Summary
ويصف هذا البروتوكول التحديد الكمي لأهداف سيتوكين متعددة في وقت واحد في supernatants ثقافة الأنسجة التي تم جمعها من سبلينوسيتيس الماوس حفز استخدام حبة متعدد المناعة استناداً إلى النظام الأساسي وسيتوميتير تدفق.
Abstract
تحديدكم المستندة إلى حبة تستخدم نفس المبدأ الأساسي تحديدكم ساندويتش. التقاط الخرز، التي يمكن أن تكون متباينة من حيث الحجم والكثافة الأسفار الداخلية اللوفيكوسيانين (APC)، وهي مترافق للأجسام المضادة المحددة إلى أكثر خاصة. وبعد ذلك، هو المحتضنة لوحة مختارة من مجموعات حبة التقاط محددة مع عينة بيولوجية تحتوي على تحليلها المستهدفة المحددة لالتقاط الأجسام المضادة. يتم إضافة جسم كشف بيوتينيلاتيد كوكتيل، الأمر الذي يؤدي إلى تشكيل التقاط السندوتشات حبة-أكثر-كشف الأجسام المضادة.
وأخيراً، إضافة ستريبتافيدين-فيكوريثرين (SA-PE)، الذي يربط بيوتينيلاتيد الكشف عن الأجسام المضادة، توفير كثافات الفلورسنت إشارة ما يتناسب مع كمية أكثر منضم. PE الفلورسنت إشارة مناطق الخرز أكثر حدة هو كمياً استخدام التدفق الخلوي، وتركيزات معينة تحليلها مصممون على استخدام برمجيات تحليل البيانات والمنحنى المعياري ولدت في المقايسة.
في هذه التجربة، نحن نستخدم لوحة سيتوكين مساعد تي ماوس لقياس تركيز 13 أهداف سيتوكين منفصلة في supernatants ثقافة الأنسجة التي تم جمعها من الماوس سبلينوسيتيس مثقف تحت مختلف الظروف تنشيطية في وقت واحد.
Introduction
في دورها كجزيئات إرسال الإشارات للذوبان، السيتوكينات التوسط في عمليات منسقة للغاية والمتعددة العوامل التي تحكم المضيف الاستجابات المناعية. أنها يتم التعبير عنها من خلال جميع مراحل عملية تحريضية، من البدء بالقرار، وتنظيم شبكة تفاعل معقد الذي يشمل التوليف الخاصة بهم، وأن تلك المستقبلات الخلوية1. شبكة الاتصالات هذه الطبقات مع تعقيد الذي يذهب إلى أبعد من علاقات التآزر أو العدائية التي قد تكون موجودة بين المكونات الفردية. وفي الواقع، معروفة السيتوكينات العديد من تقاسم الوظائف الزائدة عن الحاجة أو متداخلة جزئيا على الأقل2،3.
النهج بيولوجيا النظم المتكاملة التي كمياً تحليلها سيتوكين متعددة في نفس الوقت تقوم حاليا بتوفير فهم شامل متزايد سيتوكينوميس الفريدة التي تنسق الاستجابات المناعية الكامنة وراء المرض متعددة الدول4،5. هذه المرض الدول مجموعة من التهاب المعمم للسرطان والشروط التنكسية العصبية وأمراض القلب والأوعية الدموية6،7،،من89.
يمكن استجوابهم هذه الشبكات سيتوكين فعالية استخدام تحديدكم المستندة إلى حبة ليجيندبليكس. هذه الاختبارات تستند على نفس المبدأ ساندويتش Enzyme-Linked المرتبط بالانزيم (ELISA)، واستخدام fluorescence ترميز الجزئي المجالات الخرز الصغير بالتقاط الأجسام المضادة تساهمي تعلق على سطحها. هذه الأجسام المضادة هي المعطل تداولها في المناطق السطحية أصغر بكثير من تلك التي يتطلبها التقليدية أليسا تنسيقات. وهذا يتيح هذه الاختبارات تتم مع أقل بكثير من حجم العينة، بينما في الوقت نفسه الحد غير محددة ملزمة وتوفير متعدد تحليل لتحليلها عدة.
الفحص المبينة في هذا البروتوكول يستخدم هذه التكنولوجيا قوانتيتاتي تصل إلى 13 أهداف في وقت واحد. البيانات المستمدة من هذا التحليل يمكن الحصول عليها باستخدام مجموعة متنوعة من سيتوميتيرس تدفق المتاحة عموما، وعلى عكس الاختبارات الأخرى المتاحة لا تتطلب استخدام الأجهزة الخاصة بفحص مخصص. مع ملف كتالوج الآخذة في اتساع من لوحات أكثر تم التحقق من صحتها، استخدمت هذه الاختبارات في عدة البحوث الطبية الحيوية الجارية مشاريع10،11،،من1213.
للبرهنة على سهولة وفائدة تنسيق المقايسة، في هذه التجربة نستخدم لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس" إلى كوانتيتاتي فصل 13 تركيزات سيتوكين من supernatants ثقافة الأنسجة التي تم الحصول عليها من سبلينوسيتيس الماوس مثقف تحت متعددة شروط محفزة. بالإضافة إلى زراعة الأنسجة سوبيرناتانتس، هذا التحليل يمكن أيضا إجراء باستخدام عينات المصل أو البلازما.
Protocol
جميع التجارب على الحيوانات وأجريت وفقا للمعاهد الوطنية للصحة التوصيات الواردة ضمن الدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية، ووافقت عليها إياكوك في بيوليجيند-
الرقم 1: تصفية لوحة الفحص الداخلي موجز. ويمثل البروتوكول لإجراء الفحص استخدام لوحات تصفية كرسم تخطيطي يصور المكونات الرئيسية المقايسة وحضانة الخطوات. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
1-"إعداد العينات البيولوجية"
ملاحظة: الموقع المختار التشريحية والحجم لجمع الدم متروك للسلطة التقديرية لكل محقق فردية ولن تؤثر على نتائج الفحص. ومع ذلك، حالما يتم الحصول عليها، ينبغي معالجة العينات وفقا للخطوات المذكورة أدناه-
- جمع وحدة التخزين المطلوبة من الدم إلى أنبوب جمع المفضل والسماح لها بتجلط لمالا يقل عن 30 دقيقة من إعداد عينات مصلية
- الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 1,000 س ز في درجة حرارة الغرفة-
- إزالة المصل والمقايسة فورا أو قاسمة في أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي وتخزين العينات في ≤-20 درجة مئوية.
- إعداد عينات البلازما
- جمع المغلفة وحدة التخزين المطلوبة من الدم حمض الإيثيلين (يدتا) باستخدام أنابيب جمع الدم.
- الطرد المركزي عن 10 دقيقة في 1,000 س ز في درجة حرارة الغرفة داخل 30 دقيقة لجمع.
- إزالة البلازما والمقايسة فورا، أو قاسمة في أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي وتخزين العينات في ≤-20 درجة مئوية.
- إعداد عينات الأنسجة ثقافة طافية
- الطرد المركزي العينة لمدة 10 دقيقة في 1,500 س ز عند 4 درجة مئوية لإزالة الحطام وخلايا.
- جمع المادة طافية والمقايسة فورا أو قاسمة إلى أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي وتخزينها في ≤-20 درجة مئوية.
- ذوبان الجليد من تجميد عينات بيولوجية
- الذوبان تماما أي عينات بيولوجية المجمدة سابقا على الجليد، ودوامه بإيجاز قبل الاستخدام. تجنب دورات تجميد/ذوبان الجليد أكثر من 2.
ملاحظة: تم الحصول على العينات المستخدمة في هذا البروتوكول باستزراع سبلينوسيتيس الماوس بالب/c (1 × 10 6 خلايا في 37 ° C + 5% CO 2 تحت ظروف مختلفة: أونستيمولاتيد، لبس (100 نانوغرام/ملليلتر)، αCD3 (1 ميكروغرام/مل المغلفة بلوحة) + αCD28 (1 ميكروغرام/مل القابلة للذوبان)، سلطة النقد الفلسطينية (20 نانوغرام/مل) + إيونوميسين (500 نانوغرام/ملليلتر). Supernatants ثقافة وجمعت بعد 48 ساعة ومعالجتها كما هو موضح في القسم 1.3.
- الذوبان تماما أي عينات بيولوجية المجمدة سابقا على الجليد، ودوامه بإيجاز قبل الاستخدام. تجنب دورات تجميد/ذوبان الجليد أكثر من 2.
2. إعداد كاشف
- حبات Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized
- سنكيت الخرز قبل مختلطة زجاجة لمدة 1 دقيقة في حمام سونيكاتور في درجة حرارة الغرفة، ودوامه آنذاك عن 30 ثانية قبل الاستخدام. في حالة توفر لا حمام سونيكاتور، زيادة وقت دوامة بمقدار 1
- إعداد المخزن أغسل
- إحضار 20 x "يغسل المخزن المؤقت" (برنامج تلفزيوني 20 x % 1 توين-20) المتوفرة مع هذه المجموعة إلى درجة حرارة الغرفة ودوامه لإحضار جميع الأملاح إلى الحل.
- تمييع 25 مل 20 x العازلة يغسل بماء منزوع 475 مل. تخزين الجزء غير المستعمل بين 2 درجة مئوية و 8 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
- إعداد مصفوفة ب (للاستخدام مع المصل وعينات البلازما فقط)
- إضافة مل 5.0 الإنزيم المخزن المؤقت (برنامج تلفزيوني مع جيش صرب البوسنة 1 ٪) في الطقم إلى زجاجة تحتوي على المجففة بالتبريد مصفوفة ب السماح على الأقل 15 دقيقة لكامل ريكونست إيتوشن، ثم دوامة مزيج جيد. يمكن تخزين بقايا "ب مصفوفة" المعاد تشكيلها في ≤-70 درجة مئوية لمدة تصل إلى شهر واحد.
3. إعداد معيار
ملاحظة: كل أكثر في هذا الفريق لديه تركيز معيار أعلى من 10,000 بيكوغرام/مل.
- ميليلتر 250 إضافة الإنزيم المخزن المؤقت إعادة تشكيل المجففة بالتبريد "الماوس Th سيتوكين القياسية كوكتيل". مزيج من فورتيكسينج بإيجاز وتسمح القنينة للجلوس في درجة حرارة الغرفة للحد الأدنى 10 نقل
- كوكتيل القياسية لأنبوب ميكروسينتريفوجي البولي بروبلين المسمى " C7 ". وهذا سوف تستخدم كمعيار الأعلى.
- أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي 6 التسمية ك C6 C5، C4، C3, C2 و C1.
- ميليلتر 75 إضافة الإنزيم المخزن المؤقت لكل من هذه الأنابيب-
- نقل 25 ميليلتر من C7 القياسية الأعلى إلى أنبوب C6 ومزيج جيد من قبل فورتيكسينج. وسيكون هذا المعيار C6.
- متابعة أداء المسلسل تخفيف 1:4 باستخدام بيبيت جديد نصيحة لكل أنبوبة لإضافة 25 ميليلتر من المعيار السابق إلى ميليلتر 75 من "المخزن المؤقت للفحص" في أنبوب معيار أدنى المقبل تليها فورتيكسينج للحصول على معايير C5، C4، C3 ، C2 و C1. استخدام "المخزن المؤقت للفحص" كمعيار 0 pg/mL (C0).
4. عينة تمييع
ملاحظة: تجارب رائدة الأولية باستخدام هذا التحليل مع تخفيف متعددة قد تكون مطلوبة تحديد أنسب عامل تخفيف لمجموعة معينة من العينات البيولوجية. سوف تنتج عامل تخفيف مناسبة تركيز العمليات الحسابية للعينة التي تقع داخل حدود المنحنى القياسي. الخطوات التالية هي يعني كمبادئ توجيهية، وقد يتحدد تجريبيا تبعاً لنوع العينة.
- ديلوتى المصل أو البلازما عينات 2-fold مع "المخزن المؤقت للفحص" (مثال. تمييع 50 ميكروليتر من عينة مع 50 ميليلتر من المخزن المؤقت للمقايسة) في أنابيب البولي بروبلين ميكروسينتريفوجي.
ملاحظة: إذا كان كذلك مطلوب تمييع عينة، تخفيف وينبغي أن يتم مع "مصفوفة ب" بدلاً من المخزن المؤقت للفحص لضمان دقة القياس. إضافة عينات المصل أو البلازما دون تمييع سيؤدي إلى دقة التحليل منخفضة وقد تسد طبق عامل التصفية. مصفوفة ب يتكون من المصل التجميعي الماوس المنضب لأهداف التحليل الذاتية. يتم استخدامه كعينة المصل أو البلازما مادة لتجنب الآثار مصفوفة، والتي من المعروف أن تؤثر على حساسية تحليلية تحديدكم.
خلية - اختبار عينات طافية الثقافة دون تمييع.
ملاحظة: يمكن أن تختلف مستويات أكثر كثيرا من عينة بعينه. إذا لزم الأمر، تمييع طافية العينات باستخدام إعداد طازجة المتوسطة ثقافة الخلية المقابلة أو "المخزن المؤقت للمقايسة".
5. الاعتداء الداخلي
ملاحظة: يمكن أن يؤديها المقايسة في لوحات البولي بروبلين تصفية أو الأنابيب الصغيرة نظام مراقبة الأصول الميدانية ميكروبلاتيس الخامس لأسفل. ينصح إجراء المقايسة لوحة تصفية بسبب حسن عينة إلى عينة الاتساق ومتانة المقايسة، وسهولة التعامل. يتطلب هذا الإجراء وحدة ترشيح فراغ للغسيل (المقدمة من المستعملين النهائيين).
- تسمح جميع الكواشف الحارة إلى درجة حرارة الغرفة (20-25 درجة مئوية) قبل استخدام.
- مجموعة لوحة تصفية على غطاء لوحة مقلوبة في جميع الأوقات أثناء خطوات الإعداد وحضانة المقايسة، حيث أن الجزء السفلي من اللوحة ولا تلمس أي السطوح كما أنها قد تسبب تسرب.
- تبقى اللوحة منتصبا أثناء إجراء فحص كامل، بما في ذلك خطوات الغسيل، لتجنب فقدان الخرز.
- إبقاء اللوحة في الظلام أو ملفوفة برقائق الألومنيوم لكل حضانة الخطوات.
- تشغيل جميع المعايير والعينات كالتكرارات، رتبت على اللوحة في ترتيب تسلسلي.
- قبل الرطب لوحة التصفية عن طريق إضافة 100 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل بئر والسماح لها الجلوس لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (في حالة استخدام الميكروسكوبية تصفية السفلي)-
- إزالة حجم المخزن المؤقت باستخدام المشعب فراغ (5-10 ق). لا تتجاوز 10 " Hg فراغ. أغسل الزائدة وصمة عار المخزن المؤقت من الجزء السفلي من اللوحة بالضغط على اللوحة في كومة من المناشف الورقية النظيفة. وضع لوحة على أعلى الغطاء لوحة المقلوب.
ملاحظة: قد تكون حذف الخطوات 5، 1-5، 2 إذا كان أداء الفحص استخدام V-أسفل ميكروسكوبية أو الجزئي أنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية- - لخليه ثقافة عينة طافية، إضافة 25 ميليلتر من "المخزن المؤقت للفحص" لجميع الآبار. إضافة 25 ميليلتر لكل معيار للآبار القياسية. إضافة 25 ميليلتر من كل عينة إلى الآبار عينة-
- لقياس عينات المصل أو البلازما، إضافة 25 ميليلتر من "مصفوفة ب" إلى الآبار القياسية. إضافة 25 ميليلتر من "المخزن المؤقت للمقايسة" للآبار عينة. إضافة 25 ميليلتر لكل معيار للآبار القياسية. إضافة 25 ميليلتر من كل من المصل المخفف أو عينة البلازما للآبار عينة-
- دوامة مختلطة الخرز ل 30 ميليلتر إضافة 25 س. من حبات مختلطة لكل بئر، تهز زجاجة حبة بشكل متقطع لتجنب حبة تسوية. يجب أن تكون وحدة التخزين النهائي ميليلتر 75 في كل بئر بعد إضافة الخرز.
- ختم اللوحة مع السدادة لوحة. التفاف لوحة كاملة، بما في ذلك غطاء لوحة مقلوب، مع رقائق الألومنيوم. وضع اللوحة على شاكر لوحة وتأمينه ويهز حوالي 500 لفة في الدقيقة ح 2 في درجة حرارة الغرفة. لمنع تسرب، لا يتم تطبيق الضغط الإيجابي على السدادة صفيحة.
- دون عكس، ضع اللوحة في فراغ المتشعبة وتطبيق فراغ كما كان من قبل وإضافة 200 ميليلتر من 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل بئر.
- إزالة محتويات الآبار لوحة الفحص عن طريق الترشيح فراغ. لطخة العازلة الغسيل الزائد من الجزء السفلي من اللوحة مع لوحة ماصة أو مناشف ورقية. كرر هذه الخطوة مرة أخرى.
ملاحظة: إذا كان يتم إجراء الفحص استخدام الأصول ميكروسكوبية أو الجزئي الخامس-أسفل أنابيب تخطي الخطوتين 5.12 و 5.13. بدلاً من ذلك الطرد المركزي اللوحة في 1,000 س ز لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة، ثم إزالة المادة طافية ماصة متعددة باستخدام- - إضافة 25 ميليلتر من الكشف عن الأجسام المضادة (انظر الجدول للمواد) لكل بئر.
- ختم اللوحة مع السدادة لوحة جديدة. التفاف لوحة كاملة، بما في ذلك غطاء لوحة مقلوب، مع رقائق الألومنيوم.
- وضع اللوحة على شاكر لوحة ويهز حوالي 500 لفة في الدقيقة ح 1 في درجة حرارة الغرفة-
- دون كنس، إضافة 25 ميليلتر من كاشف سا-PE مباشرة لكل بئر. لا تمييع كاشف ضروري-
- ختم اللوحة مع السدادة لوحة جديدة. التفاف لوحة كاملة، بما في ذلك غطاء لوحة مقلوب، مع رقائق الألومنيوم.
- وضع اللوحة على شاكر لوحة ويهز حوالي 500 لفة في الدقيقة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة-
- كرر الخطوة أعلاه 5.13.
- ميليلتر إضافة 200 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل بئر. إعادة تعليق الخرز على شاكر طبق للحد الأدنى 1
- باستخدام بيبيت الأقنية، نقل عينات من لوحة تصفية لأنابيب نظام مراقبة الأصول الميدانية لقراءة عينات في سيتوميتير تدفق.
ملاحظة: حجم العينة يمكن زيادة من ميليلتر 200 إلى 300 ميليلتر بإضافة ميليلتر إضافية 100 1 × المخزن المؤقت للمياه والصرف الصحي لكل أنبوبة لتجنب العينة قيد التشغيل الجاف. إذا كان يمكن تخزين العينات اللازمة في 4 درجات مئوية محمية من الضوء وحللت في اليوم التالي. بيد تخزين العينة فترة طويلة يمكن أن يؤدي إلى انخفاض إشارة-
6. تدفق الإعداد سيتوميتير
ملاحظة: من أجل توليد البيانات الموثوقة، سيتوميتير تدفق يجب إعداد بشكل صحيح قبل الحصول على البيانات. وستختلف هذه العملية للمستخدمين الفرديين في ما يخص بعض اعتماداً على تكوين صك خاص يقوم الفحص على. عملية إعداد معمم سيتوميتير قادرة على قياس PE، وآسيا والمحيط الهادئ ومجهزة بكل 488 و 633 نانومتر ليزر الموضحة أدناه.
- بدء تدفق سيتوميتير واقتناء البرامج وفقا للشركة المصنعة ' s الإرشادات المتوفرة مع الصك. إنشاء
- مؤامرة دوت مع منتدى التعاون الأمني (الأمام مبعثر) على المحور السيني والتعاون بين بلدان الجنوب (الجانب مبعثر) على المحور الصادي. تعيين منتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب إلى النمط الخطي. إنشاء
- مؤامرة نقطة ثانية مع PE على المحور السيني والجيش الشعبي الكونغولي للمحور ص. يجب تعيين هذه الأرض إلى وضع عرض على أساس سجل.
- دوامة قنينة الخرز الخام في الطقم لمدة 30 ثانية إعادة تعليق الخرز. هذه الخرز تحتوي صبغ APC داخلية وهي تتألف من اثنين حجم السكان-
- نقل 400 ميليلتر من الخرز الخام إلى أنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية جديد.
- تعيين معدل تدفق cytometer التدفق المنخفض.
- تشغيل الخرز الخام، بعناية ضبط المكاسب والجهد لمنتدى التعاون الأمني، والتعاون بين بلدان الجنوب حيث تكون كل حجم السكان من هذه الخرز واضح المنفصلين عن ذويهم وسهلة للبوابة.
- ضبط عتبة منتدى التعاون الأمني لاستبعاد الأحداث غير المرغوب فيها (أي فقاعات الهواء أو الحطام).
- الأرض في منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب، رسم بوابة التي تشمل جميع السكان حبة.
ملاحظة: الخرز الخام تحتوي على اثنين حجم السكان من الخرز، أصغر " خرز " وأكبر " ب حبة " المناطق. - عرض السكان حبة مسور من المؤامرة منتدى التعاون الأمني مقابل SSC في المؤامرة النقطة الثانية مع PE على المحور السيني والجيش الشعبي الكونغولي للمحور ص.
- ضبط الجهد PMT للقناة fluorescence APC بحيث إشارة الجيش الشعبي الكونغولي لكل حبة السكان قد fluorescence متوسط كثافة (MFI) التي تقع بين 1 × 10 1 و 5 × 10 3-
- دوامة قنينة الإعداد PE الخرز لمدة 30 ثانية إعادة تعليق الخرز.
- الخرز نقل 400 ميليلتر من المؤسسة العامة لأنبوب نظام مراقبة الأصول الميدانية جديد.
- استبدال أنبوب الخرز الخام من سيتوميتير التدفق مع PE الخرز الأنبوبة.
- ضبط الجهد (PMT) أنبوب ضوئي PE الأسفار قناة الإعداد حيث أن مؤسسة مونتانيار الخرز PE يقع بين طائفة محددة الكثير وجدت المدرجة على القنينة الخرز PE.
ملاحظة: الخرز الإعداد PE يحتوي على الخرز حجم السكان واحد (" خرز " فقط)-
7. الحصول على البيانات
ملاحظة: الإجراءات الدقيقة المرتبطة بالحصول على بيانات بشأن صك معين يمكن أن تختلف وهي تعتمد على سيتوميتير ' s تكوين المواصفات والبرمجيات واجهة المستخدم. ولذلك تهدف الإرشادات أدناه لتسليط الضوء على الخطوات المطلوب اتخاذها في التحليل بغض النظر عن سيتوميتير المستخدمة في الفحص.
- التحقق من معدل التدفق سيتوميتير لا يزال يتم تعيين إلى منخفض.
- تعيين عدد الأحداث حبة الحصول عليها إلى حوالي 300 الواحدة أكثر. ل 13-من نوع plex مجتمعة الفريق هذا يساوي الحصول على الأحداث 3,900 من كل حبة حجم السكان (ألف + باء الخرز)-
- دوامة كل عينة ل 5 s قبل التحليل- عينات
- القراءة. عند قراءة عينات، تعيين cytometer التدفق إلى وضع الإعداد الأولى وانتظر حتى استقرت حبة السكان قبل التبديل إلى وضع اقتناء.
- استخدام أسماء بسيط مع ترقيم متعاقبة لملفات البيانات لتسهيل تحليل البيانات-
- تصدير الأحداث بوابات فقط (ألف + باء حبة المناطق) بدلاً من مجموع الأحداث.
- تخزين جميع FCS الملفات في نفس المجلد لكل فحص. إذا تشغيل فحوصات متعددة، قم بإنشاء مجلد منفصل لكل مقايسة.
ملاحظة: ينبغي تحليله FCS الملفات التي تم إنشاؤها في سيتوميتير التدفق باستخدام برنامج تحليل البيانات، التي يمكن تحميلها مجاناً 14-
- تثبيت برنامج تحليل البيانات على جهاز كمبيوتر.
- نقل جميع المقايسة FCS الملفات إلى الكمبيوتر الذي يحتوي على برنامج التحليل.
- دونغل مفتاح الترخيص (ضمن الطقم) بتوصيل بمنفذ USB للكمبيوتر-
- بدء تشغيل برنامج تحليل البيانات-
- انقر فوق الأزرق " "إضافة ملفات" " الزر الموجود في الجزء العلوي من الشاشة.
- انتقل إلى المجلد الذي يحتوي على ملفات FCS من التحليل في يطفو على السطح نافذة تظهر.
- انقر واسحب كافة الملفات المقايسة FCS من يطفو على السطح نافذة لعرض البرامج. الآن يجب أن تظهر كافة الملفات في قائمة- انقر فوق
- الأخضر " القادم " الزر في أسفل يمين الشاشة. الأيسر باستمرار لسحب الصغيرة أزرار الأزرق المنحنى المعياري (C7 إلى C0) إلى ملفاتهم FCS المطابق من القائمة لتحديد المنحنى القياسي.
- انقر فوق الأخضر " القادم " الزر في أسفل يمين الشاشة لفتح النابضة يطفو على السطح نافذة.
- على الجانب الأيسر من الإطار النابضة بإدخال الأسماء من كل ألف وب حبة مناطق الاعتداء أهدافا أكثر ومعرف حبة المرتبطة بها (موجود في الدليل المزودة المقايسة) في ترتيب تصاعدي.
- قم بتحديد أداة النابضة من الجزء العلوي من يطفو على السطح نافذة واستخدامها لرسم غيتس 2 في المؤامرة منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب، وواحدة حول الخرز A وثانية حول الخرز ب.
- استعراض APC مقابل PE مبعثر المؤامرات التي تظهر أسفل الأرض منتدى التعاون الأمني مقابل التعاون بين بلدان الجنوب التي تظهر. سيكون هناك 6 نطاقات أكثر في الخرز A (اليسار الأرض) ونطاقات أكثر 7 في الخرز ب (حق الأرض)-
ملاحظة: غيتس قد تكون redrawn يدوياً باختيار أداة الممحاة في الجزء العلوي والنقر فوق حذف منفذ معين. ثم يمكن تحديد الأداة النابضة والمستخدمة لتطبيق بوابة يدوياً إلى منطقة الشريط المطلوب. - انقر فوق الأخضر " موافق " زر إغلاق النابضة يطفو على السطح نافذة والعودة إلى قائمة الملفات FCS.
- تحديد أي تخفيف أدلى الحق النقر فوق ملف معين، واختيار العينات البيولوجية " "إضعاف إضعاف" " من القائمة، وإدخال القيمة الصحيحة.
- انقر فوق الأخضر " تشغيل " الزر في أسفل يمين الشاشة لتوليد المنحنيات القياسية للمقايسة وحساب تركيزات العينات البيولوجية غير معروف.
Representative Results
هذا البروتوكول يوضح كيف يمكن استخدام منصة المستندة إلى حبة المناعة قوانتيتاتي في وقت واحد الملامح سيتوكين من العينات البيولوجية باستخدام cytometer تدفق. كانت العينات البيولوجية المستخدمة في هذا المثال supernatants ثقافة الخلية من الماوس سبلينوسيتيس أنه قد تم سابقا المحتضنة تحت شروط تفعيل مختلف، على الرغم من أن شكل المقايسة كما تم التحقق من للاستخدام مع عينات المصل أو البلازما.
وتستخدم البيانات الناتجة من الفحص تشييد المنحنيات القياسية لجميع التحاليل في الفريق متعدد. برنامج تحليل البيانات يصنف كل أكثر خاصة استناداً إلى حجم حبة فريدة من نوعها وكثافة آسيا والمحيط الهادئ، ويوضحها لهم استخدام مراسل PE. وأظهرت النطاقات الحيوية، فضلا عن حساسية المقايسة عندما تآمروا على نطاق سجل--سجل في الشكل 2A. يستخدم البرنامج بيانات الفحص وخوارزميه ملائمة منحنى 5-المعلمة لدقة حساب تركيزات تحليلها في المستخدم ليس فقط قدمت عينات بيولوجية ولكن أيضا حدود الكشف عن نهاية جميع المنحنيات القياسية (1 الجدول عالية ومنخفضة ). كما يوفر التنسيق المبينة في هذا البروتوكول المقايسة قوية عالية الدقة. وترد البيانات في الشكل 2 (ب) و 2 (ج) تصور تباين الفحص داخل كل أكثر. تم تحليل تركيزات البروتين القياسية منفصلة اثنين (ارتفاع وانخفاض) في تحليل واحد مع replicates 16 لكل عينة. يمثل الرقم 2 و 2D تقلب المقايسة بين الوكالات لتحليلها المستهدفة من ثلاثة فحوصات مستقلة. كما مع التجارب الدقة داخل-المقايسة، حللت التركيزات القياسية العالية والمنخفضة مع 3 وإنشاء نسخ متماثلة في كل من التجارب المستقلة. تقلب الدنيا في تركيز البروتينات المستهدفة المحسوبة واضحة للعيان.
بغية إظهار فائدة فحوصات سيتوميتريك القائم على حبة في استجواب سيتوكين التعبير الملامح، كانت المحتضنة الماوس سبلينوسيتيس تحت ظروف تفعيل مختلف. بالإضافة إلى عنصر تحكم أونستيمولاتيد، كانت الخلايا المحتضنة أيضا مع لبس والأجسام المضادة-CD3/مكافحة-CD28، أو phorbol 12-ميريستاتي 13-خلات وإيونوميسين. وقد جمعت supernatants ثقافة الخلية ح 48 أحدث وجزيئي استخدام لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس". تمثل نتائج التقدير الكمي من هذه التجربة في الشكل 3 ، وأثر شروط التحفيز على تركيزات سيتوكين هو بوضوح.
النتائج المذكورة أعلاه نموذجية، طالما المجرب قد تقنية المختبرات الجيدة ويتبع البروتوكول المقايسة المقدمة. يمكن أن تنشأ مصادر الخطأ في هذا الشكل المقايسة من الانحرافات في أوقات الاحتضان، مجلدات كاشف، الغسيل، أو من غير لائق PMT إعدادات cytometer تدفق المستخدمة لتحليل العينات. في الشكل 4A مبعثر يظهر الأرض من مقايسة نجاح 2 السكان حبة المتميزة التي تم تعريفها بوضوح. ويمكن مقارنة هذا إلى الشكل 4 باء، التي أدت فيها الغسيل وبروتوكول التقيد بالفقراء إلى المجاميع حبة الذي طمس الشعبين. وباﻹضافة إلى ذلك، كما يتضح من تحت الأنقاض في الربع الأيسر السفلي، تم تصدير سيتوميتير مجموع الأحداث للتحليل بدلاً من الشكل المفضل لبوابة الأحداث فقط. سيتوميتير المناسبة إعداد أمر بالغ الأهمية لتوليد بيانات موثوقة في هذا التحليل. في 4 الشكل السليم PMT تسمح إعدادات لحل كل من تحليلها 6 في قناة تصنيف آسيا والمحيط الهادئ. سيؤدي إلى سوء PMT إعدادات بيانات مماثلة لتلك المعروضة في الشكل 4 فيها السكان حبة مع تداخل تصنيف الكثافات قناة آسيا والمحيط الهادئ. هذا سوف يبطل المقايسة نظراً لأنه سيكون من المستحيل لحساب تركيزات أكثر دون السكان محددة بوضوح من حبات المقايسة.
رقم 2: النطاقات المنحنى القياسي ودقة التحليل. (أ) ممثل منحنى المعياري التي تم إنشاؤها باستخدام لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس". يجب تشغيل منحنى قياسي بكل مقايسة. (ب-ج) الدقة داخل المقايسة. تم تحليل عينتين بتركيزات مختلفة من البروتينات المستهدفة (ارتفاع وانخفاض) في تحليل واحد مع replicates 16 لكل عينة. وتمثل البيانات يعني + الانحراف المعياري. (د-ه) دقة التحليل بين الوكالات. وتم تحليل عينتين بتركيزات مختلفة من البروتينات المستهدفة (ارتفاع وانخفاض) في ثلاثة فحوصات مستقلة مع replicates 3 لكل عينة. وتمثل البيانات يعني + الانحراف المعياري. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: القياس الكمي لنتائج الممثل. كانت مثقف سبلينوسيتيس الماوس (1 × 106 خلايا) عند 37 ° C + 5% CO2 تحت ظروف مختلفة: أونستيمولاتيد، لبس (100 نانوغرام/ملليلتر)، αCD3 (1 ميكروغرام/مل المغلفة بلوحة) + αCD28 (1 ميكروغرام/مل القابلة للذوبان)، سلطة النقد الفلسطينية (20 نانوغرام/ملليلتر) + إيونوميسين (500 نانوغرام/ملليلتر). Supernatants ثقافة جمعت بعد 48 ساعة ثم كمياً باستخدام لوحة سيتوكين مساعد "تي الماوس". تكون التشكيلات الجانبية للتعبير سيتوكين التفاضلية في الاستجابة لشروط التحفيز مرئية بوضوح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: نتيجة ناجحة مقابل فحوصات غير ناجحة. (أ) سيكون نجاح فحوصات السكان حبة متميزة للسكان ميكروسفيري. (ب) سيكون فحوصات غير ناجحة لفصل السكان الفقراء وحبه المجاميع، والعديد من الأحداث التي تم جمعها. (ج) نجاح فحوصات حددت بوضوح كثافة في قناة fluorescence التصنيف التي سهلة للبوابة وتحديدها كمياً. (د) فحوصات غير ناجحة سوف يكون ضعيف فصل وتصنيف الكثافات التي تتداخل مع السكان حبة متعددة، مما يجعل من الصعب التحديد الكمي. ويمكن تجنب العديد من هذه الأخطاء من خلال التقيد بالبروتوكول الفحص الدقيق. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| المنحنى المعياري | حساسية (pg/mL) | ||||
| أكثر | صيغة تناسب | السيرة الذاتية | R2 | دقيقة. | ماكس. |
| IFN-Γ | 5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) | 1.77 في المائة | 0.99 | 2.1 | 18105.0 |
| إيل-5 | 5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) | 1.32 في المائة | 1 | 1.9 | 14514.0 |
| تنف-Α | 5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) | 1.48 في المائة | 0.99 | 1.9 | 20109.0 |
| إيل-2 | 5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) | 1.34% | 1 | 1.9 | 25109.0 |
| إيل-6 | 5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37) | ||||
الجدول 1: تركيب المنحنى المعياري وتحليل الحساسية- واستخدمت برامج تحليل البيانات لإنشاء منحنيات قياسية لجميع التحاليل الواردة في التحليل متعدد. ينطبق على منحنى 5-معلمة قوية المناسب الخوارزمية إلى تمييع المعايير سلسلة من الفحص هذا التحليل مؤتمتة بالكامل وكانت تستخدم أيضا لتحديد حساسية الفحص باستخدام حدود النظرية للكشف.
Discussion
شكل الإنزيم الموصوفة في هذا البروتوكول يمكن أن توفر الكمي قوية للملامح وسيط قابل للذوبان في العينات البيولوجية التي قدمت المجرب قد تقنية المختبرات الجيدة وتلتزم بالبروتوكول الموصى بها.
وهناك العديد من الخطوات الأساسية التي ينبغي اتباعها من أجل ضمان نتائج موثوقة. أولاً، يجب أن يسمح بمعايير المؤتلف إعادة تشكيل في المخزن المؤقت للمقايسة كامل الوقت الموصى بها، وبعد إلا تضعف في أنابيب البولي بروبلين. أنابيب البوليستيرين يمكن تعزيز التمسك بالبروتينات الجدار الأنابيب، مما يمكن أن يؤدي إلى إشارات منخفضة عند إنشاء المنحنى المعياري. ثانيا، تهتز أثناء حضانة الخطوات المناسبة أمر بالغ الأهمية. دون الانفعالات المناسبة، يمكن أن تعوق شدة خصائص ربط الخرز المقايسة. وباﻹضافة إلى ذلك، الغسيل المناسبة بين الخطوات حضانة مطلوب أيضا. يجب ضمان المجرب إزالة الكواشف الزائدة من الآبار قبل البدء في الخطوة التالية في البروتوكول. يجب أن يكون الأمثل إعدادات الصكوك cytometer تدفق المستخدمة في استجواب الخرز المقايسة كذلك. على وجه الخصوص، يجب تعديل إعدادات PMT لضمان الفصل السليم حبة ونطاقات دينامية واسعة النطاق للمنحنيات القياسية. أخيرا، يجب أن حبات فقط قبل يجري تحليله في سيتوميتير، فورتيكسيد لضمان تعليق مناسب وتجنب تشكيل المجاميع التي يمكن أن تحرف النتائج.
يمكن تعديل هذا البروتوكول يحتمل أن تكون لتحليل الأنسجة هوموجيناتيس، فضلا عن أنواع نموذج بحث في هذه المخطوطة، شريطة الباحث على استعداد لتحسين بروتوكول تحلل بها قبل إجراء فحوصات لوحة كبيرة وكاملة. تقنية الفعلية تختلف بطبيعة الحال تبعاً لنوع النسيج؛ ومع ذلك، عموما البروتوكول ينبغي استخدام المخزن مؤقت الأس الهيدروجيني محايدة المحتوية على تركيزات فسيولوجية من الأملاح الأيونية، لا المواد الكيميائية يشوه، ويفضل أن لا المنظفات. إذا كان يجب استخدام المنظفات، ينبغي أن يظل تركيز المنظفات غير الأيونية كحد أدنى (مثلاً لا يزيد عن 1 في المائة). المخزن المؤقت ينبغي أن تتضمن أيضا مثبطات البروتياز كافية لمنع تدهور proteolytic البروتينات المستهدفة. بغض النظر عن تحلل البروتوكول المستخدم، يجب تثفيل الاستعدادات النهائية لإزالة الجسيمات قبل التحليل.
فيما يتعلق بالقيود المقايسة، تركيزات أهدافا أكثر في أنواع العينات البيولوجية يمكن أن تختلف إلى حد كبير. من أجل قياس تركيزات أكثر بشكل صحيح، يجب أن تندرج ضمن القيم العلوية والسفلية للمنحنى المعياري. استقراء قيم المنحنى ليست موثوقة بالضرورة، ولا يوصي. المحققين ولذلك يجب تحسين تخفيف تلك العينات خاصة في تجارب نموذجية قبل أن يعمل فحص الكامل--لوحة. وباﻹضافة إلى ذلك، التحضير الدقيق للعينات البيولوجية تكون جزيئي أمر بالغ الأهمية لنجاح هذا الشكل المقايسة. عينات ليبيميك أو هيموليزيد، أو تحتوي على بروتين الحطام سوف تؤثر على جسم مستضد التفاعلات التي تحدد المبدأ الأساسي لهذه المناعة، وتقديم النتائج التي يتم أونينتيربريتابل.
هذا الفحص هام فيما يتعلق بالأساليب القائمة على القياس الكمي لعدة أسباب. عند تشغيل بشكل صحيح، يمكن أن قوانتيتاتي شكل الإنزيم تحليلها تصل إلى 13 من عينة استخدام كميات أقل بكثير مما ستكون هناك حاجة تحليل العينة باستخدام فحوصات أليسا التقليدية. تنسيق هذا التحليل أيضا لا تتطلب الأجهزة مخصصة من أجل إجراء. هذه ميزة مقارنة الأخرى المتاحة تجارياً تحديدكم المستندة إلى حبة كما يمكن تشغيل الفحص استخدام أي عدد من سيتوميتيرس تدفق استخداماً.
التحقيق العلمي في الدور الذي تقوم به العوامل يفرزها وسيتوكين الشبكات في الصحة والمرض أخذ في التوسع. تنسيق التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة يمكن أن يكون أداة قيمة للباحثين تسعى إلى فهم هذه الظواهر معقدة ومتعددة الجوانب. بدأت برامج البحوث الطبية البيولوجية النشطة لاستكشاف دور شبكات سيتوكين في ليس فقط المناطق المعمم مثل التهاب6، ولكن أيضا في سياق الدول أمراض محددة مثل تصلب الشرايين والسرطان ونيوروينفلاميشن 1516،،17. مما لا شك فيه، سوف يواصل التحقيق تنمو في هذه المناطق كما يوسع البحث عن علاجات جديدة لعلاج هذه الحالات المزمنة. الحاجة إلى التقدير الكمي دقيقة وموثوق بها للوسطاء للذوبان المرتبطة بهذه الأمراض سوف تظل أولوية حاسمة لبحث.
Disclosures
يعمل الكتاب بيوليجيند، التي تقوم بتصنيع الكواشف الموصوفة في هذه المخطوطة. فيجن التكنولوجيا، وشركة تطوير برمجيات تحليل البيانات ليجيندبليكس التي تستخدم لتحليل البيانات التي تم إنشاؤها من التحليل الوارد وصفها في هذه المخطوطة.
Acknowledgments
يود المؤلفون الاعتراف بالمساهمات من المؤشرات الحيوية والمناعية-فحوصات فريق "تطوير المنتج" لتنمية المقايسة. وبالإضافة إلى ذلك، نود أن نشكر تك فيجيني, Inc. للجهود التعاونية في تصميم حزم برامج تحليل البيانات.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
| Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
| Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
| Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
| Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
| Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
| FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
| Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
| Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
| 96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
References
- Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
- Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
- Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
- Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
- Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).
- Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
- Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
- Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
- Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
- Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
- Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
- Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
- Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
- LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017).
- Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
- West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
- Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
