Summary
Denne protokollen beskriver kvantifisering av flere cytokin mål samtidig i vev kultur supernatants fra stimulert musen splenocytes multiplex perle basert immunanalyse plattform og en flyt cytometer.
Abstract
Perle-baserte immunanalyser benytter samme grunnleggende prinsipp som sandwich immunanalyser. Fange perler, som kan differensieres etter størrelse og interne allophycocyanin (APC) fluorescens intensitet, er konjugert til antistoffer spesifikke for en bestemt analytt. Deretter er et valgte panel av definerte opptakssett perle ruges med et biologiske utvalg som inneholder målet analytter gjelder for fangst antistoffer. Et biotinylated gjenkjenning antistoff cocktail legges, som fører til dannelsen av fange perle-analytt-gjenkjenning antistoff smørbrød.
Endelig legges streptavidin-phycoerythrin (SA-PE), som binder seg til biotinylated oppdagelse antistoffer, gir fluorescerende signal intensiteter forhold til hvor mye bundet analytt. PE fluorescerende signal analytt-spesifikke perler regioner er kvantifisert ved hjelp av flowcytometri og konsentrasjonen av bestemt analytter fastsettes ved hjelp av dataanalyse programvare og standardkurven generert i analysen.
I dette eksperimentet bruker vi en mus T helper cytokin panel samtidig kvantifisere konsentrasjonen av 13 separate cytokin mål i vev kultur supernatants fra mus splenocytes kulturperler under ulike stimulerende forhold.
Introduction
I sin rolle som løselig signalnettverk molekyler formidle cytokiner svært koordinert og multifaktoriell prosessene som styrer vert immunologiske svar. De er uttrykt i alle faser av inflammatoriske prosessen, fra innvielsen oppløsning, og regulere et komplekst samspill nettverk som bruker egne syntese og til deres cellular reseptorer1. Denne kommunikasjonsnettverk er lagdelt med en kompleksitet som går utover synergistisk eller antagonistiske forholdet som eksisterer mellom komponentene. Faktisk er mange cytokiner kjent for å dele overflødige eller minst delvis overlappende2,3.
Integrerte systemer biologi tilnærminger som samtidig kvantifisere flere cytokin analytter er å tilby en stadig mer omfattende forståelse av den unike cytokinomes som arrangerer immunreaksjoner underliggende flere sykdom sier4,5. Disse sykdom stater varierer fra generalisert betennelse cancer, Nevro-degenerative tilstander og hjerte-og karsykdommer6,7,8,9.
Slike cytokin nettverk kan bli avhørt effektivt bruke LEGENDplex perle-baserte immunanalyser. Disse analyser er basert på samme prinsipp som sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent analysen (ELISA), og bruke fluorescens kodet mikrosfærer med fangst antistoffer covalently knyttet til deres overflate. Disse antistoffene er immobilisert på flater mye mindre enn de som kreves av tradisjonelle ELISA formater. Dette gjør at slike analyser utføres med langt mindre utvalg volum, mens samtidig redusere uspesifisert bindende og gir multiplekset analyse av flere analytter.
Analysen beskrevet i denne protokollen utnytter denne teknologien å quantitate opp til 13 mål samtidig. Data fra denne analysen kan oppnås ved hjelp av en rekke lett tilgjengelige flyt cytometers og i motsetning til andre tilgjengelige analyser krever ikke bruk av dedikert analysen-spesifikke instrumentering. Med en voksende katalog av validerte analytt paneler, har disse analyser blitt brukt i flere pågående biomedisinsk forskning prosjekter10,11,12,13.
For å demonstrere den enkle og nytte av analysen format, i dette eksperimentet vi bruke en mus T helper cytokin panel for å quantitate skille 13 cytokin konsentrasjoner fra vev kultur supernatants fra mus splenocytes kultivert under flere stimulerende forhold. I tillegg til vev kultur supernatants, kan denne analysen også utføres serum- eller utvalg.
