Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Hele-mount Clearing og flekker av Arabidopsis blomst organer og Siliques

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Summary

Denne protokollen, vi beskriver teknikker for riktig dissection Arabidopsis blomster og siliques, noen grunnleggende clearing teknikker, og valgt flekker prosedyrer for hele-mount observasjoner av reproduktive strukturer.

Abstract

På grunn av sin formidable verktøy for molekylær genetisk studier er Arabidopsis thaliana en av de mest fremtredende modell artene i anlegget biologi og særlig i anlegget Reproduktivt biologi. Men innebære plante morfologiske, anatomiske og ultrastructural analyser tradisjonelt tidkrevende innebygging og snitting prosedyrer for lyse feltet, skanning og elektronmikroskop. Framskritt i AC confocal fluorescens mikroskopi, state-of-the-art 3D dataassistert mikroskopiske analyser og kontinuerlig avgrensningen av molekylære teknikker brukes på minimalt prosesserte hele-mount prøver, har ført til økt etterspørsel etter utvikle effektiv og minimal prosessering teknikker. I denne protokollen, vi beskriver teknikker for riktig dissekere Arabidopsis blomster og siliques, grunnleggende clearing teknikker, og noen flekker prosedyrer for hele-mount observasjoner av reproduktive strukturer.

Introduction

Blomster er blant de viktigste definere organer av Dekkfrøede planter. Blomsterplanter dukket opp noen 90 – 130 millioner år siden1, og diversifisert så fort at utseendet rask ble beskrevet som en "avskyelige mystery" av Charles Darwin2. Interessene til anlegget forskere i utvikling blomst er mangfoldig. Noen undersøkelser har fokusert på å forstå evolusjonære opprinnelsen til blomsten som en helhet, eller utviklingen av bestemte anatomiske, strukturelle og funksjonelle egenskaper blomster3,4,5,6 . Høy variasjonen i floral form og struktur, samt moduser av seksuelle og aseksuell reproduksjon stole på dem, gjør blomsten en svært komplisert struktur. Dette har ført til variert innsats for å karakterisere funksjonene anatomi og strukturelle floral organer, med lys og elektron microscopical teknikker som kan kombineres med genetisk og molekylære undersøkelser7. Videre som kilde av frukt og frø, er blomster av avgjørende betydning for mennesker og dyr ernæring. Derfor har karakterisering av blomst og frukt utvikling mange implikasjoner for anvendt forskning, inkludert matsikkerhet for et stadig økende befolkningen og økologiske bevaringsstrategiene under skiftende miljø8 , 9 , 10.

Flower utvikling i Arabidopsis starter med blomst induksjon og transformasjonen av den vegetative meristem til en sitter (gruppe blomster)-meristem. Blomst primordia er initiert sidelengs på flanken av de sitter meristem11. De floral orgel primordia form gradvis i konsentriske kranser utenfra til midten av blomsten, og til slutt utvikle seg til kronblader, kronblad, pollenbærere og carpels7. Disse floral organer oppfylle forskjellige nutritive, beskyttende, og funksjonell (f.ekspollinator attraksjon) roller i forskjellige plantearter, med kjønnsorganene opprettholde utviklingen av mannlige og kvinnelige gametophytes, henholdsvis12 , 13. gametophytes, i sin tur hver skille et par mann (sperm) og kvinnelige gameter (egg og sentrale celle), som knytter på dobbel-fertilisering til neste generasjon, zygoten og den primære endosperm, en terminal vev støtte den utvikling av embryoet14,15. Frukt og frø støtte vekst, modning, og bevaring av embryoet og senere sin spredning. Omfattende forskning har utført betegner blomst og embryo utvikling i forskjellige plantearter, spesielt i modellen arten Arabidopsis7,16,17.

