Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Developmental Biology

Hela-mount Clearing och färgning av Arabidopsis blomma organ och Siliques

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441

Summary

I detta protokoll, vi beskriver tekniker för korrekt dissektion av Arabidopsis blommor och siliques, några grundläggande clearing tekniker, och utvalda färgning förfaranden för hela-mount observationer av reproduktiva strukturer.

Abstract

På grund av dess formidabelt verktyg för molekylära genetiska studier är Arabidopsis thaliana en av de mest framträdande modell arterna i växtbiologi och, framför allt i växten reproduktionsbiologi. Dock innebära växt morfologiska, anatomiska och ultrastrukturella analyser traditionellt tidsödande inbäddning och snittning förfaranden för ljusa fält, skanning och elektronmikroskopi. Senaste framsteg i confocal fluorescensmikroskopi, state-of-the-art 3D-datorstödd mikroskopiska analyser och kontinuerlig förfining av molekylärbiologiska metoder som ska användas på minimalt bearbetade hela-mount exemplar, har lett till en ökad efterfrågan på utveckla effektiva och minimal prov bearbetningsmetoder. I detta protokoll, beskriver vi tekniker för korrekt dissekera Arabidopsis blommor och siliques, grundläggande clearing tekniker, och vissa färgning förfaranden för hela-mount observationer av reproduktiva strukturer.

Introduction

Blommor bland de viktigaste definiera organ blomväxter. Blommande växter dök upp några 90-130 miljoner år sedan1, och diversifierade så snabbt att deras snabba utseende beskrevs som en ”avskyvärda mysterium” av Charles Darwin2. Intresse av anläggningen forskare blomma utveckling är olika. Viss forskning har fokuserat på förstå det evolutionära ursprunget till blomman som helhet, eller utvecklingen av specifika anatomiska, strukturella och funktionella egenskaper av blommor3,4,5,6 . Den höga variationen i blommig form och struktur, samt lägena av sexuell och asexuell reproduktion som förlitar sig på dem, göra blomman en mycket komplexa struktur. Detta har lett till olika insatser att karakterisera anatomi och strukturella funktioner i blommig organ, med ljus och elektron mikroskopiska tekniker som kunde kombineras med genetiska och molekylära utredningar7. Dessutom som källa av frukter och frön, är blommor av avgörande betydelse för människors och djurs näring. Karakterisering av blomma och frukt utveckling har därför många konsekvenser för tillämpad forskning, inklusive livsmedelssäkerhet för en ökande befolkning och ekologiskt bevarandestrategier i en föränderlig miljö8 , 9 , 10.

Blomma utveckling i Arabidopsis börjar med blomma induktion och omvandlingen av vegetativa meristemen till en blomställning (grupp av blommor) meristem. Blomma primordia initieras sido på flanken av blomställning meristem11. De blommiga orgel primordia utgör successivt i koncentriska virvlar från utsidan till mitten av blomman, och så småningom utvecklas till foderblad, kronblad, ståndare och fruktblad7. Dessa blommiga organ uppfylla distinkta nutritive, skyddande, och funktionell (t.ex., pollinerare attraktion) roller i olika växtarter, med könsorgan upprätthålla utvecklingen av manliga och kvinnliga rymdskepp, respektive12 , 13. rymdskepp, i sin tur varje skilja ett par manliga (spermier) och kvinnliga könsceller (ägg och centrala cell), som förenar vid dubbel befruktning bilda nästa generation, zygoten, och den primära frövitan, en terminal vävnad som stöder den utveckling av embryo14,15. Frukt- och fröpartier utveckling stöd på tillväxt, mognad och bevarandet av embryot och slutligen dess spridning. Omfattande forskning har utförts för att karakterisera blomma och embryo utveckling i olika växtarter, särskilt i modell arter Arabidopsis7,16,17.

Tidiga mikroskopiska analyser av blomma utveckling var baserade på tidskrävande prov bearbetning och observation tekniker såsom paraffin eller harts inbäddning och snittning, kombinerat med ljus eller elektronmikroskopi. Dessa traditionella mikroskopiska tekniker användes ofta i kombination med molekylära genetiska undersökningar, såsom mikroskopiska analyser av mutanter, lokalisering av RNA av i situ hybridisering eller immuno-påvisande av proteiner. Senaste framsteg i wide-området och confocal fluorescensmikroskopi, i state-of-the-art 3D-datorstödd image analyser och kontinuerlig förfining av molekylära metoder som kan användas på minimalt bearbetade hela-mount exemplar, har lett till ett behov av effektiv och minimal prov bearbetningsmetoder som prioriterat kan bli föremål för kvantitativa analyser. Under de senaste åren har betydande framsteg gjorts i utveckla clearing tekniker på hela-mount djur preparat. De gör provet transparent antingen genom att använda vattenbaserade urea - eller socker-baserade reagens (t.ex., skala, SeeDB, CUBIC)18,19,20, eller genom att selektivt avlägsna lipider (med tvättmedel SDS) efter bädda in prover i stabil hydrogels; avlägsnande av lipider kan uppnås antingen genom passiv diffusion (t.ex., modifierade klarhet protokoll21, pakten-PARS-fälgar22) eller aktivt genom elektrofores (ursprungliga tydlighet protokoll23 och ACT-PRESTO24). Uppmuntrad av detta snabba framsteg, några härledda tekniker finns också nya för användning i växter.

I detta metoder papper fokuserade på modellen Arabidopsis, beskriver vi förfarandet för korrekt dissektion av blomknoppar, blommor, och unga siliques och clearing av hela-mount prover för olika färgning och observation procedurer med hjälp Klassiskt eller en nyligen SDS-baserade clearing-metod. Exempel för stärkelse, callose och kromatin färgning ges. Även om dessa förfaranden kan behöva ytterligare förbättringar och anpassningar när den används med andra arter, hoppas vi att de kommer att ställa på scenen för ytterligare forskning på dessa enkla men kritiska metoder som är utgångspunkten för många forskningsprojekt.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. blomma och skida fixering

  1. Skörden blommor och siliques från växter synkroniseras vid öppnandet av den första blomman.
    Obs: Under experimentella förhållanden används här, börja växter blomma ungefär 21 dagar efter transplantation från Murashige och Skoog (MS) plåtar till jord. Frön är stratifierat för 3 – 4 dagar vid 4 ° C och grott/odlas på MS plattorna vid 22 ° C 16 h ljus och 18 ° C 8 h mörka för 8 till 10 dagar, före transplantation plantor på näringsrik jord i krukor höll på samma villkor (figur 1). Antalet replikat beror på den specifika forskningsmål, men minst 5 blomställningar (från 5 enskilda växter) för varje behandling rekommenderas. Om blommor är den experimentella enheten, rekommenderas ett minimum av 10 blommor per replikat.
  2. Klipp blomställningar eller blommor (figur 1E-H) med liten sax (t.ex., nagelsax) och placera dem omedelbart i en mikrocentrifug rör (för enkel blomställning/blomma fixering) eller ett koniskt rör (för kollektiva upptagningar) med nyaktiverad gjort Carnoy's, metanol/ättiksyra eller FPA50 fixativ (beroende på tillämpning, se nedan) på is.
    Obs: Prover bör vara helt nedsänkt i fixativ.
  3. Lämna vävnaden inom fixeringsvätskan för 4 h till övernattning vid 4 ° C.
    Obs: Vakuum infiltration kan användas för att påskynda genomträngningen av fixeringsvätskan i vävnaden, men detta kan vara skadligt för bevara strukturen av vävnaden. Författarna implementerar inte vakuum infiltration.
  4. Ta bort fixeringsvätskan, lägga tillräckligt 70% etanol för att täcka proverna och återföra dem till 4 ° C i minst 24 tim. prover kan bo på obestämd tid i denna lösning. Efter bort etanol, omedelbart gå vidare till nästa steg; dissektion eller SDS clearing.

2. dissektion under stereomikroskopet

  1. Put nytillagade 70% etanol i klocka maker's glas placeras på en liten petriskål för stöd.
  2. Plats den blomställning/blomma/skida på detta nyligen gjort fixativ och dissekera under stereomikroskopet med pincett och en spruta med en kanyl.
    1. Använd klocka maker's glas eller liknande enhet som gör att proverna ska vara helt täckt med etanol (rekommenderas) för dissektion av blomställningar och slita blommig organ av mogna blommor (foderblad, kronblad och ståndare kan vara dissekeras i detta skede ) att undvika risken för att prover som torkar ut.
  3. Dissekera siliques och små blomknoppar på en bild som beskrivs nedan.
    1. Gallrat den klocka maker's glas med förbearbetade prover, och använda en normal bild för den slutliga dissektionen.
    2. Flytta provet av intresse till bild och tillsätt 10 µL av färsk 70% etanol. Arbeta snabbt på den slutliga dissektionen och tillsätt 10 µL etanol, om nödvändigt, att hålla provet fuktig utan överdriven vätska.
    3. För att frigöra pollenkorn från ståndare, se steg 5.1. För dissekera fruktblad och fröämnen, Följ proceduren som beskrivs i figur 2. Den här proceduren för alla stadier i utvecklingen av en pistill, inbegripet utveckling av gröna siliques.
      Lägg Inte till etanol om det finns tillräcklig etanol överföringar från flytta proven; dissekera mycket små prover är mycket lättare i en minimal mängd vätska. Alltid hålla endast organen av intresse (foderblad, kronblad, ståndare, fruktblad, fröämnen, frön eller pollen korn) i bilden. Detta förfarande kommer att säkerställa en enhetlig tjocklek mellan bild och täckglas, motsvarar tjockleken på orgel under granskning, vilket resulterar i en högre homogenitet och därmed effektivitet för mikroskopiska undersökningar (högre antal mål exemplar i samma fokalplan).
  4. Använd en liten bit av läskpapper och absorbera ta bort så mycket etanol som möjligt. Snabbt vidare till nästa steg (avsnitt 3, 4 eller 6) innan de provet torkar ut.

3. Chloral Hydrate-baserade Clearing och kombinerade Clearing-färgning

Obs: Bästa resultat för chloral hydrate-baserade clearing erhålls med FPA50 fast material.

  1. Placera 20 µL av clearing lösning (chloral hydrat/glycerol, modifierad Hoyer's medium, Herr's 4½ eller Herr's IKI-4½ lösningar) i preparatet räntebärande bilden. Med ett par sprutor med hypodermal nålar, placera exemplaren som behövs genom att minska utrymmet mellan dem och vända dem där orgeln av intresse vänd nedåt. Ta bort alla återstående luftbubbla med hjälp av nålen.
  2. Sänka ett täckglas i sidled och försiktigt placera den, trycka på mycket försiktigt, och vänta tills clearing lösningen fyller utrymmet mellan. Lägg till minimal clearing lösning, om det behövs, att fylla hela utrymmet under täckglaset.
  3. Placera bilden på en hållare och lämna den under spiskåpa. Fortsätt till mikroskopiska observationer under följande 4 – 5 dagar och efter minst 4 h.

4. kombinerad Alexander färgning och Herr's 4½ Clearing av Anthers

Obs: Det ursprungliga Alexander-protokollet är baserat på släppa pollen korn i bilden innan färgning. En effektiv och mer informativa, modifierade Alexander färgning och rensa förfarande är färgningen av mogen pollenkorn inom mogna men icke-dehiscent ståndarknappar.

