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Developmental Biology

पूरे माउंट समाशोधन और Arabidopsis फूल अंगों और Siliques के दाग

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Summary

इस प्रोटोकॉल में, हम Arabidopsis फूल और siliques के समुचित विच्छेदन के लिए तकनीक का वर्णन, कुछ बुनियादी समाशोधन तकनीक, और चयनित पूरी-प्रजनन संरचनाओं के प्रेक्षण माउंट के लिए प्रक्रियाओं धुंधला ।

Abstract

आणविक आनुवंशिक अध्ययन के लिए अपनी दुर्जेय उपकरण के कारण, Arabidopsis थालियाना संयंत्र जीव विज्ञान में सबसे प्रमुख मॉडल प्रजातियों में से एक है और, विशेष रूप से, संयंत्र प्रजनन जीव विज्ञान में । हालांकि, संयंत्र रूपात्मक, संरचनात्मक, और ultrastructural विश्लेषण पारंपरिक रूप से समय लेने वाली embedding और चमकदार क्षेत्र, स्कैनिंग, और इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के लिए प्रक्रियाओं की धारा शामिल है । फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी में हाल ही में प्रगति, राज्य के अत्याधुनिक 3-डी कंप्यूटर सूक्ष्म विश्लेषण सहायता प्राप्त है, और आणविक तकनीकों के सतत शोधन के लिए ंयूनतम संसाधित पूरे-माउंट नमूनों पर इस्तेमाल किया जा करने के लिए एक वृद्धि की मांग के लिए नेतृत्व में है कुशल और न्यूनतम नमूना प्रसंस्करण तकनीक का विकास. इस प्रोटोकॉल में, हम ठीक से Arabidopsis फूल और siliques, बुनियादी समाशोधन तकनीक, और पूरे के लिए कुछ धुंधला प्रक्रियाओं प्रजनन संरचनाओं की टिप्पणियों माउंट के लिए तकनीकों का वर्णन ।

Introduction

फूल वनस्पतियों के सबसे महत्वपूर्ण परिभाषित अंगों में से हैं । फूल पौधों कुछ 90-130 मिलियन साल पहले1दिखाई दिया, और इतनी तेजी से विविध है कि उनके तेजी से उपस्थिति चार्ल्स डार्विन2द्वारा एक "घिनौना रहस्य" के रूप में वर्णित किया गया था । फूल के विकास में संयंत्र शोधकर्ताओं के हितों विविध रहे हैं । कुछ अनुसंधान एक पूरे के रूप में फूल के विकासवादी मूल समझ पर ध्यान केंद्रित किया है, या विशिष्ट संरचनात्मक, संरचनात्मक, और फूल के कार्यात्मक गुण के विकास3,4,5,6 . पुष्प रूप और संरचना में उच्च भिन्नता, साथ ही उन पर निर्भर यौन और अलैंगिक प्रजनन के तरीके, फूल एक उच्च जटिल संरचना बनाते हैं । यह विविध के लिए शरीर रचना विज्ञान और पुष्प अंगों की संरचनात्मक सुविधाओं की विशेषता प्रयासों के लिए नेतृत्व किया है, प्रकाश और इलेक्ट्रॉन microscopical तकनीक है कि आनुवंशिक और आणविक जांच7के साथ जोड़ा जा सकता है का उपयोग कर । इसके अलावा, फल और बीज के स्रोत के रूप में, फूल मानव और पशु पोषण के लिए सर्वोपरि महत्व के हैं । इसलिए, फूल और फलों के विकास के लक्षण वर्णन अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए कई निहितार्थ है, एक बदलते परिवेश के तहत एक बढ़ती मानव आबादी और पारिस्थितिकी संरक्षण रणनीतियों के लिए खाद्य सुरक्षा सहित8 , 9 , 10.

Arabidopsis में फूल विकास फूल प्रेरण और वनस्पति meristem के परिवर्तन के साथ शुरू होता है एक फूलना (फूलों का समूह) meristem. फूल primordia फूलना meristem के पार्श्व पर बाद में शुरू कर रहे हैं11. पुष्प अंग primordia गाढ़ा whorls में बाहर से फूल के केंद्र के लिए फार्म का, और अंत में sepals में विकसित, पंखुड़ियों, पुंकेसर, और अंडप7। इन पुष्प अंगों अलग पोषक, सुरक्षात्मक, और कार्यात्मक (जैसे, परागण आकर्षण) विभिन्न प्रजातियों के पौधे, पुरुष और महिला gametophytes के विकास को बनाए रखने के साथ यौन अंगों को पूरा, क्रमशः12 , 13. gametophytes, बदले में, प्रत्येक पुरुष (शुक्राणु) और महिला gametes (अंडा और केंद्रीय सेल), जो डबल निषेचन पर एकजुट करने के लिए अगली पीढ़ी के फार्म का एक जोड़ी अंतर, युग्मनज, और प्राथमिक endosperm, एक टर्मिनल का समर्थन ऊतक भ्रूण का विकास14,15. फल और बीज विकास का समर्थन विकास, परिपक्वता, और भ्रूण के संरक्षण और, अंततः, इसके फैलाव । व्यापक अनुसंधान के लिए विभिंन प्रजातियों के पौधे में फूल और भ्रूण विकास की विशेषता प्रदर्शन किया गया है, विशेष रूप से मॉडल प्रजातियों में Arabidopsis7,16,17।

फूल विकास के प्रारंभिक सूक्ष्म विश्लेषण समय लेने वाली नमूना प्रसंस्करण और इस तरह के तेल या राल embedding और अनुभाग, प्रकाश या इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी के साथ संयुक्त रूप में अवलोकन तकनीक, पर आधारित थे । इन पारंपरिक सूक्ष्म तकनीक अक्सर आणविक आनुवंशिक जांच के साथ संयोजन में उपयोग किया गया था, जैसे म्यूटेंट के microscopical विश्लेषण, सीटू संकरण में द्वारा आरएनए के स्थानीयकरण, या इंयूनो-प्रोटीन का पता लगाने. व्यापक क्षेत्र में हाल ही में प्रगति और फोकल प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी, के राज्य में-कला 3-डी कंप्यूटर छवि विश्लेषण सहायता प्राप्त है, और आणविक तरीकों कि ंयूनतम संसाधित पूरे पर इस्तेमाल किया जा सकता है की सतत शोधन-नमूनों माउंट, के लिए एक की जरूरत के लिए प्रेरित किया है कुशल और ंयूनतम नमूना प्रसंस्करण तकनीक है कि तरजीही मात्रात्मक विश्लेषण के लिए उत्तरदाई हैं । हाल के वर्षों में, महत्वपूर्ण प्रगति पूरी-पशु नमूना माउंट पर समाशोधन तकनीक के विकास में किया गया है । वे नमूना पारदर्शी या तो जलीय यूरिया का उपयोग करके या चीनी-आधारित रिएजेंट प्रदान (उदा., स्केल, SeeDB, घन)18,19,20, या चुनिंदा द्वारा लिपिड को हटाने (डिटर्जेंट एसडीएस का उपयोग करके) के बाद स्थिर hydrogels में नमूने embedding; लिपिड को हटाने निष्क्रिय प्रसार द्वारा या तो प्राप्त किया जा सकता है (उदा, संशोधित स्पष्टता प्रोटोकॉल21, समझौता-पार्स-22रिम्स) या सक्रिय रूप से ट्रो द्वारा (मूल स्पष्टता प्रोटोकॉल23 और अधिनियम-सफ़ाई24) । इस तेजी से प्रगति द्वारा प्रोत्साहित किया, कुछ व्युत्पंन तकनीक भी पौधों में उपयोग के लिए उभर रहे हैं ।

इस तरीके मॉडल Arabidopsisपर ध्यान केंद्रित कागज में, हम फूल कलियों, फूल, और युवा siliques के समुचित विच्छेदन के लिए प्रक्रिया का वर्णन है, और पूरे के समाशोधन-विविध धुंधला और प्रेक्षण का उपयोग प्रक्रियाओं के लिए नमूने माउंट शास्त्रीय या हाल ही में एसडीएस-आधारित समाशोधन विधि । स्टार्च, callose, और क्रोमेटिन दाग के लिए उदाहरण दिए गए हैं । हालांकि इन प्रक्रियाओं और सुधार और अनुकूलन जब अंय प्रजातियों के साथ प्रयोग की जरूरत हो सकती है, हमें उंमीद है कि वे इन सरल लेकिन महत्वपूर्ण तरीकों पर है कि कई अनुसंधान परियोजनाओं के प्रारंभिक बिंदु है पर आगे अनुसंधान के लिए मंच निर्धारित करेंगे ।

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Protocol

1. फूल और Silique निर्धारण

  1. फसल फूल और पौधों से siliques पहले फूल के उद्घाटन पर सिंक्रनाइज़ ।
    नोट: यहां इस्तेमाल प्रयोगात्मक शर्तों के तहत, पौधों Murashige और Skoog (एमएस) प्लेटों से मिट्टी के प्रत्यारोपण के बाद लगभग 21 दिनों के फूल शुरू करते हैं । बीज 4 डिग्री सेल्सियस पर 3-4 दिन के लिए स्तरीकृत कर रहे हैं और 22 डिग्री सेल्सियस पर एमएस प्लेटों पर अंकुरित/8 से 10 दिनों के लिए प्रकाश और 18 ° c/बर्तनों में पोषक तत्वों से भरपूर मिट्टी पर अंकुर प्रत्यारोपित करने से पहले उसी परिस्थितियां (चित्र 1) के नीचे रखे । दोहराने की संख्या विशिष्ट अनुसंधान उद्देश्य पर निर्भर करता है, लेकिन प्रत्येक उपचार के लिए 5 फूलना (5 व्यक्तिगत संयंत्रों से) की एक ंयूनतम सिफारिश की है । यदि फूल प्रयोगात्मक इकाई, दोहराने प्रति 10 फूलों की एक ंयूनतम की सिफारिश की है ।
  2. कट फूलना या फूल (चित्रा 1E-एच) छोटे कैंची (जैसे, कील कैंची) का उपयोग कर और उन्हें तुरंत एक microcentrifuge ट्यूब में जगह (एकल फूलना/फूल निर्धारण के लिए) या एक शंकु ट्यूब (सामूहिक निर्धारण के लिए) युक्त हौसले से बना है Carnoy, मेथनॉल/एसिटिक एसिड, या FPA50 fixatives (आवेदन पर निर्भर करता है, नीचे देखें) बर्फ पर ।
    नोट: निर्धारण में नमूने पूरी तरह से जलमग्न होने चाहिए ।
  3. 4 ज के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर रात भर के लिए निर्धारण के भीतर ऊतक छोड़ दें ।
    नोट: वैक्यूम घुसपैठ ऊतक में निर्धारण के प्रवेश को तेज करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह ऊतक की संरचना के संरक्षण के लिए हानिकारक हो सकता है । लेखक वैक्यूम घुसपैठ को लागू नहीं करते हैं ।
  4. निर्धारण को दूर, नमूनों को कवर करने के लिए पर्याप्त ७०% इथेनॉल जोड़ने के लिए, और 4 डिग्री सेल्सियस के लिए उन्हें कम से कम 24 घंटे के लिए वापस; नमूने इस समाधान में अनिश्चित काल तक रह सकते हैं. इथेनॉल को हटाने के बाद, अगले कदम के लिए तुरंत आगे बढ़ना; या तो विच्छेदन, या एसडीएस समाशोधन ।

2. Stereomicroscope के अंतर्गत विच्छेदन

  1. ताजा एक घड़ी है निर्माता के समर्थन के लिए एक छोटी पेट्री डिश पर रखा ग्लास में ७०% इथेनॉल बना रखो ।
  2. इस हौसले से बना निर्धारण और संदंश का उपयोग कर stereomicroscope के तहत काटना और एक सुई के साथ एक सिरिंज पर फूलना/फूल/silique प्लेस ।
    1. एक घड़ी निर्माता के गिलास या इसी तरह के उपकरण है कि नमूनों पूरी तरह इथेनॉल के साथ कवर किया जा करने की अनुमति देता का उपयोग करें (की सिफारिश की) फूलना के विच्छेदन के लिए, और के अलावा फाड़ के लिए परिपक्व फूल के पुष्प अंगों (sepals, पंखुड़ी, और stamen इस स्तर पर विदारक हो सकता है ) बाहर सुखाने नमूनों के जोखिम से बचने के लिए ।
  3. काटना siliques और एक स्लाइड पर छोटे फूल कलियों नीचे वर्णित के रूप में ।
    1. एक तरफ पूर्व संसाधित नमूनों के साथ घड़ी निर्माता के गिलास रखो, और अंतिम विच्छेदन के लिए एक सामान्य स्लाइड का उपयोग करें ।
    2. स्लाइड के लिए ब्याज का नमूना ले जाएं और ताजा ७०% इथेनॉल के 10 µ एल जोड़ें । अंतिम विच्छेदन पर तेजी से काम करते हैं और इथेनॉल के 10 µ एल जोड़ने के लिए, यदि आवश्यक हो, अत्यधिक तरल के बिना नमूना नम रखने के लिए.
    3. पुंकेसर से पराग अनाज जारी करने के लिए, ५.१ कदम देखें । अंडप और ओव्यूल्स को विच्छेदन के लिए, आरेख 2में वर्णित कार्यविधि का पालन करें । यह प्रक्रिया हरित siliques के विकास के चरण सहित कापेल के विकास के सभी चरणों पर लागू होती है ।
      नोट: इथेनॉल जोड़ नहीं है अगर वहां पर्याप्त है इथेनॉल ले जाने से अधिक नमूने ले जाने से; बहुत छोटे नमूने विदारक तरल की एक ंयूनतम राशि में बहुत आसान है । स्लाइड पर हमेशा केवल रुचि के अंगों (sepals, पंखुड़ी, पुंकेसर, अंडप, ओव्यूल्स, बीज, या पराग अनाज) रखें । इस प्रक्रिया स्लाइड और coverslip, परीक्षा के तहत अंग की मोटाई के लिए इसी के बीच एक समान मोटाई सुनिश्चित करेगा, एक उच्च एकरूपता में जिसके परिणामस्वरूप, और इस प्रकार सूक्ष्म परीक्षाओं के लिए दक्षता (लक्ष्य नमूनों की अधिक संख्या एक ही फोकल विमान में) ।
  4. सोख्ता कागज के एक छोटे से टुकड़े को अवशोषित और जितना संभव हो उतना इथेनॉल हटाने का प्रयोग करें । नमूना सूख जाने से पहले अगले चरण (अनुभाग 3, 4, या 6) पर तुरंत आगे बढ़ें ।

3. Chloral हाइड्रेट-आधारित समाशोधन और संयुक्त समाशोधन-धुंधला

नोट: chloral हाइड्रेट के लिए सर्वश्रेष्ठ परिणाम-आधारित समाशोधन FPA50 निश्चित सामग्री के साथ प्राप्त कर रहे हैं ।

  1. जगह समाशोधन समाधान के 20 µ एल (chloral हाइड्रेट/ग्लिसरॉल, संशोधित Hoyer के माध्यम है, हेर्र 4 ½, या हेर्र के इकि-4 ½ समाधान) नमूना असर स्लाइड पर । hypodermal सुई के साथ सीरिंज की एक जोड़ी का उपयोग करना, उन दोनों के बीच अंतरिक्ष को कम करने की जरूरत के रूप में नमूनों की स्थिति, और उन जहां ब्याज के अंग नीचे चेहरे flipping. सुई का उपयोग कर किसी भी शेष हवा बुलबुला निकालें.
  2. बग़ल में एक coverslip कम और धीरे से यह जगह है, बहुत धीरे से दबाव, और समाशोधन समाधान जब तक प्रतीक्षा के बीच में अंतरिक्ष भरता है । न्यूनतम समाशोधन समाधान जोड़ें, यदि आवश्यक हो, coverslip के तहत पूरे अंतरिक्ष को भरने के लिए.
  3. एक स्लाइड धारक पर स्लाइड प्लेस और यह धुएं हुड के नीचे छोड़ दें । सूक्ष्म अवलोकन के बाद कम से 4 ज और बाद में 4-5 दिनों के दौरान आगे बढ़ें ।

4. संयुक्त अलेक्जेंडर धुंधला और हेर्र के परागकोष के 4 ½ समाशोधन

नोट: मूल अलेक्जेंडर प्रोटोकॉल धुंधला से पहले स्लाइड पर पराग अनाज जारी करने पर आधारित है । एक कुशल और अधिक जानकारीपूर्ण, संशोधित अलेक्जेंडर धुंधला और समाशोधन प्रक्रिया परिपक्व लेकिन गैर फूटनेवाला परागकोष के भीतर परिपक्व पराग अनाज के दाग है ।

  1. हौसले से काटा फूल कलियों कि के बारे में गैर फूटनेवाला परागकोष के साथ खोलने के लिए चुन सकते हैं ।
    नोट: क्योंकि सिकंदर धुंधला परिपक्व पराग अनाज के लिए करना है और कुशलता से अपरिपक्व पराग अनाज दाग नहीं है युवा फूल कलियों मत लो । विभिंन पौधों और फूलना से काटा उपचार प्रति 5 फूलों की एक ंयूनतम सिफारिश की है ।
  2. एक फूल कली जलमग्न करने के लिए पर्याप्त है अलेक्जेंडर समाधान के साथ एक ९६ अच्छी तरह से थाली तैयार करें । sepals और पंखुड़ियों को हटाकर परागकोष को बेनकाब करें और उन्हें सिकंदर के समाधान में विसर्जित कर दें । 1 के लिए धुएं डाकू के तहत नमूने रखें-3 एच ।
  3. है हेर्र 4 ½ समाधान के साथ अलेक्जेंडर समाधान बदलें और जगह बहु अच्छी तरह से एक रात की मशीन के लिए धुएं डाकू के तहत वापस थाली ।
  4. संदंश का प्रयोग, धीरे एक नई स्लाइड पर खाली फूल कलियों ले जाएं । के बाद से कुछ ले-अलेक्जेंडर समाधान के खत्म हो सकता है, एक सोख्ता कागज का उपयोग करने के लिए जितना संभव हो उतना समाशोधन समाधान निकालें ।
  5. काटना पुंकेसर और अंय सभी ऊतकों को हटा दें । हेर्र के 4 ½ समाधान का उपयोग कर अनुभाग 3 में दिए गए चरणों का पालन करें ।

5. पराग अनाज से Exine को हटाना

नोट: हम DAPI धुंधला के लिए Carnoy के निर्धारण का उपयोग करने की सलाह देते हैं ।

  1. अनुभाग 1 और 2 में वर्णित निर्धारण और विच्छेदन कार्यविधि का पालन करें । अब तक, एक ७०% इथेनॉल की एक ंयूनतम राशि के भीतर स्लाइड पर कई पुंकेसर के लिए एक होना चाहिए ।
  2. अतिरिक्त इथेनॉल को हटाने के लिए एक सोख्ता कागज का प्रयोग करें, और DAPI समाधान के 5 – 10 µ l जोड़ें । सुई के साथ सिरिंज के एक जोड़े का उपयोग करना, समाधान की है कि छोटी राशि के भीतर पराग अनाज जारी (उदा, एक सिरिंज का उपयोग करने के लिए stamen और दूसरे को पराग अनाज जारी) स्थिर । अगर समाधान सूख जाता है तो DAPI के एक और 5 µ l को जोड़ें ।
  3. stamen के सभी मलबे को हटाना एक महत्वपूर्ण कदम है, इस तरह कि केवल पराग अनाज स्लाइड और coverslip के बीच छोड़ दिया जाता है ।
  4. यह बग़ल में कम करने और अंतरिक्ष को भरने के लिए आवश्यक DAPI समाधान की न्यूनतम राशि जोड़ने के द्वारा नमूना असर स्लाइड पर एक coverslip प्लेस । coverslip पर एक सूचकांक उंगली प्लेस, और बहुत अधिक एक त्वरित, फर्म, और कम फिसलने आंदोलन को कुचलने के बिना ।
    नोट: आवश्यक बल और फिसलने आंदोलन के आयाम गेज करने के लिए, इस कदम कई बार अभ्यास किया जाना चाहिए, माइक्रोस्कोप के तहत हर बार परिणामों की जाँच.
  5. यदि आवश्यक हो तो DAPI समाधान जोड़ें और अंधेरे में एक आर्द्र बॉक्स में स्लाइड को 4 ° c पर 15 मिनट के लिए 1 h. के अंतर्गत नमूनों का निरीक्षण करने के लिए आगे बढ़ें विस्तृत क्षेत्र प्रतिदीप्ति या फोकल माइक्रोस्कोपी के भीतर 24 घंटे की जाँच करें कि क्या आगे सुधार करने के लिए एसडीएस समाशोधन के साथ इस प्रक्रिया को संयोजित करने की कोशिश जाहिर प्राप्त किया जा सकता है ।

6. सोडियम Dodecyl सल्फेट (एसडीएस) समाशोधन

नोट: पुष्प अंग पर निर्भर करता है विश्लेषण किया जा करने के लिए, और शोधकर्ता के कौशल पर बहुत नरम और छोटे नमूनों काटना करने के लिए, एसडीएस उपचार से पहले या तो (अनुभवी शोधकर्ताओं के लिए) या विच्छेदन कदम के बाद (कम अनुभवी के लिए किया जा सकता है मेथनॉल-एसिटिक एसिड निश्चित सामग्री पर शोधकर्ताओं) ।

  1. एक घड़ी निर्माता के गिलास, एक गुफा स्लाइड, या एक microcentrifuge ट्यूब के लिए 1% एसडीएस और ०.२ N NaOH समाधान कमरे के तापमान पर रातोंरात में विच्छेदित या गैर विच्छेदित नमूनों की मशीन का प्रयोग करें ।
  2. देखभाल के साथ संभाल क्योंकि नमूना बहुत नरम है और एक पारदर्शी उपस्थिति है । पानी के साथ कई बार कुल्ला ।
    नोट: एसडीएस समाधान के अवशेष धुंधला समाधान, उदा, एनिलिन नीला जोड़ते समय तेज़ी का कारण बन सकते हैं ।
  3. गैर-विच्छेदित नमूनों के लिए, खंड 2 में वर्णित विच्छेदन प्रक्रिया का पालन करें, ७०% इथेनॉल के बजाय पानी का उपयोग करना । वांछित ऊतक विदारक के बाद, किसी भी अवशेष और मलबे, और एक सोख्ता कागज के साथ किसी भी अतिरिक्त पानी को हटाने, तो धुंधला समाधान के 20-40 µ एल जोड़ने, और कदम ६.५ के साथ आगे बढ़ना ।
  4. विच्छेदित नमूनों के लिए, ध्यान से धोने समाधान से नमूना ले जाएँ और यह एक साफ स्लाइड पर जगह है, और दाग समाधान के 20 – 40 µ l जोड़ें.
  5. धीरे से यह बग़ल में कम से स्लाइड पर एक coverslip जगह है । ध्यान रखना नहीं स्क्वैश तैयारी करने के लिए । ऊतक बहुत नरम है, तो स्लाइड और coverslip के बीच में किसी भी पतली विभाजक प्लेस (उदा., टेप या एक टूटी हुई coverslip), स्लाइड और coverslip के बीच एक चैंबर की तरह अंतरिक्ष छोड़ने, इस तरह कि coverslip नमूना कुचल नहीं करता है ।
  6. एक आर्द्र बॉक्स के भीतर सभी स्लाइड प्लेस, यह एल्यूमीनियम पंनी के साथ कवर, और यह 4 डिग्री सेल्सियस से कम 1 ज के लिए जगह है । 24 एच के भीतर widefield प्रतिदीप्ति या फोकल माइक्रोस्कोपी का उपयोग कर नमूना का पालन करने के लिए आगे बढ़ें ।

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Representative Results

Arabidopsis Brassicacea परिवार के अंतर्गत आता है, उभयलिंगी फूल एक corymb (चित्रा 1) में व्यवस्था के साथ असर फूलना । प्रत्येक फूल चार sepals, चार पंखुड़ी, छह पुंकेसर (चार लंबी और दो छोटी), और एक syncarpous जायांग दो जंमजात के साथ जुड़े अंडप (चित्रा 1F-एच) चार गाढ़ा whorls25,26में व्यवस्था की है । Arabidopsis ने tenuinucellate, anatropous ओव्यूल्स की व्यवस्था पार्श्विका placentation में दो पंक्तियों में की है (प्रत्येक पंक्ति में 12-20 ओव्यूल्स) अंडाशय के दो locules में से प्रत्येक के भीतर (कुल 45 – 80 ओव्यूल्स) (अप्रकाशित डेटा, और संदर्भ27, 28 , 29 , 30). आदेश में एक व्यक्तिगत संयंत्र या विभिंन संयंत्रों के बीच में फूल और भ्रूण विकास के मजबूत तुलनात्मक विश्लेषण शुरू करने के लिए (के रूप में प्रतिकृति या उपचार), यह एक संदर्भ के रूप में बहुत पहले खुले फूल का उपयोग करने के लिए उचित है (चित्रा 1b) । इस स्तर पर, फूलना (चित्रा 1E) आम तौर पर 20 और 30 के बीच फूल विकास के सभी चरणों फैले कलियों, और अन्य व्यक्तियों (अप्रकाशित डेटा) में लगभग समान चरणों में है । अधिक फूल meristems (5 और 20 फूल के बीच गठन) पहले फूल खोला के बाद फूलना meristem द्वारा शुरू किया जाएगा । पहले दो फूल प्रजनन दोष दिखा सकता है और, इसलिए, विश्लेषण में शामिल नहीं किया जाना चाहिए ।

समाशोधन Arabidopsis फूल और फूलों के अंगों का उपयोग chloral जलयोजन आधारित समाशोधन समाधान31,३२, सहित हेर्र 4 ½ समाशोधन समाधान३३, सामांयतः अंतर हस्तक्षेप कंट्रास्ट के लिए मार डाला है ( उद्योग) फूल, silique, और भ्रूण विकास की सूक्ष्म विश्लेषण (चित्रा 3ए-जे) । 4 ½ समाधान stamen विकास का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से सिफारिश की है, और मजबूत समाशोधन क्षमता की आवश्यकता अंगों के लिए. कुछ chloral हाइड्रेट आधारित समाधान समाशोधन और एक साथ दाग के दोहरे प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है; यह मूल है अलेक्जेंडर३४ और हेर्र इकि-4 ½३५,३६ समाधान के लिए मामला है । अलेक्जेंडर धुंधला व्यापक रूप से Arabidopsis में प्रयोग किया जाता है पराग गर्भपात का मूल्यांकन । एक संशोधित और अधिक जानकारीपूर्ण अलेक्जेंडर धुंधला प्रक्रिया३७ के लिए पूरे परिपक्व पराग अनाज युक्त परागकोष दाग है । इस प्रक्रिया के एक पीछे समाशोधन हेर्र के 4 ½ समाधान (चित्रा 3K-एल) का उपयोग कर परागकोष की आवश्यकता है । अंय धुंधला अलग संयंत्र प्रजातियों में इस्तेमाल तकनीक पराग व्यवहार्यता का एक बेहतर आकलन प्रदान (जैसे, fluorochromatic fluorescein diacetate का उपयोग कर प्रतिक्रिया, callose, स्टार्च, डीएनए, और आरएनए के लिए धुंधला हो सकता है, और एंजाइमी परीक्षण का उपयोग कर redox रंजक)३८,३९,४०. हालांकि, इन तकनीकों के अधिकांश पराग अनाज कि जरूरी पराग व्यवहार्यता के साथ सहसंबंधी नहीं हो सकता है और, महत्वपूर्ण बात, पराग प्रजनन के एक विशिष्ट पहलू का मूल्यांकन । पराग अंकुरण की क्षमता का मूल्यांकन, और निषेचन और सेट बीज प्रभाव करने की क्षमता अधिक सटीक३८-४०हो सकता है । एक बहुत कम इस्तेमाल किया समाशोधन-धुंधला प्रक्रिया है हेर्र इकि-4 ½, जो समाशोधन और स्टार्च धुंधला समाधान को जोड़ती है । स्टार्च (चित्रा 4) के लिए धुंधला के अलावा, इस प्रक्रिया सामांय समाशोधन प्रयोजनों के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है जब भी उच्च कंट्रास्ट (उदा, चित्र 3ए, ई) की जरूरत है ।

auramine और calcofluor का एक संयोजन कई प्रजातियों के पौधों में प्रयोग किया जाता है४१ एक साथ पराग exine और (चित्रा धारा 5) दाग के लिए । इनमें से अधिकांश और अंय रासायनिक रंजक एक भी सेलुलर घटक दाग नहीं है और, इसलिए, ऐसे गस या फ्लोरोसेंट के रूप में अधिक प्रत्यक्ष लेबलिंग तकनीकों के साथ संयोजन में इस्तेमाल किया जाना चाहिए-मार्कर लाइनें, एंटीबॉडी, या सीटू में संकरण । उंहोंने यह भी कई उत्तेजना और उत्सर्जन स्पेक्ट्रा दिखा सकता है । DAPI, इसके विपरीत में, और अधिक विशिष्ट है, और आमतौर पर दाग क्रोमेटिन और गुणसूत्र अर्धसूत्रीविभाजन के दौरान४२ फैलता है, और पराग विकास४३का पालन करें, इसके अलावा नाभिक के लिए एक counterstain के रूप में कई गुना अनुप्रयोगों से । यहाँ, हम बताते हैं कि किस तरह दाग की तीव्रता को exine (चित्रा 5B-सी) को यांत्रिक रूप से हटाकर शुक्राणु और वनस्पति नाभिक के क्रोमेटिन का अधिक विस्तृत दृश्य प्राप्त करने के लिए बढ़ाया जा सकता है । हालांकि इस तकनीक क्रोमेटिन, गुणसूत्रों, और परमाणु संरचना का विस्तृत विश्लेषण प्रदर्शन में रुचि रखने वालों के लिए बहुत उपयोगी है, exine के यांत्रिक हटाने पराग अनाज के संगठन को प्रभावित हो सकता है, कि इस तरह के परिणाम होना चाहिए देखभाल के साथ व्याख्या की ।

इन फ्लोरोसेंट रंजक के अधिकांश ऊतक के पूर्व समाशोधन के बिना उपयोग किया जाता है; लेकिन कुछ मामलों में, वे एक पीछे chloral हाइड्रेट के साथ संगत कर रहे हैं-स्लाइड४४पर आधारित समाशोधन । एसडीएस समाशोधन हाल ही में पशु और संयंत्र अनुसंधान में रिएजेंट समाशोधन के रूप में इस्तेमाल किया गया है और widefield प्रतिदीप्ति और फोकल माइक्रोस्कोप (सांसदों-पौधों में PI४५ के लिए अलग धुंधला प्रक्रियाओं के साथ संगत होना दिखाया गया है, और23स्पष्टता, 22 या अधिनियम-सफ़ाई24 पशुओं में समझौता) । एनिलिन नीले दाग (चित्रा 5d-एच) से पहले एक एसडीएस-NaOH समाशोधन का उपयोग करना, हम आंतरिक ऊतकों के लिए उच्च पहुंच प्राप्त करने के साथ ही फूलों के ऊतकों के भीतर callose के लिए एक बेहतर दाग (चित्रा 5I-एल) पाने में कामयाब रहे । calcofluor के लिए समान परिणाम प्राप्त किए गए (डेटा नहीं दिखाया गया) ।

Figure 1
चित्रा 1: Arabidopsis पौधों और फूलों की तस्वीरें । (A-D) Arabidopsis जीवन चक्र के विभिंन चरणों में पौधों: rosette (ए) बोल्टिंग से पहले, पहले फूल खोलने (बी), प्राथमिक और कुछ माध्यमिक फूलना (सी) के साथ, और फूल के अंत में (D) । (ई) विभिंन विकासात्मक चरणों में फूलों के साथ एक Arabidopsis फूलना के ठेठ corymb, परिपक्व acropetally । (F-H) anthesis में एक Arabidopsis फूल, आत्म-परागण (कलंक को छूने और पराग अनाज रिहा stamen) illustrating । आंकड़े ई एच ३६, ५३, ४२, और ३२ चित्रों का फोकस ढेर हैं, क्रमशः, एक सॉफ्टवेयर उपकरण (उदा, Helicon फोकस) का उपयोग कर इकट्ठे । F-h उसी फूल का प्रतिनिधित् व करता है जहां एक sepal, दो पंखुड़ी, और एक अल् stamen Hमें निकाले गए थे । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

Figure 2
चित्रा 2: कैसे एक जायांग और ओव्यूल्स काटना करने के लिए । (1-3) एक स्लाइड पर जायांग के रूप में ड्राइंग में चित्रित ७०% इथेनॉल और स्थिति हाथों की एक ंयूनतम राशि के साथ प्लेस । कटौती 1-3 लाल तीर द्वारा संकेत दिया निर्देशों का पालन करें । 2-3 कटौती के लिए ओव्यूल्स से ऊपर की ओर और दूर का सामना करना पड़ खोलने के साथ सुई का प्रयोग करें । (4-6) कापेल १८० डिग्री रोटेट के रूप में दिखाया गया है, और पहले तीन कटौती की तरह 4-6 कटौती करते हैं । (7) वाल्व को हटाने: नीचे का सामना करना पड़ खोलने के साथ सुई का उपयोग करें, यह ओव्यूल्स नीचे जगह है, और वाल्व मार्जिन के साथ सही करने के लिए जल्दी सुई स्लाइड । बड़ा अंडप के लिए (anthesis और आगे), या कुछ विच्छेदन विशेषज्ञता के साथ, एक कापेल के दूसरी तरफ चरण 2 और 5 दोहराकर इस कदम स्थानापन्न कर सकते हैं । (8-9) कलंक शैली और तेज कटौती के साथ डंठल अपने बग़ल में खोलने और ओव्यूल्स से दूर के साथ सुई का उपयोग कर हटा दें । (10) दो चरम सीमाओं में से एक पर संचारण ऊतक स्तर पर एक तेज छोटे कटौती करते हैं । (11) संदंश और सुई का उपयोग करने के लिए अलग दो हिस्सों आंसू । (12) संदंश और सुई का उपयोग करना, धीरे दो समानांतर पंक्तियों को प्राप्त करने के लिए ओव्यूल्स की एक पंक्ति फ्लिप । वैकल्पिक रूप से, दो पंक्तियों के साथ खड़ी जगह ऊपर के बेर झूठ बोल रही है और धीरे से बेर के साथ नीचे धक्का दोनों ओर दो बीजांड पंक्तियों फैला । दो चपटा लेकिन अभी भी संलग्न ओव्यूल्स की पंक्तियों समाशोधन और हेर्र इकि-4 ½ समाधान के साथ धुंधला के बाद विच्छेदन के परिणाम के एक उदाहरण के रूप में दिखाया गया है । स्केल बार्स = ८० µm इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 3
चित्रा 3: Chloral हाइड्रेट-के साथ या फूल के विकास के दौरान दाग के बिना समाशोधन आधारित. (क) एक युवा फूल कली. (B-E) cytokinesis (ख), tetrads के microspores (ग), पराग बँटवारा मैं (घ), और tricellular पराग अनाज (ङ) में microspore माँ कोशिकाओं के साथ Stamen विकास. (F-J) megaspore मां कोशिकाओं के साथ ओव्यूल्स युक्त जायांग (तीर) से पहले अर्धसूत्रीविभाजन (F और G) और meiotic दौर के दौरान मैं (H), एक binuclear भ्रूण सैक (तीर) (I) के साथ, और निषेचन पर (J) । नोट Jमें बीजांड के micropylar क्षेत्र के भीतर एक पराग ट्यूब (तीर) का पता लगाएं । (K-L) संशोधित अलेक्जेंडर है पूर्ण (कश्मीर) या कम पराग व्यवहार्यता गर्मी तनाव के कारण (एल) के साथ परागकोष के धुंधला । anther locules के भीतर निरस्त पराग अनाज की खाली कोशिका द्रव्य और अनियमित आकृतियों को L. Arabidopsis वाइल्ड-टाइप कर्नल-0 एक्सेस में नोट करें । समाशोधन या धुंधला: है हेर्र 4 के लिए ½ बी डी और एफ जे, है हेर्र इकि-4 के लिए ½ एक और ई, और संशोधित अलेक्जेंडर के लिए दाग K-L। स्केल बार्स = 10 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 4
चित्रा 4: फूल और प्रारंभिक बीज के विकास के दौरान स्टार्च गतिशीलता । प्रतिनिधि के परिणाम फूल विकास के दौरान गतिशील स्टार्च कारोबार illustrating । (A-C) stamen विकास के अंतिम चरण के दौरान स्टार्च amylogenesis/amylolysis की तीसरी लहर हाल ही में वर्णित३९के रूप में । (डी-जी) bicellular मंच पर amylogenesis के एक चोटी के साथ पराग अनाज में अद्वितीय स्टार्च लहर के प्रतिनिधि परिणाम । (H-N) megaspore मदर सेल स्टेज (एच) में ओव्यूल्स में स्टार्च गतिशीलता के प्रतिनिधि परिणाम, महिला gametophytes के विकास में (I-K), और प्रारंभिक बीज विकास के दौरान (सिर्फ एलमें निषेचन के बाद, binucleate endosperm में एम , और Nमें octant भ्रूण चरण) । Arabidopsis जंगली-प्रकार कर्नल-0 प्रवेश । स्केल बार्स = 20 µm. इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के लिए कुछ शास्त्रीय धुंधला प्रक्रियाओं और एसडीएस के प्रभाव-समाशोधन. (क) Calcofluor-पराग परिपक्वता के दौरान धुंधला Auramine, जहां की वजह से (Calcofluor) और exine तीव्रता से हरे रंग (Auramine) दाग है । (B-C) exine और tricellular पराग अनाज के दाग DAPI के यांत्रिक हटाने । (D-H) एक फूलना के प्रतिनिधि चित्रों से पहले (डी, के रूप में निर्धारण से बरामद) और एसडीएस समाशोधन के बाद (ई-एच). ऊतक है कि फूलना स्टेम (जी) और फूल कली डंठल (एच) के भीतर vasculature के अवलोकन की अनुमति देता है की पारदर्शिता पर ध्यान दें । (I-J) stamen के भीतर tetrad चरण में microspores में callose के लिए एनिलिन नीला दाग । स्पष्टता और गैर-एसडीएस द्वाा anther (I) और एसडीएस-द्वाा anther (J) के बीच दाग की तीव्रता की तुलना करें । (K) An एसडीएस-द्वाा और एनिलिन नीले सना anther microspores के साथ पराग बँटवारा के दौरान I. नोट इन दोनों synchrony में इस मुकाम पर कई पराग अनाज का locules. (L) एक एसडीएस-साफ़ और निषेचन के बाद एनिलिन नीले दाग बीजांड । नोट पराग ट्यूब के अवशेष में और बीज कोट में callose दाग । Arabidopsis जंगली-प्रकार कर्नल-0 प्रवेश । स्केल बार = 20 µm (A-C, I-L); 1 मिमी (डी एच) । कृपया यहां क्लिक करें इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण को देखने के लिए ।

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Discussion

Arabidopsisके एक एकल फूलना के भीतर कई फूल कलियों के अस्तित्व, सभी फूल विकास के चरणों में फैले, एक उपचार या विकासात्मक सुविधा का एक प्रभाव निस्र्पक के उद्देश्य से अध्ययन के लिए एक अनूठा अवसर प्रदान करता है एक साथ फूल विकास के विभिंन चरणों में । अलग अलग पौधों के बीच एक अच्छा संदर्भ बिंदु मुख्य फूलना के पहले फूल के उद्घाटन है । पौधों को इस तरह से माना जाता है कि फूलों को जितना संभव हो सिंक्रनाइज़ किया जाता है (उदा., 3-4 दिन स्तरीकरण 4 डिग्री पर सिंक्रोनस बीज अंकुरण को अधिकतम करता है और इसलिए अधिक फूल भी), और केवल वही पौधे हैं जो उसी दिन अपना पहला फूल खोलते हैं उपचार और दोहराने के बीच वितरित करने के लिए एक बैच के रूप में लिया; परवर्ती दिनों पर तैयार किए गए बैचेस प्रयोग को दोहराने के लिए उपयोग किए जा सकते हैं । इस प्रक्रिया के बाद, और अधिक मजबूत तुलनात्मक विश्लेषण, के भीतर और पौधों के बीच पर्यावरण और विकासात्मक बदलाव के लिए नियंत्रण, किया जा सकता है ।

है हेर्र समाशोधन समाधान के साथ है Lugol दाग के संयोजन हमें न केवल शास्त्रीय समाशोधन समाधान की तुलना में मंजूरी दे दी नमूनों में इसके विपरीत सुधार करने की अनुमति है, लेकिन यह भी फूल और भ्रूण विकास के दौरान स्टार्च गतिशीलता की विशेषताएं, के रूप में हाल ही में रिपोर्ट के लिए Arabidopsis ४६. इस सरल प्रक्रिया का उपयोग करते हुए, हम anther विकास के दौरान स्टार्च amylogenesis-amylolysis की एक नई लहर के अस्तित्व को जानने के लिए सक्षम थे, और शामिल जीन एंकोडिंग प्रोटीन की अभिव्यक्ति में वैश्विक परिवर्तन के साथ स्टार्च गतिशीलता सहसंबंधी बनाना चीनी और स्टार्च चयापचय में । इस विश्लेषण से पता चला कि GPT6 में स्टार्च संश्लेषण के लिए cytosol से amyloplasts तक चीनी-फास्फेट की translocator है. विभिन्न ऊतकों में स्टार्च गतिशीलता पर विस्तृत परिणाम स्टार्च चयापचय में अन्य महत्वपूर्ण जीन निस्र्पक की संभावना को खोलता है, और कम अध्ययन लेकिन संयंत्र के विकास के महत्वपूर्ण चरणों के विषय में अनसुलझे सवालों का पता करने के लिए. आयोडीन आधारित स्टार्च धुंधला मात्रात्मक नहीं है, और अंय तरीकों४६के साथ पूरित किया जाना चाहिए ।

बेहतर समाशोधन प्रक्रियाओं है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी के साथ संगत कर रहे हैं के लिए खोज अनुसंधान पिछले वर्षों में तेज हो गया है, विशेष रूप से पशु क्षेत्र में. हालांकि संयंत्र अनुसंधान क्षेत्र के पीछे ठंड है, और समाशोधन बड़े पैमाने पर उद्योग विश्लेषण के लिए पारंपरिक समाशोधन समाधान पर निर्भर करता है (जैसे, chloral हाइड्रेट-समाधान, benzyl benzoate, dibutyl phthalate, और मिथाइल सैलिसिलेट)31 ,३३,४७,४८, पशु क्षेत्र में की गई तेजी से प्रगति द्वारा प्रोत्साहित किया, कुछ इसी तरह की तकनीक यूरिया का उपयोग कर उभर रहे है-(उदा, ClearSee४९ और अंय५०), और 2, 2 '-thiodiethanol-आधारित समाशोधन प्रक्रियाओं५१,५२। यहां, हम बताते है कि NaOH के साथ संयोजन में एसडीएस डिटर्जेंट के उपयोग के ऊतकों को पारदर्शी renders और इस तरह के callose और फाइबर के लिए calcofluor के लिए एनिलिन ब्लू के रूप में कुछ शास्त्रीय प्रतिदीप्ति धुंधला प्रक्रियाओं, में सुधार । इन होनहार परिणामों के आधार पर, लिपिड के एसडीएस-आधारित चयनात्मक हटाने में इसी तरह की प्रगति निकट भविष्य में संयंत्र के क्षेत्र में उम्मीद की जा सकती है । के बाद से संयंत्र कोशिकाओं कठोर कोशिका दीवारों कि पशु कोशिकाओं में अनुपस्थित रहे हैं, hydrogels में पहले embedding आवश्यक नहीं हो सकता है, के रूप में पशुओं के ऊतकों के लिए मामला है । अंय फ्लोरोसेंट रंजक और आनुवंशिक मार्कर लाइनों में इस्तेमाल किया fluorophores इस समाशोधन प्रक्रिया का उपयोग कर परख हो सकता है ।

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Disclosures

लेखकों का खुलासा करने के लिए कुछ नहीं है ।

Acknowledgments

इस काम के ज्यूरिख विश्वविद्यालय द्वारा समर्थित किया गया था, एक आईईएफ मैरी क्यूरी अनुदान (अनुदान no. TransEpigen-२५४७९७ करने के लिए A.H.), यूरोपीय अनुसंधान परिषद के एक उंनत अनुदान (अनुदान सं । MEDEA-२५०३५८ करने के लिए U.G.), और एक अनुसंधान और प्रौद्योगिकी विकास परियोजना (अनुदान MecanX करने के लिए U.G.) से SystemsX.ch, सिस्टम जीवविज्ञान में स्विस पहल.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

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Hedhly, A., Vogler, H.,… More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

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