Tidlig mikroskopiske analyser av flower utvikling var basert på tidkrevende prøve behandling og observasjon teknikker, slik som parafin eller harpiks innebygging og snitting kombinert med lys eller elektronmikroskop. Disse tradisjonelle mikroskopiske teknikker ble ofte brukt i kombinasjon med molekylær genetisk undersøkelser, som microscopical analyser av mutanter, lokalisering av RNA av i situ hybridisering eller immuno-påvisning av proteiner. Framskritt i fluorescens wide-feltet og AC confocal mikroskopi, state-of-the-art 3D dataassistert bilde analyser og kontinuerlig avgrensningen av molekylære metoder som kan brukes på minimalt prosesserte hele-mount prøver, har ført til et behov for effektiv og minimal prosessering teknikker som er fortrinnsvis mottakelig for kvantitative analyser. De siste årene, har betydelig fremgang gjort utvikle clearing teknikker på hele-mount dyr prøven. De gjengi prøven gjennomsiktig ved å bruke kammervann urea - eller sukker-basert reagenser (f.eksskala, SeeDB, CUBIC)18,19,20, eller selektivt fjerne lipider (med vaskemiddel SDS) etter innebygging prøver i stabile hydrogels; fjerning av lipider kan oppnås ved passiv diffusjon (f.eksendret KLARHET protokollen21, pakt-PARS-FELGER22) eller aktivt geleelektroforese (opprinnelige KLARHET protokollen23 og ACT-PRESTO24). Oppmuntret av denne framskritt, noen avledede teknikker er også nye for bruk i planter.

I notatet metoder fokusert på modellen Arabidopsis, beskriver vi fremgangsmåten for den riktige Disseksjon av blomsten knopper, blomster, og unge siliques og clearing av hele-mount prøver for ulike flekker og observasjon prosedyrer som bruker klassisk eller siste SDS-baserte clearing metode. Eksempler for stivelse, callose og chromatin flekker er gitt. Selv om disse prosedyrene kan trenge ytterligere forbedringer og tilpasninger når den brukes med andre arter, håper vi de vil sette scenen for videre forskning på disse enkle, men avgjørende metoder som er utgangspunktet for mange forskningsprosjekter.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. blomst og Silique fiksering

  1. Høst-blomster og siliques fra planter synkronisert ved åpningen av den første blomsten.
    Merk: Under eksperimentelle forhold her, planter begynne blomstring ca 21 dager etter transplantasjon fra Murashige og Skoog (MS) jord. Frø er lagdelt for 3-4 dager 4 ° C og spirer/dyrket på MS plater på 22 ° C/16 h lys og 18 ° C/8 h mørke for 8-10 dager, før transplanting seedlings på næringsrike jord i potter holdt under samme vilkår (figur 1). Antall gjentak avhenger av spesifikke forskning målet, men minst 5 inflorescences (fra 5 individuelle planter) for hver behandling anbefales. Hvis flowers eksperimentelle enheten, anbefales minimum 10 blomster per replikere.
  2. Kutt inflorescences eller blomster (figur 1E-H) med liten saks (f.eks, spikre saks) og plassere dem umiddelbart i et microcentrifuge rør (for enkelt sitter/blomst fiksering) eller en konisk tube (for kollektive fixations) som inneholder ferske laget Carnoy's, metanol/eddiksyre eller FPA50 fiksativene (avhengig av applikasjonen, se nedenfor) på is.
    Merk: Eksempler bør være helt under vann i bindemiddel.
  3. La vevet bindemiddel 4 h overnight på 4 ° C.
    Merk: Vakuum infiltrasjon kan brukes for fartsovertredelse opp utbredelsen av bindemiddel i vev, men dette kan være skadelig å bevare strukturen i vevet. Forfatterne implementerer ikke vakuum infiltrasjon.
  4. Fjerne bindemiddel, legge nok 70% etanol å dekke prøvene og returnere dem til 4 ° C i minst 24 timer; eksempler kan bo på ubestemt tid i denne løsningen. Etter fjerner etanol, videre umiddelbart til neste trinn; enten disseksjon, eller SDS clearing.

2. disseksjon under Stereomicroscope

  1. Sette nystekte 70% etanol i en ur-maker glass plassert på en liten Petriskål for støtte.
  2. Stedet sitter/blomster/silique på dette nylig gjort bindemiddel og dissekere under stereomicroscope ved hjelp av tang og en sprøyte med en nål.
    1. Bruke en se-maker glass eller lignende enhet som gjør at prøvene å være helt dekket med etanol (anbefales) for Disseksjon av inflorescences og rive i stykker floral organer av modne blomster (kronblader kronblader og stamen kan være dissekert på dette stadiet ) å unngå prøver uttørking.
  3. Dissekere siliques og små blomsterknopper på et lysbilde som beskrevet nedenfor.
    1. Legge til se maker's glass med pre-prosessert prøver til side, og bruke et vanlig lysbilde for den endelige disseksjon.
    2. Flytte prøven av interesse til lysbildet og legge 10 µL av fersk 70% etanol. Jobbe raskt på siste dissection og legge 10 µL av etanol, nødvendig for å holde prøven fuktig uten overdreven væske.
    3. For å slippe pollen korn fra pollenbærere, kan du se trinn 5.1. For dissekere carpels og ovules, følger du fremgangsmåten som er beskrevet i figur 2. Denne fremgangsmåten gjelder for alle faser av utviklingen av carpel, inkludert utviklingstrinn av grønne siliques.
      Merk: Ikke Legg etanol hvis det er tilstrekkelig etanol carry-over fra flytte prøver; dissekere svært små utvalg er mye lettere i en minimal mengde væske. Hold alltid bare organer av interesse (kronblader, kronblad, pollenbærere, carpels, ovules, frø og pollen korn) på lysbildet. Denne fremgangsmåten vil sikre en ensartet tykkelse mellom lysbilder og dekkglassvæske, samsvarer med tykkelsen på orgelet under undersøkelse, noe som resulterer i en høyere homogenitet, og dermed effektiviteten microscopic eksamen (høyere antall mål prøver i samme fokalplanet).
  4. Bruk et lite stykke blotting papir å absorbere og fjerne etanol så mye som mulig. Raskt videre til neste trinn (del 3, 4 eller 6) før eksempel dries ut.

3. Chloral hydrat-basert Clearing og kombinerte Clearing flekker

Merk: Best resultat for chloral hydrat-baserte clearing oppnås med FPA50 fast materiale.

  1. Sted 20 µL av oppryddingen løsning (chloral hydrat/glyserol, endret Høyers medium, Herr's 4½ eller Herr's IKI-4½ løsninger) på prøven rentebærende lysbildet. Med et par av sprøyter med hypodermal nåler, plassere de etter behov ved å redusere avstanden mellom dem og pokkers dem der orgelet rundt vender nedover. Fjern alle gjenværende luftboble med nålen.
  2. Lavere en dekkglassvæske sidelengs og forsiktig plassere den, trykke veldig forsiktig, og vente til fjerne løsningen fyller området mellom. Legge til minimal clearing løsning, om nødvendig for å fylle hele plassen under dekkglassvæske.
  3. Plasserer lysbildet på en lysbilde og la den under avtrekksvifte. Videre til mikroskopiske observasjoner etter minst 4 h og under følgende 4-5 dager.

4. kombinert Alexander flekker og Herr's 4½ Clearing av Anthers

Merk: Opprinnelige Alexander protokollen er basert på slipper pollen korn på lysbildet før farging. En effektiv og mer informativ, endret Alexander flekker og fjerne prosedyren er den flekker av modne pollen korn i modne bortsett fra ikke-dehiscent anthers.

