Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Multiplex cytokin profilering af stimuleret mus Splenocytes ved hjælp af en Cytometric perle-baseret immunassay Platform

doi: 10.3791/56440 Published: November 9, 2017

Summary

Denne protokol beskriver kvantificering af flere cytokin mål samtidig i vævskultur analysere indsamlet fra stimuleret mus splenocytes ved hjælp af multiplex perle baseret immunassay platform og et flow Flowcytometret.

Abstract

Perle-baserede immunassays beskæftiger det samme grundlæggende princip som sandwich immunassays. Fange perler, som kan differentieres efter størrelse og indre allophycocyanin (APC) Fluorescens intensitet, er konjugeret til antistoffer specifikke for en bestemt analysand. Næste, en valgte panel af definerede capture perle sæt er inkuberes med en biologisk prøve, der indeholder mål analysander specifikke til capture-antistoffer. En biotinylated detektor-antistofs cocktail er tilføjet, hvilket fører til dannelsen af capture perle-analyt-detektor-antistofs sandwich.

Endelig, føjes streptavidin-phycoerythrin (SA-PE), som binder sig til biotinylated påvisning antistoffer, at give fluorescerende signal støtteintensiteter i forhold til mængden af bundne analysand. PE fluorescerende signal af analysandens-specifikke perler regioner kvantificeres ved hjælp af flowcytometri, og koncentrationerne af særlige analysander bestemmes ved hjælp af data analyse software og standardkurven genereres i analysen.

I dette eksperiment bruger vi en mus T helper cytokin panel til samtidig kvantificere koncentrationen af 13 separat cytokin mål i vævskultur analysere indsamlet fra mus splenocytes kulturperler under forskellige stimulerende.

Introduction

I deres rolle som opløselige signaling molekyler mægle cytokiner de meget koordineret og multifaktoriel processer, der styrer vært immunologiske reaktioner. De er udtrykt i alle faser af den inflammatoriske proces, fra indledning til løsning, og regulere et komplekst samspil netværk, der omfatter deres egen syntese og med deres cellulære receptorer1. Denne meddelelse netværk er lagdelt med en kompleksitet, der går ud over de synergistisk eller antagonistisk relationer, der kan eksistere mellem individuelle komponenter. Faktisk, mange cytokiner er kendt at dele overflødige eller i det mindste delvist overlappende funktioner2,3.

Integrerede systemer biologi tilgange, der samtidig kvantificere flere cytokin analysander leverer i øjeblikket en stadig mere omfattende forståelse af den unikke cytokinomes, der dirigerer immunrespons underliggende flere sygdom hedder4,5. Disse sygdom stater spænder fra generaliseret betændelse på kræft, neurodegenerative og hjerte-kar-sygdom6,7,8,9.

Sådanne cytokin net kan være afhørt effektivt ved hjælp af LEGENDplex perle-baserede immunassays. Disse analyser er baseret på samme princip som sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), og bruge fluorescens kodet mikrokugler med capture antistoffer kovalent knyttet til deres overflade. Disse antistoffer er immobiliseret på overfladen områder meget mindre end dem, der kræves af traditionelle ELISA formater. Dette gør det muligt for disse analyser skal udføres med langt mindre sample volumen, mens på samme tid reducere ikke-specifik binding og leverer multipleksede analyse af flere analysander.

Analysen i denne protokol beskrevne udnytter denne teknologi til at kvantificere op til 13 mål samtidig. Data fra denne analyse kan opnås ved hjælp af en bred vifte af almindeligt tilgængelige flow cytometers og i modsætning til andre tilgængelige assays kræver ikke brug af dedikerede assay-specifikke instrumentation. Med en voksende katalog af validerede analysand paneler, har disse assays været brugt i flere igangværende biomedicinsk forskning projekter10,11,12,13.

For at demonstrere den lethed og nytte af formatet analysen i dette eksperiment, vi bruger en mus T helper cytokin panel til at kvantificere adskille 13 cytokin koncentrationer fra vævskultur analysere fremstillet af mus splenocytes kulturperler under flere stimulerende betingelser. Ud over vævskultur analysere, kan dette assay også udføres ved hjælp af serum eller plasma prøver.

Protocol

alle dyreforsøg blev udført ifølge NIH anbefalingerne i vejledningen for pleje og anvendelse af forsøgsdyr og blev godkendt af IACUC på BioLegend.

Figure 1
figur 1: filtrere plade Assay Procedure Resumé. Protokol til at udføre analysen ved hjælp af filteret plader er repræsenteret som et diagram, skildrer centrale assay komponenter og inkubation trin. venligst klik her for at se en større version af dette tal.

1. biologiske prøveforberedelse

Bemærk: de valgte anatomiske websted og mængden af blod samling er overladt til den enkelte individuelle investigator og vil ikke påvirke resultatet af analysen. Når de er opnået, kan prøverne skal håndteres ifølge nedenstående trin.

  1. Udarbejdelse af serumprøver
    1. indsamle den ønskede mængde af blod ind i foretrukne indsamling rør og lad den størkne i mindst 30 min.
    2. Centrifugeres prøve i 10 min ved 1000 x g ved stuetemperatur.
    3. Fjerne serum og assay straks eller alikvot i polypropylen microcentrifuge rør og gemme prøver på ≤ -20 ° C.
  2. Forberedelse af plasmaprøver
    1. indsamle den ønskede mængde blod ved hjælp af ethylendiamintetra syre (EDTA) belagt blod indsamling rør.
    2. Centrifugeres i 10 min ved 1000 x g ved stuetemperatur i 30 min. af samling.
    3. Fjerne plasma og assay straks eller alikvot i polypropylen microcentrifuge rør og gemme prøver på ≤ -20 ° C.
  3. Forberedelse af vævskultur supernatanten prøver
    1. centrifugeres prøve i 10 min på 1.500 x g ved 4 ° C til at fjerne celler og debris.
    2. Indsamler supernatanten og assay straks eller alikvot i polypropylen microcentrifuge rør og lagrer på ≤ -20 ° C.
  4. Optøning af frosne biologiske prøver
    1. helt tø nogen tidligere frosne biologiske prøver på is og vortex kort før brug. Undgå mere end 2 fryse/optøningscykler.
      Bemærk: De prøver, der indgår i denne protokol blev fremstillet ved dyrkning af BALB/c mus splenocytes (1 x 10 6 celler ved 37 ° C + 5% CO 2 forskellige betingelser: unstimulated, LP'ER (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plade-belagt) + αCD28 (1 µg/mL opløselige), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kultur supernatanter blev indsamlet efter 48 h og behandles som beskrevet i afsnit 1.3.

2. Reagens

  1. Preparation of Pre-mixed Antibody-Immobilized perler
    1. Sonicate færdigblandede perler flaske i 1 min i en sonikator bad ved stuetemperatur, og derefter vortex for 30 s før brug. Hvis der findes nogen sonikator bad, øge vortex tid til 1 min.
  2. Forberedelse af Wash Buffer
    1. Bring 20 x vaskebuffer (20 x PBS med 1% Tween-20) leveres med kit til stuetemperatur og vortex at bringe alle salte i opløsning.
    2. Fortyndes 25 mL af 20 x vaskebuffer med 475 mL deioniseret vand. Store uudnyttede del mellem 2 ° C og 8 ° C i op til en måned.
  3. Forberedelse af Matrix B (til brug med Serum og Plasma prøver kun)
    1. tilføje 5,0 mL af analysebuffer (PBS med 1% BSA) inkluderet i kit til den flaske, som indeholder frysetørret Matrix B. Tillad mindst 15 min. til komplet reconst itution, derefter vortex at blande godt. Sidesten rekonstitueret Matrix B kan opbevares ved ≤ 70 ° C i op til en måned.

3. Standardpraeparat

Bemærk: hver analysand i dette panel har en top standard koncentration på 10.000 pg/mL.

  1. Tilføje 250 µL af analysebuffer til at rekonstruere den frysetørrede mus Th cytokin Standard Cocktail. Mix af kort vortexing og tillade hætteglas til at sidde ved stuetemperatur i 10 min.
  2. Overføre den standard cocktail til en polypropylen microcentrifuge tube mærket " C7 ". Dette vil blive brugt som standard toppen.
  3. Etiket 6 polypropylen microcentrifuge rør som C6, C5, C4, C3, C2 og C1.
  4. Tilføje 75 µL af analysebuffer til hver af disse rør.
  5. Overføre 25 µL af den øverste standard C7 til C6 tube og bland godt ved vortexing. Dette vil være standarden, der C6.
  6. Fortsæt udfører serie 1:4 fortyndinger ved hjælp af en ny afpipetteres tip for hver tube at tilføje 25 µL af den tidligere standard til analysebuffer 75 µL i den næste laveste standard tube efterfulgt af vortexing at opnå normer C5, C4, C3 , C2 og C1. Bruge analysebuffer seriemæssigt 0 pg/mL (C0).

4. Prøve fortynding

Bemærk: indledende pilotforsøg med flere fortyndinger dette assay kan være forpligtet til at afgøre den mest hensigtsmæssige fortyndingsfaktoren for et bestemt sæt af biologiske prøver. En ordentlig fortyndingsfaktoren vil producere koncentration beregninger for prøven, der ligger inden for grænserne af standardkurven. Følgende trin er ment som retningslinjer og kan have fastsættes empirisk afhængigt af prøvetypen.

  1. Dilute serum eller plasma prøver 2-fold med analysebuffer (fx. fortyndet 50 µL af prøven med 50 µL af analysebuffer) i polypropylen microcentrifuge rør.
    Bemærk: Hvis der kræves yderligere prøveopløsning, fortyndinger bør ske med Matrix B i stedet for analysebuffer at sikre nøjagtig måling. Tilføje serum eller plasma prøver uden fortynding vil resultere i lav assay nøjagtighed og kan tilstoppe filterplade. Matrix B består af poolede mus serum forarmet af endogene assay mål. Det bruges som en serum eller plasma prøve fortynder til at undgå matrixeffekter, som er kendt for at påvirke analytiske følsomhed immunassays.
  2. Test celle kultur supernatanten prøver uden fortynding.
    Bemærk: Indholdet af analysand kan variere stærkt fra prøve til prøve. Om nødvendigt, fortyndes supernatanten prøver ved hjælp af en frisk forberedelse af deres tilsvarende cellekulturmedium eller analysebuffer.

5. Analysen Procedure

Bemærk: analysen kan være udført i polypropylen filter plader, micro FACS rør eller V-bund mikroplader. Filter plade analyseprocedure anbefales på grund af god prøve til prøve konsistens, assay robusthed og nem håndtering. Denne procedure kræver en vakuum filtrering enhed til vask (leveres af slutbrugeren).

  1. Tillade alle reagenser til varme til stuetemperatur (20-25 ° C) før brug.
  2. Sæt filterplade på en inverteret plade cover på alle tidspunkter under assay setup og inkubering trin, således at bunden af pladen ikke røre nogen overflader, da det kan forårsage utæt.
  3. Holde pladen oprejst under hele ANALYSEPROCEDURE, herunder vask trin, for at undgå at miste perler.
  4. Holde pladen i mørke eller indpakket med aluminiumsfolie for alle inkubation trin.
  5. Køre alle standarder og prøver som dubletter, arrangeret på plade i en sekventiel rækkefølge.
  6. Pre våd filter pladen ved at tilføje 100 µL 1 x vaskebuffer i hver brønd og lad det sidde i 1 min. ved stuetemperatur (hvis du bruger filter-bunden mikrotiterplade).
  7. Fjern buffer volumen ved hjælp af vakuum manifold (5-10 s). Ikke overstiger 10 " Hg vakuum. Skamplet overskydende vask Buffer fra bunden af pladen ved at trykke på pladen på en stak af rene papirservietter. Placer tallerkenen oven på dækslet til inverted plade.
    Bemærk: Trin 5.1-5.2 kan udelades, hvis udfører analysen ved hjælp af en V-bund mikrotiterplade eller mikro FACS rør.
  8. For celle kultur supernatanten prøver, tilføje 25 µL af analysebuffer til alle brønde. Tilføj 25 µL af hver standard standard brønde. Tilføj 25 µL af hver prøve prøve brønde.
  9. Til måling af serum eller plasma prøver, tilføje 25 µL af Matrix B standard brønde. Tilføj 25 µL af analysebuffer prøve brønde. Tilføj 25 µL af hver standard standard brønde. Tilføj 25 µL af hver fortyndede serum- eller plasmaprøve prøve brønde.
  10. Vortex blandet perler for 30 s. tilføje 25 µL af blandet perler til hver brønd, rystende perle flaske periodisk for at undgå perle afregning. Den endelige rumfang bør være 75 µL i hver brønd efter tilsætning af perler.
  11. Forsegle pladen med en plade sealer. Wrap hele pladen, herunder inverterede plade-cover med aluminiumsfolie. Pladen anbringes på en plade shaker, sikre det, og ryste på ca 500 rpm i 2 timer ved stuetemperatur. For at undgå utætte, gælder ikke overtryk plade sealer.
  12. Uden invertere, pladen anbringes på det vakuum manifold og anvender vakuum som før og tilføje 200 µL 1 x vaskebuffer i hver brønd.
  13. Fjerne indholdet af plade brøndene ved vakuum filtrering. DUP overskydende vaskebuffer fra bunden af pladen med en absorberende puden eller papirservietter. Gentag dette trin en gang mere.
    Bemærk: Hvis analysen er udført ved hjælp af en V-bund mikrotiterplade eller mikro FACS rør springe trin 5,12 og 5.13. I stedet centrifugeres plade på 1.000 x g i 5 min ved stuetemperatur, så Fjern supernatanten ved hjælp af en multikanalpipette.
  14. Tilføje 25 µL af påvisning antistoffer (se tabel materialer) til hver brønd.
  15. Forsegle pladen med en frisk plade sealer. Wrap hele pladen, herunder inverterede plade-cover med aluminiumsfolie.
  16. Pladen anbringes på en plade shaker og ryst på ca 500 rpm i 1 time ved stuetemperatur.
  17. Uden støvsugning, tilsæt 25 µL af SA-PE reagens direkte til hver brønd. Ingen fortynding af reagens er nødvendige.
  18. Forsegle pladen med en frisk plade sealer. Wrap hele pladen, herunder inverterede plade-cover med aluminiumsfolie.
  19. Pladen anbringes på en plade shaker og ryst på ca 500 rpm i 30 min. ved stuetemperatur.
  20. Gentag trin 5.13 ovenfor.
  21. Tilføje 200 µL 1 x vaskebuffer til hver brønd. Genopslæmmes perler på en plade shaker i 1 min.
  22. Bruger en multikanals pipette, overføre prøver fra filterplade til FACS rør at læse prøver på en flow Flowcytometret.
    Bemærk: Sample volumen forhøjes fra 200 µL til 300 µL ved at tilføje en ekstra 100 µL 1 x vaskebuffer i hver tube at undgå prøve løb tør. Hvis nødvendigt prøver opbevares ved 4 ° C beskyttet mod lys og analyseret den følgende dag. Men langvarig prøve opbevaring kan føre til reduceret signal.

6. Flow Flowcytometret Set-up

Bemærk: for at generere pålidelige data, flow forskellige skal være sat rigtigt op før dataopsamling. Denne proces varierer for de enkelte brugere i nogle henseender afhængig af konfigurationen af det særlige instrument analysen udføres på. En generaliseret konfigurationsprocessen for en Flowcytometret stand til at måle PE og APC og udstyret med både en 488 og 633 nm laser er diskuteret nedenfor.

  1. Opstart flow forskellige og erhvervelse software Ifølge producenten ' s vejledningen med instrumentet.
  2. Opret en prik plot med FSC (forward scatter) på x-aksen og SSC (side scatter) for y-aksen. Angive FSC og SSC til lineære tilstand.
  3. Oprette en anden dot plot med PE på x-aksen og APC for y-aksen. Denne parcel skal indstilles til en log-baserede skærmtilstand.
  4. Vortex hætteglas med rå perler inkluderet i kit til 30 s til genopslæmmes perlerne. Disse perler indeholder en intern APC farvestof og består af to størrelse populationer.
  5. Overføre 400 µL af de rå perler til en ny FACS tube.
  6. Angivet forskellige flow strømningshastighed til lav.
  7. Køre de rå perler, omhyggeligt justering af gain og spænding for FSC og SSC så at begge størrelse populationer af disse perler er synligt adskilt og let at gate.
  8. Justere FSC tærskel for at udelukke uønsket hændelser (dvs. snavs eller luft bobler).
  9. I FSC vs SSC plot, tegne en gate, der omfatter alle perle populationer.
    Bemærk: De rå perler indeholder to størrelse populationer af perler, jo mindre " en perler " og den større " B perle " regioner.
  10. Vise gated perle befolkninger fra FSC vs SSC plot på den anden dot plot med PE på x-aksen og APC for y-aksen.
  11. Justere ydelse spænding til APC fluorescens kanal, så APC signal for alle perle befolkninger har en median fluorescens intensitet (MFI), der ligger mellem 1 x 10 1 og 5 x 10 3.
  12. Vortex hætteglas af PE installation perler for 30 s til genopslæmmes perlerne.
  13. Overføre 400 µL af PE perler til en ny FACS tube.
  14. Erstatte de rå perler tube fra flow forskellige med PE perler tube.
  15. Justere photomultiplier tube (PMT) spænding for den PE fluorescens kanal indstilling så at MFI af PE perler falder mellem rækken Lotspecifik fundet opført på PE perler hætteglas.
    Bemærk: PE installation perler indeholde perler af én populationens størrelse (" en perler " kun).

7. Dataopsamling

NOTE: de nøjagtige procedurer i forbindelse med erhvervelse af data på et givent instrument kan variere og er afhængig af forskellige ' s konfiguration specifikationer og interface software anvendes. Vejledningen nedenfor er derfor beregnet til at fremhæve de nødvendige skridt til at blive taget i analysen uanset forskellige ansat i analysen.

  1. Kontrollere forskellige strømningshastighed er stadig indstillet til lav.
  2. Indstille antallet af perle begivenheder skal erhverves til omkring 300 pr. analysand. For en 13-plex panel dette svarer til at erhverve 3.900 begivenheder kombineret fra begge perle størrelse populationer (A + B perler).
  3. Vortex hver prøve for 5 s før analyse.
  4. Læs prøver. Når du læser prøver, sat strøm Flowcytometret til installationstilstand først og vente, indtil perle befolkning er stabiliseret før du skifter til erhvervelse tilstand.
  5. Bruge enkle navne med fortløbende nummerering for datafiler til at lette dataanalyse.
  6. Eksporterer kun de låge begivenheder (A + B perle regioner) i stedet for samlede begivenheder.
  7. Gemme alle FCS filer i den samme mappe til hvert assay. Hvis kører flere assays, oprette en separat mappe for hver assay.
< p klasse= "jove_title" > 8. Fortsæt til dataanalyse

Bemærk: The FCS filer genereret på flow-Flowcytometret skal analyseres ved hjælp af data analyse software, som kan downloades gratis 14.

  1. Installere data analyse software på en PC.
  2. Overføre alle assay FCS filer til computeren, som indeholder analysesoftwaren.
  3. Tilsluttes en USB-port på computeren den licens nøgle dongle (medfølger i sættet).
  4. Launch data analyse software.
  5. Klik på blå " tilføje filer " knappen placeret øverst i skærmbilledet.
  6. Naviger til den mappe, der indeholder filerne FCS fra assay i pop op-vindue, der vises.
  7. Klik på og træk alle assay FCS filer fra pop op-vindue til visningen, software. Alle filer vises nu i listeform.
  8. Klik på grønne " næste " knappen nederst til højre på skærmen. Venstreklik og hold for at trække lille blå standardkurven knapper (C7 til at C0) til de tilsvarende FCS filer fra listen for at definere standardkurven.
  9. Klik på grønne " næste " knappen nederst til højre på skærmen for at åbne gating pop up vindue.
  10. På venstre side af vinduet gating Angiv navnene på både A og B perle regioner assay analysand mål og deres tilknyttede perle ID (findes i manualen forsynet med analysen) i stigende rækkefølge.
  11. Vælg værktøjet gating fra toppen af pop op-vindue og bruge den til at tegne 2 porte i FSC vs SSC plot, en omkring A perler og en anden omkring B perler.
  12. Gennemgå APC vs PE scatter parceller der vises under FSC vs SSC plottet, der vises. Der vil være 6 analysand bands i A perler (venstre plot) og 7 analysand bands i B perler (højre plot).
    Bemærk: Portene kan genudstedes manuelt ved at vælge viskelæderværktøjet i toppen og klikke på for at slette en given gate. Værktøjet gating kan derefter vælges og anvendes til at udligne en gate til regionen bølgeområde.
  13. Klik på grønne " OK " knappen Luk gating pop-up-vinduet og vende tilbage til listen over filer, FCS.
  14. Definerer de fortyndinger, der blev foretaget til biologiske prøver af højre klikke på en bestemt fil, vælge " fortynding Fold " fra menuen, og inddata den korrekte værdi.
  15. Klik på grønne " køre " knappen i nederste højre hjørne af skærmen for at generere de standard kurver for analysen og beregne koncentrationerne af ukendt biologiske prøver.

Representative Results

Denne protokol viser, hvordan en perle-baseret immunassay platform kan bruges til at kvantificere samtidig cytokin profiler fra biologiske prøver ved hjælp af en flow forskellige. De biologiske prøver, der indgår i dette eksempel blev celle kultur analysere fra mus splenocytes, der havde været tidligere inkuberet under forskellige aktiverende, selv om formatet assay er også blevet valideret til brug sammen med serum eller plasma prøver.

Data, der genereres fra analysen bruges til at konstruere standard kurver for alle analysander i panelet multiplex. Data analyse software klassificerer hver pågældende analysand baseret på en unik perle størrelse og APC intensitet og kvantificerer dem ved hjælp af en PE reporter. De dynamiske områder samt følsomhed af analysen er demonstreret når plottet på en log-log skala i figur 2A. Softwaren bruger assay data og en 5-parameter kurve montering algoritme til præcist beregne ikke kun koncentrationer af analysander i bruger omhandlede biologiske prøver, men også påvisningsgrænser på både høj og lav ende af alle standard kurver (tabel 1 ). Det format, der er beskrevet i denne protokol giver også meget robust assay præcision. I figur 2B og 2 C præsenteres data skildrer intra-assay variationen af hver analysand. To separate standard protein koncentrationer (høj og lav) blev analyseret i en assay med 16 flergangsbestemmelser for hver prøve. Figur 2 c og 2D repræsenterer den inter assay variation af target analysander fra tre uafhængige assays. Som med intra-assay præcision eksperimenter, høj og lav standard koncentrationer blev analyseret med 3 gentagelser i hver af de uafhængige forsøg. Minimal variation i den beregnede koncentration af target proteiner er klart synlige.

For at påvise nytten af perle-baserede cytometric assays i spørgekriterierne cytokin udtryk profiler, blev mus splenocytes udruget forskellige aktiverende betingelser. Ud over en unstimulated kontrol, blev celler også inkuberes med LP'ER, anti-CD3/anti-CD28 antistoffer, eller phorbol 12-myristate 13-acetat og ionomycin. Celle kultur analysere blev indsamlet 48 timer senere og analyserede ved hjælp af musen T helper cytokin panel. Kvantificere resultaterne fra dette eksperiment er repræsenteret i figur 3 og effekten af stimulation betingelser på cytokin koncentrationer er klart afgrænset.

Resultater beskrevet ovenfor er typisk, så længe eksperimentatoren har god laboratoriepraksis teknik og følger den medfølgende assay protokol. Fejlkilder i dette assay format kan opstå fra afvigelser i inkuberingstider, reagens diskenheder, vask, eller forkert ydelse indstillinger på flow Flowcytometret bruges til at analysere prøverne. I figur 4A scatter viser plot fra en vellykket analysen 2 adskilte perle populationer, der er klart defineret. Dette kan være i kontrast til figur 4B, hvor fattige vask og protokollen overholdelse har ført til perle aggregater, som slører de to befolkningsgrupper. Desuden, som det fremgår af vragrester i nederste venstre kvadrant, blev samlede forskellige begivenheder eksporteret til analyse snarere end det foretrukne format for gated begivenheder kun. Ordentlig forskellige oprettet er afgørende for at generere pålidelige data i denne analyse. I figur 4 c ordentlig ydelse indstillinger giver mulighed for opløsning af hver af de 6 analysander i APC klassificering kanal. Forkert ydelse indstillinger vil resultere i data svarer til præsenteret i figur 4D hvor APC kanalen har perle populationer med overlappende klassificering intensiteter. Dette vil medføre analysen, da det vil være umuligt at beregne analysandens koncentration uden klart definerede populationer af assay perler.

Figure 2
Figur 2: Standard kurve intervaller og Assay præcision. (A) en repræsentativ standardkurve genereret ved hjælp af musen T helper cytokin panel. En standardkurve skal køres med hvert assay. (B-C) Intra-assay præcision. To prøver med forskellige koncentrationer af target proteiner (høj og lav) blev analyseret i en assay med 16 flergangsbestemmelser for hver prøve. Data repræsenteres som middelværdi + standardafvigelse. (D-E) Inter assay præcision. To prøver med forskellige koncentrationer af target proteiner (høj og lav) blev analyseret i tre uafhængige assays med 3 flergangsbestemmelser for hver prøve. Data repræsenteres som middelværdi + standardafvigelse. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 3
Figur 3: kvantificering af repræsentative resultater. Mus splenocytes (1 x 106 celler) var kulturperler ved 37 ° C + 5% CO2 forskellige betingelser: unstimulated, LP'ER (100 ng/mL), αCD3 (1 µg/mL plade-belagt) + αCD28 (1 µg/mL opløselige), PMA (20 ng/mL) + Ionomycin (500 ng/mL). Kultur supernatanter blev indsamlet efter 48 h så kvantificeres ved hjælp af musen T helper cytokin panel. Differential cytokin udtryk profiler som svar på stimulation betingelser er klart synlige. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 4
Figur 4: resultater fra vellykket vs mislykket Assays. (A) vellykket assays vil har adskilte perle befolkninger for microsphere populationer. (B) mislykket assays vil have fattige befolkning adskillelse, perle aggregater og for mange indsamlede hændelser. (C) vellykket assays har klart definerede intensiteter i klassificering fluorescens-kanal, som er nemme at gate og kvantificere. (D) mislykket assays vil have dårligt adskilt og klassificering intensiteter, der overlapper flere perle populationer, vanskeliggør kvantificering. Mange af disse fejl kan undgås ved omhyggelig overholdelse af assay-protokollen. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.

Standardkurven Følsomhed (pg/mL)
Analysand Fit formel CV R2 Min. Max.
IFN-Γ 5-P.log(4.43, 14.40, 0.54, 9.11, 0.01) 1,77% 0,99 2.1 18105.0
IL-5 5-P.log(4.36, 12.68, 0.64, 5.73, 0.36) 1.32% 1 1.9 14514.0
TNF-Α 5-P.log(4.36, 11.63, 0.79, 5.45, 0.37) 1,48% 0,99 1.9 20109.0
IL-2 5-P.log(4.46, 12.62, 0.78, 5.07, 0.34) 1.34% 1 1.9 25109.0
IL-6 5-P.log(4.58, 11.66, 0.64, 5.77, 0.37)
TD>1.70% 0,99 2.0 7022.0 IL-4 5-P.log(4.27, 12.23, 0.62, 5.72, 0.36) 1,36% 1 2.0 13273.0 IL-10 5-P.log(4.67, 11.65, 1.20, 6.28, 0.61) 1,81% 0,99 2.2 5190.0 IL-9 5-P.log(4.32, 13.86, 0.86, 5.90, 0.45) mod 1,82% 1 1.9 12602.0 IL-17A 5-P.log(4.06, 14.03, 0.47, 6.52, 0.32) 0,99% 1 2.0 12285.0 IL-17F 5-P.log(4.52, 12.15, 0.61, 5.52, 0.34) 0,92% 1 2.0 14841.0 IL-21 5-P.log(4.90, 8.03, 1.77, 4.74, 1.11) 0,79% 1 9,0 12943.0 IL-22 5-P.log(4.57, 12.56, 0.63, 6.06, 0.39) 1.16% 1 2.0 6408.0 IL-13 5-P.log(4.40, 11.44, 0.22, 3.19, 1.45) 1,11% 1 2.1 16728.0

Tabel 1: Standardkurven montering og Assay følsomhed. Data analyse software blev brugt til at generere standard kurver for alle analysander indeholdt i multiplex analysen. Denne fuldt automatiseret analyse gælder en robust 5-parameter kurve montering algoritme til fortynding serie standarder fra analysen og blev også brugt til at definere assay følsomhed ved hjælp af de teoretiske påvisningsgrænser.

Discussion

Assay format beskrevet i denne protokol kan give robuste kvantificering af opløselige mægler profiler i biologiske prøver leveret eksperimentatoren har god laboratoriepraksis teknik og overholder de anbefalede protocol.

Der er flere vigtige skridt, der skal følges for at sikre pålidelige resultater. Først, må de rekombinante standarder til at rekonstruere i analysebuffer fuld tid anbefales, og efter kun fortyndet i polypropylen rør. Polystyren rør kan fremme overholdelsen af proteinerne mur af rør, som kan føre til lavt signaler, når du genererer standardkurven. Andet, ordentlig ryster under inkubation trin er kritisk. Uden ordentlig agitation, kan bindende egenskaber af analysen perler blive alvorligt hæmmet. Korrekt vask mellem inkubation trin er derudover også nødvendig. Eksperimentatoren bør sikre, at overskydende reagenser er fjernet fra brøndene før påbegyndelse det næste trin i protokollen. Instrumenter indstillinger for flow Flowcytometret bruges til at afhøre assay perlerne skal optimeres så godt. Især skal ydelse indstillinger ændres for at sikre ordentlig perle adskillelse og bred dynamisk intervallerne for de standard kurver. Endelig, lige før at blive analyseret på forskellige, perler skal være vortexed at sikre ordentlig suspension og undgå dannelsen af aggregater, der kan forvrænge resultater.

Denne protokol kan potentielt modificeret til at analysere væv homogeniseret samt prøve typer drøftet i dette manuskript, forudsat at forskeren er villig til at optimere deres lysis protokol inden du udfører store, fuld plade assays. Den faktiske teknik vil naturligvis variere afhængigt af vævstype; men generelt protokollen bør bruge en neutral pH buffer indeholdende fysiologiske koncentrationer af Ioniske salte, ingen denaturering kemikalier og helst ikke rengøringsmidler. Hvis rengøringsmiddel skal anvendes, bør nonionisk detergent koncentrationer holdes på et minimum (f.eks. ikke mere end 1%). Bufferen bør også indeholde tilstrækkelige proteasehæmmere for at forhindre proteolytisk nedbrydning af target proteiner. Uanset lysis protokollen anvendes, bør de sidste forberedelser centrifugeres for at fjerne partikler inden analyse.

Vedrørende analyse, koncentrationen af analysanden mål i biologisk prøve typer kan variere meget. For at korrekt kvantificere analysand koncentrationer, skal de falder inden for de øverste og nederste værdier for standardkurven. Ekstrapolering af værdier af kurven er ikke nødvendigvis pålidelig og anbefale ikke. Efterforskere skal derfor optimere fortyndinger af deres særlige prøver i pilotforsøg inden du kører en fuld-plade assay. Derudover er den omhyggelige forberedelse af de biologiske prøver til analyseres altafgørende for succes i dette assay format. Prøver, der er lipemic, hemolyzed, eller indeholder protein snavs vil påvirke antigen-antistof interaktioner, der definerer Kerneprincippet for denne immunassay og render resultater, der er uninterpretable.

Denne analyse er væsentlige for den eksisterende kvantificering metoder af flere grunde. Når kører ordentligt, kan formatet assay kvantificere op til 13 analysander fra en prøve ved hjælp af langt mindre mængder end ville være forpligtet til at analysere prøven ved hjælp af traditionelle ELISA assays. Dette assay format kræver også ikke dedikeret instrumentation i for at blive udført. Det er en fordel i forhold til andre kommercielt tilgængelige perle-baserede immunassays som analysen kan køres ved hjælp af et vilkårligt antal almindeligt anvendte flow cytometers.

Videnskabelig undersøgelse til rollen spillet af udskilles faktorer og cytokin netværk i sundhed og sygdom er i vækst. Formatet assay beskrevet i dette manuskript kan være et værdifuldt redskab for forskere søger at forstå disse mangesidede og komplekse fænomener. Aktive biomedicinsk forskningsprogrammer begyndt at udforske rollen af cytokin netværk i ikke kun områder såsom generaliseret betændelse6, men også i forbindelse med specifikke sygdomstilstande såsom åreforkalkning, kræft og neuroinflammation 15,16,17. Utvivlsomt, undersøgelsen vil fortsætte med at vokse i disse områder som søgen efter nye terapi til behandling af disse kroniske tilstande udvider. Behovet for nøjagtig og pålidelig kvantificering af opløselige mæglerne forbundet med disse sygdomme vil fortsat prioriteres kritisk forskning.

Disclosures

Forfatterne er ansat af BioLegend, som fremstiller de reagenser, der er beskrevet i dette håndskrift. Vigene Tech, Inc. udviklet LEGENDplex data analyse software, der bruges til at analysere data genereret fra analysen beskrives i dette håndskrift.

Acknowledgments

Forfatterne vil gerne anerkende bidragene af biomarkører og Immuno-assays produktudvikling team til udviklingen af analysen. Derudover vil vi gerne takke Vigene Tech, Inc. til deres fælles indsats i at designe data analyse softwarepakker.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Allegra 6R Centrifuge with MICROPLUS Carrier Adaptor Beckman Coulter 366816 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
LEGENDplex Mouse T helper Cytokine Panel BioLegend 740005 Multiplex Immunoassay (13-plex)
Anti-mouse CD3ε antibody BioLegend 100314 Clone 145-2C11, low endotoxin, azide free format
Anti-mouse CD28 antibody BioLegend 102112 Clone 37.51, low endotoxin, azide free format
Vacuum Pump EMD Millipore WP6111560 For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Vacuum Manifold EMD Millipore MSVMHTS00 For LEGENDplex assays using filter plates (recommended)
Sterile Disposable Reagent Reservoirs Fisher Scientific 07-200-130 Or equivalent
Polypropylene MicroFACS Tubes Fisher Scientific 11-842-90 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)
Pipette Kit Fisher Scientific 14-388-100 Four pipette sizes (0.2-2µL, 2-20µL, 20-200µL, 100-1000µL)
Multi-Channel Pipette Fisher Scientific FA10011G capable of dispensing 5 μL to 200 μL
Microplate Shaker Fisher Scientific 88880023 Or equivalent
Microcentrifuge Fisher Scientific 75002410 Or equivalent
FACS tubes Fisher Scientific NC9885747 12 x 75 mm round bottom
PMA (Phorbol 12-myristate 13-acetate) Sigma-Aldrich P8139
Lipopolysaccharide (LPS) Sigma-Aldrich L-8274 Escherichia coli O26:B6
Ionomycin Sigma-Aldrich I0634
Branson B200 Ultrasonic Cleaner Sigma-Aldrich Z305359 Or equivalent
Microcentrifuge tubes Sigma-Aldrich Z666505 1.5 mL polypropylene tubes
Flow Cytometer Various Various Cytometer equipped with single laser (488nm blue) or two lasers (488nm blue or 532nm green + 633nm Red) capable of reading emission wavelengths at 575nm and 660nm
96-Well Polypropylene Plate VWR 82050-662 For LEGENDplex assays is run in microtubes, V-or U-bottom 96-well plate (optional)

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Stanley, A. C., Lacy, P. Pathways for cytokine secretion. Physiology (Bethesda). 25, 218-229 (2010).
  2. Nicola, N. A. Cytokine pleiotropy and redundancy: a view from the receptor. Stem Cells. 12, (1994).
  3. Miyajima, A., Hara, T., Kitamura, T. Common subunits of cytokine receptors and the functional redundancy of cytokines. Trends Biochem Sci. 17, 378-382 (1992).
  4. Costantini, S., Castello, G., Colonna, G. Human Cytokinome: a new challenge for systems biology. Bioinformation. 5, 166-167 (2010).
  5. Capone, F., et al. Serum Cytokinome Profile Evaluation: A Tool to Define New Diagnostic and Prognostic Markers of Cancer Using Multiplexed Bead-Based Immunoassays. Mediators Inflamm. 3064643 (2016).
  6. Schett, G., Elewaut, D., McInnes, I. B., Dayer, J. M., Neurath, M. F. How cytokine networks fuel inflammation: Toward a cytokine-based disease taxonomy. Nat Med. 19, 822-824 (2013).
  7. Tse, E., Kwong, Y. L. T-cell lymphoma: Microenvironment-related biomarkers. Semin Cancer Biol. 34, 46-51 (2015).
  8. Reale, M., Greig, N. H., Kamal, M. A. Peripheral chemo-cytokine profiles in Alzheimer's and Parkinson's diseases. Mini Rev Med Chem. 9, 1229-1241 (2009).
  9. Vistnes, M., Christensen, G., Omland, T. Multiple cytokine biomarkers in heart failure. Expert Rev Mol Diagn. 10, 147-157 (2010).
  10. Gobel, K., et al. Blood coagulation factor XII drives adaptive immunity during neuroinflammation via CD87-mediated modulation of dendritic cells. Nat Commun. 7, 11626 (2016).
  11. Palm, A. K., Friedrich, H. C., Kleinau, S. Nodal marginal zone B cells in mice: a novel subset with dormant self-reactivity. Sci Rep. 6, 27687 (2016).
  12. Yu, Y., et al. The transcription factor Bcl11b is specifically expressed in group 2 innate lymphoid cells and is essential for their development. J Exp Med. 212, 865-874 (2015).
  13. Pelly, V. S., et al. IL-4-producing ILC2s are required for the differentiation of TH2 cells following Heligmosomoides polygyrus infection. Mucosal Immunol. 9, 1407-1417 (2016).
  14. LEGENDplex Multiplex Assays. Available from: https://www.biolegend.com/legendplex (2017).
  15. Autieri, M. Pro- and anti-inflammatory networks in atherosclerosis. ISRN Vascular Medicine. 2012, (2012).
  16. West, N. R., et al. Emerging cytokine networks in colorectal cancer. Nat Rev Immunol. 15, 615-629 (2015).
  17. Becher, B., Spath, S., Goverman, J. Cytokine networks in neuroinflammation. Nat Rev Immunol. 17, 49-59 (2017).
Multiplex cytokin profilering af stimuleret mus Splenocytes ved hjælp af en Cytometric perle-baseret immunassay Platform
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (129), e56440, doi:10.3791/56440 (2017).More

Lehmann, J. S., Zhao, A., Sun, B., Jiang, W., Ji, S. Multiplex Cytokine Profiling of Stimulated Mouse Splenocytes Using a Cytometric Bead-based Immunoassay Platform. J. Vis. Exp. (129), e56440, doi:10.3791/56440 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter