Multiplex cytokin profilering av stimuleras mus Splenocytes använder en flödescytometrisk pärla-baserad Immunoassay plattform

Summary

Det här protokollet beskriver kvantifiering av flera cytokin mål samtidigt i vävnad cellkulturer som samlats in från stimuleras mus splenocytes använder multiplex pärla baserad immunoassay plattform och en flödescytometer.

Abstract

Bead-baserade immunanalyser anställa samma grundläggande princip som smörgås immunanalyser. Fånga pärlor, som kan differentieras efter storlek och interna allophycocyanin (APC) fluorescensintensiteten, konjugeras till antikroppar som är specifika för en viss analyt. Nästa, en vald panel av definierade inspelningsuppsättningar pärla inkuberas med ett biologiskt prov innehållande mål analyter specifika för fånga antikropparna. En biotinylerade detektionsantikropp cocktail tillsätts, vilket leder till bildandet av capture pärla-analyt-detektionsantikropp smörgåsar.

Slutligen läggs streptividin-fykoerytrin (SA-PE), som binder till biotinylerade upptäcka antikroppar, som ger fluorescerande signal stödnivåer i proportion till den bundna analyten. PE fluorescerande signal av analyten-specifika pärlor regioner kvantifieras med hjälp av flödescytometri och koncentrationerna av särskilda analyter bestäms med hjälp av data analysprogram och standardkurvan genereras i analysen.

I detta experiment använder vi en mus T helper cytokin panel samtidigt kvantifiera koncentration av 13 separata cytokin mål i vävnad cellkulturer som samlats in från mus splenocytes odlade olika stimulerande villkor.

Introduction

I sin roll som lösliga signalmolekyler medla cytokiner de mycket samordnat och multifaktoriell processer som styr värd immunologiska svar. De uttrycks under alla stadier av den inflammatoriska processen, från initiering till resolution, och reglera ett komplext samspel nätverk som inkluderar sin egen syntes och att deras cellulära receptorer¹. Detta kommunikationsnätet är skiktad med en komplexitet som går utöver de synergistiska eller antagonistiska relationer som kan finnas mellan enskilda komponenter. Faktiskt, många cytokiner är kända för att dela redundant eller åtminstone delvis överlappande funktioner^2,3.

Integrerade system biologi metoder som samtidigt kvantifiera flera cytokin analyter för närvarande tillhandahåller en alltmer omfattande förståelse för den unika cytokinomes som dirigera immunsvaret underliggande flera sjukdom har^4,5. Sjukdom har allt från generaliserad inflammation på cancer, neurodegenerativa och hjärt-kärlsjukdom^6,7,8,9.

Sådana cytokin nät kan förhöras effektivt med LEGENDplex pärla-baserade immunanalyser. Dessa analyser baseras på samma princip som smörgås enzymkopplad immunadsorberande analys (ELISA), och använda fluorescens kodade mikrosfärer med capture antikroppar kovalent bifogas deras yta. Dessa antikroppar är orörlig på ytor som är mycket mindre än de som krävs enligt traditionell ELISA-format. Detta gör att sådana analyser skall utföras med långt mindre provvolymen, medan på samma gång minska icke-specifik bindning och tillhandahålla multiplexed analys av flera analyter.

Den analysmetod som beskrivs i detta protokoll använder denna teknik för att kvantifiera upp till 13 mål samtidigt. Data från denna analys kan fås med en mängd olika vanligen förekommande flöde cytometers och till skillnad från andra tillgängliga analyser kräver inte användning av dedikerade assay-specifika instrumentering. Med en växande katalog av validerade analyten paneler, har dessa analyser använts i flera pågående biomedicinsk forskning projekt^10,11,12,13.

För att demonstrera den lätthet och nyttan av formatet assay, i detta experiment använder vi en mus T helper cytokin panel för att kvantifiera separata 13 cytokin koncentrationer från vävnad cellkulturer från mus splenocytes odlade under flera stimulerande förhållanden. Utöver vävnad cellkulturer, kan denna analys också utföras med hjälp av serum-eller plasmaprover.

Protocol

alla djurförsök utfördes enligt NIH rekommendationer som finns i guiden för skötsel och användning av laboratoriedjur och godkändes av IACUC på BioLegend.

figur 1: filtrera Plate Assay förfarande Sammanfattning. Protokollet för att utföra analysen använder filtret plattor representeras som ett diagram skildrar viktiga assay komponenter och inkubationsstegen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

1. biologiska provberedning

Obs: den valda anatomiska platsen och volymen av blodinsamling är kvar till bedömning av varje enskild utredare och kommer inte att påverka resultatet av analysen. Men när de erhållits, prover ska hanteras enligt stegen nedan.

1. Beredning av serumprover
   1. samla in önskad volym blod i rekommenderad samling röret och låter det att koagulera i minst 30 min.
   2. Centrifugera provet för 10 min vid 1 000 x g rumstempererat.
   3. Ta bort serum och assay omedelbart eller alikvot i polypropylen mikrocentrifugrör och lagra prover på ≤ -20 ° C.
2. Beredning av plasmaprover
   1. samla den önskade volymen av blod med hjälp av etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA) belagd blod insamling rör.
   2. Centrifugera i 10 min vid 1 000 x g i rumstemperatur inom 30 min samling.
   3. Ta bort plasma och assay omedelbart eller alikvot i polypropylen mikrocentrifugrör och lagra prover på ≤ -20 ° C.
3. Beredning av vävnadsodling Supernatant prover
   1. Centrifugera provet för 10 min vid 1 500 x g vid 4 ° C att ta bort celler och skräp.
   2. Samla in supernatanten och assay omedelbart eller alikvot i polypropylen mikrocentrifugrör och lagra på ≤ -20 ° C.
4. Upptining av frysta biologiska prover
   1. helt Tina någon tidigare frysta biologiska prover på is och vortex kort före användning. Undvika mer än 2 frysas och tinas cykler.
      Obs: De prover som används i detta protokoll erhölls genom odling BALB/c mus splenocytes (1 x 10 ⁶ celler vid 37 ° C + 5% CO ₂ under olika förhållanden: ostimulerade, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plattan-belagd) + αCD28 (1 µg/mL lösliga), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Cellkulturer samlades efter 48 h och bearbetas som beskrivs i avsnitt 1.3.

2. REAGENSBEREDNING

1. Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized pärlor
   1. Sonicate färdigblandade pärlor flaska för 1 min i ett någon sonikator bad vid rumstemperatur, och sedan virvel för 30 s före användning. Om det finns ingen någon sonikator bad öka vortex tiden till 1 min.
2. Beredning av tvättbuffert
   1. Bring 20 x Tvättbuffert (20 x PBS med 1% Tween-20) levereras med setet till rumstemperatur och vortex att föra alla salter i lösning.
   2. Späd 25 mL av 20 x Tvättbuffert med 475 mL avjoniserat vatten. Store oanvänd mellan 2 ° C-8 ° C i upp till en månad.
3. Beredning av matris B (för användning med Serum och Plasma prover endast)
   1. Tillsätt 5,0 mL analysbuffert (PBS med 1% BSA) ingår i satsen i flaskan som innehåller frystorkade Matrix B. Tillåt minst 15 min för komplett reconst itution, sedan vortex att blanda väl. Överbliven färdigberedd matris B kan förvaras vid ≤-70 ° C i upp till en månad.

3. Standardpreparatet

Obs: varje analyt i den här panelen har en topp standard koncentration på 10 000 pg/mL.

1. Lägg 250 µL analysbuffert för beredning av den frystorkade mus Th cytokin Standard Cocktail. Blanda genom kort vortexa och Låt injektionsflaskan stå i rumstemperatur i 10 min.
2. Överföra standard cocktail till en polypropylen mikrocentrifug rör märkt " C7 ". Detta kommer att användas som standard.
3. Etikett 6 polypropylen mikrocentrifugrör som C6 C5, C4, C3, C2 och C1.
4. Lägga till 75 µL analysbuffert till var och en av dessa rör.
5. Överföra 25 µL av högsta standard C7 till C6 röret och blanda väl genom vortexa. Detta kommer att vara standarden C6.
6. Fortsätt utföra seriell 1:4 spädningar med hjälp av en ny Pipettera tips för varje tub att lägga 25 µL av den tidigare standarden till den 75 µL analysbuffert i nästa lägsta standard röret följt av vortexa att få standarder C5, C4, C3 , C2 och C1. Använda analysbuffert som standarden 0 pg/mL (C0).

4. Prova utspädning

Obs: preliminära pilotförsök med denna analys med flera spädningar kan krävas att avgöra lämpligaste utspädningsfaktorn för en viss uppsättning biologiska prover. En ordentlig utspädningsfaktorn kommer att producera koncentration beräkningar av provet som ligga inom gränserna för standardkurvan. Följande steg är avsedda som riktlinjer och kan behöva bestämmas empiriskt beroende på Provtyp.

1. Dilute serum eller plasma prover 2gånger med Analysbuffert (t.ex. Späd 50 µL prov med 50 µL analysbuffert) i polypropylen mikrocentrifugrör.
   Obs: Om det krävs ytterligare provspädning, utspädningar bör göras med matris B istället för analysbuffert att säkerställa exakt mätning. Lägga serum eller plasma prover utan utspädning resulterar i låg analysens noggrannhet och kan täppa filtret plattan. Matris B består av poolade mus serum utarmat av endogena assay mål. Det används som ett serum eller plasma prov spädningsvätska för att undvika matriseffekter, som är kända för att påverka Analytisk känslighet immunanalyser.
2. Test cell kultur supernatant prover utan utspädning.
   Obs: Nivåerna av analyt kan variera kraftigt från prov till prov. Vid behov späd supernatant prover med en färsk beredning av deras motsvarande cellodlingsmedium eller analysbuffert.

5. Assay förfarande

Obs: analysen kan utföras i polypropylen filter plattor, micro FACS rör eller V-botten mikroplattor. Analysförfarandet filtret plattan rekommenderas på grund av bra prov till prov konsekvens, analysens robusthet och enkel hantering. Detta förfarande kräver en dammsugarfilter enhet för tvätt (tillhandahålls av slutanvändaren).

1. Låt samtliga reagenser värmas till rumstemperatur (20-25 ° C) före användning.
2. Uppsättning filter plattan på en inverterad plattan täcker hela tiden under analysstegen setup och inkubation, så att botten av plattan inte vidrör några ytor eftersom det kan orsaka läckande.
3. Hålla plattan upprätt under hela analysförfarandet, inklusive tvätt stegen, för att undvika att förlora pärlor.
4. Hålla plattan i mörka eller inslagna med aluminiumfolie för alla inkubationsstegen.
5. Kör alla standarder och prover som dubbletter, ordnade på plattan i en sekventiell ordning.
6. Pre våt filtret plattan genom att lägga till 100 µL av 1 x Tvättbuffert i varje brunn och låt det sitta i 1 min i rumstemperatur (om du använder filter-botten mikroplattan).
7. Ta bort buffert volymen genom att använda vakuum samlingsröret (5-10 s). Överskrid inte 10 " Hg vakuum. Blot överskott Wash Buffert från botten av plattan genom att trycka på plattan på en bunt rent hushållspapper. Placera plattan ovanpå locket inverterad plattan.
   Obs: Steg 5.1-5.2 kan utelämnas om utför analysen med en V-botten mikroplattan eller micro FACS rören.
8. För cellprover kultur supernatanten, lägga till 25 µL analysbuffert i alla brunnar. Tillsätt 25 µL av varje standard till standard brunnarna. Lägg till 25 µL av varje prov till prov brunnarna.
9. För mätning av serum-eller plasmaprover, tillsätt 25 µL matris B i standard brunnarna. Lägga till 25 µL analysbuffert prov brunnarna. Tillsätt 25 µL av varje standard till standard brunnarna. Tillsätt 25 µL av varje utspädda serum- eller plasmaprov till provet brunnarna.
10. Vortex blandade pärlor för 30 s. Lägg 25 µL av blandade pärlor i varje brunn, skakar pärla flaska ibland för att undvika pärla lösa. Den slutliga volymen bör vara 75 µL i varje brunn efter tillsats av pärlor.
11. Tätning plattan med en tallrik sealer. Linda hela plattan, inklusive omslagets inverterad plattan, med aluminiumfolie. Placera plattan på en tallrik shaker, säkra den och skaka på ca 500 rpm för 2 h i rumstemperatur. För att förhindra läckage, gäller inte positivt tryck plattan sealer.
12. Utan invertering, placera plattan på vakuum grenröret och tillämpa vakuum som tidigare och tillsätt 200 µL 1 x Tvättbuffert i varje brunn.
13. Ta bort innehållet i de plattan analysbrunnar genom dammsugarfilter. Blot överskott tvättbuffert från botten av plattan med en absorberande pad eller pappershanddukar. Upprepa detta en gång till.
    Obs: Om analysen utförs med en V-botten mikroplattan eller micro FACS rör hoppa över steg 5.12 och 5.13. I stället Centrifugera plattan vid 1 000 x g i 5 min i rumstemperatur och sedan avlägsna supernatanten med hjälp av en flerkanalspipett.
14. Lägg till 25 µL av upptäcka antikroppar (se tabell av material) till varje brunn.
15. Tätning plattan med en färsk platta sealer. Linda hela plattan, inklusive omslagets inverterad plattan, med aluminiumfolie.
16. Placera plattan på en tallrik-shaker och skaka på ca 500 rpm för 1 h i rumstemperatur.
17. Utan dammsugning, tillsätt 25 µL av SA-PE reagens direkt till varje brunn. Ingen utspädning av reagens krävs.
18. Tätning plattan med en färsk platta sealer. Linda hela plattan, inklusive omslagets inverterad plattan, med aluminiumfolie.
19. Placera plattan på en tallrik-shaker och skaka på ca 500 rpm i 30 min i rumstemperatur.
20. Upprepa steg 5.13 ovan.
21. Tillsätt 200 µL av 1 x tvättlösning till varje brunn. Återsuspendering pärlorna på en tallrik shaker för 1 min.
22. Använder en flerkanalig Pipettera, överför prover från filtret plattan FACS rör att läsa prover på en flödescytometer.
    Obs: Provvolymen ökas från 200 µL till 300 µL genom att lägga en extra 100 µL av 1 x Tvättbuffert i varje rör att undvika provet körs torr. Om nödvändiga prov kan förvaras vid 4 ° C skyddas från ljus och analyseras följande dag. Men långvarig förvaringen kan leda till svagare signal.

6. Flöde Cytometer Set-up

Obs: för att generera tillförlitliga uppgifter, flödescytometer måste ställas in korrekt innan datainsamling. Den här processen varierar för enskilda användare i vissa avseenden beroende på det särskilda instrumentet analysen utförs på konfiguration. En generaliserad installationsprocessen för en cytometer kunna mäta PE och APC och utrustade med både en 488 och 633 nm laser diskuteras nedan.

1. Starta flödet cytometer och förvärv programvaran enligt tillverkaren ' s instruktionerna som medföljer instrumentet.
2. Skapa en dot tomt med FSC (framåt punktdiagram) på x-axeln och SSC (side scatter) för y-axeln. Inställt linjärt läge FSC och SSC.
3. Skapa en andra dot-tomten med PE på x-axeln och APC för y-axeln. Denna tomt bör sättas till ett logg-baserade visningsläge.
4. Vortex injektionsflaskan med raw pärlor ingår i kit för 30 s för återsuspendering pärlorna. Dessa pärlor innehåller en inre APC färgämne och består av två storlek populationer.
5. Överföra 400 µL av rå pärlor till FACS reservrör.
6. Inställt flöde cytometer flödet lågt.
7. Kör raw pärlorna, noggrant justera vinst och spänning för FSC och SSC så att båda storlek populationer av dessa pärlor är synbart separerade och lätt till gate.
8. Justera tröskeln FSC för att utesluta oönskade händelser (dvs skräp eller luftbubblor).
9. I FSC vs. SSC tomten, rita en grind som inkluderar alla pärla populationer.
   Obs: Rå pärlorna innehåller två storlek populationer av pärlor, den mindre " en pärlor " och de större " B pärla " regioner.
10. Visa gated pärla befolkningarna från FSC vs. SSC tomten på andra dot tomten med PE på x-axeln och APC för y-axeln.
11. Justera PMT spänningen för APC fluorescens kanalen så att APC signalen för alla bead populationer har en median fluorescensintensiteten (MFI) som ligger mellan 1 x 10 ¹ och 5 x 10 ³.
12. Vortex injektionsflaskan med PE installationen pärlor för 30 s för återsuspendering pärlorna.
13. Överföra 400 µL av PE pärlor till FACS reservrör.
14. Ersätt raw pärlorna tube från flödescytometer med PE pärlor tube.
15. Justera fotomultiplikatorn röret (PMT) spänningen för den PE fluorescens kanal inställningen så att MFI av PE pärlor faller mellan hel-specifika spänna hittade som anges på injektionsflaskan PE pärlor.
    Obs: PE installationen pärlorna innehåller pärlor av en populationsstorlek (" en pärlor " endast).

7. Data Acquisition

Observera: de exakta förfaranden i samband med förvärvet av data om ett visst instrument kan variera och är beroende av cytometer ' s konfiguration specifikationer och den programvara som gränssnitt. Instruktionerna nedan är därför avsedda att framhäva de steg som krävs vidtas i analysen oavsett den cytometer som används i analysen.

1. Verifierar cytometer flödet fortfarande är inställd på låg.
2. Ange antalet pärla händelser förvärvas till ca 300 per analyten. För en 13-plex kombinerad panel detta motsvarar förvärva 3.900 händelser från båda pärla storlek populationerna (A + B pärlor).
3. Vortex varje prov för 5 s före analys.
4. Läs prover. När man läser prover, ställa flödescytometer setup-läget först och vänta tills pärla befolkningen stabiliseras innan du byter till förvärv läge.
5. Använda enkla namn med löpande numrering för datafiler för att underlätta dataanalys.
6. Exportera endast gated händelserna (A + B bead regioner) snarare än total händelser.
7. Lagra alla FCS filer i samma mapp för varje analys. Om kör flera analyser, skapar en separat mapp för varje analys.

< p klass= ”jove_title” > 8. Gå vidare till dataanalys

Obs: The FCS filer genereras på flödescytometer bör analyseras med hjälp av data analys programvara som kan laddas ner gratis ¹⁴.

1. Installera data analys programvara på en PC.
2. Överföra alla assay FCS filer till datorn som innehåller analysprogrammet.
3. Licens nyckel dongle (ingår i satsen) ansluts via en USB-port på datorn.
4. Starta data analys programvara.
5. Klicka på blå " Lägg till filer " knappen längst upp på skärmen.
6. Navigera till mappen som innehåller filerna FCS från analysen i pop up fönster som visas.
7. Klicka och dra alla assay FCS filer från pop up-fönstret till programvara displayen. Alla filer ska nu visas i en lista.
8. Klicka på gröna " nästa " knappen på nere till höger i displayen. Vänsterklicka och håll för att dra lilla blå standardkurvan knappar (C7 att C0) till deras motsvarande FCS filer från listan för att definiera standardkurvan.
9. Klicka på gröna " nästa " knappen på nere till höger på displayen för att öppna Usenets pop up fönster.
10. På vänster sida av fönstret Usenets anger namnen på både A och B pärla regioner assay analyten mål och deras associerade pärla-ID (finns i handbok med analys) i stigande ordning.
11. Välj verktyget portande från toppen av pop up-fönstret och använda den för att rita 2 grindar i FSC vs. SSC tomten, en runt A pärlor och en andra runt B pärlorna.
12. Granska APC vs. PE scatter tomter som visas nedanför FSC vs. SSC tomten som visas. Det blir 6 analyten band i A pärlorna (vänster tomt) och 7 analyten band i B pärlorna (rätt tomt).
    Obs: Gates kan ritas manuellt genom att välja radergummiverktyget i toppen och klicka på ta bort en viss grind. Usenets verktyget kan sedan väljas och används för att manuellt Applicera en grind till regionen önskat band.
13. Klicka på gröna " OK " knappen för att stänga Usenets pop up-fönstret och återgå till listan över FCS filer.
14. Definiera alla spädningar som gjorts i biologiska prover vid rätt klickande en viss fil, välja " utspädning vik " från menyn och rätta värde.
15. Klicka på gröna " kör " knappen nere till höger på displayen för att generera de standard kurvorna för analysen och beräkna koncentrationerna av okända biologiska prover.

Representative Results

Detta protokoll visar hur en pärla-baserad immunoassay plattform kan användas för att samtidigt kvantifiera cytokin profiler från biologiska prover med hjälp av en flödescytometer. De biologiska prover som används i det här exemplet var cell cellkulturer från mus splenocytes som hade varit tidigare inkuberas under olika aktiverande villkor, även om formatet assay har också validerats för användning med serum-eller plasmaprover.

Data som genereras från analysen används för att konstruera standard kurvor för alla analyter på panelen multiplexade. Data analys programvaran klassificerar varje viss analyt baserat på en unik pärla storlek och APC intensitet och kvantifierar dem med en PE-reporter. Dynamiska spänner, liksom känsligheten analysens demonstreras när plottas i ett log-log skala i figur 2A. Programvaran använder assay data och en 5-parametern kurva montering algoritm för att exakt beräkna inte bara koncentrationerna av analyter i användaren tillhandahålls biologiska prover men också gränsen för upptäckt på både hög och låg slutet av alla standard kurvor (tabell 1 ). Det format som beskrivs i detta protokoll ger också mycket robust Analysens precision. I figur 2B och 2 C presenteras data som skildrar inom analysen variabilityen av varje analyt. Två separata standard protein koncentrationer (hög och låg) analyserades i en analys med 16 replikat för varje prov. Figur 2 c och 2D representerar mellan analyser variabilityen av målet analyter från tre oberoende analyser. Som med intra-Analysens precision experiment, hög och låg standard koncentrationer analyserades med 3 replikerar i var och en av de oberoende experiment. Minimal variabilitet i den beräkna koncentrationen av målproteiner syns tydligt.

För att påvisa nyttan av pärla-baserade flödescytometrisk analyser i förhör cytokin uttrycket profiler, inkuberades mus splenocytes olika aktiverande villkor. Förutom en ostimulerade kontroll inkuberades även celler med LPS, anti-CD3/anti-CD28 antikroppar, eller phorbol 12-isopropylmyristat 13-acetat och ionomycin. Cell cellkulturer samlades 48 h senare och analyseras med hjälp av musen T helper cytokin panelen. Kvantifiera resultaten från detta experiment är representerade i figur 3 och effekten av stimulering villkor på cytokin koncentrationer är tydligt avgränsad.

Resultaten ovan är typiska, så länge experimenter har god laboratoriesed teknik och följer protokollet tillhandahålls assay. Felkällor i denna analys format kan uppstå från avvikelser i inkubationstider, reagens volymer, tvättmaskin, eller felaktig PMT inställningar på den flödescytometer som används för att analysera proven. I figur 4A en scatter visar plot från en framgångsrik analys 2 distinkta pärla befolkningsgrupper som är klart definierade. Detta kan jämföras figur 4B, där fattiga tvätt och protokoll följsamhet har lett till bead aggregat som oskärpa de två populationerna. Dessutom, vilket framgår av skräp i nedre vänstra kvadranten, exporterades totalt cytometer händelser för analys i stället för föredragna formatet för endast gated händelser. Korrekt cytometer ställa in är kritisk till att generera tillförlitliga uppgifter i denna analys. I figur 4 c korrekt PMT gör inställningar för att lösa varje av de 6 analyterna i APC klassificering kanalen. Felaktig PMT inställningarna kommer att resultera i data som presenteras i figur 4 d där kanalen APC har bead populationer med överlappande klassificering stödnivåer. Detta ogiltigförklarar analysen eftersom det blir omöjligt att beräkna analyten koncentrationer utan tydligt definierade populationer av assay pärlor.

Figur 2: Standard kurva spänner och Precision analys. (A) en representativ standardkurvan genereras med hjälp av panelen mus T helper cytokin. En standardkurva måste köras med varje analys. (B-C) Inom analysen precision. Två prover med olika koncentrationer av målproteiner (hög och låg) analyserades i en analys med 16 replikat för varje prov. Data representeras av medelvärdet + standardavvikelse. (D-E) Mellan analys precision. Två prover med olika koncentrationer av målproteiner (hög och låg) analyserades i tre oberoende analyser med 3 replikat för varje prov. Data representeras av medelvärdet + standardavvikelse. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3: kvantifiering av representativa resultat. Mus splenocytes (1 x 10⁶ celler) odlades vid 37 ° C + 5% CO₂ under olika förhållanden: ostimulerade, LPS (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plattan-belagd) + αCD28 (1 µg/mL lösliga), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Cellkulturer samlades efter 48 h sedan kvantifieras med hjälp av musen T helper cytokin panelen. Differentiell cytokin uttrycket profiler som svar på stimulering villkor syns tydligt. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 4: resultat från framgångsrika vs. misslyckade Assays. (A) framgångsrika analyser har distinkta pärla populationer för microsphere befolkningarna. (B) misslyckade analyser måste fattiga befolkningen separation, pärla aggregat och alltför många insamlade händelser. (C) framgångsrika analyser har tydligt definierade stödnivåer i klassificering fluorescens kanalen som är lätta att gate och kvantifiera. (D) misslyckade analyser kommer har dåligt separerat och klassificering stödnivåer som överlappar flera pärla populationer, försvårar kvantifiering. Många av dessa fel kan undvikas genom noggrann följsamhet till protokollet assay. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

	Standardkurva			Känslighet (pg/mL)
Analyt	Fit formel	CV	R2	Min.	Max.
IFN-Γ	5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01)	1,77%	0,99	2.1	18105.0
IL-5	5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36)	1,32%	1	1.9	14514.0
TNF-Α	5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37)	1,48%	0,99	1.9	20109.0
IL-2	5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34)	1,34%	1	1.9	25109.0
IL-6	5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)

TD>1.70% 0,99 2.0 7022.0 IL-4 5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36) 1,36% 1 2.0 13273.0 IL-10 5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61) 1,81% 0,99 2.2 5190.0 IL-9 5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45) 1,82% 1 1.9 12602.0 IL-17A 5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32) 0,99% 1 2.0 12285.0 IL-17F 5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34) 0,92% 1 2.0 14841.0 IL-21 5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11) 0,79% 1 9.0 12943.0 IL-22 5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39) 1.16% 1 2.0 6408.0 IL-13 5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45) 1,11% 1 2.1 16728.0

Tabell 1: standardkurvan montering och analysens känslighet. Programvaran data analys användes för att generera standard kurvor för alla analyter som ingår i den multiplex assay. Denna helt automatiserad analys gäller en robust 5-parametern kurva montering algoritm utspädning serien standarder från analysen och användes också till att definiera analysens känslighet med teoretiska gränsen för upptäckt.

Discussion

Det assay format som beskrivs i detta protokoll kan ge robusta kvantifiering av lösliga medlare profiler i biologiska prover som tillhandahålls av försöksledaren har god laboratoriesed teknik och följer det rekommendera protokollet.

I området i närheten finns det flera viktiga steg som måste följas för att garantera tillförlitliga resultat. Först, rekombinant normerna får Beredes i analysbuffert på heltid som rekommenderas, och efter endast späds med polypropylene rören. Polystyren rören kan främja efterlevnaden av proteiner väggen i rören, vilket kan leda till låga signaler när du genererar standardkurvan. Andra, ordentlig skakar under inkubationsstegen är kritisk. Utan korrekt agitation, kan de bindande egenskaperna av assay pärlor hindras allvarligt. Dessutom krävs också ordentlig tvätt mellan inkubationsstegen. Försöksledaren måste se till att överskott reagenser avlägsnas från brunnarna innan vi påbörjar nästa steg i protokollet. Instrument inställningar för den flödescytometer som används för att förhöra assay pärlorna måste optimeras liksom. I synnerhet måste PMT inställningar justeras för att säkerställa korrekt pärla separation och brett dynamiskt intervall för standard kurvorna. Slutligen, strax före analyseras på cytometer, pärlor måste vara vortexed att försäkra korrekt fjädring och för att undvika bildandet av aggregat som kan förvränga resultaten.

Detta protokoll kan potentiellt ändras för att analysera vävnad homogenates samt de provtyper som diskuteras i detta manuskript, förutsatt att forskaren är villiga att optimera deras lysis protokoll före utför stor, full tallrik analyser. Själva tekniken varierar naturligtvis beroende på vävnadstyp; i allmänhet bör protokollet dock använda ett neutralt pH buffert innehållande fysiologiska koncentrationer av Joniska salter, inga denatureringen kemikalier och helst inga rengöringsmedel. Om rengöringsmedel måste användas, bör icke-joniskt rengöringsmedel koncentrationerna hållas på ett minimum (t.ex. mer än 1%). Bufferten bör också innehålla tillräcklig proteashämmare för att förhindra proteolytisk nedbrytning av målproteiner. Oavsett det lysis protokoll som används, bör de sista förberedelserna vara centrifugeras för att ta bort partiklar före analys.

Angående analys begränsningar, koncentrationerna av analyten mål i typer av biologiska prov kan variera kraftigt. För att korrekt vis kvantifiera analyten koncentrationer, måste de falla inom de övre och nedre värdena för standardkurvan. Extrapolering av värden av kurvan är inte nödvändigtvis pålitlig och rekommenderar inte. Utredarna måste därför optimera utspädningar av sina särskilda prover i pilotförsök innan du kör en full-plate assay. Dessutom är försiktig utarbetandet av de biologiska proverna som skall analyseras avgörande för framgången för detta test format. Prover som lipemiska, hemolyserade, eller innehålla protein skräp kommer att påverka det antigen-antikropp samspel som definierar core principen om denna immunoassay, och återge resultaten som är det.

Denna analys är betydelse med avseende på befintliga metoder för kvantifiering av flera skäl. När kör ordentligt, kan formatet assay kvantifiera upp till 13 analyter från ett prov med långt mindre volymer än skulle vara skyldiga att analysera provet med traditionell ELISA-analyser. Denna assay format också kräver inte särskild instrumentering för att utföras. Detta är en fördel jämfört med andra kommersiellt tillgängliga pärla-baserade immunoanalyser som analysen kan köras med valfritt antal vanliga flöde cytometers.

Vetenskaplig undersökning in i rollen som spelas av utsöndrade faktorer och cytokin nätverk i hälsa och sjukdom expanderar. Det assay format som beskrivs i detta manuskript kan vara ett värdefullt verktyg för forskare som försöker förstå dessa mångfacetterade och komplexa fenomen. Aktiva biomedicinsk forskningsprogram börjar utforska rollen som cytokin nätverk inte bara områden såsom generaliserad inflammation⁶, men också i samband med särskilda sjukdomstillstånd såsom åderförkalkning, cancer och neuroinflammation ^15,16,17. Utan tvekan, undersökningen kommer att fortsätta att växa i dessa områden som sökandet efter nya läkemedel för att behandla dessa kroniska tillstånd expanderar. Behovet av korrekt och tillförlitlig kvantifiering av den lösliga mediatorer som förknippas med dessa sjukdomar kommer att förbli en kritisk forskning prioritet.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor	Beckman Coulter	366816	For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel	BioLegend	740005	Multiplex Immunoassay (13-plex)
Anti-mouse CD3ε antibody	BioLegend	100314	Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format
Anti-mouse CD28 antibody	BioLegend	102112	Clone 37.51, low endotoxin, azide free format
Vacuum Pump	EMD Millipore	WP6111560	For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Vacuum Manifold	EMD Millipore	MSVMHTS00	For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Sterile Disposable Reagent Reservoirs	Fisher Scientific	07-200-130	Or equivalent
Polypropylene MicroFACS Tubes	Fisher Scientific	11-842-90	For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
Pipette Kit	Fisher Scientific	14-388-100	Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL)
Multi-Channel Pipette	Fisher Scientific	FA10011G	capable of dispensing 5 μL to 200 μL
Microplate Shaker	Fisher Scientific	88880023	Or equivalent
Microcentrifuge	Fisher Scientific	75002410	Or equivalent
FACS tubes	Fisher Scientific	NC9885747	12 x 75 mm round bottom
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate)	Sigma-Aldrich	P8139
Lipopolysaccharide (LPS)	Sigma-Aldrich	L-8274	Escherichia coli O26:B6
Ionomycin	Sigma-Aldrich	I0634
Branson B200 Ultrasonic Cleaner	Sigma-Aldrich	Z305359	Or equivalent
Microcentrifuge tubes	Sigma-Aldrich	Z666505	1.5 mL polypropylene tubes
Flow Cytometer	Various	Various	Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm
96-Well Polypropylene Plate	VWR	82050-662	For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)