Protocol
alle dyreforsøk ble utført i henhold til NIH anbefalingene i veiledningen og bruk av forsøksdyr og ble godkjent av IACUC på BioLegend.
figur 1: filtrere Plate analysen prosedyren Sammendrag. Protokollen for å utføre analysen bruker filteret plater er representert som et diagram som viser viktige analysen komponenter og inkubasjon skritt. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
1. biologiske utvalg forberedelse
Merk: valgte anatomiske området og volum av blod samling er overlatt til skjønn av hver individuelle etterforsker og vil ikke påvirke utfallet av analysen. Men når de er oppnådd, prøver skal håndteres i henhold til trinnene nedenfor.
- Forberedelse av serumprøver
- samle ønsket volum av blod inn foretrukne samling rør og tillate den å koagulere i minst 30 min.
- Sentrifuge utvalget for 10 min 1000 x g ved romtemperatur.
- Fjerne serum og analysen umiddelbart eller aliquot i polypropylen microcentrifuge rør og lagre prøver på ≤ -20 ° C.
- Forberedelse av plasmaprøver
- samle ønsket volum av blod med ethylenediaminetetraacetic syre (EDTA) belagt blod samling rør.
- Sentrifuge for 10 min 1000 x g ved romtemperatur innen 30 min samling.
- Fjerne plasma og analysen umiddelbart, eller aliquot i polypropylen microcentrifuge rør og lagre prøver på ≤ -20 ° C.
- Forberedelse av vev kultur Supernatant prøver
- sentrifuge utvalget for 10 min 1500 x g på 4 ° C fjerne celler og rusk.
- Samle nedbryting og analysen umiddelbart eller aliquot i polypropylen microcentrifuge rør og lagre på ≤ -20 ° C.
- Tining av frosne biologiske prøver
- helt tine alle tidligere frosne biologiske prøver på is og vortex kort før bruk. Unngå mer enn 2 fryse/tine sykluser.
Merk: Prøver som brukes i denne protokollen ble oppnådd ved dyrking BALB/c musen splenocytes (1 x 10 6 celler på 37 ° C + 5% CO 2 under ulike forhold: unstimulated, LP-plater (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plate-belagt) + αCD28 (1 µg/mL løselig), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kultur supernatants ble samlet etter 48 timer og behandles som beskrevet i delen 1.3.
- helt tine alle tidligere frosne biologiske prøver på is og vortex kort før bruk. Unngå mer enn 2 fryse/tine sykluser.
2. Forberedelse av reagenser
- Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized perler
- Sonicate ferdigblandet perler flaske i 1 min i et sonicator bad i romtemperatur, og deretter vortex for 30 s før bruk. Hvis ingen sonicator bad er tilgjengelig, øke vortex til 1 min.
- Forberedelse av vaskebuffer
- Bring 20 x vaskebuffer (20 x PBS med 1% Tween-20) følger med kit til romtemperatur og vortex å bringe alle salter i løsningen.
- Fortynne 25 mL av 20 x vaskebuffer med 475 mL vaskebuffer vann. Lagre ubrukte delen mellom 2 ° C og 8 ° C i opptil én måneds.
- Forberedelse av Matrix B (For bruk med Serum og Plasma prøver bare)
- legge 5.0 mL analysebuffer (PBS med 1% BSA) inkludert i pakken til flasken med lyofilisert Matrix B. Tillat minst 15 min for fullstendig reconst itution, deretter vortex å bland godt. Leftover rekonstituert Matrix B kan lagres på ≤-70 ° C i opptil én måneds.
3. Standard forberedelse
Merk: hver analytt i dette panelet har en topp standard konsentrasjon på 10 000 pg/mL.
- Legge til 250 µL av analysebuffer å gjeninnføre den lyofilisert musen Th cytokin Standard Cocktail. Blande av kort vortexing og tillate ampullen å sitte ved romtemperatur for 10 min.
- Overføre standard cocktail slik polypropylen microcentrifuge merket " C7 ". Dette vil bli brukt som topp standard.
- Etikett 6 polypropylen microcentrifuge rør som C6, C5, C4, C3, C2 og C1.
- Legge til 75 µL av analysebuffer til hver av disse rørene.
- Overføre 25 µL av den øverste standard C7 C6 rør og bland godt av vortexing. Dette blir standard C6.
- Fortsett utfører føljetong 1:4 fortynninger ved hjelp av en ny Pipetter tips for hver rør legge 25 µL av tidligere standarden til 75 µL av analysebuffer i neste laveste standard røret etterfulgt av vortexing å få standarder C5, C4, C3 , C2 og C1. Bruke analysebuffer som 0 pg/mL standard (C0).
4. Smak fortynning
Merk: Foreløpig piloten eksperimenter med flere fortynninger denne analysen kan være nødvendig å bestemme den mest passende fortynningsfaktoren for et bestemt sett av biologiske prøver. En skikkelig fortynningsfaktoren produsere konsentrasjon beregninger for prøven som ligger innenfor grensene av standardkurve. Følgende fremgangsmåte er ment som retningslinjer og må bestemmes empirisk avhengig av prøvetype.
- Dilute serum- eller prøver 2-fold med analysebuffer (f.eks. fortynne 50 µL av prøve med 50 µL av analysebuffer) i polypropylen microcentrifuge rør.
Merk: Hvis ytterligere eksempel fortynning, fortynninger bør gjøres med Matrix B i stedet for analysebuffer å sikre nøyaktig måling. Legge serum- eller prøver uten fortynning vil føre lav analysen nøyaktighet og kan tette filter platen. Matrix B består av grupperte musen serum utarmet av endogene analysen mål. Den brukes som en serum- eller prøve fortynningsmiddel for å unngå matrix effekter, som er kjent for å påvirke analytisk følsomheten til immunanalyser. - Test celle kultur supernatant prøver uten fortynning.
Merk: Nivåer av analytt kan variere sterkt fra prøve å prøve. Eventuelt fortynne supernatant prøver ved en fersk forberedelse av tilsvarende celle kultur medium eller analysebuffer.
5. Analysen prosedyren
Merk: analysen kan utføres i polypropylen filter plater, mikro FACS rør eller V-bunn microplates. Filtreringen plate analysen anbefales på grunn av gode eksempler å prøve konsistens, analysen robusthet og bevegelighet. Denne prosedyren krever en vakuum filtrering enhet for vask (fra sluttbruker).
- Tillate alle reagenser til varm til romtemperatur (20-25 ° C) før bruk.
- Set filter plate på en invertert plate dekke hele tiden under analysen oppsett og inkubasjon trinnene, slik at bunnen av platen ikke berører alle overflater som det medfører lekker.
- Holde platen oppreist under hele analysen prosedyren, inkludert vask trinnene, for å unngå å miste perlene.
- Holde platen i den mørke eller innpakket med aluminiumsfolie for alle inkubasjon trinn.
- Kjøre alle standarder og prøver som duplikater, ordnet på platen i en rekkefølge.
- Pre våt filter platen ved å legge til 100 µL av 1 x vaskebuffer hver brønn og la det sitte i 1 min i romtemperatur (hvis bruker filteret bunn microplate).
- Fjern buffer volum ved hjelp av vakuum manifold (5-10 s). Ikke overstige 10 " Hg vakuum. Blot overflødig vask Bufferen fra bunnen av platen ved å trykke platen på en stabel med ren papirhåndklær. Plasser platen på invertert plate dekselet.
Merk: Trinn 5.1-5.2 kan utelates hvis utfører analysen ved hjelp av en V-bunn microplate eller micro FACS rør. - For celle kultur supernatant prøver, legge til 25 µL av analysebuffer i alle brønnene. Legg til 25 µL av hver standard standard brønnene. Legge til 25 µL av hver prøve prøve brønnene.
- Måle serum- eller prøver, legge 25 µL av Matrix B til standard brønnene. Legg til 25 µL av analysebuffer eksempel brønnene. Legg til 25 µL av hver standard standard brønnene. Legge til 25 µL av hver utvannet serum eller plasmaprøve eksempel brønnene.
- Vortex blandet perler for 30 s. Legg 25 µL av blandet perler i hver brønn, risting perle flaske midlertidig for å unngå perle settling. Det siste bindet skal 75 µL i hver brønn etter tillegg av perler.
- Sel platen med en plate sealer. Pakk hele platen, inkludert invertert plate coveret, med aluminiumsfolie. Plasser platen på en plate shaker, sikre det og riste på ca 500 rpm for 2 timer ved romtemperatur. For å forhindre lekkasje, gjelder ikke positivt trykk plate sealer.
- Uten invertere, Plasser platen på vakuum manifolden og bruke vakuum som før og legge 200 µL av 1 x vaskebuffer i hver brønn.
- Fjerne innholdet på platen mikrotiterbrønnene ved vakuum filtrering. Blot overflødig vaskebuffer fra bunnen av platen med en absorberende puten eller papir håndkle. Gjenta dette trinnet en gang.
Merk: Hvis analysen utføres ved hjelp av en V-bunn microplate eller micro FACS rør hopp over trinn 5,12 og 5.13. I stedet sentrifuge platen på 1000 x g i 5 minutter ved romtemperatur, og deretter fjerner nedbryting bruker en flerkanals pipette. - Legge til 25 µL av gjenkjenning antistoffer (se tabell for materiale) i hver brønn.
- Sel platen med en frisk plate sealer. Vikle hele platen, inkludert invertert plate coveret, med aluminiumsfolie.
- Plasser platen på en plate shaker og rist på ca 500 rpm 1t ved romtemperatur.
- Uten støvsuging, legge til 25 µL av SA-PE reagensen direkte i hver brønn. Ingen utvanning av reagens kreves.
- Sel platen med en frisk plate sealer. Vikle hele platen, inkludert invertert plate coveret, med aluminiumsfolie.
- Plasser platen på en plate shaker og rist på ca 500 rpm i 30 min ved romtemperatur.
- Gjenta trinn 5.13 ovenfor.
- Legge til 200 µL av 1 x vaskebuffer hver brønn. Nytt suspendere perlene på en plate shaker i 1
- Bruker en flerkanals Pipetter, overføre prøver fra filteret platen til FACS rør lese prøver på en flyt cytometer.
Merk: Utvalg volum kan økes fra 200 µL til 300 µL ved å legge til en ekstra 100 µL av 1 x vaskebuffer hver rør å unngå prøven kjører tørr. Hvis nødvendig prøver kan lagres på 4 ° C beskyttet fra lys og analysert dagen. Men langvarig eksempel lagring kan føre til redusert signal.
6. Flow Cytometer oppsett
Merk: for å generere pålitelige data, flyt cytometer må settes opp riktig før datainnsamling. Denne prosessen varierer for individuelle brukere på enkelte forhold etter konfigurasjonen av spesielle instrument analysen utføres på. En generalisert installasjonsprosessen for en cytometer kunne måle PE og APC og utstyrt med både en 488 og 633 nm laser diskuteres under.
- Oppstart flyt cytometer og oppkjøp programvaren ifølge produsenten ' s instruksjonene som følger med apparatet.
- Opprette en prikk tomt med FSC (fremover XY) på x-aksen og SSC (siden XY) for y-aksen. Angi FSC og SSC til lineær modus.
- Opprette en andre dot plott med PE på x-aksen og APC for y-aksen. Denne handlingen kan settes til en logg-baserte visningsmodus.
- Vortex ampullen av rå perlene i settet for 30 s å suspendere perler. Disse perlene inneholder en intern APC fargestoff og består av to størrelse bestander.
- Overføre 400 µL av rå perler slik ny FACS.
- Satt flyt cytometer flow rate til lave.
- Kjøre de rå perlene, nøye justerer gevinst og spenningen for FSC og SSC slik at populasjonene størrelsen av disse perlene er tydelig atskilt og lett til gate.
- Juster FSC terskelen for å utelate uønskede hendelser (i.e. rusk eller luft bobler).
- I FSC vs SSC tomten, tegne en gate som inkluderer alle perle populasjoner.
Merk: Rå perlene inneholder to størrelse bestander av perler, den minste " en perler " og større " B perle " regioner. - Vise gated perle befolkningen fra FSC vs SSC plottet på den andre dot tomten med PE på x-aksen og APC for y-aksen.
- Juster avdrag spenningen for APC fluorescens kanalen slik at APC signalet for alle perle populasjoner har en median fluorescens intensitet (MFI) som ligger mellom 1 x 10 1 og 5 x 10 3.
- Vortex ampullen av PE installasjonen perler for 30 s å suspendere perlene.
- Overføre 400 µL av PE perler slik ny FACS.
- Erstatte rå perlene rør fra flyt cytometer med PE perler tube.
- Juster photomultiplier tube (avdrag) spenning for PE fluorescens kanalen innstillingen slik at MFI av PE perler faller spesifikt området fant oppført på PE perler ampullen.
Merk: PE installasjonsprogrammet perlene inneholder perler av en populasjonsstørrelse (" en perler " bare).
7. Datainnsamling
Merk: den nøyaktige fremgangsmåten forbundet med anskaffelse av data på en gitt instrument kan variere, avhengig av cytometer ' s konfigurasjonen spesifikasjoner og grensesnitt programvaren brukes. Instruksjonene nedenfor er derfor ment å markere de nødvendige tiltak i analysen uansett cytometer ansatt i analysen.
- Kontroller infusjonshastigheten cytometer fortsatt være satt til lavt.
- Angir antall perle hendelser ervervet til om lag 300 per analytt. En 13-plex panelet dette tilsvarer anskaffe 3900 hendelser kombinert fra populasjonene bead størrelse (A + B perler).
- Vortex hvert utvalg for 5 før analyse.
- Read vareprøver. Når du leser prøver, satt flyt cytometer til installasjonsmodus første og vent til perle befolkningen har stabilisert seg før vinningen måte.
- Bruker enkle navn med fortløpende nummerering for datafiler til forenkler dataanalyse.
- Eksportere bare gated hendelsene (A + B perle områder) enn totalt hendelser.
- Lagre alle FCS filer i samme mappe for hver analysen. Hvis kjører flere analyser, Opprett en separat mappe for hver analysen.
Merk: The FCS filer generert på flyt cytometer bør analyseres ved hjelp av dataanalyse programvare, hvilke kan dataoverførte gratis 14.
- Installere data analyseprogramvare på en PC.
- Overføre alle analysen FCS-filer til datamaskinen som inneholder analyseprogramvare.
- Kobler lisens nøkkel dongle (inkludert i pakken) til en USB-port på datamaskinen.
- Starte data analyseprogramvare.
- Klikk på blå " Legg til filer " knappen øverst på skjermen.
- Naviger til mappen som inneholder FCS filene fra analysen i popup-vinduet som vises.
- Klikk og dra alle analysen FCS filer fra popup-vinduet til displayet programvare. Alle filene skal nå vises i en liste.
- Klikk grønne " neste " knappen på nederst til høyre på skjermen. Venstre-klikk og hold for å dra lille blå standardkurve knapper (C7 til C0) til tilsvarende FCS filer fra listen for å definere standardkurven.
- Klikk grønne " neste " knappen på nederst til høyre på displayet for å åpne gating pop opp vinduet.
- På venstre side av vinduet gating angi navnene på begge A og B perle regioner analysen analytt mål og deres tilknyttede perle-IDen (finnes i håndboken som fulgte med analysen) i stigende rekkefølge.
- Velg gating fra toppen av popup-vinduet og bruke den til å tegne 2 porter i FSC vs SSC tomten, en rundt A perler og andre rundt B perlene.
- Gjennom APC vs PE scatter tomter som vises under FSC vs SSC tomten som vises. Det vil være 6 analytt band i A perler (venstre tomt) og 7 analytt band i B perler (høyre plott).
Merk: Gates kan tilbaketrekkes manuelt ved å velge viskelæret på toppen og klikke for å slette en bestemt gate. Verktøyet gating kan deretter valgt og brukt til å bruke en port manuelt regionen ønskede båndet. - Klikk grønne " OK " knappen Lukk gating popup-vinduet og gå tilbake til listen over FCS filer.
- Definerer alle fortynninger som ble gjort biologiske prøver av rett klikker en gitt fil, velge " fortynning brett " fra menyen og inn den riktige verdien.
- Klikk grønne " kjøre "-knappen nederst til høyre på displayet for å utvikle standard kurvene for analysen og Beregn konsentrasjonen av ukjent biologiske prøver.
Representative Results
Denne protokollen viser hvordan en perle-baserte immunanalyse plattform kan brukes å samtidig quantitate cytokin profiler fra biologiske prøver ved hjelp av en flow cytometer. De biologiske prøvene som brukes i dette eksemplet ble celle kultur supernatants fra mus splenocytes som tidligere hadde blitt ruget under ulike aktivering forhold, selv om analysen formatet har også blitt godkjent for bruk med serum- eller eksempler.
Data som er generert fra analysen brukes til å konstruere standard kurver for alle analytter i multiplex-panelet. Data analyseprogramvare klassifiserer hver bestemt analytt basert på en unik perle størrelse og APC intensitet og kvantifiserer dem ved hjelp av PE reporter. Dynamiske områdene, samt sensitivitet til analysen er demonstrert da tegnes i logg-log skala i figur 2A. Programvaren bruker analysen data og en 5-parameteren kurve passende algoritme å nøyaktig beregne ikke bare konsentrasjonen av analytter bruker gitt biologiske prøver, men også grensene for gjenkjenning på både den høye og lave enden av alle standard kurver (tabell 1 ). Formatet beskrevet i denne protokollen gir også svært robust analysen presisjon. I figur 2B og 2 C presenteres data som intra-analysen variasjon av hver analytt. To separate standard protein konsentrasjoner (høy og lav) ble analysert i en analysen med 16 gjentak for hvert utvalg. Figur 2C og 2D representerer mellom analysen variasjon av målet analytter fra tre uavhengige analyser. Som med den intra-analyse presisjon eksperimenter, høy og lav standard konsentrasjoner ble analysert med 3 replikerer i hver av de uavhengige eksperimentene. Minimal variasjon i beregnede konsentrasjonen av målet proteiner er klart synlig.
For å demonstrere nytten av perle-baserte cytometric analyser i avhør cytokin uttrykket profiler, ble mus splenocytes inkubert under ulike aktivering forhold. I tillegg til en unstimulated kontroll, var celler også inkubert med LPS, anti-CD3/anti-CD28 antistoffer, eller phorbol 12-myristate 13-acetate og ionomycin. Celle kultur supernatants ble samlet 48 timer senere og assayed ved hjelp av musen T helper cytokin panelet. Kvantifisering resultatene fra dette eksperimentet er representert i Figur 3 og effekten av stimulering forhold på cytokin konsentrasjoner er klart avgrenset.
Resultatene beskrevet ovenfor er typisk, så lenge eksperimentator har god laboratorium teknikk og følger den angitte analyse protokollen. Feilkilder i denne analysen format kan oppstå fra avvik i inkubasjon ganger, reagens volumer, vaskemaskin, eller upassende avdrag innstillinger på flyt cytometer brukes til å analysere prøvene. I figur 4A et scatter viser handlingen fra en vellykket analysen 2 forskjellige perle populasjoner som er klart definert. Dette kan være forskjellige til figur 4B, hvor dårlig vask og protokoll etterlevelse har ført til perle aggregat som uskarphet de to populasjonene. Dessuten, som dokumentert av rusk i nedre venstre kvadrant, ble totalt cytometer hendelser eksportert analyse i stedet for formatet som foretrekkes av gated hendelser bare. Riktig cytometer definere er avgjørende for å generere pålitelige data i denne analysen. I figur 4C riktig avdrag lar innstillinger for løsning av hver av de 6 analytter i APC klassifisering kanalen. Uriktig avdrag innstillingene vil resultere i data tilsvarende som i Figur 4 d der APC kanalen har perle populasjoner med overlappende klassifisering intensiteter. Dette vil ugyldiggjøre analysen siden det vil være umulig å beregne analytt konsentrasjoner uten klart definerte bestander av analysen perler.
Figur 2: Standard kurve områder og analysen presisjon. (A) en representant standardkurve generert ved hjelp av musen T helper cytokin panelet. En standard kurve må kjøres med hver analysen. (ABC) Intra-analysen presisjon. To prøver med ulike konsentrasjoner av målet proteiner (høy og lav) ble analysert i en analysen med 16 gjentak for hvert utvalg. Dataene er representert som betyr + standardavvik. (D-E) Inter analysen presisjon. To prøver med ulike konsentrasjoner av målet proteiner (høy og lav) ble analysert i tre uavhengige analyser med 3 gjentak for hvert utvalg. Dataene er representert som betyr + standardavvik. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: kvantifisering av representant resultater. Mus splenocytes (1 x 106 celler) ble kultivert på 37 ° C + 5% CO2 under ulike forhold: unstimulated, LP-plater (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plate-belagt) + αCD28 (1 µg/mL løselig), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kultur supernatants ble samlet etter 48 timer, deretter kvantifisert ved hjelp av musen T helper cytokin panelet. Differensial cytokin uttrykket profiler svar stimulering forhold er synlig. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: resultater fra vellykkede og mislykkede analyser. (A) vellykket analyser vil ha forskjellige perle befolkninger microsphere befolkningen. (B) mislykket analyser vil ha fattige befolkningen separasjon, perle aggregater og mange innsamlede hendelsene. (C) vellykket analyser klart definerte intensiteter i klassifisering fluorescens kanalen som er lett å gate og kvantifisere. (D) mislykket analyser vil ha dårlig skilt og klassifisering intensiteter som overlapper flere perle befolkninger, gjør kvantifisering vanskelig. Mange av disse feilene kan unngås gjennom forsiktig etterlevelse av analysen protokollen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
| Standardkurve | Følsomhet (pg/mL) | ||||
| Analytt | Tilpass formel | CV | R2 | Min. | Max. |
| IFN-Γ | 5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) | 1,77% | 0.99 | 2.1 | 18105.0 |
| IL-5 | 5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) | 1.32% | 1 | 1.9 | 14514.0 |
| TNF-Α | 5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) | 1.48% | 0.99 | 1.9 | 20109.0 |
| IL-2 | 5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) | 1,34% | 1 | 1.9 | 25109.0 |
| IL-6 | 5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37) | ||||
Tabell 1: standardkurven montering og analysen følsomhet. Data analyseprogramvare ble brukt til å generere standard kurver for alle analytter i multiplex analysen. Helautomatisk analysen gjelder en robust 5-parameteren kurve utrustning algoritmen fortynning serien standarder fra analysen og ble også brukt til å definere analysen følsomhet ved hjelp av teoretiske grensene for gjenkjenning.
Discussion
Analysen formatet beskrevet i denne protokollen gir robust kvantifisering løselig megler profiler i biologiske prøver gitt eksperimentator har god laboratorium teknikk og overholder de anbefalte protokollen.
Det er flere viktige trinn som må følges for å garantere pålitelige resultater. Først må rekombinant standarder tillates å gjeninnføre i analysebuffer heltid anbefales, og etter bare fortynnet i polypropylen rør. Polystyren rør kan fremme overholdelse av proteiner til veggen av rørene, som kan føre til lav signaler ved generering av standardkurven. Andre, riktig riste under inkubasjon trinnene er avgjørende. Uten riktig agitasjon, kan bindende egenskaper analysen perlene bli alvorlig hindret. I tillegg er riktig vask mellom inkubasjon trinn også nødvendig. Eksperimentator må sikre at overflødig reagenser er fjernet fra brønnene før du setter i neste trinn i protokollen. Instrumenter innstillinger for flyt cytometer brukes til å forhøre analysen perler må optimaliseres også. Spesielt må avdrag innstillinger justeres for å sikre riktig perle separasjon og brede dynamiske områder for standard kurvene. Til slutt, like før blir analysert på cytometer, perler må være vortexed å sikre riktig suspensjon og unngå dannelse av aggregater som kan forskyve resultatene.
Denne protokollen kan potensielt endres for å analysere vev homogenates samt hvilke eksempel diskutert i dette manuskriptet forutsatt forskeren er villig til å optimalisere sine lyse protokollen før du utfører stort, full plate analyser. Er selve teknikken vil selvfølgelig varierer avhengig av vev; men bør generelt protokollen bruke en nøytral pH buffer inneholder fysiologiske konsentrasjoner av ioniske salter, ingen denaturing kjemikalier og fortrinnsvis uten vaskemidler. Hvis vaskemiddel må brukes, bør ikke-ioniske vaskemiddel konsentrasjoner holdes på et minimum (f.eks mer enn 1%). Bufferen bør også inneholde tilstrekkelig proteasehemmere for å hindre proteolytisk nedbrytning av målet proteiner. Uansett lysis protokollen brukes, bør de siste forberedelsene være sentrifugeres for å fjerne partikler før analyse.
Om analysen begrensninger, konsentrasjonen av analytt mål i biologiske utvalg typer kan variere sterkt. For å kvantifisere analytt konsentrasjoner, må de være innenfor de øverste og nederste verdiene for standardkurven. Ekstrapolering av verdiene i kurven er ikke nødvendigvis være pålitelige og anbefale ikke. Etterforskerne må derfor optimalisere fortynninger av sine bestemt prøver i piloten eksperimenter før du kjører en full plate analysen. Dessuten er forsiktig utarbeidelsen av de biologiske prøvene å være assayed viktig for suksessen til denne analysen format. Eksempler som er lipemic, hemolyzed, eller inneholder protein rusk vil påvirke antigen antistoff samhandlingene som definerer selve grunnprinsippet for denne immunanalyse og gjengi resultater som er uninterpretable.
Denne analysen er viktig med hensyn til eksisterende metoder for kvantifisering av flere grunner. Når kjører riktig, kan analysen formatet quantitate opp til 13 analytter fra et utvalg med langt mindre volumer enn ville bli pålagt å analysere prøven ved hjelp av tradisjonelle ELISA analyser. Denne analysen format også krever ikke dedikert instrumentering for å utføres. Dette er en fordel i forhold til andre tilsvarede perle-baserte immunanalyser som analysen kan kjøres på en rekke vanlige flyt cytometers.
Vitenskapelig undersøkelse rollen spilt av utskilles faktorer og cytokin nettverk i helse og sykdom utvider. Analysen formatet beskrevet i dette manuskriptet kan være et verdifullt verktøy for forskere søker å forstå disse mangefasettert og komplekse fenomener. Aktive biomedisinsk forskningsprogrammer begynner å utforske rollen cytokin nettverk i ikke bare områder som generalisert betennelse6, men også i sammenheng med spesifikke sykdomstilstander som åreforkalkning og kreft neuroinflammation 15,16,17. Utvilsomt, etterforskning vil fortsette å vokse i disse områdene som søk etter romanen therapeutics å behandle disse kroniske tilstander utvides. Behovet for nøyaktig og pålitelig kvantifisering av løselig meglere forbundet med disse sykdommene vil være en kritisk forskning prioritet.
Disclosures
Forfatterne er ansatt av BioLegend, som produserer reagensene beskrevet i dette manuskriptet. Vigene Tech, Inc. utviklet LEGENDplex data analyseprogramvare som brukes til å analysere data generert fra analysen beskrevet i dette manuskriptet.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker å erkjenne bidrag Biomarkers og immun-analyser produktutvikling team til utviklingen av analysen. I tillegg vil vi gjerne takke Vigene Tech, Inc. for deres felles anstrengelser i å utforme data analyse programvarepakkene.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor | Beckman Coulter | 366816 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel | BioLegend | 740005 | Multiplex Immunoassay (13-plex) |
| Anti-mouse CD3ε antibody | BioLegend | 100314 | Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format |
| Anti-mouse CD28 antibody | BioLegend | 102112 | Clone 37.51, low endotoxin, azide free format |
| Vacuum Pump | EMD Millipore | WP6111560 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Vacuum Manifold | EMD Millipore | MSVMHTS00 | For LEGENDplex assays using filter plates (recommended) |
| Sterile Disposable Reagent Reservoirs | Fisher Scientific | 07-200-130 | Or equivalent |
| Polypropylene MicroFACS Tubes | Fisher Scientific | 11-842-90 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
| Pipette Kit | Fisher Scientific | 14-388-100 | Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL) |
| Multi-Channel Pipette | Fisher Scientific | FA10011G | capable of dispensing 5 μL to 200 μL |
| Microplate Shaker | Fisher Scientific | 88880023 | Or equivalent |
| Microcentrifuge | Fisher Scientific | 75002410 | Or equivalent |
| FACS tubes | Fisher Scientific | NC9885747 | 12 x 75 mm round bottom |
| PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Lipopolysaccharide (LPS) | Sigma-Aldrich | L-8274 | Escherichia coli O26:B6 |
| Ionomycin | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Branson B200 Ultrasonic Cleaner | Sigma-Aldrich | Z305359 | Or equivalent |
| Microcentrifuge tubes | Sigma-Aldrich | Z666505 | 1.5 mL polypropylene tubes |
| Flow Cytometer | Various | Various | Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm |
| 96-Well Polypropylene Plate | VWR | 82050-662 | For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional) |
References
- Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
- Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
- Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
- Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
- Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. , 3064643 (2016).
- Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
- Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
- Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
- Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
- Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
- Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
- Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
- Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
- LEGENDplex Multiplex Assays. , Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017).
- Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
- West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
- Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
