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Developmental Biology

전체-마운트 고 애기 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩

doi: 10.3791/56441 Published: April 12, 2018

Summary

이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 몇 가지 기본적인 개간 기술의 적절 한 해 부에 대 한 기법을 설명 하 고 생식 구조의 전체 마운트 관측에 대 한 절차를 얼룩이 지기 선정.

Abstract

분자 유전자 연구에 대 한 강력한 도구, 인 애기 thaliana 식물 생물학으로 하 고, 특히, 식물 생식 생물학에서에서 가장 눈에 띄는 모델 종 중 하나입니다. 그러나, 식물 형태학, 해부학, 그리고 ultrastructural 분석 전통적으로 포함 포함 시간과 절차 밝은 필드, 스캐닝, 및 전자 현미경 단면. 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 현미경 분석, 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 분자 기술의 지속적인 세련미에 최근 진행 상황에 대 한 수요 증가를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 개발. 이 프로토콜에서 우리 애기 꽃과 siliques, 기본 기술, 청소를 제대로 해 부에 대 한 기술 설명 그리고 일부 얼룩 절차 전체-마운트의 생식 구조 관찰.

Introduction

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꽃은 가장 중요 한 중 장기 적의 정의. 꽃 식물 몇 백만 90-130 년 전에 나타나1, 너무 빨리 그들의 급속 한 외관 찰스 다윈2"지독한 미스터리"로 기술 되었다 다양 하 고. 꽃 개발에 대 한 식물 연구자의 관심사는 다양 하다. 일부 연구는 전체, 또는 꽃3,,45,6의 특정 해 부, 구조, 및 기능 속성의 진화로 이해 하는 꽃의 진화 근원에 집중 . 그들에 의존 하는 성적 및 성적 재생산의 모드 뿐만 아니라 꽃 형태와 구조, 높은 변형 꽃 매우 복잡 한 구조를 확인 합니다. 유전 및 분자 조사7과 결합 될 수 있는 빛과 전자 현미경 기술을 사용 하 여 꽃 기관의 해부학 및 구조적 기능을 특성화 하기 위해 다양 한 노력을 주도하 고 있다. 또한, 과일과 씨앗, 소스 꽃은 인간과 동물 영양에 대 한 파라마운트 중요성의 이다. 따라서, 꽃 및 과일 개발의 특성화는 늘어나는 인구와 생태 보존 전략 변화 환경8 아래에 대 한 식량 안보를 포함 하 여 응용된 연구에 대 한 많은 의미는 , 9 , 10.

애기 에 꽃 개발 꽃 유도 및 꽃이 핌 (꽃의 그룹) 분열 조직에 식물 분열 조직의 변환으로 시작합니다. 꽃 primordia 옆 화 서 분열 조직11의 측면에서 시작 됩니다. 꽃 기관 primordia는 꽃의 중심에는 외부에서 동심 whorls에 점차적으로 형성 하 고 결국 sepals, 꽃잎, stamens, 및 carpels7으로 개발. 이러한 꽃 기관의 행 독특한 영양, 보호, 및 기능 (예를 들어, pollinator 매력) 다양 한 식물 종, 남성과 여성의 gametophytes, 각각12 의 개발을 유지 하는 성적인 기관 역할 , 13. gametophytes, 차례 차례로, 각 남성 (정자)의 쌍 차별화와 결합 시 여성 gametes (계란과 중앙 셀), 더블를 다음 세대, zygote, 기본 endosperm 수정 터미널 조직 지원 합니다 배아14,15의 개발. 과일, 종자 개발 성장, 성숙, 그리고 태아와, 결국, 그것의 분산의 보존을 지원 합니다. 광범위 한 연구 모델 종 애기7,,1617에 (서) 특히 다양 한 식물 종, 꽃과 배아 개발 특성화를 수행 하고있다.