  1. Velg nylig høstet blomsterknopper som åpner med ikke-dehiscent anthers.
    Merk: Ikke ta yngre blomsterknopper fordi Alexander flekker er beregnet på eldre pollen korn og ikke effektivt flekker umodne pollen korn. Minimum 5 blomster per behandling høstet fra forskjellige planter og inflorescences anbefales.
  2. Forberede en 96-brønns plate med nok Aleksanders løsning å senke en blomst knopp. Vise anthers ved å fjerne kronblader og kronblad og dyppe dem i Aleksanders løsning. Holde prøvene under avtrekksvifte for 1-3 h.
  3. Erstatte Aleksanders løsning med Herr's 4½ løsning, og plasser flere godt platen tilbake under avtrekksvifte for en overnatting inkubasjon.
  4. Ved hjelp av pinsett, forsiktig flytte ryddet blomsterknopper på et nytt lysbilde. Siden noen bære-over Aleksanders løsning kan oppstå, kan du bruke blotting papir fjerne så mye clearing løsningen som mulig.
  5. Dissekere pollenbærere og fjerne alle andre vev. Fremgangsmåten i del 3 bruker Herr's 4½ løsning.

5. fjerne Exine fra Pollen korn

Merk: Vi anbefaler bruker Carnoys bindemiddel for DAPI flekker.

  1. Følg fiksering og disseksjon fremgangsmåten beskrevet i delene 1 og 2. Nå, bør man ha en til mange pollenbærere på lysbildet i et minimum av 70% etanol.
  2. Bruke blotting papir for å fjerne overflødig etanol, og legge 5-10 µL DAPI løsning. Bruke et par sprøyter med nåler, slipp pollen korn i at små mengder løsning (f.eks, bruk en sprøyte til nakkens stamen og den andre til slipper pollen korn). Legge til en annen 5 µL av DAPI Hvis løsningen tørker ut.
  3. Fjerne alle rester av stamen er et viktig skritt, slik at bare pollen korn igjen mellom lysbildet og i dekkglassvæske.
  4. Plasser en dekkglassvæske på prøven rentebærende lysbildet ved å senke den sidelengs og legge et minimum av DAPI løsningen som kreves for å fylle rommet. Plasser en pekefinger på dekkglassvæske, og uten squashing for mye gjøre en rask, fast og kort glidende bevegelse.
    Merk: For å måle den nødvendige kraft og amplituden av glidende bevegelse, dette trinnet skal praktiseres flere ganger, sjekke resultatene hver gang under mikroskopet.
  5. Legge til DAPI løsning hvis nødvendig og sted i lysbildet i en fuktig i mørket på 4 ° C i 15 min til 1 h. Fortsett å observere prøvene under wide-field fluorescens eller AC confocal mikroskopi innen 24 h. prøve å kombinere denne prosedyren med SDS fjerne for å kontrollere om ytterligere forbedre menter kan oppnås.

6. natrium Dodecyl Sulfate (SDS) fjerne

Merk: Avhengig av floral orgelet som skal analyseres, og forskeren ferdigheter å dissekere veldig myk og små prøver, SDS behandling kan utføres enten før (for erfarne forskere) eller etter dissection trinn (for mindre erfarne forskere) på metanol-eddiksyre fast materiale.

  1. Bruk en se-maker glass, en konkav lysbilde eller et microcentrifuge rør for å ruge dissekert eller ikke-dissekert prøver 1% SDS og 0,2 N NaOH løsning over natten i romtemperatur.
  2. Håndteres med forsiktighet fordi prøven er veldig myk og har et gjennomsiktig utseende. Skyll flere ganger med vann.
    Merk: Rester av SDS løsningen kan føre til nedbør når du legger til farging løsning, f.eks, til anilin blå.
  3. For ikke-dissekert prøver, følger du disseksjon fremgangsmåten beskrevet i del 2, bruk av vann istedenfor 70% etanol. Etter dissekere ønsket vevet, fjerne rester og avfall, og alle overflødig vann med blotting papir, så legge til 20-40 µL av flekker løsning, og fortsett med trinn 6.5.
  4. For dissekert prøver, nøye bevege prøven fra vask løsningen og plassere den på et rent lysbilde, og legge til 20-40 µL av flekker løsning.
  5. Forsiktig plassere en dekkglassvæske på lysbildet ved å senke den sidelengs. Ta vare ikke for å squash utarbeidelse. Hvis vevet er for myk, forlate sted noen tynne skilletegn i mellom lysbildet og dekkglassvæske på hjørnene (f.eks, bånd eller en ødelagt dekkglassvæske), et kammer som mellomrom mellom lysbildet og dekkglassvæske, slik at dekkglassvæske ikke knuse prøven.
  6. Plassere alle lysbildene i en fuktig boks, dekke det med aluminiumsfolie og plassere det på 4 ° C i minst 1 h. Fortsett å observere prøven ved hjelp widefield fluorescens eller AC confocal mikroskopi innen 24 timer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arabidopsis tilhører Brassicacea familie, bærer inflorescences med bifil blomster arrangert i en corymb (figur 1). Hver blomst har fire kronblader, fire petals, seks pollenbærere (fire lange og to korte) og en syncarpous gynoecium som består av to congenitally smeltet carpels (figur 1F-H) ordnet i fire konsentriske kranser25,26. Arabidopsis har tenuinucellate, anatropous ovules arrangert i parietal placentation i to rader (12-20 ovules i hver rad) i hver av de to locules av eggstokkene (totalt 45-80 ovules) (upubliserte data og referanser27, 28 , 29 , 30). for å foreta robust sammenlignende analyser av blomst og embryo utvikling innen en enkelt anlegg eller mellom forskjellige planter (som gjentak eller behandlinger), er det tilrådelig å bruke den første åpne blomsten som referanse (figur 1B). på dette stadiet, sitter (figur 1E) har vanligvis mellom 20 og 30 blomsterknopper omfatter alle stadier av utvikling blomst, og på omtrent like stadier i andre personer (upubliserte data). Flere blomst meristems (danne mellom 5 og 20 blomster) startet sitter meristem etter den første blomsten åpnet. De to første blomstene kan vise fruktbarhet defekter og derfor skal ikke inkluderes i analysen.

Fjerne Arabidopsis blomster og floral organer bruker chloral hydrat utføres clearing løsninger31,32, inkludert Herr's 4½ fjerne løsningen33, vanligvis for differensial forstyrrelser kontrast ( DIC) mikroskopiske analyser av blomst, silique og embryo utvikling (figur 3A-J). 4½ løsningen er spesielt anbefalt for analyse stamen utvikling og organer som krever sterkere clearing kapasitet. Noen chloral hydrat-baserte løsninger brukes dobbelt formål å fjerne og flekker samtidig; Dette gjelder for opprinnelige Alexanders34 og Herr's IKI-4½35,36 løsninger. Alexander flekker er mye brukt i Arabidopsis for å vurdere pollen abort. En modifisert og mer informative Alexander flekker prosedyren37 er stain hele anthers inneholder eldre pollen korn. Denne prosedyren krever en bakre clearing av anthers med Herr's 4½ løsning (Figur 3 K-L). Andre flekker teknikker som brukes i forskjellige plantearter kan gi en bedre estimering av pollen levedyktighet (f.eksfluorochromatic reaksjon med fluorescein diacetate, flekker for callose, stivelse, DNA, og RNA og enzymatiske tester med redoks fargestoffer)38,39,40. Men evaluere de fleste av disse teknikkene et bestemt aspekt av pollen korn som ikke kanskje nødvendigvis samsvarer med pollen levedyktighet og, viktigst, pollen fruktbarhet. En evaluering av pollen spiring evne og dens evne til å påvirke befruktning og sette frø kan være mer nøyaktig38-40. En mindre brukt fjerne flekker prosedyre er Herr's IKI-4½, som kombinerer clearing og stivelse flekker. Foruten flekker for stivelse (Figur 4), kan denne prosedyren brukes til generelle clearing formål når høyere kontrast er nødvendig (f.eks figur 3A, E).

En kombinasjon av auramine og calcofluor brukes i mange plante arter41 samtidig stain pollen exine og intine (figur 5A). De fleste av disse og andre kjemiske fargestoffer flekker ikke en enkelt mobilnettet komponent, og derfor bør brukes i kombinasjon med mer direkte merking teknikker som GUS eller fluorescently-merket merke linjer, antistoffer eller i situ hybridisering. De kan også vise flere eksitasjon og utslipp spectra. DAPI, derimot er mer spesifikt, og brukes vanligvis stain chromatin og kromosom sprer42 under meiose, og å følge pollen utvikling43, bortsett fra dens mangfoldige søknadene som en counterstain for kjernen. Her viser vi hvordan flekker intensiteten kan økes for å få en mer detaljert visning av chromatin av sæd og vegetative kjerner av mekanisk fjerning av exine (figur 5B-C). Selv om denne teknikken er svært nyttig for de som er interessert i å utføre detaljerte analyser av chromatin og kromosomene kjernefysiske struktur, kan mekanisk fjerning av exine påvirke organiseringen av pollen korn, slik at resultatene skal tolkes med forsiktighet.

De fleste av disse fluorescerende fargestoffer brukes uten tidligere lysning av vev; men i noen tilfeller de er kompatible med en bakre chloral hydrat-baserte fjerne på lysbildet44. SDS clearing har nylig blitt brukt som tømme reagenser i dyre- og plantelivet forskning og har vist seg å være kompatible med ulike flekker prosedyrer for widefield fluorescens og AC confocal mikroskopi (mPS-PI45 i planter og klarhet23, PAKTEN22 eller ACT-PRESTO24 i dyr). Bruker en SDS-NaOH fjerne før anilin blå flekker (figur 5 dH), klarte vi å oppnå høyere tilgjengelighet til interne vev samt en bedre flekker for callose i floral vev (figur 5I-L). Lignende resultater ble oppnådd for calcofluor (data ikke vist).

Figure 1
Figur 1: Bilder av Arabidopsis planter og blomster. (A-D) Arabidopsis planter på ulike stadier av livet syklus: rosett før bolting (A), på første blomst åpning (B), med primær og noen sekundær inflorescences (C), og på slutten av blomstrende (D). (E) de typiske corymb av en Arabidopsis sitter med blomster i ulike utviklingsstadier, modning acropetally. (F-H) En Arabidopsis blomst i anthesis, illustrerer self-pollination (stamen berøre stigma og slippe pollen korn). Tallene eh er fokus stabler av 36, 53, 42 og 32 bilder, henholdsvis sammen ved hjelp av en Programvareverktøyet (f.eksHelicon Focus). F-H representerer den samme blomsten der en sepal, to kronblader og en kort stamen ble fjernet i H. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: hvordan å dissekere en gynoecium og ovules. (1-3) sted gynoecium i et lysbilde med minimalt med 70% etanol og posisjon hender som avbildet i tegningen. Gjøre kutt 1-3 følgende instruksjonene angitt av den røde piler. Bruk nålen med åpningen vendt oppover og fra ovules for kutt 2-3. (4-6) rotere carpel 180 grader som vist, og kutt 4-6 som første tre kutt. (7) fjerne ventilene: bruke nålen med åpningen vendt nedover, plasser den under ovules og skyv nålen raskt til høyre langs ventil margen. For større carpels (anthesis og videre), eller med noen disseksjon kompetanse, kan man erstatte dette trinnet ved å gjenta trinn 2 og 5 på den andre siden av carpel. (8-9) fjerne stigma-stil og peduncle med skarp kutt bruker nålen med åpningen sidelengs og bort fra ovules. (10) gjør en skarp liten klipp på overføring vev nivå på en av de to ytterpunktene. (11) bruke pinsett og nålen for å rive i stykker de to halvdelene. (12) ved hjelp av tang og nålen, forsiktig bla én rad med ovules å få to parallelle rader. Alternativt sted to radene loddrett med replum ligger ovenfor og trykk forsiktig nedover langs replum å spre to ovule radene på begge sider. To flatet men fortsatt festet rader med ovules etter clearing og flekker med Herr's IKI-4½ løsning er vist som en illustrasjon av resultatet av dissection. Skalere barer = 80 µm Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: Chloral hydrat-baserte clearing med eller uten flekker under utvikling blomst. (A) A unge blomst knopp. (B-E) Stamen utvikling med microspore mor celler i cytokinesis (B), tetrads av microspores (C), pollen mitose jeg (D), og tricellular pollen korn (E). (F-J) Gynoecium som inneholder ovules med megaspore mor celler (pil) før meiose (F og G) og under meiotic prophase jeg (H), med en binuclear embryo sac (pil) (jeg), og ved befruktning (J). Merk spor av en pollen tube (pil) i micropylar-regionen i ovule i J. (K-L) Modifisert Alexander er farging av anthers med full (K) eller redusert pollen levedyktighet på grunn av varmestress (L). Note tom cytoplasma og irregulær form av avbrutt pollen korn i de annen locules i L. Arabidopsis vill-type Col-0 tilknytning. Fjerne eller flekker: Herr's 4½ for B-D og FJ, Herr's IKI-4½ for A og E, og endret Alexander flekker for K-L. Skalere barer = 10 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: stivelse dynamics under blomsten og tidlig frø utvikling. Representant resultater illustrerer dynamisk stivelse omsetningen under utvikling blomst. (A-C) Den tredje bølgen av stivelse amylogenesis/amylolysis under de siste fasene av stamen utvikling som nylig beskrevet39. (D-G) Representant resultatene av den unike stivelse bølgen i pollen korn med en topp på amylogenesis på bicellular scenen. (H-N) Representant resultatene av stivelse dynamikk i ovules på megaspore mor celle scenen (H), utvikle kvinnelige gametophytes (-K), og under tidlig frø utvikling (bare etter befruktning L, binucleate endosperm i M , og octant embryoet scene i N). Arabidopsis vill-type Col-0 tilknytning. Skalere barer = 20 µm. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: noen klassiske flekker prosedyrer for fluorescens mikroskopi og effekten av SDS-clearing. (A) Calcofluor-Auramine flekker under pollen modning hvor intine er farget blå (calcofluor) og exine intenst grønn (Auramine). (ABC) Mekanisk fjerning av exine og DAPI flekker tricellular pollen korn. (D-H) Representant bilder av en sitter før (D, som utvinnes fra bindemiddel) og etter SDS fjerne (Eh). Merk gjennomsiktigheten av vev som lar observasjon av blodkar sitter stilken (G) og blomst knopp peduncle (H). (-J) Anilin blå flekker for callose i microspores på tetrad scenen i stamen. Sammenligne klarhet og intensiteten av flekker mellom ikke-SDS ryddet anther (jeg) og SDS klarert anther (J). (K) en SDS klarert og anilinhud blå farget anther med microspores under pollen mitose I. Merk synkronisering av mange pollen korn på dette stadiet i disse to locules. (L) en SDS klarert og anilinhud blå farget ovule etter befruktning. Merk callose flekker i restene av pollen røret og frø jakke. Arabidopsis vill-type Col-0 tilknytning. Skala bar = 20 µm (-vekselstrøm,-L); 1 mm (D-H). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Eksistensen av mange blomsterknopper innenfor en enkelt sitter i Arabidopsis, som strekker seg over alle blomst utviklingsstadier, tilbyr en unik mulighet for studier karakterisere en effekt av en behandling eller en utviklingsmessige funksjon samtidig over de ulike stadiene av utvikling blomst. Et godt referansepunkt mellom ulike personlige planter er åpningen av den første blomsten av de viktigste sitter. Planter er behandlet slik at blomstrende er synkronisert som mulig (f.eks3-4 dager lagdeling på 4 ° C maksimerer synkron frø spiring og dermed jevnere blomstrende), og bare planter som åpner sin første blomsten på samme dag er tatt som en satsvis jobb til å distribuere mellom behandlinger og gjentak; bunker klar på påfølgende dager kan brukes til å replikere eksperimentet. Etter denne prosedyren, mer robust sammenlignende analyser, kontrollere for miljø- og utviklingsmessige variasjoner innenfor og mellom planter, kan utføres.

Kombinere Lugol flekk med Herr's clearing løsningen vi ikke bare å forbedre kontrasten i ryddet prøver i forhold til klassisk clearing løsninger, men også å karakterisere stivelse dynamics under blomsten og embryo utvikling, som nylig rapportert for Arabidopsis 46. bruker denne enkle fremgangsmåten, vi var i stand til løse eksistensen av en ny bølge av stivelse amylogenesis-amylolysis under annen utvikling, og å korrelere stivelse dynamics med globale endringer i uttrykket av gener koding proteiner involvert i sukker og stivelse metabolisme. Denne analysen viste at GPT6 er translocator av sukker-fosfat fra stoffer til amyloplasts for stivelse syntese. Den detaljerte resultatet på stivelse dynamikk i ulike vev åpner muligheten for karakteriserer andre viktige gener i stivelse metabolisme, og å håndtere uløste spørsmål om mindre studert men viktige stadier av anlegget utvikling. Jod-baserte stivelse flekker er ikke kvantitativ, og bør suppleres med andre metoder46.

Forskning på jakt etter bedre fjerne prosedyrer som er kompatible med fluorescens mikroskopi har intensivert de siste årene, spesielt i feltet dyr. Selv om feltet anlegget forskning er henger etter og fjerne i stor grad avhengig av tradisjonelle clearing løsninger for DIC analyse (f.ekschloral hydrat-baserte løsninger, benzyl benzoate, Dibutylftalat og methyl salicylate)31 ,33,47,48, oppmuntret av rask fremdriften i feltet dyr noen lignende teknikker dukker med urea - (f.eks, ClearSee49 og andre50), og 2, 2-thiodiethanol-baserte fjerne prosedyrer51,52. Her viser vi at bruk av SDS vaskemiddel i kombinasjon med NaOH gjengir vevet gjennomsiktig og forbedrer noen klassiske fluorescens flekker prosedyrer, for eksempel anilin blå for callose og calcofluor for cellulose. Basert på disse lovende resultater, kan lignende fremgang i SDS-baserte selektiv fjerning av lipider forventes i feltet anlegget i nær fremtid. Siden anlegget celler har stive cellevegger som er fraværende i dyreceller, den tidligere bygge i hydrogels kan ikke være nødvendig som er tilfelle for dyr vev. Andre fluorescerende fargestoffer og fluorophores brukes i genetisk merke linjer kan være assayed til å bruke denne clearing prosedyren.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av universitetet i Zurich, en IEF Marie Curie Grant (gi nei. TransEpigen-254797 til A.H.), en avansert tildeling av europeiske forskningsråd (gi nei. MEDEA-250358 til UG), og et forskning og teknologiutvikling prosjekt (grant MecanX til UG) fra SystemsX.ch, den sveitsiske initiativ i Systems Biology.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).

Tags

Utviklingspsykologi biologi problemet 134 Herr's clearing Høyers clearing SDS clearing Lugol jod flekker DAPI flekker anilin blå ovule utvikling pollen utvikling
Hele-mount Clearing og flekker av <em>Arabidopsis</em> blomst organer og Siliques
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hedhly, A., Vogler, H.,… More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter