведенческих должно стать более простой и доступной для лаборатории.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Корейский институт науки и технологии институциональной программы (проекты № 2E26190 и 2E26170) и программу человека пограничной науки (RGY0089/2012).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Silicon Probe | Neuronexus | Buzsabi32 | Recording electrode |
| Recording system | Intantech | RHD2132/RHD2000 | |
| 3D printer | Asiga | Pico Plus 27 | High resolution printer for micro-drive |
| 3D printer | Stratasys | Mojo | Lower resolution printer for hat components |
| Stereotaxic apparatus | Kopf | Model 963 | |
| Binocular microscope | Leica | M60 | |
| Treadmill apparatus | We build them |
References
- Schjetnan, A. G., Luczak, A. Recording large-scale neuronal ensembles with silicon probes in the anesthetized rat. J Vis Exp. (56), (2011).
- Buzsaki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nat Neurosci. 7 (5), 446-451 (2004).
- Suner, S., Fellows, M. R., Vargas-Irwin, C., Nakata, G. K., Donoghue, J. P. Reliability of signals from a chronically implanted, silicon-based electrode array in non-human primate primary motor cortex. IEEE Trans Neural Syst Rehabil Eng. 13 (4), 524-541 (2005).
- Csicsvari, J., et al. Massively parallel recording of unit and local field potentials with silicon-based electrodes. J Neurophysiol. 90 (2), 1314-1323 (2003).
- Hochberg, L. R., et al. Neuronal ensemble control of prosthetic devices by a human with tetraplegia. Nature. 442 (7099), 164-171 (2006).
- Okun, M., Lak, A., Carandini, M., Harris, K. D. Long Term Recordings with Immobile Silicon Probes in the Mouse Cortex. PLoS One. 11 (3), e0151180 (2016).
- Vandecasteele, M., et al. Large-scale recording of neurons by movable silicon probes in behaving rodents. J Vis Exp. (61), e3568 (2012).
- Kipke, D. R., et al. Advanced neurotechnologies for chronic neural interfaces: new horizons and clinical opportunities. J Neurosci. 28 (46), 11830-11838 (2008).
- Royer, S., et al. Control of timing, rate and bursts of hippocampal place cells by dendritic and somatic inhibition. Nat Neurosci. 15 (5), 769-775 (2012).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale genetically targeted optical control of neural activity. Nat Neurosci. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. Eur J Neurosci. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Geiller, T., Fattahi, M., Choi, J. S., Royer, S. Place cells are more strongly tied to landmarks in deep than in superficial CA1. Nat Commun. 8, 14531 (2017).
- Ylinen, A., et al. Sharp wave-associated high-frequency oscillation (200 Hz) in the intact hippocampus: network and intracellular mechanisms. J Neurosci. 15 (1 Pt 1), 30-46 (1995).
- Battaglia, F. P., Sutherland, G. R., McNaughton, B. L. Local sensory cues and place cell directionality: additional evidence of prospective coding in the hippocampus. J Neurosci. 24 (19), 4541-4550 (2004).
- Hazan, L., Zugaro, M., Buzsaki, G. Klusters, NeuroScope, NDManager: a free software suite for neurophysiological data processing and visualization. J Neurosci Methods. 155 (2), 207-216 (2006).
- Kadir, S. N., Goodman, D. F., Harris, K. D. High-dimensional cluster analysis with the masked EM algorithm. Neural Comput. 26 (11), 2379-2394 (2014).
- Lewicki, M. S. A review of methods for spike sorting: the detection and classification of neural action potentials. Network. 9 (4), R53-R78 (1998).
- Battaglia, F. P., et al. The Lantern: an ultra-light micro-drive for multi-tetrode recordings in mice and other small animals. J Neurosci Methods. 178 (2), 291-300 (2009).
- Blumberg, M. S., Sokoloff, G., Tiriac, A., Del Rio-Bermudez, C. A valuable and promising method for recording brain activity in behaving newborn rodents. Dev Psychobiol. 57 (4), 506-517 (2015).
- Haiss, F., Butovas, S., Schwarz, C. A miniaturized chronic microelectrode drive for awake behaving head restrained mice and rats. J Neurosci Methods. 187 (1), 67-72 (2010).
- Dombeck, D. A., Khabbaz, A. N., Collman, F., Adelman, T. L., Tank, D. W. Imaging large-scale neural activity with cellular resolution in awake, mobile mice. Neuron. 56 (1), 43-57 (2007).
- Villette, V., Malvache, A., Tressard, T., Dupuy, N., Cossart, R. Internally Recurring Hippocampal Sequences as a Population Template of Spatiotemporal Information. Neuron. 88 (2), 357-366 (2015).
- Ziv, Y., et al. Long-term dynamics of CA1 hippocampal place codes. Nat Neurosci. 16 (3), 264-266 (2013).
- Danielson, N. B., et al. Distinct Contribution of Adult-Born Hippocampal Granule Cells to Context Encoding. Neuron. 90 (1), 101-112 (2016).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. J Neurophysiol. 108 (1), 349-363 (2012).
- Wu, F., et al. An implantable neural probe with monolithically integrated dielectric waveguide and recording electrodes for optogenetics applications. J Neural Eng. 10 (5), 056012 (2013).