꽃 발달의 이른 현미경 분석 시간이 걸리는 샘플 처리 및 파라핀 또는 수 지를 포함, 단면, 등 기법, 결합 빛 또는 전자 현미경 관찰에 근거 했다. 이러한 전통적인 현미경 기술은 돌연변이, 제자리에서 교 잡에 의해 RNA의 지역화 또는 단백질의 면역 검출의 현미경 분석 등 분자 유전자 조사와 함께에서 자주 사용 했다. 넓은 필드와 공초점 형광 현미경 검사 법, 최신의 3 차원 전산 이미지 분석 및 최소 처리 전체 산 표본에 사용 될 수 있는 분자 방법의 지속적인 세련미에에서 최근 진행 상황에 대 한 필요를 주도하 고 있다 효율적이 고 최소 샘플 처리 기술 정량 분석을 우선적으로 받을. 최근 몇 년 동안, 상당한 진행이 했다 전체-산 동물 표본에 개간 기술 개발. 그들은 렌더링 샘플 투명 수성 우 레 아 또는 설탕 기반 약 (예를 들어, 규모, SeeDB, 큐빅)을 사용 하 여18,,1920, 또는 선택적으로 후 (SDS 세제를 사용 하 여) 하는 지질을 제거 하 여 안정적인 hydrogels;에 샘플 포함 지질 제거 될 수 있다 수동 확산에 의해 달성 (예를 들어, 선명도 프로토콜21, 협정-동위-바퀴22수정) 또는 전기 이동 법 (원래 선명도 프로토콜23 , 법-프레스 토24)으로 적극적으로. 이 빠른 진행에 의해 격려 해, 일부 파생된 기술도 등장 하고있다 식물에 사용 하기 위해.

애기모델에 초점을 맞춘이 방법 종이, 우리 꽃 봉 오리, 꽃, 그리고 젊은 siliques의 적절 한 해 부와 다양 한 얼룩에 대 한 전체-마운트 샘플의 비운에 대 한 절차 및 사용 하 여 관찰 절차 설명 클래식 또는 최근 SDS 기반 개간 방법. 전 분, callose, 및 chromatin는 얼룩이 지기에 대 한 예제는 주어진 다. 이러한 절차 개선 및 적응 다른 종이 함께 사용 될 때 추가 해야 할 수도 있습니다, 하지만 그들은 많은 연구 프로젝트의 출발점은이 간단 하지만 중요 한 방법에 추가 연구를 위한 무대를 설정 됩니다 바랍니다.

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Protocol

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1. 꽃과 Silique 고정

  1. 수확 꽃과 식물에서 siliques 첫 번째 꽃의 개통에 동기화.
    참고: 여기에 사용 된 실험 조건에서 식물 시작 重와 Skoog (MS)에서 토양에 이식 후 약 21 일 꽃. 씨앗은 4 ° C에서 3-4 일에 대 한 층 화와 출 아 했다/성장 22 ° C/16 h 빛과 18 ° C/8 h에서 MS 접시에 어두운 (그림 1) 동일한 조건 하에서 보관 하는 냄비에 영양분이 풍부한 토양에 묘 종을 이식 하기 전에 8 ~ 10 일 동안. 복제의 수는 특정 연구 목적에 따라 달라 집니다 하지만 각 치료에 대 한 (5 개별 공장)에서 5 inflorescences의 최소 권장 합니다. 꽃은 실험 단위, 복제 당 10 꽃의 최소 권장 합니다.
  2. Inflorescences 또는 꽃 (그림 1E-H) 작은 위 (예를 들어, 손톱이 위)를 사용 하 여 자르고 (단일 화 서/꽃 고정)을 위한 microcentrifuge 튜브 또는 (대 한 집단 fixations) 원뿔 튜브에 즉시 배치 Carnoy의, 메탄올/아세트산, 또는 FPA50 fixatives 만든 갓 포함 하는 응용 프로그램에 따라 참조 아래 얼음에.
    참고: 샘플 해야 합니다 수 완전히 침수는 정착 제에.
  3. 4 ° c.에서 하룻밤에 4 h에 대 한 정착 액 내 조직을 두고합니다
    참고: 진공 침투는 조직으로, 속도 정착 액의 침투를 위해 사용 될 수 있지만이 조직의 구조를 보존 될 수 있습니다. 저자는 진공 침투를 구현 하지 마십시오.
  4. 정착 액 제거 샘플을 충당 하기 위해 충분 한 70% 에탄올을 추가 하 고 적어도 24 h; 4 ° C에 게 반환 샘플이이 솔루션에서 무기한으로 유지할 수 있습니다. 에탄올을 제거한 후 바로 다음 단계로 진행 합니다; 해 부, 또는 SDS 개간입니다.