  1. Välj nyskördade blomknoppar som kommer att öppna med icke-dehiscent ståndarknappar.
    Obs: Ta inte yngre blomknoppar eftersom Alexander färgning är avsedd för mogna pollenkorn och inte effektivt fläckar omogna pollenkorn. Minst 5 blommor per behandling skördas från olika växter och blomställningar rekommenderas.
  2. Förbereda en plattan med 96 brunnar med tillräckligt Alexanders lösning att dränka en blomknopp. Utsätta ståndarknappar genom att ta bort de foderblad och kronblad och doppa dem i Alexanders lösning. Hålla proverna under spiskåpa för 1 – 3 h.
  3. Ersätta Alexanders lösning med Herr's 4½ lösning och placera flera plattan tillbaka under spiskåpa för en övernattning inkubering.
  4. Med pincett, försiktigt flytta clearade blomknoppar på en ny bild. Eftersom vissa överföring av Alexanders lösning kan förekomma, använda ett läskpapper för att ta bort så mycket clearing lösning som möjligt.
  5. Dissekera ståndare och ta bort alla andra vävnader. Följ stegen i avsnittet 3 använda Herr's 4½ lösning.

5. ta bort Exine från pollenkorn

Obs: Vi rekommenderar att du använder Carnoys fixativ för DAPI färgning.

  1. Följ fixering och dissektion procedurerna som beskrivs i avsnitten 1 och 2. Nu bör man ha en till många ståndare i bilden inom ett minimum av 70% etanol.
  2. Använd ett läskpapper för att ta bort överflödig etanol och tillsätt 5 – 10 µL av DAPI lösning. Med ett par sprutor med nålar, släppa pollen kornen inom den liten mängden lösning (t.ex., Använd en spruta att immobilisera ståndare och den andra att släppa pollen korn). Lägga till en annan 5 µL DAPI om lösningen torkar ut.
  3. Ta bort alla skräp av Ståndarna är ett viktigt steg, så att endast pollenkorn är kvar mellan bilden och täckglaset.
  4. Placera ett täckglas i preparatet räntebärande bilden genom att sänka det i sidled och minimal mängd av DAPI lösning krävs för att fylla utrymmet. Placera ett pekfinger på täckglaset och utan squash alltför mycket göra en snabb, fast, och kort glidande rörelse.
    Obs: För att mäta den nödvändiga kraften och amplituden av glidande rörelse, detta steg bör praktiseras flera gånger, kontrollera resultatet varje gång under mikroskopet.
  5. Lägg till DAPI lösning om det behövs och placera bilden i en fuktig ruta i mörker vid 4 ° C i 15 min till 1 h. fortsätta att iaktta prover under wide-fältet fluorescens eller konfokalmikroskopi inom 24 h. försöker kombinera detta förfarande med SDS clearing för att kontrollera om ytterligare förbättra ment kan erhållas.

6. sodium Dodecyl Sulfate (SDS) rensa

Obs: Beroende på den blommiga orgeln ska analyseras, och forskarens kompetens att dissekera mycket mjuk och liten exemplar, SDS behandling kan utföras antingen innan (för erfarna forskare) eller efter dissektion steg (för mindre erfarna forskare) på metanol-ättiksyra fast material.

  1. Använd klocka maker's glas, en konkav bild eller en mikrocentrifug rör ruva dissekerade eller icke-dissekeras prover i 1% SDS och 0,2 N NaOH-lösning över natten i rumstemperatur.
  2. Hantera med försiktighet eftersom provet är mycket mjuk och har en transparent utseende. Skölj flera gånger med vatten.
    Obs: Resterna av SDS lösningen kan leda till nederbörd när du lägger till i färglösningen, t.ex., anilin blå.
  3. För icke-dissekeras prover, följ dissektion proceduren som beskrivs i avsnitt 2, använda vatten istället för 70% etanol. Efter dissekera önskad vävnad, ta bort alla rester och skräp, och eventuellt överflödigt vatten med ett läskpapper, sedan Tillsätt 20 – 40 µL av färglösningen, och fortsätta med steg 6,5.
  4. Dissekerade prover, försiktigt flytta provet från tvättlösningen och placera den på ett rent objektglas, och lägga till 20 – 40 µL av färglösningen.
  5. Placera försiktigt ett täckglas i bilden genom att sänka den i sidled. Se till att inte squash beredning. Om vävnaden är för mjuk, lämnar plats någon tunn avgränsare i mellan bilden och täckglaset på dess hörn (t.ex., band eller ett trasigt täckglas), en kammare-liknande utrymme mellan bild och täckglas, sådan att täckglaset inte krossa preparatet.
  6. Placera alla bilder i en fuktig låda, täck den med aluminiumfolie och placera den vid 4 ° C i minst 1 h. fortsätta att iaktta preparatet med hjälp av widefield fluorescens eller konfokalmikroskopi inom 24 h.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arabidopsis tillhör familjen Brassicacea, bära blomställningar med bisexuella blommor ordnade i en corymb (figur 1). Varje blomma har fyra foderblad, fyra kronblad, sex ståndare (fyra lång och två korta) och en syncarpous gynoecium bestående av två medfödd smält fruktblad (figur 1F-H) ordnade i fyra koncentriska virvlar25,26. Arabidopsis har tenuinucellate, anatropous fröämnen ordnade i parietala placentation i två rader (12-20 fröämnen i varje rad) inom vart och ett av de två locules i äggstockarna (sammanlagt 45 – 80 fröämnen) (opublicerade data och referenser27, 28 , 29 , 30). för att genomföra robust jämförande analyser av blomma och embryo utveckling inom en enskild anläggning eller mellan olika växter (som replikat eller behandlingar), är det tillrådligt att använda den allra första öppen blomman som referens (figur 1b). I detta skede har Blomställningen (figur 1E) vanligtvis mellan 20 och 30 blomknoppar som spänner över alla utvecklingsfaserna blomma, och i ungefär samma stadier i andra individer (opublicerade data). Mer blomma meristems (bildas mellan 5 och 20 blommor) kommer att inledas av blomställning meristemen efter första blomman öppnat. De två första blommorna kan visa fertilitet defekter och därför inte bör ingå i analysen.

Rensa Arabidopsis blommor och blommig organ med chloral hydrate-baserade utförs clearing lösningar31,32, inklusive Herr's 4½ clearing lösning33, vanligen för differentiell störningar kontrast ( DIC) mikroskopiska analyser av blomma, skida och embryo utveckling (figur 3A-J). 4½ lösningen rekommenderas speciellt för att analysera ståndare utveckling, och för organ som kräver starkare clearing kapacitet. Vissa chloral hydrate-baserade lösningar används dubbla syfte att rensa och färgning samtidigt; Detta är fallet för det ursprungliga Alexander's34 och Herr's IKI-4½35,36 lösningar. Alexander färgning används ofta i Arabidopsis för att utvärdera pollen abort. En modifierad och mer informativa Alexander färgning förfarande37 är att färga hela ståndarknappar innehåller mogna pollenkorn. Detta förfarande kräver en bakre röjning av de ståndarknappar med Herr's 4½ lösning (figur 3 K-L). Andra färgning tekniker som används i olika växtarter kan ge en bättre uppskattning av pollen livskraft (t.ex., fluorochromatic reaktionen med fluorescein diacetat, färgning för callose, stärkelse, DNA, RNA och enzymatisk tester med Redox färgämnen)38,39,40. Men utvärdera de flesta av dessa tekniker en specifik aspekt av pollen säden som inte kanske nödvändigtvis korrelerar med pollen livskraft och allt pollen fertilitet. En utvärdering av pollen grobarhet förmåga, och dess förmåga att påverka befruktning och sätta frön kanske mer exakt3840. En mycket mindre använda clearing-färgning tillvägagångssättet är Herr's IKI-4½, som kombinerar clearing och stärkelse-färgning lösningar. Förutom färgning för stärkelse (figur 4), kan detta förfarande användas för allmän clearing ändamål när högre kontrast är nödvändiga (t.ex., figur 3A, E).

En kombination av auramin och calcofluor används i många växt arter41 samtidigt färga de pollen exine och intine (figur 5A). De flesta av dessa och andra kemiska färgämnen fläckar inte en enda cellulära komponent och därför bör användas i kombination med mer direkt märkning tekniker såsom GUS eller fluorescently-taggade markör linjer, antikroppar eller in situ hybridisering. De kan också visa flera excitation och utsläpp spektra. DAPI, däremot är mer specifik, och används vanligtvis att färga kromatin och kromosom sprider42 under meios och följa pollen utveckling43, frånsett dess många tillämpningar som en kontrollfärg för kärnan. Här visar vi hur färgning intensiteten kan ökas för att få en mer detaljerad vy av kromatinet spermier och vegetativa atomkärnor genom att mekaniskt avlägsna exine (figur 5B-C). Men denna teknik är mycket till hjälp för dem som är intresserade av att utföra detaljerade analyser av kromatin, kromosomer och nukleära struktur, kan mekanisk borttagning av exine påverka organisationen av pollen säden, så att resultaten bör tolkas med försiktighet.

De flesta av dessa fluorescerande färgämnen används utan föregående röjning av vävnad; men i vissa fall, de är förenliga med en bakre chloral hydrate-baserade rensa på bild44. SDS clearing har nyligen använts som clearing reagens i djur- och växtarter forskning och har visat sig vara kompatibla med olika färgning förfaranden för widefield fluorescens och konfokalmikroskopi (mPS-PI45 i växter och tydlighet23, PAKTEN22 eller ACT-PRESTO24 djur). Använder en SDS-NaOH clearing före anilin blå färgning (figur 5 d-H), lyckades vi uppnå högre tillgänglighet till inre vävnader samt en bättre färgning för callose inom blommig vävnader (figur 5I-L). Liknande resultat erhölls för calcofluor (inga data anges).

Figure 1
Figur 1: Fotografier av Arabidopsis växter och blommor. (A-D) Arabidopsis växter i olika stadier av livscykeln: rosett innan bultning (A), vid första blomma öppning (B), med primär och några sekundära blomställningar (C) och i slutet av blommande (D). (E), den typiska corymb av en Arabidopsis blomställning med blommor i olika utvecklingsstadier, förfaller acropetally. (F-H) En Arabidopsis blomma på anthesis, som illustrerar självpollinering (ståndare röra stigmaen och släppa pollen korn). Siffror E-H är fokus travar av 36, 53, 42 och 32 bilder, respektive monteras med ett verktyg (t.ex., Helicon Focus). F-H representerar samma blomman där en sepal, två kronblad och en kort ståndare togs bort i H. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figure 2
Figur 2: Hur att dissekera en gynoecium och fröämnen. (1-3), Place gynoecium på en bild med en minimal mängd av 70% etanol och position händer som skildras i ritningen. Gör snitt 1-3 följande anvisningarna se röda pilarna. Använda nålen med öppningen vänd uppåt och bort från fröämnen för snitt 2-3. (4-6) Vrid pistill 180 grader enligt bilden och göra nedskärningar 4-6 som de tre första nedskärningarna. (7) ta bort ventilerna: använda nålen med öppningen nedåt och placera det under fröämnen glida nålen snabbt till höger längs ventil marginalen. För större fruktblad (anthesis och framåt), eller med vissa dissektion expertis, kan man ersätta detta steg genom att upprepa steg 2 och 5 på den andra sidan av pistill. (8-9) ta bort det stigma-stilen och skaftet med vassa skär med nålen med dess öppning i sidled och bort från fröämnen. (10), göra en vass liten skär vid sändande vävnaden nivå på en av två ytterligheter. (11) använda tången och nålen för att slita isär de båda halvorna. (12) med hjälp av tången och nålen, försiktigt knäppa en rad fröämnen att erhålla två parallella rader. Alternativt placera två rader vertikalt med den replum som ligger ovanför och tryck försiktigt nedåt längs replum att sprida två fröämnet rader på vardera sidan. Två tillplattade men fortfarande sitter rader av fröämnen efter röjning och färgning med Herr's IKI-4½ lösning visas som en illustration av resultatet av dissektion. Skala barer = 80 µm vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 3
Figur 3: Chloral hydrate-baserade röjning med eller utan färgning under blomma utveckling. (A) A unga blomknopp. (B-E) Ståndare utveckling med microspore mor celler i cytokines (B), tetrads av mikrosporer (C), pollen Mitos jag (D), och tricellular pollenkorn (E). (F-J) Gynoecium som innehåller fröämnen med megaspore mor celler (pil) före meios (F och G) och under meiotiska profas jag (H), med en binukleära embryo sac (pil) (jag) och vid befruktning (J). Observera tracen av en pollen tube (pilen) inom regionen micropylar i ägget i J. (K-L) Modifierade Alexander är färgning av ståndarknappar med full (K) eller nedsatt pollen lönsamhet på grund av värmestress (L). Observera den tomma cytoplasman och oregelbundna former av avbrutna pollenkorn inom de anther locules i L. Arabidopsis vildtyp Col-0 anslutning. Rensa eller färgning: Herr's 4½ för B-D och F-J, Herr's IKI-4½ för A och E, och modifierade Alexander färgning för K-L. Skala barer = 10 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 4
Figur 4: stärkelse dynamics under blomman och tidigt frö utveckling. Representativa resultat illustrerar den dynamiska stärkelse omsättningen under blomma utveckling. (A-C) Den tredje vågen av stärkelse amylogenesis/amylolysis under de sista stadierna av ståndare utveckling beskrivs som nyligen39. (D-G) Representativa resultat av unika stärkelse vågen i pollen korn med en topp på amylogenesis i bicellular skede. (H-N) Representativa resultat av stärkelse dynamik i fröämnen i megaspore mor cellstadie (H), utveckla kvinnliga rymdskepp (jag-K), och under tidig frö utveckling (strax efter befruktning i L, binucleate frövitan i M , och Oktanten fosterstadiet i N). Arabidopsis vildtyp Col-0 anslutning. Skala barer = 20 µm. vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.

Figure 5
Figur 5: några klassiska färgning förfaranden för fluorescensmikroskopi och effekten av SDS-clearing. (A) Calcofluor-auramin färgning under pollen mognad där intine är målat blå (calcofluor) och exine intensivt gröna (auramin). (B-C) Mekanisk borttagning av exine och DAPI färgning av tricellular pollenkorn. (D-H) Representativa bilder av en blomställning innan (D, som återvunnits från fixativ) och efter SDS clearing (E-H). Observera insyn i vävnaden som gör att observationen av vaskulatur inom blomställning stammen (G) och blomknopp skaftet (H). (I-J) Anilin blå färgning för callose i mikrosporer i Triaden skede inom ståndare. Jämför klarheten och intensiteten i färgningen mellan icke-SDS rensat anther (jag) och den SDS-godkänt anther (J). (K), en SDS-godkänt och anilinfärgad blå färgade anther med mikrosporer under pollen Mitos I. Observera sömnapparater av många pollenkorn i detta skede i dessa två locules. (L) An SDS-godkänt och anilinfärgad blå färgade fröämnet efter befruktningen. Observera callose färgning i resterna av pollen röret och i utsäde pälsen. Arabidopsis vildtyp Col-0 anslutning. Skalstapeln = 20 µm (A-C,-L); 1 mm (D-H). Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Förekomsten av många blomknoppar inom en enda blomställning av Arabidopsis, som spänner över alla blomma utvecklingsstadier, erbjuder en unik möjlighet för studier syftar till att karaktärisera en effekt av en behandling eller en utvecklande funktion samtidigt över de olika utvecklingsstadierna blomma. En bra referenspunkt mellan olika enskilda växter är öppnandet av den första blomman av den huvudsakliga blomställningen. Växter behandlas på ett sådant sätt att blommande synkroniseras så mycket som möjligt (t.ex., 3 – 4 dagar stratifiering vid 4 ° C maximerar synkron frögroning och därmed jämnare blomning), och endast växter som öppnar sin första blomma på samma dag är tas som en batch att fördela mellan behandlingar och replikat; batchar redo på varandra följande dagar kan användas för att replikera experimentet. Efter detta förfarande, mer robust jämförande analyser, kontrollera för miljö- och utvecklingstoxicitet variationer inom och mellan växter, kan utföras.

Kombinera Lugols fläcken med Herr's clearing lösning tillät oss inte bara att förbättra kontrasten i clearade prover jämfört med klassisk clearing lösningar, men också att karakterisera stärkelse dynamics under blomman och embryo utveckling, som nyligen rapporterats för Arabidopsis 46. använder denna enkla procedur, vi kunde avslöja förekomsten av en ny våg av stärkelse amylogenesis-amylolysis under anther utveckling, och att korrelera stärkelse dynamics med globala förändringar i uttrycket av gener kodning proteiner involverade i metabolismen av socker och stärkelse. Denna analys visade att GPT6 är translocator av socker-fosfat från cytosolen till amyloplasts för stärkelse syntes. De detaljerade resultat på stärkelse dynamics i olika vävnader öppnar möjligheten att karaktärisera andra viktiga gener i stärkelse ämnesomsättning och att ta itu med olösta frågor om mindre studerade men viktiga utvecklingsstadier växt. Jod-baserade stärkelse färgning är inte kvantitativ, och bör kompletteras med andra metoder46.

Forskning söker förbättrad clearing förfaranden som är kompatibla med fluorescensmikroskopi intensifierats de senaste åren, särskilt i fältet djur. Även om växten forskningsområdet släpar och clearing till stor del bygger på traditionella clearing lösningar för DIC analys (t.ex., chloral hydrate-baserade lösningar, bensyl benzoate, dibutylftalat och metylsalicylat)31 ,33,47,48, uppmuntrad av snabba framsteg i fältet djur några liknande tekniker växer fram med hjälp av urea - (e.g., ClearSee49 och andra50), och 2, 2'-thiodiethanol-baserade clearing förfaranden51,52. Här visar vi att användningen av SDS tvättmedel i kombination med NaOH gör vävnaden transparent och förbättrar vissa klassiskt fluorescens färgning förfaranden, såsom anilin blå för callose och calcofluor för cellulosa. Baserat på dessa lovande resultat, kan liknande framsteg i SDS-baserade selektiv borttagning av lipider förväntas i fältet växt inom en snar framtid. Eftersom växtceller har stela cellväggar som är frånvarande i djurceller, föregående inbäddning i hydrogels kanske inte nödvändigt, som är fallet för djurvävnader. Andra fluorescerande färgämnen och fluorophores används i genetisk markör linjer kan analyseras med hjälp av proceduren clearing.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har något att avslöja.

Acknowledgments

Detta arbete stöds av universitetar av Zurich, en IEF Marie Curie Grant (bevilja nr. TransEpigen-254797 till A.H.), en avancerad beviljande av Europeiska forskningsrådet (bevilja nr. Medea-250358 till U.G.), och en forskning och teknikutveckling projekt (grant MecanX att U.G.) från SystemsX.ch, schweiziska initiativet i systembiologi.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).

Tags

Utvecklingsbiologi fråga 134 Herr's clearing Hoyer's clearing SDS clearing Lugols jod färgning DAPI färgning anilin blå fröämnet utveckling pollen utveckling
Hela-mount Clearing och färgning av <em>Arabidopsis</em> blomma organ och Siliques
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hedhly, A., Vogler, H.,More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter