Compensação de toda a montagem e coloração de Siliques e órgãos de flor de Arabidopsis

Summary

Neste protocolo, descrevemos técnicas para a adequada dissecção da Arabidopsis flores e siliques, algumas técnicas básicas de compensação e selecionados coloração procedimentos para observações de toda a montagem de estruturas reprodutivas.

Abstract

Devido às suas formidáveis ferramentas para estudos de genéticas molecular, Arabidopsis thaliana é uma das espécies modelo mais proeminentes em biologia vegetal e, especialmente, na biologia reprodutiva de plantas. No entanto, planta morfológica, anatômica e análises ultra-estruturais tradicionalmente envolvem a incorporação demorados e procedimentos para campo claro, varredura e microscopia eletrônica de corte. Recentes progressos em microscopia de fluorescência confocal, estado-da-arte em 3D auxiliado por computador análises microscópicas e o refinamento contínuo de técnicas moleculares para ser usado em amostras de toda a montagem minimamente processadas, conduziu a um aumento da demanda por desenvolvimento de técnicas de processamento de amostra mínima e eficiente. Neste protocolo, descrevemos técnicas para corretamente dissecando Arabidopsis flores e siliques, básicos de técnicas, de compensação e alguns procedimentos de coloração para toda montagem observações de estruturas reprodutivas.

Introduction

Flores estão entre os mais importantes definindo órgãos das angiospérmicas. Plantas apareceu há alguns anos 90 milhões¹e diversificou-se tão rápido que sua rápida aparição foi descrita como um "abominável mistério" por Charles Darwin². Os interesses dos investigadores da planta em desenvolvimento da flor são diversos. Algumas pesquisas centrou-se na compreensão da origem evolutiva da flor como um todo, ou a evolução das propriedades específicas de anatômicas, estruturais e funcionais de flores^3,4,5,6 . A alta variação na forma floral e estrutura, bem como os modos de reprodução sexual e assexual, confiando neles, fazer a flor de uma estrutura altamente complexa. Isto levou a diversos esforços para caracterizar as anatomia e características estruturais dos órgãos florais, usando técnicas de microscópica luz e o elétron que poderiam ser combinadas com investigações genéticas e moleculares⁷. Além disso, como a fonte de frutos e sementes, as flores são de suma importância para a nutrição humana e animal. Portanto, a caracterização de desenvolvimento de flores e frutas tem muitas implicações para a investigação aplicada, incluindo a segurança alimentar de uma população humana crescente e estratégias de conservação ecológica sob uma mudança de ambiente^{8 , 9 , 10}.

Desenvolvimento da flor em Arabidopsis começa com indução de flor e a transformação do meristema vegetativa para uma meristema de inflorescência (grupo de flores). Primordia flor é iniciada lateralmente no flanco do meristema inflorescência¹¹. O primordia órgão floral forma progressivamente em espirais concêntricos de fora para o centro da flor e eventualmente evoluir para sépalas, pétalas, estames e carpelos⁷. Estes órgãos florais cumprir distinta nutritiva, protetora e funcional (por exemplo, atração de polinizadores) funções em diferentes espécies de plantas, com os órgãos sexuais, sustentando o desenvolvimento de gametófitos masculinos e femininos, respectivamente,^{12 , 13}. os gametófitos, por sua vez, cada diferenciam um par do sexo masculino (esperma) e gametas femininas (ovo e célula central), que unem a dupla fertilização para formar a próxima geração, o zigoto e o endosperma primário, um terminal tecido apoiando o desenvolvimento do embrião^14,15. Desenvolvimento de frutos e sementes apoiar o crescimento, maturação e preservação do embrião e, eventualmente, a sua dispersão. Extensas pesquisas tem sido realizada para caracterizar o desenvolvimento de flor e embrião em espécies de plantas diversas, especialmente nas espécies modelo Arabidopsis^7,16,17.

Primeiras análises microscópicas de desenvolvimento da flor basearam-se na observação técnicas, tais como a parafina ou resina incorporação e seccionamento, combinado com a luz ou microscopia eletrônica e processamento de amostra demorada. Estas técnicas microscópicas tradicionais eram frequentemente usadas em combinação com as investigações de genéticas moleculares, tais como análises microscópica de mutantes, a localização do RNA por hibridação in situ ou imuno-detecção de proteínas. Recentes progressos em microscopia de fluorescência de campo amplo e confocal, no estado-da-arte em 3D auxiliado por computador imagem análises e o contínuo refinamento dos métodos moleculares que podem ser usados em espécimes de toda a montagem minimamente processados, levou a uma necessidade de técnicas de processamento eficiente e mínimo de amostra que são preferencialmente passíveis de análises quantitativas. Nos últimos anos, tem sido feitos progressos significativos no desenvolvimento de técnicas de compensação em toda a montagem espécime animal. Eles processam a amostra transparente usando reagentes aquosa ou açúcar-à base de ureia (por exemplo, escala, SeeDB, cúbicos)^18,19,20, ou removendo seletivamente lipídios (usando o detergente SDS) após incorporação de amostras em hidrogel estável; a remoção de lipídios pode ser alcançado por difusão passiva (por exemplo, modificação clareza protocolo²¹, pacto-PARS-aros²²) ou ativamente por eletroforese (original clareza protocolo²³ e PRESTO ACT²⁴). Encorajado por este progresso rápido, também estão surgindo algumas técnicas derivadas para uso em plantas.

Este papel de métodos focado no modelo Arabidopsis, descrevemos o procedimento para a adequada dissecção de botões florais, flores e siliques jovens e a limpeza de toda a montagem amostras para coloração diversa e procedimentos de observação usando clássica ou um recente método de compensação baseada em SDS. Exemplos de amido, callose e mancha de cromatina são dadas. Embora esses procedimentos podem precisar de mais melhorias e adaptações quando usado com outras espécies, esperamos que irão definir o cenário para uma pesquisa mais adicional sobre esses métodos simples, mas essenciais que são o ponto de partida de muitos projetos de pesquisa.

Protocol

1. a flor e a fixação de síliqua

1. Colheita de flores e siliques de plantas sincronizados na abertura das primeiras flores.
   Nota: Nas condições experimentais utilizadas aqui, plantas começam a floração aproximadamente 21 dias após o transplante das placas de Murashige e Skoog (MS) para o solo. As sementes são estratificadas por 3 – 4 dias a 4 ° C e germinadas/cultivadas em placas de MS em 22 ° C/16 h luz e 18 ° C/8 h escura por 8 a 10 dias, antes de transplantar as mudas em solo rico em nutrientes em vasos mantidos sob as mesmas condições (Figura 1). O número de repetições varia de acordo com o objetivo específico de investigação, mas é recomendado um mínimo de 5 inflorescências (a partir de 5 plantas individuais) para cada tratamento. Se as flores são a unidade experimental, é recomendado um mínimo de 10 flores por replicar.
2. Cortar as inflorescências ou flores (Figura 1E-H), usando uma tesoura pequena (por exemplo, tesoura de unha) e colocá-los imediatamente em um tubo de microcentrifugadora (para fixação única inflorescência/flor) ou um tubo cónico (para fixações coletivas) contendo recém feita do Carnoy, metanol/ácido acético ácido ou fixadores de FPA50 (dependendo da aplicação, veja abaixo) no gelo.
   Nota: As amostras devem estar completamente mergulhadas no fixador.
3. Deixe o tecido dentro do fixador para 4h durante a noite a 4 ° C.
   Nota: Infiltração de vácuo pode ser usada para acelerar a penetração do fixador no tecido, mas isto pode ser prejudicial para a preservação da estrutura do tecido. Os autores não implementar a infiltração de vácuo.
4. Retire o fixador, Adicionar suficiente etanol a 70% para cobrir as amostras e devolvê-los a 4 ° C, durante pelo menos 24 h; as amostras podem ficar indefinidamente nesta solução. Depois de retirar o etanol, dirijam-se para a próxima etapa; dissecação, ou clareira de SDS.

2. dissecação sob o microscópio estereoscópico

1. Coloque acabadas etanol a 70% em vidro de um fabricante relógio colocado em um pequeno prato de Petri para apoio.
2. Lugar da inflorescência/flor/síliqua sobre este recém feito fixador e dissecar sob o microscópio estereoscópico usando fórceps e uma seringa com uma agulha.
   1. Use de um criador de relógio vidro ou dispositivo similar que permite que as amostras de estar totalmente coberto com etanol (recomendado) para a dissecação de inflorescências e destruindo os órgãos florais de flores maduras (sépalas, pétalas e estame pode ser dissecado nesta fase ) para evitar o risco de secagem de amostras.
3. Disse siliques e pequenos botões de flores em um slide, conforme descrito abaixo.
   1. Colocar o vidro do relógio da sua cafeteira com amostras pre-processed de lado e usar um slide normal para a última dissecção.
   2. Mover a amostra de interesse para o slide e adicionar 10 µ l de etanol a 70% fresco. Trabalhar rapidamente a última dissecção e adicionar 10 µ l de etanol, se necessário, para manter a amostra húmida sem líquido excessivo.
   3. Para liberar os grãos de pólen de estames, consulte Etapa 5.1. Para dissecação carpelos e óvulos, siga o procedimento descrito na Figura 2. Este procedimento aplica-se a todas as fases de desenvolvimento do carpelo, incluindo o estágio de desenvolvimento do siliques verdes.
      Nota: Não adicionar etanol se houver suficiente ao reporte de etanol de mover as amostras; dissecar as amostras muito pequenas é muito mais fácil em uma quantidade mínima de líquido. Sempre manter apenas os órgãos de interesse (sépalas, pétalas, estames, carpelos, óvulos, as sementes ou grãos de pólen) no slide. Esse procedimento irá assegurar uma espessura uniforme entre a lâmina e lamela, correspondente à espessura do órgão sob exame, resultando em uma maior homogeneidade e, portanto, a eficiência de exames microscópicos (maior número de espécimes de alvo no mesmo plano focal).
4. Use um pequeno pedaço de papel mata-borrão para absorver e remover tanto etanol quanto possível. Rapidamente, prossiga para a etapa seguinte (seção 3, 4 ou 6) antes da amostra seca para fora.

3. com base em hidrato de cloral compensação e compensação combinada de coloração

Nota: Os melhores resultados para a compensação baseada em hidrato de cloral são obtidos com FPA50 fixada de material.

1. Lugar de 20 µ l de solução de compensação (hidrato de cloral/glicerol, modificado médio do Hoyer, 4½ do Herr ou soluções de IKI-4½ do Herr) no slide espécime-rolamento. Usando um par de seringas com agulhas hypodermal, posicione os espécimes conforme necessário, reduzindo o espaço entre eles e lançando aqueles onde o órgão de interesse virado para baixo. Remova qualquer bolha de ar restante, usando a agulha.
2. Baixe uma lamela lateralmente gentilmente colocá-lo, pressionando suavemente e esperar até que a solução de limpeza preenche o espaço entre. Adicione solução de compensação mínima, se necessário, para preencher todo o espaço sob a lamínula.
3. Coloque o slide sobre um suporte de corrediça e deixá-lo sob a coifa. Proceda às observações microscópicas após pelo menos 4 h e durante 4 a 5 dias seguintes.

4. combinado Alexander manchando e Herr 4½ clareira de anteras

Nota: O protocolo original de Alexander baseia-se em liberar os grãos de pólen no slide antes de coloração. Uma eficiente e mais informativo, modificado Alexander manchando e procedimento de compensação são a coloração dos grãos de pólen maduros dentro de anteras maduras mas não-deiscente.

1. Escolha os botões de flores recém-colhidas que estão prestes a abrir com anteras não-deiscente.
   Nota: Não tome mais novos botões de flores porque Alexander coloração destina-se a grãos de pólen maduros e não mancha eficientemente imaturos grãos de pólen. É recomendado um mínimo de 5 flores por tratamento de inflorescências e plantas diferentes colhidas.
2. Prepare uma placa de 96 poços com solução de Alexander suficiente para submergir uma flor em botão. Expor as anteras, removendo as sépalas e pétalas e mergulhe-os em solução de Alexander. Mantenha as amostras sob a coifa para 1 a 3 h.
3. Substitua a solução de Alexander 4½ solução do Herr e coloque a placa de multi bem sob a coifa para uma incubação durante a noite.
4. Usando fórceps, mova os botões da flor apurados para um novo slide. Uma vez que pode ocorrer algum reporte solução de Alexandre, use um toalhete de papel para remover tanto clareira solução possível.
5. Dissecar os estames e remover todos os outros tecidos. Siga as etapas na seção 3, usando solução de 4½ do Herr.

5. remover o Exine de grãos de pólen

Nota: Recomendamos o uso de fixador do Carnoy para coloração de DAPI.

1. Siga os procedimentos de fixação e dissecação descritos nas seções 1 e 2. Até agora, um deve ter um para muitos estames no slide dentro de uma quantidade mínima de etanol a 70%.
2. Use um papel mata-borrão para remover o excesso etanol e adicionar 5-10 µ l da solução DAPI. Usando um par de seringas com agulhas, libere os grãos de pólen dentro essa pequena quantidade de solução (por exemplo, usar uma seringa para imobilizar o estame e o outro para liberar os grãos de pólen). Adicione outro 5 µ l de DAPI se a solução secar.
3. Remover todos os detritos do estame é uma etapa crítica, tal que somente os grãos de pólen são deixados entre a lâmina e a lamela.
4. Local uma lamela sobre a corrediça do espécime-rolamento de abaixá-la para o lado e adicionar a quantidade mínima de solução DAPI necessária para preencher o espaço. Coloque um dedo sobre a lamela, e sem pisar na também muito fazer uma rápida, firme e curta o movimento de deslizamento.
   Nota: Para medir a força necessária e a amplitude do movimento deslizante, esta etapa deve ser praticada várias vezes, verificar os resultados de cada vez ao microscópio.
5. Adicionar a solução DAPI se necessário e melhorar o lugar que o slide em uma caixa úmido no escuro a 4 ° C por 15 min a 1 h. seguir para observar amostras sob campo amplo fluorescência ou microscopia confocal, no prazo de 24 h. Tente combinar este procedimento com SDS de compensação para verificar se ainda mais mentos podem ser obtidos.

6. sódio Dodecil sulfato (SDS) de compensação

Nota: Dependendo do órgão floral para ser analisado e em habilidades do pesquisador para dissecar espécimes muito macias e pequenas, o tratamento de SDS pode ser realizado antes (por pesquisadores experientes) ou após a dissecação passo (para menos experientes pesquisadores) em metanol-ácido acético fixada material.

1. Use o vidro de um fabricante relógio, uma lâmina côncava ou um tubo de microcentrifugadora para incubar amostras dissecadas ou não-dissecado em SDS 1% e 0,2 N NaOH solução durante a noite em temperatura ambiente.
2. Manuseie com cuidado porque a amostra é muito macia e tem uma aparência transparente. Enxágue várias vezes com água.
   Nota: Os restos da solução SDS podem levar a precipitação ao adicionar a solução de coloração, por exemplo, anilina azul.
3. Para as amostras não-dissecado, siga o procedimento de dissecação descrito na secção 2, usando a água em vez de etanol a 70%. Depois de dissecar o tecido desejado, remover todos os restos e detritos e qualquer excesso de água com um toalhete de papel, em seguida, adicionar 20 a 40 µ l de solução de coloração e proceder com passo 6.5.
4. Para amostras dissecadas, cuidadosamente mover a amostra a partir da solução de lavagem e colocá-lo numa lâmina limpa e adicionar 20 a 40 µ l de solução de coloração.
5. Coloque delicadamente uma lamela no slide por abaixá-la para o lado. Tome cuidado para não esmagar a preparação. Se o tecido estiver muito mole, lugar nenhum fina separador em entre a lâmina e lamela em seus cantos (por exemplo, fita ou uma lamela quebrada), deixando um espaço de câmara, como entre lâmina e lamela, tal que o lamela não esmaga a amostra.
6. Coloque todos os slides dentro de uma caixa úmida, cubra com papel alumínio e coloque-a 4 ° C, durante pelo menos 1 h. seguir para observar a amostra usando widefield fluorescência ou microscopia confocal, no prazo de 24 h.

Representative Results

Arabidopsis pertence à família Brassicacea, rolamento inflorescências com flores bissexuais, dispostas em uma panícula (Figura 1). Cada flor tem quatro sépalas, pétalas de quatro, seis estames (quatro longas e dois curtas) e um gineceu syncarpous, consistindo de dois congenitamente carpelos (Figura 1F-H) dispostos em quatro verticilos concêntricos^25,26. Arabidopsis tem tenuinucellate, unitegumentados óvulos dispostos em placentação parietal em duas linhas (12-20 óvulos em cada linha) dentro de cada um os dois lóculos do ovário (um total de 45 – 80 óvulos) (dados não publicados e referências^{27, 28 , 29 , 30}). para realizar análises comparativas robustas de desenvolvimento de flor e embrião dentro de uma planta individual ou entre diferentes plantas (como repetições ou tratamentos), é aconselhável usar a primeira flor aberta como uma referência (Figura 1B). nesta fase, a inflorescência (Figura 1E) normalmente tem entre 20 e 30 botões de flores, abrangendo todas as fases de desenvolvimento da flor e em fases mais ou menos semelhantes em outros indivíduos (dados não publicados). Mais os meristemas de flor (formando entre 5 e 20 flores) serão iniciados pelo meristema inflorescência após a primeira flor aberta. As duas primeiras flores podem mostrar defeitos de fertilidade e, portanto, não devem ser incluídas na análise.

Limpar flores de Arabidopsis e órgãos florais usando com base de hidrato de cloral limpando soluções^31,32, incluindo 4½ do Herr limpar solução³³, é comumente executado para (de contraste de interferência diferencial Análises microscópicas de DIC) de desenvolvimento de flor, síliqua e embrião (Figura 3A-J). A solução de 4½ é recomendado especificamente para analisar o desenvolvimento do estame e para os órgãos que exigem capacidade de compensação mais forte. Algumas soluções baseadas em hidrato de cloral são utilizadas com a finalidade dupla de clearing e coloração simultaneamente; Este é o caso para o original Alexander³⁴ e IKI-4½^35,36 soluções do Herr. Alexander coloração é amplamente utilizado em Arabidopsis para avaliar o aborto de pólen. Um Alexander modificado e mais informativo, manchando procedimento³⁷ é manchar toda anteras contendo grãos de pólen maduros. Este procedimento exige uma compensação posterior das anteras usando solução de 4½ do Herr (Figura 3 K-L). Outras técnicas de coloração usadas em diferentes espécies de plantas podem fornecer uma melhor estimativa da viabilidade do pólen (por exemplo, a reação fluorochromatic usando diacetato de fluoresceína, coloração callose, amido, DNA, RNA e testes enzimáticos usando corantes de redox)^38,39,40. No entanto, a maioria destas técnicas avalia aspectos específicos do grão de pólen que pode não necessariamente se correlacionam com a viabilidade do pólen e, importante, a fertilidade do pólen. Uma avaliação da capacidade de germinação do pólen e sua capacidade de efeito de fertilização e conjunto de sementes podem ser mais exatos^38–40. Um procedimento de compensação de coloração muito menos utilizado é IKI-4½ do Herr, que combina soluções de compensação e amido-coloração. Além de coloração para amido (Figura 4), este procedimento pode ser usado para fins de esclarecimento geral sempre que o maior contraste é necessário (por exemplo, Figura 3A, E).

Uma combinação de auramina e calcofluor é usada em muitas espécies de planta⁴¹ simultaneamente a exine de pólen e intine (Figura 5A). A maioria destes e outros corantes químicos não mancham um único componente celular e, portanto, devem ser usados em combinação com técnicas de rotulagem mais diretas como GUS ou linhas de marcador fluorescente-etiquetadas, anticorpos ou hibridização in situ . Eles também podem mostrar múltiplas excitação e espectros de emissão. DAPI, em contraste, é mais específico e geralmente é usada a mancha de cromatina e o cromossomo se espalha⁴² durante a meiose e a seguir o desenvolvimento pólen⁴³, além de suas múltiplas aplicações como um corante de contraste para o núcleo. Aqui, nós mostramos como a intensidade de coloração pode ser aumentada para obter uma visão mais detalhada da cromatina de espermatozoides e núcleos vegetativos, mecanicamente, removendo o exine (Figura 5B-C). Embora essa técnica é muito útil para aqueles interessados em realizar análises detalhadas de cromatina, cromossomos e estrutura nuclear, a remoção mecânica do exine pode afetar a organização do grão de pólen, tal que os resultados devem ser interpretados com cuidado.

A maioria destes corantes fluorescentes é usada sem prévia compensação do tecido; Mas em alguns casos, eles são compatíveis com uma posterior esclarecimento sobre o slide⁴⁴baseada em hidrato de cloral. SDS de compensação recentemente tem sido usado como reagente na pesquisa animal e vegetal de compensação e foi mostrado para ser compatível com diferentes procedimentos de coloração para widefield fluorescência e microscopia confocal (mPS-PI⁴⁵ nas plantas e clareza²³, Pacto²² ou ACT-PRESTO²⁴ em animais). Usando um SDS-NaOH limpar antes da anilina azul coloração (Figura 5-H), conseguimos atingir maior acessibilidade aos tecidos internos, bem como uma melhor coloração para callose dentro de tecidos florais (Figura 5I-L). Resultados semelhantes foram obtidos por calcofluor (dados não mostrados).

Figura 1: Fotografias de flores e plantas de Arabidopsis . (A-D) Plantas de Arabidopsis em diferentes fases do ciclo de vida: Roseta antes de elementos de fixação (A), na primeira flor (B), com abertura primárias e algumas secundárias inflorescências (C) e no final da floração (D). (E) a panícula típica de Arabidopsis uma inflorescência com flores em diferentes estádios de desenvolvimento, maturação acropetally. (F-H) Uma flor de Arabidopsis em antese, ilustrando a autopolinização (estame tocando o estigma e liberando grãos de pólen). Figuras E-H são pilhas de foco de 36, 53, 42 e 32 fotos, respectivamente, montada usando uma ferramenta de software (por exemplo, Helicon Focus). F-H representam a mesma flor onde um sepal, duas pétalas e um estame curto foram removidos no H. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2: como dissecar um gineceu e óvulos. (1-3), lugar do carpelo em um slide com uma quantidade mínima de 70% de etanol e posição mãos como retratado no desenho. Faça cortes de 1-3 a seguir as direções indicadas pelas setas vermelhas. Use a agulha com a abertura virada para cima e para longe os óvulos para cortes de 2-3. (4-6) Gire o carpelo 180 graus, conforme mostrado e fazer cortes 4-6, como os três primeiros cortes. (7) removendo as válvulas: use a agulha com a abertura virada para baixo, coloque-o abaixo os óvulos e deslize a agulha rapidamente para a direita ao longo da margem da válvula. Para maiores carpelos (antese e em diante), ou com alguma experiência de dissecação, um pode substituir essa etapa, repetindo as etapas 2 e 5 do outro lado do carpelo. (8-9) remover o estigma-estilo e o pedúnculo com afiada corta usando a agulha com sua abertura lateral e longe dos óvulos. (10), fazer uma nítida pequena corte o tecido de transmissão nível em um dos dois extremos. (11) use a pinça e a agulha para separar as duas metades. (12) suavemente usando a pinça e a agulha, virar uma linha de óvulos para obter duas filas paralelas. Como alternativa, coloque as duas linhas verticalmente com o replum cima e empurre suavemente para baixo ao longo da replum para espalhar as duas linhas ovule em ambos os lados. Dois achatados, mas ainda ligado a linhas de óvulos depois de limpar e coloração com solução de IKI-4½ do Herr são mostrados como uma ilustração do resultado a dissecação. Escala de barras = 80 µm clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 3: compensação de hidrato de cloral-baseado com ou sem coloração durante o desenvolvimento da flor. (A), A jovem flor em botão. (B-E) Desenvolvimento do estame com mãe de Lisboa células em citocinese (B), tétrades de microsporos (C), mitose de pólen, grãos de pólen (D) e fialoconídios (E). (F-J) Carpelo que contém óvulos com células mãe Megásporo (seta) antes da meiose (F e G) e durante a prófase meiótica I (H), com um saco de embrião binuclear (seta) (eu) e a fecundação (J). Observe o traço de um tubo de pólen (seta) dentro da região micropylar o ovule em J. (K-L) Alexander modificado está manchando de anteras com cheio (K) ou reduzida a viabilidade do pólen devido ao stress de calor (L). Observe o citoplasma vazia e formas irregulares de grãos de pólen abortados dentro lóculos da antera em Arabidopsis L. adesão de Col-0 tipo selvagem. Limpar ou coloração: 4½ do Herr para B-D e F-J, Herr é IKI-4½ para A e Ee modificado Alexander mancha para K-L. Barras de escala = 10 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 4: dinâmica de amido durante a flor e cedo sementes desenvolvimento. Resultados representativos ilustrando o volume de negócios de amido dinâmica durante o desenvolvimento da flor. (A-C) A terceira onda de amylogenesis de amido/amylolysis durante os últimos estágios do desenvolvimento do estame descrito recentemente,³⁹. (D-G) Resultados representativos da onda original amido do grão de pólen com um pico de amylogenesis na fase bicelulares. (H-N) Resultados representativos da dinâmica de amido em óvulos na fase célula mãe de Megásporo (H), no desenvolvimento de gametófitos femininos (-K) e durante o desenvolvimento precoce de sementes (só depois da fertilização em L, endosperma binucleate em M e a fase de embrião de compasso em N). Adesão de Col-0 Arabidopsis selvagem-tipo. Escala de barras = 20 µm. clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 5: alguns clássicos coloração procedimentos para microscopia de fluorescência e o efeito de limpeza de SDS. (A) Calcofluor-auramina coloração durante o amadurecimento de pólen, onde o intine é manchado de azul (calcofluor) e o exine intensamente verde (auramina). (B-C) Remoção mecânica dos exine e DAPI coloração dos grãos de pólen fialoconídios. (D-H) Fotos de representante de uma inflorescência antes (D, como recuperado de fixador) e depois SDS compensação (E-H). Observe a transparência do tecido que permite a observação da vasculatura dentro da haste da inflorescência (G) e o pedúnculo da flor em botão (H). (-J) Azul de anilina mancha para callose em eletrocondutor na fase Tétrade dentro do estame. Comparar a clareza e a intensidade da coloração entre o não-SDS desmarcada antera (eu) e a antera SDS-desmarcada (J). (K) SDS An-desmarcada e anilina azul manchada antera com eletrocondutor durante pólen mitose I. Observe a sincronia de muitos grãos de pólen nesta fase destes dois lóculos. (L) An SDS-desmarcada e anilina azul manchado ovule após a fertilização. Note callose manchando os restos de pólen tubo e o revestimento de semente. Adesão de Col-0 Arabidopsis selvagem-tipo. Barra de escala = 20 µm (A-C,-L); 1mm (D-H). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussion

A existência de muitos botões de flores dentro de um único inflorescência de Arabidopsis, abrangendo todas as fases do desenvolvimento de flor, oferece uma oportunidade única para estudos vista caracterizar um efeito de um tratamento ou uma característica do desenvolvimento simultaneamente em diferentes fases do desenvolvimento da flor. Um ponto de referência boa entre diferentes plantas individuais é a abertura da primeira flor da inflorescência a principal. As plantas são tratadas de forma a que a floração é sincronizada tanto quanto possível (por exemplo, 3 – 4 dias de estratificação a 4 ° C maximiza síncrona germinação e, portanto, ainda mais floração) e somente as plantas que abrir sua primeira flor no mesmo dia tomado como um lote para distribuir entre os tratamentos e repetições; pronto em dias sucessivos lotes podem ser usados para replicar o experimento. Após este procedimento, análises comparativas mais robustas, controlando as variações ambientais e de desenvolvimento dentro e entre as plantas, podem ser executadas.

Combinando a mancha de solução de Lugol com solução de limpeza do Herr permitida-nos não só para aumentar o contraste em amostras apuradas em comparação com soluções de compensação clássica, mas também para caracterizar a dinâmica do amido durante o desenvolvimento de flor e embrião, recentemente relatado para Arabidopsis ⁴⁶. usando este procedimento simples, fomos capazes de desvendar a existência de uma nova onda de amido amylogenesis-amylolysis durante o desenvolvimento da antera e correlacionar a dinâmica de amido com mudanças globais na expressão dos genes codificação de proteínas envolvidas no metabolismo de açúcar e amido. Esta análise demonstrou que o GPT6 é o translocator de açúcar-fosfato do citosol para amiloplastos para síntese de amido. Os resultados detalhados sobre a dinâmica do amido em vários tecidos abre a possibilidade de caracterizar outros genes importantes no metabolismo do amido e abordar questões relativas a menos estudadas mas importantes fases do desenvolvimento da planta. Coloração à base de iodo amido não é quantitativa e deve ser complementado com outros métodos de⁴⁶.

Pesquisa procurando melhorar procedimentos que são compatíveis com a microscopia de fluorescência de compensação se intensificou nos últimos anos, especialmente no campo animal. Embora o campo de pesquisa de planta está atrasada, e compensação em grande parte se baseia em soluções de limpeza tradicionais para análise DIC (por exemplo, soluções baseadas em hidrato de cloral, benzoato de benzila, Dibutilftalato e salicilato de metila)^{31 ,33,},^47,48, incentivados pelo rápido progresso feito no campo de animais, algumas técnicas semelhantes estão surgindo usando ureia - (por exemplo, ClearSee⁴⁹ e outros⁵⁰), e 2, 2'-thiodiethanol-com base em procedimentos^51,52de compensação. Aqui, nós mostramos que o uso do detergente SDS em combinação com NaOH processa o tecido transparente e melhora algumas clássica fluorescência de coloração procedimentos, tais como a anilina azul para callose e calcofluor para celulose. Com base nestes resultados promissores, progressos semelhantes na remoção seletiva baseada em SDS de lipídios podem ser esperados no campo em um futuro próximo. Uma vez que células vegetais têm paredes de célula rígidas que estão ausentes em células animais, a prévia incorporação em hidrogel pode não ser necessária, como é o caso dos tecidos animais. Outros corantes fluorescentes e fluorophores utilizados em linhas de marcador genético pode ser analisada usando este procedimento de compensação.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagents and Materials
Ethanol	Scharlau	ET00102500
Acetic Acid	Applichem	A3686,2500	100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid	Sigma-Aldrich	320099	Molecular Biology Grade
Methanol	Scharlau	ME03062500
Formaldehyde Solution	Sigma-Aldrich	F1635
Propionic acid	Sigma-Aldrich	81910-250 ml
Chloral hydrate	Sigma-Aldrich	15307
Glycerol	Roth	3783.1
Gum arabic	Fluka	51198
Lactic acid	Fluka	69773
Phenol	Sigma-Aldrich	77607-250ML	We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil	Sigma-Aldrich	C8392-100ML
Xylene	Roth	4436.1
Iodine	Fluka	57665
Potassium iodide	Merck	5043
Malachite Green	Fluka	63160
Fuchsin acid	Fluka	84600
Orange G	Sigma	7252
Sodium Dodecyl Sulfate	Sigma-Aldrich	L3771	Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide	Sigma-Aldrich	71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate	Applichem	A1047,1000
Sodium phosphate dibasic	Sigma-Aldrich	S9763-1KG
Potassium phosphate	Sigma-Aldrich	04347
EDTA	Applichem	A2937,1000
Calcofluor	Sigma	F6259	Fluorescent brightener 28
Auramine	Chroma	10120
DAPI	Sigma	D9542	toxic
Triton-X-100	Sigma	T8787
Aniline blue	Merck	1275
MS medium	Carolina	19-57030
Nutrient-rich substrate	Einheitserde	ED73
Watch maker's glass			No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes	VWR	62406-200
Dumond Forceps	Actimed	0208-5SPSF-PS
Forceps	DUMONT BIOLOGY	0108-5
Syringe	BD	BD Plastipak 300013	1 ml
Preparation needle	BD	BD Microlance 304000
Microscope slides	Thermo Scientific	10143562CE	cut edges
Coverslips	Thermo Scientific	DV40008
Humid box			A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name	Company	Catalog Number	Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative			Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative			50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative			Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol			Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer			Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid			Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution			Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution			10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution			2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½			To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining			Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution			Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution			Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture			Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution			DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M)			Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution			0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.