2입니다. 아래는 Stereomicroscope 해 부

  1. 넣어 갓 지원 위한 작은 페 트리 접시에 배치 하는 시계 메이커의 유리에 70% 에탄올을 했다.
  2. 장소는 화 서/꽃/silique이에 갓 정착 액 고 바늘으로 집게와 주사기를 사용 하 여 stereomicroscope에서 해 부.
    1. 시계 메이커의 유리 또는 에탄올 (권장) inflorescences의 해 부 및 찢 어 떨어져 성숙한 꽃 (sepals, 꽃잎, 오시 수 있습니다가이 단계에서 해 부의 꽃 기관으로 완전히 덮여 수 샘플을 허용 하는 유사한 장치를 사용 하 여 )을 밖으로 건조 하는 샘플의 위험을 피하기 위해.
  3. 아래 설명 된 대로 siliques 및 슬라이드에 작은 꽃 봉 오리를 해 부.
    1. 사전 처리 샘플 시계 메이커의 유리를 치워 고 최종 해 부에 대 한 정상적인 슬라이드를 사용 합니다.
    2. 슬라이드에 관심의 샘플을 이동 하 고 신선한 70% 에탄올의 10 µ L를 추가 합니다. 최종 해 부에 신속 하 게 작업 하 고 샘플 과도 한 액체 없이 촉촉한 유지에 필요한 경우 에탄올, 10 µ L를 추가 합니다.
    3. Stamens에서 꽃가루 곡물 방출 단계 5.1 참조. Carpels 및 ovules 해 부를 위해 그림 2에 설명 된 절차를 따릅니다. 이 절차는 심 피, 녹색 siliques의 발달의 단계 등의 개발의 모든 단계에 적용 됩니다.
      참고: 샘플; 이동에서 충분 한 에탄올 이성 경우 에탄올을 추가 하지 마십시오 아주 작은 샘플을 해 부 하는 것은 액체의 최소한에 훨씬 쉽게입니다. 항상 슬라이드에만 관심 (sepals, 꽃잎, stamens, carpels, ovules, 씨앗, 또는 꽃가루 곡물)의 장기 유지. 이 이렇게는 슬라이드와 시험, 결과 높은 동질성, 그리고 따라서 현미경 검사 (높은 수 대상 표본에 대 한 효율에 따라 장기의 두께 해당 하는 coverslip 간의 균일 한 두께 보장 한다 에 동일한 초점 비행기).
  4. 압 종이의 작은 조각을 사용 하 여 흡수 하 고 가능한 많은 에탄올을 제거. 신속 하 게 밖으로 샘플 건조 하기 전에 (섹션 3, 4, 또는 6) 다음 단계로 진행 합니다.

3. Chloral 하이드 레이트-기반 개간 및 결합 된 개간 얼룩

참고: 개간 chloral 하이드 레이트-기반에 대 한 최상의 결과 얻으려면 FPA50 소재 고정으로 얻을 수 있습니다.

  1. 솔루션을 비운의 장소 20 µ L (chloral 하이드 레이트/글리세롤, 수정 Hoyer의 매체, 하느님의 4½, 또는 하느님의이 키 4½ 솔루션) 견본-베어링 슬라이드에. 그들 사이 공간을 줄이고 그 대칭 이동 하 여 필요한 경우는 표본 위치 hypodermal 바늘, 주사기의 쌍을 사용 하 여 관심의 기관 아래쪽으로 직면 하는 곳. 바늘을 사용 하 여 모든 나머지 공기 거품을 제거 합니다.
  2. 옆으로 coverslip 낮은 고 부드럽게, 매우 부드럽게 눌러 놓고 개간 솔루션 사이는 공간을 채우는 때까지 기다립니다. 아래는 coverslip 전체 공간을 채우기 위해 필요한 경우 최소한의 개간 솔루션을 추가 합니다.
  3. 슬라이드를 슬라이드 홀더에 놓고 증기 두건에서 그것을 두고. 적어도 4 h 후와 다음 4-5 일 동안 현미경 관찰으로 이동 합니다.

4. 알렉산더 얼룩과 하느님의 4½ 개간 Anthers의 결합

참고: 원래 알렉산더 프로토콜 기반으로 얼룩이 지기 전에 슬라이드에 꽃가루 곡물을 공개 합니다. 효율적이 고 더 유익한 수정 알렉산더 얼룩 지우기 절차 이며 성숙 하지만 비 dehiscent anthers 내 성숙한 꽃가루 곡물의 얼룩.

  1. Dehiscent 비 anthers 오픈 하려고 갓 수확된 꽃 봉 오리를 선택 합니다.
    참고: 알렉산더 얼룩이 지는 성숙한 꽃가루 곡물을 위한 효율적으로 미숙한 꽃가루 곡물을 얼룩이 되지 않습니다 때문에 어린 꽃 봉 오리를 복용 하지 마십시오. 치료에서 다른 식물과 inflorescences 수확 당 5 꽃의 최소 것이 좋습니다.
  2. 꽃 봉 오리를 잠수함 충분 한 알렉산더의 솔루션과 96 잘 접시를 준비 합니다. anthers sepals 및 꽃잎을 제거 하 여 노출 하 고 알렉산더의 솔루션에서 그들을 담가. 1-3 h 연기 후드 샘플을 유지.
  3. 하느님의 4½ 솔루션으로 알렉산더의 솔루션을 대체 하 고 야간 보육에 대 한 증기 두건에서 다시 다 잘 접시를 놓습니다.
  4. 집게를 사용 하 여 부드럽게 새 슬라이드에 지운된 꽃 봉 오리 이동 합니다. 알렉산더의 솔루션의 일부 월 발생할 수 있습니다 이후 압 지를 사용 하 여 가능한 많은 청소 솔루션을 제거.
  5. Stamens를 해 부하 고 다른 모든 조직을 제거 합니다. 절의 하느님의 4½ 솔루션을 사용 하 여 3 단계를 따릅니다.

5. 꽃가루 곡물에서 제거 하는 Exine

참고: DAPI 얼룩에 대 한 Carnoy의 정착 제를 사용 하 여 것이 좋습니다.

  1. 섹션 1과 2에에서 설명 된 고정 및 해 부 절차를 따릅니다. 지금까지, 한 70% 에탄올의 최소 금액 내에서 슬라이드에 많은 예를 하나 있어야 한다.
  2. 압 지를 사용 하 여 초과 에탄올을 제거 하 고 DAPI 솔루션의 5-10 µ L를 추가 합니다. 바늘과 주사기의 몇을 사용 하 여, 그 작은 솔루션 (예를 들어, stamen와 꽃가루 곡물을 해제 하는 다른 고정에 사용 한 주사기) 내 꽃가루 곡물 놓습니다. 경우에 솔루션을 밖으로 마르면 DAPI의 또 다른 5 µ L를 추가 합니다.
  3. Stamen 모든 파편을 제거는 중요 한 단계 같은 슬라이드와는 coverslip 사이 꽃가루 곡물만 남아 있습니다.
  4. coverslip 견본 베어링 슬라이드에 옆으로 낮추어 놓고 DAPI 솔루션 공간을 작성 하는 데 필요한 최소한의 금액을 추가 합니다. coverslip에 검지 손가락을 놓고 너무 부 수 없이 많은 게 빠르고, 회사, 그리고 짧은 운동 슬라이딩 합니다.
    참고: 필요한 힘 및 슬라이딩 움직임의 진폭을 측정 하기 위해이 단계 한다 연습을 여러 번 검사 결과 현미경 때마다.
  5. 필요한 경우 DAPI 솔루션을 추가 하 고 1 h. 넓은 필드 형광 또는 24 h. 이내 confocal 현미경 샘플을 관찰 하는 진행을 15 분 동안 4 ° C에서 어둠 속에서 습 한 상자에 슬라이드 SDS 여부 추가 확인을 지우고이 절차를 결합 하려고 하는 장소 개선 사항을 얻을 수 있습니다.

6. 나트륨 라우릴 황산 염 (SDS) 지우기

참고: 분석, 꽃 기관 및 연구자의 기술을 해 부하는 아주 부드럽고 작은 표본에 SDS 처리 실행 될 수 있다 밖으로 하기 전에 (대 한 경험이 풍부한 연구자) 또는 해 부 단계 (덜 경험에 대 한 후 연구원) 메탄올-아세트산 소재 고정에.

  1. 시계 메이커의 유리, 오목 슬라이드 또는 microcentrifuge 튜브를 사용 하 여 1 %SDS 실 온에서 하룻밤 0.2 N NaOH 솔루션 또는 비 해 부 해 부 샘플을 품 어.
  2. 샘플과 매우 부드럽고 투명 한 모양 때문에 관심을가지고 처리 합니다. 물으로 여러 번 씻어.
    참고: SDS 솔루션의 나머지 발생할 수 있습니다 강 수는 얼룩 솔루션, 예를들면, 아닐린 블루 추가할 때.
  3. 비 해 부 샘플에 대 한 2, 70% 에탄올 대신 물을 사용 하 여 절에서 설명한 해 부 절차를 따릅니다. 원하는 조직 해 부, 후 잔해와 파편, 및 압 지와 어떤 과잉의 물 제거 후 얼룩 솔루션의 20-40 µ L을 추가 하 고 6.5 단계로 진행.
  4. 해 부 샘플에 대 한 신중 하 게 세척 솔루션에서 샘플을 이동 및 그것 깨끗 한 슬라이드에 놓고 얼룩 솔루션의 20-40 µ L를 추가 합니다.
  5. 부드럽게 옆으로 그것을 낮추는 방법으로 슬라이드에는 coverslip 장소. 알아서 하지 준비 스쿼시. 조직 너무 연약한 경우에, 장소 어떤 얇은 슬라이드 (예를 들어, 테이프 또는 깨진된 coverslip)의 모서리에 coverslip 사이 구분 기호는 coverslip 표본 분쇄 하지 않습니다 되도록 슬라이드 사이의 coverslip, 챔버 같은 공간을 떠나.
  6. 습 한 상자 내에서 모든 슬라이드를 배치, 알루미늄 호 일, 표지 및 적어도 1 h. widefield 형광 또는 24 시간 이내 confocal 현미경 검사 법을 사용 하 여 표본 관찰을 진행 4 ° C에서 그것을 배치.

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Representative Results

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애기 는 corymb (그림 1)에서 배열 하는 양성 꽃 inflorescences 베어링 Brassicacea 가족에 속한다. 각 꽃에는 4 개의 sepals, 4 개의 꽃잎, 6 예 (4 개의 길고 2 개의 짧은), 및 4 개의 동심 whorls25,26에 배열 두 선천적인 융합된 carpels (그림 1 층-H)로 구성 된 syncarpous gynoecium는 있다. 애기 는 tenuinucellate, anatropous ovules 난소 (45-80 ovules의 합계)의 2 개의 locules의 각 내에서 두 개의 행 (각 행의 ovules 12-20)에 정수 리 placentation에서 배열 (게시 되지 않은 데이터 및 참조27, 28 , 29 , 30). 개별 공장 내에서 또는 (복제 또는 치료)로 다른 식물 사이 꽃 및 배아 개발의 강력한 비교 분석을 수행 하기 위해 그것은 맨처음 오픈 꽃 (그림 참조로 사용 하는 것이 좋습니다 1B).이 단계에서 화 서 (그림 1E)는 일반적으로 20, 30 꽃 꽃 봉 오리 꽃 개발, 그리고 다른 개인 (되지 않은 데이터)에서 대략 비슷한 단계에서 모든 단계에 걸친 사이 있다. (5와 20 꽃 사이 형성 하는) 더 많은 꽃 meristems 첫 번째 꽃 연 후 화 서 분열 조직에 의해 시작 될 것 이다. 처음 두 꽃 비 옥 결점을 표시 될 수 있습니다 그리고, 그러므로, 분석에 포함 되지 해야 합니다.

애기 꽃 및 꽃 기관 chloral 하이드 레이트-기반을 사용 하 여 지우기 지우기 솔루션31,32, 하느님의 4½ 솔루션33삭제를 포함 하 여 일반적으로 실행 차동 간섭 콘트라스트 ( DIC) 꽃, silique, 및 배아 개발 (그림 3A-J)의 미세한 분석. 4½ 솔루션은 특히 오시 개발, 분석 및 강력한 청소 능력을 요구 하는 기관에 대 한 것이 좋습니다. 일부 chloral 하이드 레이트 기반 솔루션은 삭제와 동시에; 얼룩의 이중 목적을 위해 사용 됩니다. 이것은 원래 알렉산더의34 와 하느님의이 키 4½35,36 솔루션에 대 한 경우. 알렉산더 얼룩 꽃가루 낙태를 평가 하는 애기에 널리 사용 됩니다. 수정 하 고 더 유익한 알렉산더 절차37 얼룩 얼룩 전체 anthers 성숙한 꽃가루 곡물을 포함 하는. 이 절차에는 하느님의 4½ 솔루션 (그림 3 K-L)를 사용 하 여 anthers의 후부 개간을 필요 합니다. 다른 식물 종에 사용 된 다른 얼룩 기법 (예를 들어, fluorochromatic 반응 fluorescein diacetate, callose, 전 분, DNA, RNA, 및 효소 테스트를 사용 하 여 얼룩을 사용 하 여 꽃가루 생존의 더 나은 평가 제공할 수 있습니다. 산화 환 원 염료)38,,3940. 그러나, 이러한 기술의 대부분 수도 하지 반드시 연관 꽃가루 생존 하 고, 중요 한 것은, 꽃가루 비 옥 꽃가루 곡물의 특정 측면을 평가 합니다. 꽃가루 발 아 능력의 평가 및 효과 수정 하 고 씨앗을 설정 하는 기능 더 정확한38-40수 있습니다. 훨씬 덜 사용된 개간 얼룩 절차 하느님의이 키-4½, 청소 및 전 분 얼룩이 솔루션을 결합 하는. 전 분 (그림 4)에 대 한 얼룩, 게다가이 절차 사용할 수 있습니다 일반적인 청소 목적을 위해 때마다 높은 대비 필요 (예를 들어, 그림 3A, E).

Auramine와 calcofluor의 조합 동시에 꽃가루 exine 및 intine (그림 5A) 얼룩 많은 식물 종41 에 사용 됩니다. 이들 중 대부분과 다른 화학 염료 단일 세포 구성 요소를 얼룩이 되지 않습니다 그리고, 따라서, 더 직접적인 라벨 기법 등 에서 제자리 교 잡, 항 체, 또는 붙일 태그 마커 라인, 거 스와 함께에서 사용 해야 합니다. 그들은 또한 여러 여기 및 방출 스펙트럼을 표시할 수 있습니다. DAPI, 대조적으로, 더 구체적인 이며 감수 분열, 동안 chromatin와 염색체 스프레드42 얼룩을 따라 꽃가루 개발43, 핵에 대 한 counterstain의 매니폴드 애플 리 케이 션을 제외 하 고 일반적으로 사용 됩니다. 여기, 우리가 어떻게 얼룩 강도 exine (그림 5B-C)을 기계적으로 제거 하 여 정자의 식물 핵 chromatin의 더 상세한 보기를 증가 시킬 수 있다 보여줍니다. 이 기술은 chromatin, 염색체, 핵 구조의 상세한 분석 수행에 관심이 매우 도움이 있지만는 exine의 기계적 제거 영향을 미칠 수 꽃가루 곡물의 조직 결과 하도록 한다 주의 해석.

이러한 형광 염료의 대부분은 조직의; 사전 청소 없이 사용 하지만 어떤 경우에 그들은 후부 chloral 하이드 레이트 기반 슬라이드44에 삭제와 호환 됩니다. SDS 지우기 지우기 동물과 식물 연구 시 약으로 최근 사용 되 고 widefield 형광 및 confocal 현미경 검사 법 (mPS PI45 식물과 선명도23, 다른 얼룩 절차와 호환 되도록 표시 되었습니다. 협정22 또는 동물에서 법-프레스 토24 ). SDS NaOH 아닐린 (그림 5D-H) 얼룩 블루 이전 삭제를 사용 하 여, 우리는 내부 조직으로 얼룩 꽃 조직 (그림 5I-L) 내의 callose에 대 한 높은 접근성을 달성 하기 위해 관리. 유사한 결과 calcofluor (데이터 표시 되지 않음)에 대 한 획득 했다.

Figure 1
그림 1: 사진 애기 식물 및 꽃. (A-D) 수명 주기의 여러 단계에서 애기 식물: 장미 (A)를 추대 하기 전에,에서 첫번째 꽃 (B), 기본 및 몇 가지 보조 inflorescences (C), 그리고 꽃의 끝에 (D). (E)는 애기의 전형적인 corymb acropetally 성숙 다른 발달 단계에 꽃 꽃이 핌. (F-H) Self-pollination (오시 감동 낙인과 꽃가루 곡물을 공개)을 보여주는 anthesis에서 애기 꽃. 그림 E-H 는 36, 53, 42, 32 그림의 초점 더미를 (예를 들어, 헬 리 콘 포커스) 하는 소프트웨어 도구를 사용 하 여 조립입니다. F-H 한 sepal, 2 개의 꽃잎, 그리고 짧은 오시 H에서 제거 되었습니다 같은 꽃을 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: 어떻게 해 부는 gynoecium 및 ovules. (1-3) 장소는 최소한 70% 에탄올과 위치의 슬라이드에 gynoecium 손 그림에 묘사 된 대로. 만들기 1-3 다음 빨간색 화살표로 표시 된 지시를 잘라냅니다. 컷 2-3에 대 한 ovules에서 위쪽으로 직면 하는 개통을 가진 바늘을 사용 합니다. (4-6), 심 피 180도 회전 하 고 처음 세 컷 처럼 상처 4-6. (7) 밸브를 제거: 아래쪽으로 직면 하는 개통을 가진 바늘을 사용 하 여, ovules, 아래 배치 하 고 밸브 여백 오른쪽 바늘을 신속 하 게 슬라이드. 더 큰 carpels에 대 한 (anthesis 및 앞으로), 또는 일부 해 부 전문으로 한 2 단계와 단계 5는 심 피의 반대편에 반복 하 여이 단계를 대체할 수 있습니다. (8-9) 오명-스타일과 샤 프와 peduncle 인하 옆으로 하 고 있는 ovules에서 멀리 그것의 개통을 가진 바늘을 사용 하 여 제거. (10) 확인 작은 날카로운 전송 조직에 레벨 2 개의 극치의 한 컷. (11)는 집게와 바늘을 사용 하 여 두 반쪽을 찢. (12) 두 개의 병렬 행을 얻으려면 ovules의 1 행을 플립 부드럽게 사용 하는 집게와 바늘. 또는 위에 누워 replum와 수직으로 두 행을 배치 하 고 양쪽에 두 개의 난 행을 확산 하는 replum을 따라 부드럽게 아래로 밀어. 2 평평 하지만 여전히 연결 된 ovules의 행 후 고 씨의이 키 4½ 솔루션 얼룩의 해 부 결과의 그림으로 표시 됩니다. 스케일 바 80 µ m = 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: Chloral 하이드 레이트 기반 개간 또는 꽃 개발 하는 동안 얼룩 없이. (A) A 젊은 꽃 꽃 봉 오리. (B-E) Microspore 어머니와 함께 오시 개발 세포 cytokinesis (B), microspores (C), 꽃가루 유사 분열의까지에 나 (D), 및 tricellular 꽃가루 곡물 (E). (F-J) Gynoecium ovules megaspore 어머니 세포 (화살표) 감수 분열 (FG) 이전 및 meiotic 의향 동안 포함 된 나 (H), binuclear 배아 sac (), (화살표)과 수정 (J). Micropylar의 영역 내에 일본에 난 꽃가루 관 (화살표)의 추적 note (K-L) 수정 된 알렉산더 anthers 전체 (K)의 착의 또는 열 스트레스 (L)으로 인해 꽃가루 생존 능력을 감소. Note 빈 세포질 및 L. 애기 야생-타입 열 0 가입에 꽃 밥 locules 내에서 중단 된 꽃가루 곡물의 불규칙 한 모양. 지우기 또는 얼룩: B-DF-J, 하느님에 대 한 하느님의 4½이 키-4½ AE, 그리고 알렉산더 K L에 대 한 얼룩을 수정. 스케일 바 = 10 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4: 전 분 역학 꽃 및 초기 시드 개발. 대표 꽃 개발 하는 동안 동적 전 회전율을 보여주는 결과입니다. (A C) 전 분 오시 개발의 마지막 단계에서 amylogenesis/amylolysis의 제 3 물결은 최근39설명. (D-G) Bicellular 단계에서 amylogenesis의 피크와 꽃가루 곡물에 독특한 전 분 파의 대표적인 결과. (H-N) Megaspore 어머니 세포 단계 (H), 그리고 여성 gametophytes (-K), 개발 ( L, M binucleate endosperm에서에서 수정 후 초기 종자 개발 동안에 ovules의 전 분 역학의 대표적인 결과 , 그리고 n에서octant 배아 단계). 애기 야생-타입 열 0 취득입니다. 바 규모 = 20 µ m. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5: 일부 형광 현미경 검사 법 및 SDS 비운의 효과 대 한 절차를 얼룩 클래식. (A) Calcofluor-Auramine는 intine 블루 하 게 얼룩이 꽃가루 성숙 동안 얼룩 (calcofluor)와 exine 강렬한 녹색 (Auramine). (B-C) Exine와 DAPI tricellular 꽃가루 곡물의 얼룩의 기계적 제거. (D-H) (D, 정착 액에서 발견으로) 전에 꽃이 핌의 대표 사진을 SDS (E-H) 삭제 후. (G) 화 서 줄기와 꽃 봉 오리 peduncle (H) 맥 관 구조 관찰을 허용 하는 조직의 투명성 note (J) 아닐린 블루 stamen 내 tetrad 단계에서 microspores에 callose에 대 한 얼룩. 선명도 사이 얼룩의 강도 비교 하 여 비-SDS 취소 () 꽃 밥과 SDS 허가 꽃 밥 (J). 꽃가루 유사 분열 I. 동안 microspores와 (K)는 SDS 지워지고 아닐린 블루 스테인드 꽃 밥이 두 locules이이 단계에서 많은 꽃가루 곡물의 synchrony를 참고. (L)는 SDS 지워지고 아닐린 블루 수정 후 난 스테인드. 꽃가루 관의 유적에서 고 씨 코트에서 얼룩 callose note 애기 야생-타입 열 0 취득. 눈금 막대 = 20 µ m (A-C,-L); 1 m m (D-H)입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

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애기, 모든 꽃 발달 단계에 걸친의 단일 화 서 내의 많은 꽃 봉 오리의 존재 연구 효과 치료의 발달 기능을 특성화 하기 위한 독특한 기회를 제공 꽃 발달의 다른 단계 걸쳐 동시에. 다른 개별 공장 사이 좋은 기준점은 주 화 서의 첫 번째 꽃의 개통. 식물 꽃 동기화 하는 방식으로 처리 됩니다 만큼 가능한 (예를 들어, 4 ° C에서 층 리 동기 씨 발 아 및 따라서 꽃도 더 극대화 하는 3-4 일), 그리고 그들의 첫 번째 꽃 같은 날에 열리는 식물만 치료 사이의 복제; 배포 하는 일괄 처리로 찍은 계속 되는 일에 준비 일괄 처리 실험을 복제를 사용할 수 있습니다. 다음이 절차, 더 강력한 비교 분석, 시간과 사이 식물, 환경과 발달 변화에 대 한 제어를 수행할 수 있습니다.

최근에 대 한 보고 우리가 클래식 개간 솔루션에 비해 허가 샘플에 대비를 향상 시킬 뿐만 아니라 꽃과 배아 개발 하는 동안 전 분 역학 하 이블의 개간 솔루션과 Lugol의 얼룩을 결합, 애기 46.이 간단한 절차를 사용 하 여, 우리는 꽃 밥 개발, 중 전 분 amylogenesis-amylolysis의 새로운 물결의 존재를 해명 하 고 인코딩 단백질 관련 유전자의 표현에 글로벌 변화 전 분 역학 연관 수 있었다 에 설탕과 전 분 대사. 이 분석은 GPT6 전 분 합성에 대 한 amyloplasts는 cytosol에서 설탕-인산의 translocator는 보여주었다. 다양 한 조직에 전 분 역학에 상세한 결과 식물 개발의 적은 공부 하지만 중요 한 단계에 관한 해결 되지 않은 질문을 해결 하기 위해 전 분 대사에 중요 한 유전자 다른 특성화의 가능성을 엽니다. 녹말 요오드 기반 얼룩 양적, 그리고 다른 방법46와 보완 한다.

특히 동물 분야에서에서 지난 년 동안 강화 하고있다 연구 지우기 형광 현미경과 호환 되는 절차를 개선 하기 위해 찾고. 식물 연구 분야는, 뒤에 보 온 하 고 DIC 분석 (예를 들어, chloral 하이드 레이트 기반 솔루션, 벤 질 benzoate, 틸 프 탈 레이트, 및 메 틸 살리실산 염)에 대 한 전통적인 개간 솔루션에 의존 크게 지우기31 33,,4748, 동물 분야에서 빠른 진전에 의해 격려 비슷한 기법을 사용 하 여 신흥 우 레 아-(예를 들어, ClearSee4950), 그리고 2, 2'-thiodiethanol-기반 절차51,52지우기. 여기, 우리가 NaOH와 함께에서 SDS 세제를 사용 하 여 조직을 투명 하 게 렌더링 및 일부 고전 형광 절차, callose 및 calcofluor 대 한 펄프 블루 아닐린 등 얼룩을 향상 보여줍니다. 이 유망한 결과 바탕으로, 지질 SDS 기반 선택적 제거에 비슷한 진행 예상 수 있다 수 플랜트 분야에서 가까운 장래에. 식물 세포는 단단한 세포 벽 때문 동물 세포에서 사전 hydrogels에 포함 되지 않을 수도 있습니다 필요, 동물의 조직에 대 한 경우. 다른 형광 성 염료와 fluorophores 유전자 마커 라인에 사용 되는이 개간 절차를 사용 하 여 분석 될 수 있습니다.

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Disclosures

저자는 공개 없다.

Acknowledgments

이 작품은 취리히 대학, IEF 마리 퀴리 그랜트에 의해 지원 되었다 (no를 부여 합니다. 아에 TransEpigen-254797), 유럽 연구 위원회의 고급 부여 (부여 없음. U.G.를 MEDEA-250358), 그리고 SystemsX.ch, 시스템 생물학에서 스위스 이니셔티브에서에서 연구 및 기술 개발 프로젝트 (그랜트 U.G.에 MecanX).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

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전체-마운트 고 <em>애기</em> 꽃 기관 및 Siliques의 얼룩
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Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

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