Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

مركز الجامعة-جبل وتلطيخ نبات زهرة الأجهزة وسيليكويس

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Summary

في هذا البروتوكول، نحن تصف التقنيات لتشريح سليم من نبات الزهور وسيليكويس، بعض تقنيات مسح الأساسية، وتحديد تلطيخ إجراءات الملاحظات جبل كل الهياكل الإنجابية.

Abstract

سبب أدواته الهائلة للدراسات الوراثية الجزيئية، أعطيت التمويل واحدة من أبرز الأنواع النموذجية في علم الأحياء النباتية، وخاصة في مصنع بيولوجيا التناسل. إلا أن المصنع مورفولوجية، تشريحية، وتحليلات ultrastructural تقليديا تنطوي التضمين مضيعة للوقت وتمزيقها الإجراءات الميدانية مشرق والمسح الضوئي والميكروسكوب الإلكتروني. التقدم الذي أحرز مؤخرا في الأسفار [كنفوكل] مجهرية وتحليلات مجهرية الدولة من الفن ثلاثي الأبعاد للحاسوب والتحسين المتواصل للتقنيات الجزيئية لاستخدامها على الحد الأدنى من المعالجة جبل كل العينات، قد أدى إلى زيادة طلب على تطوير تقنيات معالجة عينة تتسم بالكفاءة والحد الأدنى. في هذا البروتوكول، يمكننا وصف تقنيات بشكل صحيح تشريح نبات الزهور وسيليكويس، الأساسية تبادل التقنيات، وبعض إجراءات المصبوغة للجامعة-جبل الملاحظات لهياكل الإنجابية.

Introduction

الزهور هي من بين أهم تعريف الأجهزة من كاسيات البذور. النباتات المزهرة ظهرت قبل حوالي 90 مليون سنة1، وتنوعاً بسرعة أن مظهرها السريع وصفت بأنها "لغزا بغيضة" تشارلز داروين2. وتتنوع مصالح الباحثين المصنع في تنمية الزهور. بعض البحوث قد ركزت على فهم أصل تطوري الزهرة ككل، أو تطور الخصائص التشريحية وهيكلية ووظيفية محددة من الزهور3،،من45،6 . التباين العالي في شكل الأزهار والهيكل، فضلا عن طرق التكاثر الجنسي والتكاثر اللاجنسي الاعتماد عليها، جعل الزهرة بنية معقدة للغاية. وقد أدى هذا إلى جهود متنوعة لوصف السمات الهيكلية والتشريح أجهزة الأزهار، واستخدام تقنيات تقنيين الإلكترون والضوء التي يمكن أن تكون جنبا إلى جنب مع التحقيقات الجينية والجزيئية7. وعلاوة على ذلك، كمصدر للفواكه والبذور والزهور من الأهمية بالنسبة للتغذية البشرية والحيوانية. ولذلك، وصف وضع الزهور والفواكه آثار العديد من البحوث التطبيقية، بما في ذلك الأمن الغذائي سكان بشرية المتزايدة واستراتيجيات الحفاظ على البيئة في إطار بيئة متغيرة8 , 9 , 10.

التنمية الزهرة في نبات يبدأ التعريفي زهرة وتحويل أرض الخضري إلى أرض نورات (مجموعة من الزهور). وتبدأ بريمورديا زهرة جانبياً في الجناح من أرض نورات11. بريمورديا جهاز الأزهار تشكل تدريجيا في جدلات متحدة المركز من الخارج إلى مركز الزهرة، وتتحول في نهاية المطاف إلى كاسية، تلات، والاسدية، وكاربيلس7. هذه الأجهزة الأزهار تحقيق الحماية التغذوية، متميزة، والوظيفية (مثلاً، جذب الملقحات) أدوار في الأنواع النباتية المختلفة، مع الأعضاء الجنسية استدامة تنمية جاميتوفيتيس الذكور والإناث، على التوالي12 , 13. جاميتوفيتيس، بدوره، تميز كل زوج من الذكور (الحيوانات المنوية) والإناث الجاميطات (البويضة والخلية المركزية)، التي توحد عند ضعف الإخصاب لتشكيل الجيل القادم واقحه والسويداء الأولية، دعم الأنسجة الطرفية التنمية الجنين14،15. تطوير الفواكه والبذور دعم نمو ونضج، والمحافظة على الجنين، وفي نهاية المطاف، التشتت. وقد أجريت بحوث مستفيضة لتوصيف وضع الزهور والجنين في الأنواع النباتية المتنوعة، لا سيما في الأنواع النموذجية التي أعطيت7،،من1617.

استندت تحليلات مجهرية المبكر للتنمية زهرة تجهيز العينة مضيعة للوقت ومراقبة تقنيات مثل البارافين أو الراتنج التضمين وتمزيقها، جنبا إلى جنب مع الضوء أو المجهر الإلكتروني. وكثيراً ما استخدمت هذه التقنيات المجهرية التقليدية في تركيبة مع التحقيقات الجينية الجزيئية، مثل تحليلات تقنيين من طفرات، وإضفاء الطابع المحلي على الجيش الملكي النيبالي بالتهجين في الموقع ، أو المناعية-الكشف عن البروتينات. وادي التقدم الذي أحرز مؤخرا في الفحص المجهري الأسفار واسع المجال و [كنفوكل]، في تحليلات للدولة من أحدث صورة الحاسوب ثلاثي الأبعاد، والتحسين المتواصل للأساليب الجزيئية التي يمكن استخدامها في معالجة الحد الأدنى الجامع-جبل العينات، بحاجة إلى نموذج الكفاءة والحد الأدنى من تقنيات المعالجة قابلة تفضيلي للتحليلات الكمية. في السنوات الأخيرة، أحرز تقدم كبير في تطوير تقنيات مسح على عينة حيوانية الجامعة-جبل. أنها تجعل العينة شفافة أما باستخدام الكواشف المستندة اليوريا أو السكر مائي (مثلاً، مقياس، سيدب، مكعب)18،،من1920، أو بشكل انتقائي إزالة الدهون (باستخدام مواد التنظيف الحزب الديمقراطي الصربي) بعد تضمين عينات في الهلاميات المائية مستقرة؛ إزالة الدهون يمكن تحقيقه أما عن طريق نشر السلبي (مثلاً، تعديل الوضوح البروتوكول21،22من الميثاق-بارس-دواليب) أو بنشاط بالتفريد (الأصلي الوضوح البروتوكول23 و24من قانون-المعزوفة). وبتشجيع من هذا التقدم السريع، ظهرت بعض التقنيات المشتقة أيضا للاستخدام في المصانع.

في هذه الورقة أساليب تركز على نموذج نبات، يصف لنا إجراء تشريح سليم براعم الزهور، والزهور، وسيليكويس الشباب، وتطهير الجامعة-جبل عينات لتلطيخ المتنوعة وإجراءات المراقبة باستخدام الكلاسيكية أو أسلوب تطهير القائم على الحزب الديمقراطي الصربي مؤخرا. وترد أمثلة للنشا، كلوس، وتلطيخ الكروماتين. على الرغم من أن قد تحتاج هذه الإجراءات إلى مزيد من التحسينات والتعديلات المدخلة عند استخدامها مع الأنواع الأخرى، ونأمل أنهم سوف يمهد لإجراء المزيد من البحوث حول هذه الأساليب بسيطة ولكن الهامة التي هي نقطة انطلاق للعديد من مشاريع البحوث.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1-زهرة وتثبيت خردلة

  1. سيليكويس من النباتات والزهور الحصاد متزامنة في افتتاح أول زهرة.
    ملاحظة: في ظل الظروف التجريبية المستخدمة هنا، تبدأ النباتات المزهرة حوالي 21 يوما بعد زرع ألواح Murashige سكوغ (مللي ثانية) إلى التربة. بذور هي طبقات لمدة 3 – 4 أيام في 4 درجات مئوية ونامي/نمت على ألواح مرض التصلب العصبي المتعدد في ضوء 22 درجة مئوية/16 ح و 18 درجة مئوية/8 ح الظلام لمدة 8 إلى 10 أيام قبل زراعة الشتلات في التربة الغنية بالمغذيات في الأواني يحتفظ بنفس الشروط (الشكل 1). عدد replicates يعتمد على إجراء بحوث محددة الهدف، ولكن ينصح بالحد ني إينفلوريسسينسيس 5 (من 5 محطات فردية) لكل معاملة. إذا كانت الزهور هي وحدة تجريبية، يوصي بالحد ني زهور 10 كل تكرار.
  2. قطع إينفلوريسسينسيس أو الزهور (الشكل 1E-ح) باستخدام مقص صغير (مثلاً، مقص الأظافر) ووضعها مباشرة في أنبوب ميكروسينتريفوجي (لتثبيت نورات/زهرة واحدة) أو أنبوب مخروطي (لتثبيتات الجماعية) تتضمن حديثا أدلى في كارني، وحمض الخليك/الميثانول، أو نسيجية FPA50 (اعتماداً على التطبيق، انظر أدناه) على الجليد.
    ملاحظة: العينات ينبغي أن يكون تماما غارقة في مثبت.
  3. ترك الأنسجة داخل مثبت على 4 (ح) بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية.
    ملاحظة: تسلل فراغ يمكن أن تستخدم لتسريع اختراق مثبت الأنسجة، ولكن هذا قد يكون ضاراً للحفاظ على بنية الأنسجة. المؤلفين لا تنفذ تسلل الفراغ.
  4. إزالة مثبت وإضافة الإيثانول 70% ما يكفي لتغطية العينات، وإعادتها إلى 4 درجات مئوية على الأقل 24 ساعة؛ عينات البقاء إلى أجل غير مسمى في هذا الحل. بعد إزالة الإيثانول، الشروع فورا في الخطوة التالية؛ أما التشريح، أو إزالة مخزونات النشر الاستراتيجي.

2-التشريح تحت ستيريوميكروسكوبي

  1. وضع طازجة الإيثانول 70% في الزجاج صانع يشاهد توضع على طبق بيتري صغيرة للدعم.
  2. نورات/الزهرة/خردلة في هذا المكان طازجة مثبت وتشريح تحت ستيريوميكروسكوبي استخدام الملقط وحقنه بإبرة.
    1. استخدام الزجاج صانع يشاهد أو الأجهزة المماثلة التي تسمح العينات لتكون مغطاة تماما مع الإيثانول (مستحسن) التشريح إينفلوريسسينسيس، وتمزق الأجهزة الزهور للزهور الناضجة (كاسية تلات ويمكن السداة تكون تشريح في هذه المرحلة ) لتجنب خطر جفاف العينات.
  3. تشريح سيليكويس وبراعم الزهور الصغيرة على شريحة كما هو موضح أدناه.
    1. جانبا زجاج لصانع يشاهد مع العينات المجهزة مسبقاً، واستخدام شريحة عادية للتشريح النهائي.
    2. نقل عينة الفائدة للشريحة وإضافة 10 ميليلتر من جديد 70% إيثانول. العمل بسرعة على التشريح النهائي وإضافة 10 ميليلتر من الإيثانول، إذا لزم الأمر، للحفاظ على العينة رطبة دون السائل المفرط.
    3. للحصول على الإفراج عن حبوب اللقاح من الأسدية، راجع الخطوة 5، 1. لتشريح carpels والبويضات، اتبع الإجراء الموضح في الشكل 2. ينطبق هذا الإجراء على جميع مراحل تنمية الكربلة، بما في ذلك مرحلة تنمية سيليكويس الأخضر.
      ملاحظة: لا تقم بإضافة الإيثانول إذا لم يكن هناك كافية الإيثانول المرحل من نقل العينات؛ تشريح عينات صغيرة جداً أسهل بكثير في كمية صغيرة من السائل. تبقى فقط الأجهزة للفائدة (كاسية أو تلات، الأسدية، كاربيلس، والبويضات، بذور أو حبوب اللقاح) دائماً على الشريحة. وسيكفل هذا الإجراء سماكة موحدة بين الشرائح وساترة، المقابلة لسمك الجهاز قيد الدراسة، مما أدى إلى تجانس أعلى، وهكذا الكفاءة للفحص المجهري (عدد أكبر من العينات المستهدفة في نفس المستوى البؤري).
  4. استخدام قطعة صغيرة من ورق نشاف لامتصاص وإزالة الإيثانول قدر الإمكان. بسرعة المضي قدما إلى الخطوة التالية (القسم 3 أو 4 أو 6) قبل يجفف عينة بها.

3-كلورال هيدرات على أساس المقاصة وتلطيخ المقاصة المجمعة

ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج للمقاصة على أساس كلورال هيدرات مع FPA50 الثابتة المادية.

  1. 20 مكان ميليلتر لمسح الحل (كلورال هيدرات/والغليسيرول، تعديل المتوسط في هوير أو 4 في هير ايكي-4 الحلول هير) على الشريحة الحاملة للعينة. استخدام زوج من الحقن بالإبر، وقالت بوضع العينات عند الاقتضاء عن طريق تقليل المسافة بينها، وعكس تلك التي تواجه فيها الجهاز للفائدة إلى الأسفل. قم بإزالة أي فقاعة هواء المتبقية باستخدام الإبرة.
  2. انخفاض ساترة جانبية بلطف وضعه، الضغط بلطف جداً، والانتظار حتى الحل المقاصة يملأ المساحة بين. إضافة حل إزالة الحد الأدنى، إذا لزم الأمر، لملء المساحة الكاملة تحت ساترة.
  3. ضع الشريحة على حامل شرائح واتركه تحت غطاء الدخان. متابعة الملاحظات المجهرية بعد على الأقل 4 ح وخلال 4-5 أيام التالية.

4-الجمع بين ألكسندر تلطيخ وتطهير هير في 4 أنثيرس

ملاحظة: يستند الأصلي للبروتوكول ألكسندر الإفراج عن حبوب اللقاح على الشريحة قبل التلوين. كفاءة وأكثر إفادة، تعديل ألكسندر تلطيخ والتخليص الداخلي هو تلطيخ من حبوب اللقاح الناضجة داخل anthers ناضجة ولكن غير ديهيسسينت.

  1. اختر براعم الزهور الطازجة المحصودة التي على وشك فتح مع أنثيرس غير ديهيسسينت.
    ملاحظة: لا تأخذ الشابة زهرة براعم لأن ألكسندر تلطيخ المقصود لحبوب اللقاح الناضجة وعدم كفاءة وصمة حبوب اللقاح غير ناضجة. ويوصي بحد أدنى زهور 5 كل معاملة حصادها من نباتات مختلفة وإينفلوريسسينسيس.
  2. إعداد لوحة 96-جيدا مع حل ألكسندر كافية لغمر برعم زهرة. كشف أنثيرس عن طريق إزالة كاسية وتلات وتزج بها في حل ألكسندر. تبقى العينات تحت غطاء الدخان ح 1 – 3.
  3. استبدال الحل ألكسندر مع الحل هير في 4 ومكان لوحة متعددة جيدا مرة أخرى تحت غطاء الدخان لحضانة بين عشية وضحاها.
  4. استخدام الملقط، تحرك بلطف تطهير براعم الزهور إلى شريحة جديدة. منذ قد تحدث بعض المرحل من حل ألكسندر، استخدام ورقة نشاف لإزالة الحل المقاصة قدر الإمكان.
  5. تشريح والاسدية، وإزالة جميع الأنسجة الأخرى. اتبع الخطوات الموجودة في القسم 3 استخدام هير للحل 4.

5-إزالة اكسين من حبوب اللقاح

ملاحظة: نوصي باستخدام مثبت في كارني لتلطيخ DAPI.

  1. اتبع إجراءات التثبيت وتشريح المبينة في القسمين 1 و 2. الآن، واحدة يجب أن يكون واحد للعديد من الأسدية على الشريحة ضمن الحد أدنى من الإيثانول 70%.
  2. استخدام ورقة نشاف لإزالة الزائدة الإيثانول، وإضافة 5-10 ميليلتر لحل DAPI. باستخدام اثنين من الحقن بالإبر، الإفراج عن حبوب اللقاح داخل ذلك كمية صغيرة من الحل (مثلاً، استخدام حقنه واحدة شل في السداة وأخرى للإفراج عن حبوب اللقاح). إضافة آخر ميليلتر 5 من DAPI إذا كان الحل الذي يجف.
  3. إزالة جميع الأنقاض من السداة خطوة حاسمة، مثل أن تترك بين الشريحة وساترة حبوب اللقاح فقط.
  4. ضع ساترة على الشريحة الحاملة للعينة بتخفيض من جانبية وإضافة الحد الأدنى من حل DAPI المطلوبة لملء الفراغ. مكان سبابة على ساترة، ودون السحق أيضا الكثير مما جعل سريعة، وطيد، وانزلاق حركة قصيرة.
    ملاحظة: لقياس القوة اللازمة، والسعة لحركة انزلاق، هذه الخطوة ينبغي أن يمارس عدة مرات، التحقق من النتائج في كل مرة تحت المجهر.
  5. إضافة حل DAPI إذا لزم الأمر وتحسين مكان الشريحة في مربع رطبة في الظلام عند 4 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة إلى حاء 1 المضي قدما لمراقبة العينات تحت الأسفار واسع المجال أو مجهرية [كنفوكل] داخل 24 حاء في محاولة للجمع بين هذا الإجراء مع المقاصة للتحقق ما إذا كانت زيادة مخزونات النشر الاستراتيجي ويمكن الحصول على الإدلاء بالبيانات.

6-الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS) مسح

ملاحظة: اعتماداً على جهاز الأزهار يتم تحليلها، وعلى مهارات الباحث تشريح العينات لينة جداً وصغيرة، معاملة مخزونات النشر الاستراتيجي يمكن القيام أما قبل (للباحثين ذوي الخبرة) أو بعد التشريح خطوة (لأقل من ذوي الخبرة الباحثين) في حمض الخليك الميثانول الثابتة المادية.

  1. استخدام الزجاج صانع مشاهدة شريحة مقعرة أو أنبوب ميكروسينتريفوجي لاحتضان تشريح أو غير تشريح عينات في مخزونات النشر الاستراتيجي 1% وحل ن هيدروكسيد الصوديوم 0.2 بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
  2. التعامل مع الرعاية لأن العينة لينة جداً وله مظهر شفافة. يشطف عدة مرات بالماء.
    ملاحظة: قد تؤدي مخلفات حل الحزب الديمقراطي الصربي لهطول الأمطار عند إضافة حل المصبوغة، مثلاً، انيلين الأزرق.
  3. لعينات غير تشريح، اتبع الإجراء التشريح هو موضح في القسم 2، باستخدام المياه بدلاً من الإيثانول 70%. بعد تشريح الأنسجة المرجوة، لإزالة أي بقايا والحطام، وأي فائض المياه مع ورقة نشاف، ثم إضافة 20 – 40 ميليلتر من حل المصبوغة، والمضي في الخطوة 6، 5.
  4. لعينات تشريح، بعناية نقل العينة من الحل الغسيل ووضعه على شريحة نظيفة، وإضافة 20 – 40 ميليلتر من حل المصبوغة.
  5. بلطف ضع ساترة على الشريحة عن طريق خفض من جانبية. الحرص على عدم الاسكواش الإعداد. مكان أي رقيقة فاصل بين الشريحة وساترة في أركانه (مثلاً، الشريط أو ساترة مكسورة)، إذا كانت الأنسجة الناعمة جداً، ترك مساحة مثل الدائرة بين الشرائح وساترة، مثل أن لا سحق ساترة العينة.
  6. ضع كافة الشرائح داخل مربع رطبة وتغطية ذلك مع رقائق الألومنيوم، ووضعه في 4 درجات مئوية على الأقل 1 حاء المضي قدما لمراقبة العينة باستخدام ويديفيلد fluorescence أو مجهرية [كنفوكل] داخل ح 24.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

نبات ينتمي إلى أسرة براسيكاسيا، إذ تضع inflorescences مع المخنثين الزهور مرتبة في كوريمب (الشكل 1). وقد كل زهرة كاسية أربعة وتلات أربع وست الأسدية (أربعة منذ فترة طويلة وقصيرة اثنين) ومن متاع سينكاربوس تتكون من اثنين carpels تنصهر خلقية (الشكل 1-واو-ح) مرتبة في أربع جدلات متحدة المركز25،26. وقد أعطيت تينوينوسيلاتي، أنتروبوس البويضات مرتبة في بلاسينتيشن الجدارية في صفين (12-20 البويضات في كل صف) داخل كل من لوكوليس اثنين من المبيض (مجموع البويضات 45 – 80) (البيانات غير المنشورة، ومراجع27، 28 , 29 , 30)-بغية إجراء تحليلات مقارنة قوية للتنمية زهرة والجنين داخل منشأة فردية أو بين نباتات مختلفة (ك replicates أو العلاجات)، فإنه من المستحسن استخدام زهرة المفتوحة الأولى كمرجع (الشكل 1B). وفي هذه المرحلة، نورات (الشكل 1E) عادة ما بين 20 و 30 من براعم الزهور التي تغطي جميع مراحل التنمية زهرة، وفي مراحل مماثلة تقريبا من الأفراد الآخرين (بيانات غير منشورة). وسوف يشرع المزيد من الخلايا الإنشائية زهرة (تشكيل بين الزهور 5 و 20) بأرض نورات بعد فتح أول زهرة. وقد تظهر عيوب الخصوبة الزهور الأولى والثانية، ومن ثم، ينبغي أن لا تدرج في التحليل.

مسح زهور نبات والأزهار الأجهزة باستخدام المستندة إلى كلورال هيدرات تطهير حلول31،32، بما في ذلك 4 هير لمسح الحل33، عادة ينفذ للتدخل التفاضلية (التباين DIC) التحليلات المجهرية للتنمية زهرة وخردلة، والجنين (الشكل 3 ألف-ياء). الحل 4 ينصح على وجه التحديد لتحليل التنمية السداة، والأجهزة التي تتطلب قدرة أقوى على المقاصة. وتستخدم بعض الحلول المستندة إلى كلورال هيدرات لغرض مزدوج للمقاصة وبقع في وقت واحد؛ هذا هو الحال بالنسبة لالكسندر الأصلي34 وايكي-436 35،الحلول هير. ألكسندر تلطيخ يستخدم على نطاق واسع في نبات لتقييم الإجهاض حبوب اللقاح. ألكسندر معدلة وأكثر إفادة تلطيخ الداخلي37 وصمة عار anthers كاملة تحتوي على حبوب اللقاح الناضجة. يتطلب هذا الإجراء توفر تبادل الخلفي من أنثيرس استخدام هير للحل 4 (الشكل 3 K-L). قد توفر تقنيات المصبوغة الأخرى المستخدمة في الأنواع النباتية المختلفة أفضل تقدير صلاحية اللقاح (مثلاً، رد فعل فلوروتشروماتيك استخدام اسيتات فلوريسسين، تلطيخ كلوس والنشا والحمض النووي، والجيش الملكي النيبالي والاختبارات الأنزيمي باستخدام صبغات الأكسدة)38،،من3940. ومع ذلك، معظم هذه التقنيات تقييم جانبا محدداً من الحبوب حبوب اللقاح قد لا ترتبط بالضرورة بصلاحية اللقاح، والأهم من ذلك، الخصوبة حبوب اللقاح. إجراء تقييم لقدرة إنبات حبوب اللقاح، وقدرته على تأثير التسميد وتعيين البذور قد يكون أكثر دقة38–40. إجراء المقاصة تلطيخ المستخدمة أقل بكثير هو ايكي-4 هير، الذي يجمع بين حلول المقاصة وتلطيخ النشا. وباﻹضافة إلى تلطيخ للنشا (الشكل 4)، يمكن استخدام هذا الإجراء لأغراض المقاصة العامة كلما كان التباين العالي المطلوبة (مثلاً، الشكل 3 ألف، هاء).

يتم استخدام مزيج من أرمين وكالكوفلور في العديد من الأنواع النباتية41 لوصمة عار في نفس الوقت اكسين حبوب اللقاح وإينتيني (الشكل 5A). معظم هذه وغيرها من الأصباغ الكيميائية وصمة عار لا مكون خلوية واحد، ومن ثم، ينبغي أن تستخدم في تركيبة مع تقنيات وضع العلامات أكثر مباشرة مثل غوس أو خطوط العلامة فلوريسسينتلي معلم أو الأجسام المضادة أو التهجين في الموقع . وقد تبين أيضا العديد من الإثارة وأطياف الانبعاث. وفي المقابل، DAPI، أكثر تحديداً، ويستخدم عادة لوصمة عار الكروماتين وكروموسوم ينتشر42 خلال الانقسام الاختزالي، ومتابعة حبوب اللقاح التنمية43، وبصرف النظر عن تطبيقاتها المتعددة كونتيرستين للنواة. وهنا نعرض كيف يمكن زيادة كثافة المصبوغة للحصول على عرض أكثر تفصيلاً من الكروماتين للحيوانات المنوية ونوى الخضري عن طريق إزالة ميكانيكيا اكسين (الشكل 5B-ج). على الرغم من أن هذا الأسلوب مفيد جداً للراغبين في إجراء تحليلات تفصيلية الكروماتين والصبغيات، والهيكل النووي، إزالة الميكانيكية اكسين قد تؤثر على منظمة الحبوب حبوب اللقاح، وأن النتائج يجب أن تكون يفسر بعناية.

وتستخدم معظم هذه الأصباغ الفلورية دون إزالة مسبقة للأنسجة؛ ولكن في بعض الحالات، متوافقة مع الخلفي التخليص على الشريحة44على أساس كلورال هيدرات. الحزب الديمقراطي الصربي مسح استخدمت مؤخرا تطهير الكاشف في البحوث النباتية والحيوانية وقد ثبت أن تكون متوافقة مع مختلف إجراءات المصبوغة ويديفيلد الأسفار ومجهرية [كنفوكل] (mPS PI45 في النباتات، و23من الوضوح، ميثاق22 أو24 من قانون-المعزوفة في الحيوانات). استخدام الحزب الديمقراطي الصربي-هيدروكسيد الصوديوم المقاصة قبل انيلين الأزرق تلطيخ (الشكل 5-H)، تمكنا من تحقيق أعلى الوصول إلى الأنسجة الداخلية، فضلا عن تلطيخ صورة أفضل عن كلوس داخل أنسجة نباتية (الشكل 5I-L). تم الحصول على نتائج مماثلة كالكوفلور (البيانات لا تظهر).

Figure 1
الشكل 1: الصور الفوتوغرافية للزهور والنباتات نبات . (أ-د) نبات النباتات في مراحل مختلفة من دورة الحياة: روزيت قبل انشقاقه (A) وفي أول افتتاح زهرة (ب)، مع الابتدائية وبضعة inflorescences الثانوي (ج) وفي نهاية الأزهار (د). (ﻫ) corymb نموذجية لنبات نورات مع الزهور في مراحل إنمائية مختلفة، تنضج أكروبيتالي. (وح) زهرة نبات في تركيبيا، توضح الأزهار (السداة لمس وصمة العار وإطلاق حبوب اللقاح). الأرقام ه-ح التركيز أكوام من 36، 53، 42، و 32 من الصور، على التوالي، تجميعها باستخدام أداة برمجية (مثلالتركيز الهليكون). وح تمثل الزهرة نفسها حيث أزيلت سيبال واحد واثنين بتلات من السداة قصيرة في ح. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
رقم 2: كيفية تشريح من متاع والبويضات. (1-3) مكان متاع على شريحة مع الحد أدنى من الإيثانول 70% وموقف اليدين كما هو مبين في الرسم. جعل التخفيضات التالية 1-3 التوجيهات أوضح بالأسهم الحمراء. استخدام الإبرة مع فتح التي تواجه التصاعدي وبعيدا عن البويضات لخفض 2-3. (4-6) تدوير الكربلة 180 درجة كما هو موضح، وإجراء تخفيضات 4-6 مثل التخفيضات الثلاثة الأولى. (7) إزالة الصمامات: استخدام الإبرة مع فتح التي تواجه الهبوط ووضعه تحت البويضات والشريحة الإبرة بسرعة إلى اليمين على طول الهامش صمام. ل carpels أكبر (تركيبيا وما بعدها)، أو مع بعض الخبرة في التشريح، واحد يمكن أن تحل محل هذه الخطوة بتكرار الخطوات 2 و 5 على الجانب الآخر من الكربلة. (8-9) إزالة الوصمة-النمط والسويقه مع شارب التخفيضات باستخدام الإبرة مع افتتاحه جانبية وبعيدا عن البويضات. (10) جعل حاد صغير قطع في الأنسجة يحيل المستوى في واحد من هذين النقيضين. (11) استخدام الملقط والإبرة لتمزيق النصفي. (12) استخدام الملقط والإبرة، الوجه بلطف صف واحد من البويضات للحصول على صفين متوازيين. وبدلاً من ذلك، وضع صفين عمودياً مع ريبلوم الكذب أعلاه ودفع بلطف إلى أسفل على طول ريبلوم إلى انتشار ovule صفين على جانبي. اثنين بالأرض ولكن لا تزال تعلق الصفوف من البويضات بعد التخليص وتلطيخ مع الحل ايكي-4 هير لتظهر كمثال لنتيجة التشريح. تغيير حجم أشرطة = 80 ميكرومتر الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: المقاصة على أساس كلورال هيدرات مع أو بدون تلطيخ أثناء تطوير زهرة. (أ) ألف برعم زهرة الشباب. (ب-E) التنمية السداة مع الأم المئبر الخلايا cytokinesis (ب)، تيترادس ميكروسبوريس (ج) الانقسام حبوب اللقاح حبوب اللقاح الأول (د)، وتريسيلولار (E). (وي) متاع المحتوية على البويضات مع ميجاسبوري الخلايا الأم (سهم) قبل الانقسام الاختزالي (F و G) وأثناء الطور الأول هو الأول (ح)، مع كيس الجنين بينوكلير (سهم) (أنا)، وفي التسميد (J). ملاحظة أثر لأنبوب اللقاح (سهم) في منطقة ميكروبيلار أبل في ي. (K-L) ألكسندر معدلة تلطيخ من أنثيرس مع كامل (K) أو تقليص صلاحية اللقاح بسبب الإجهاد الحراري (L). ملاحظة فارغة السيتوبلازم والأشكال غير النظامية لإحباط حبوب اللقاح داخل لوكوليس العضو الذكرى في نبات لام البرية من نوع Col-0 الانضمام. مسح أو تلطيخ: 4 في هير ب-دال و واو-ياء، هير ايكي-4 ألف و هاء، وتعديل ألكسندر تلطيخ لام ك. تغيير حجم أشرطة = 10 ميكرون. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4: ديناميات النشا خلال زهرة وأوائل بذور التنمية- نتائج تمثيلية توضح دوران النشا الديناميكية أثناء تطوير زهرة. (أ-ج) ووصف الموجه الثالثة من النشا أميلوجينيسيس/أميلوليسيس خلال المراحل الأخيرة من تطوير السداة مؤخرا في39. (د-ز) نتائج تمثيلية موجه فريدة النشا في الحبوب حبوب اللقاح مع ذروة أميلوجينيسيس في المرحلة بيسيلولار. (ح-ن) نتائج تمثيلية لديناميات النشا في البويضات في مرحلة الخلية الأم ميجاسبوري (ح)، في وضع جاميتوفيتيس الإناث (ك)، وخلال أوائل تطوير البذور (فقط بعد الإخصاب في لام، السويداء بينوكليتي في م ، ومرحلة الجنين أوكتانت ن). نبات البرية من نوع Col-0 الانضمام. تغيير حجم أشرطة = 20 ميكرومتر. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الرقم 5: الكلاسيكية بعض تلطيخ إجراءات الفحص المجهري الأسفار وأثر إزالة مخزونات النشر الاستراتيجي- (أ) كالكوفلور-أرمين تلطيخ أثناء نضج حبوب اللقاح حيث إينتيني هو الملون الأزرق (كالكوفلور) واكسين مكثف الخضراء (أرمين). (ب-ج) إزالة الميكانيكية اكسيني وتلطيخ DAPI من حبوب اللقاح تريسيلولار. (ح د) صور الممثل نورات قبل (د، كما استعاد مثبت) وبعد الحزب الديمقراطي الصربي المقاصة (ح ه). ملاحظة شفافية الأنسجة التي تتيح مراقبة المفرج داخل برعم زهرة السويقة (ح) وتنبع نورات (ز). (--ي) أزرق الانيليني تلطيخ كلوس في ميكروسبوريس في مرحلة تتراد داخل السداة. مقارنة الوضوح وشدة تلطيخ بين الحزب الديمقراطي الصربي-عدم مسح العضو الذكرى (أنا) والعضو الذكرى تطهير الحزب الديمقراطي الصربي (J). (ك) الأزرق الانيليني و "الحزب الديمقراطي الصربي" تطهير العضو الذكرى الملون مع microspores خلال حبوب اللقاح الانقسام أولاً ملاحظة التزامن لكثير من حبوب اللقاح في هذه المرحلة في هذه لوكوليس اثنين. (L) مسح "الحزب الديمقراطي الصربي" والانيليني الأزرق الملون ovule بعد الإخصاب. ملاحظة كلوس تلطيخ في ما تبقى أنبوب اللقاح ومعطف البذور. نبات البرية من نوع Col-0 الانضمام. شريط المقياس = 20 ميكرومتر (أ-ج-L)؛ 1 ملم (د-ه). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

وجود العديد من براعم الزهور داخل نورات واحدة من نبات، التي تغطي جميع مراحل نمو الزهرة، يوفر فرصة فريدة من نوعها لدراسات تهدف إلى وصف تأثير علاج أو ميزة الإنمائية في الوقت نفسه عبر مراحل مختلفة من التنمية زهرة. نقطة مرجعية جيدة بين مختلف النباتات الفردية هو افتتاح أول زهرة نورات الرئيسي. يتم التعامل مع مصانع في مثل هذه طريقة أن تتم مزامنة المزهرة قدر ممكن (مثلاً، 3 – 4 أيام النظام الطبقي عند 4 درجة مئوية يزيد من إنبات البذور متزامن ومن ثم أكثر حتى المزهرة)، والنباتات التي فتح بها أول زهرة في نفس اليوم فقط اتخذت كدفعة توزيعها بين العلاجات و replicates؛ يمكن استخدام مجموعات جاهزة في أيام متتالية لتكرار التجربة. بعد هذا الإجراء، والتحليلات المقارنة أكثر قوة، مراقبة التغيرات البيئية والإنمائية داخل وبين النباتات، ويمكن أن يؤديها.

الجمع بين وصمة عار لوجول إزالة الحل هير يسمح لنا ليس فقط تحسين التباين في عينات مسح مقارنة بالحلول الكلاسيكية المقاصة، ولكن أيضا لوصف ديناميات النشا أثناء وضع الزهور والجنين، ذكرت مؤخرا نبات 46-باستخدام هذا الإجراء البسيط، تمكنا من كشف وجود موجه جديدة من النشا أميلوجينيسيس-أميلوليسيس أثناء وضع العضو الذكرى، والربط بين الديناميات النشا مع التغيرات العالمية في التعبير عن الجينات تنطوي البروتينات ترميز في استقلاب السكر والنشا. وأظهر هذا التحليل أن GPT6 هو ترانسلوكاتور للسكر – فوسفات من سيتوسول إلى أميلوبلاستس لتجميع النشا. النتائج التفصيلية على ديناميات النشا في الأنسجة المختلفة يفتح إمكانية تميز جينات أخرى هامة في استقلاب النشويات، ومعالجة المسائل المعلقة بشأن مراحل تطور النبات أقل درس لكن المهم. تلطيخ النشا المستندة إلى اليود وليس الكمية، وينبغي أن تستكمل مع أساليب أخرى46.

البحث تبحث عن تحسين مسح الإجراءات التي تتوافق مع الفحص المجهري fluorescence كثفت خلال السنوات الماضية، لا سيما في مجال الحيوان. على الرغم من أن مجال البحوث النباتية يزال متخلفاً، ومسح إلى حد كبير تعتمد على الحلول التقليدية المقاصة ل DIC تحليل)مثلاً، والحلول المستندة إلى كلورال هيدرات، البنزيل بنزوات، الفثالات والفثالات، ساليسيلات الميثيل)31 ،33،،من4748، تشجع بما أحرز من تقدم سريع في مجال الحيوان، تبرز بعض تقنيات مماثلة باستخدام اليوريا-(مثلاً، كليرسي49 وآخرون50)، و 2, 2 '-ثيوديثانول-على أساس مسح الإجراءات51،52. وهنا نعرض أن استخدام المنظفات الحزب الديمقراطي الصربي في تركيبة مع هيدروكسيد الصوديوم يجعل الأنسجة شفافة ويحسن بعض الأسفار الكلاسيكية تلطيخ الإجراءات، مثل انيلين كلوس وكالكوفلور السليولوز باللون الأزرق. وبناء على هذه النتائج الواعدة، تقدم مماثل في إزالة الدهون الانتقائي القائم على الحزب الديمقراطي الصربي يمكن توقع في مجال النباتات في المستقبل القريب. منذ خلايا نباتية جامدة جدران الخلايا التي لا توجد في الخلايا الحيوانية، قبل تضمينها في الهلاميات المائية قد لا يكون ضروريا، كما الحال بالنسبة للأنسجة الحيوانية. قد يكون جزيئي fluorophores المستخدمة في خطوط البصمات الجينية والأصباغ الفلورية الأخرى باستخدام هذا الإجراء المقاصة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.

Acknowledgments

هذا العمل كان تدعمها جامعة زيوريخ، على الانبعاث ماري كوري منحة (منح لا. TransEpigen-254797 إلى هجري)، "منحة متقدمة" "مجلس البحوث الأوروبي" (منحة لا. MEDEA-250358 بعنوان)، ومشروع بحوث وتطوير التكنولوجيا (منح مكان لعنوان) من SystemsX.ch، "المبادرة السويسرية" في "بيولوجيا الأنظمة".

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).

Tags

علم الأحياء التنموي، 134 قضية، تطهير هير، المقاصة هوير، وتطهير الحزب الديمقراطي الصربي، اليود لوجول لتلطيخ، DAPI تلطيخ، انيلين الأزرق، التنمية أبل، وتطوير اللقاح
مركز الجامعة-جبل وتلطيخ <em>نبات</em> زهرة الأجهزة وسيليكويس
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hedhly, A., Vogler, H.,… More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter