Summary
このプロトコルでは、シロイヌナズナの花と siliques、いくつかの基本的な清算のテクニックの適切な解剖のためのテクニックの説明し、生殖構造の観察を全取り付ける染色を選択しました。
Abstract
分子遺伝学的研究の素晴らしいツールによるシロイヌナズナは植物生物学で、特に、植物生殖生物学の最も著名なモデル種の一つです。ただし、植物形態学的、解剖学的、および微細構造分析時間のかかる埋め込み、明視野、スキャン、および電子顕微鏡のための手続の区分を含む伝統的。最低限の処理のホール マウント標本に使用される分子技術の継続的な改良、新式の 3次元計算機援用微視的解析、共焦点蛍光顕微鏡の最近の進歩の需要の増加につながっています。効率的かつ最小限のサンプル処理技術を開発します。このプロトコルでは正しく解剖シロイヌナズナの花や siliques、基本的な技術をクリアするための手法について述べるとのいくつかの汚損プロシージャ全体マウント生殖構造の観察。
Introduction
花は最も重要な被子植物の器官を定義しています。顕花植物登場いくつかの 9000 万年前1、急速な外見だったチャールズ ・ ダーウィン2「忌まわしい謎」として記載されて、非常に高速の多様化。花の開発の植物研究者の関心は多様であります。いくつかの研究は、全体または花3,4,5,6 の特定の解剖学的、構造的・機能的特性の進化として花の進化的起源を理解することに焦点を当ててください。.フローラル フォームの構造と、それらに依存する性および無性生殖様式の高い変化は花に非常に複雑な構造を作る。これは遺伝学的および分子調査7と組み合わせることができる光と電子顕微鏡技術を使用して花の器官の解剖学と構造機能を特徴付けるため多様な活動につながっています。さらに果実や種子のソースとして、花は人間および動物栄養物のため非常に重要です。したがって、花とフルーツの開発の特性、応用研究、増え人口と変化する環境8下で生態系保全戦略のための食料安全保障を含む多くの影響,9,10。
シロイヌナズナの花の開発には花成誘導と花序 (花のグループ) の分裂組織に植物の分裂組織の変容が始まります。花原基は、花序メリステム11の側面に横方向に開始されます。花の器官原基の花の中心に外から同心円状の渦巻き状に徐々 に形し、がく片、花びら、雄しべ、心皮の7に最終的に開発。これらの花器を果たす個別栄養、保護、および機能 (例えば、送粉者魅力) オスとメスの配偶体、それぞれ12の発達を支える性的器官との異なる植物の役割,13配偶体、ターンでは、それぞれを区別する男性 (精子) のペアと雌性の配偶子 (卵と中央のセル) に結合する二重次世代、受精と一次胚乳を形成する受精ターミナル組織支援、。胚14,15の開発。果実や種子の開発は、成長、成熟および胚と、最終的には、その分散の保全をサポートします。シロイヌナズナ7,16,17モデル種を中心に、多様な植物の花と胚の開発を特徴付ける広範な研究を行った。
花の開発の初期の顕微鏡分析は時間のかかるサンプル加工、パラフィンまたは樹脂埋め込み断面などの手法は組み合わせて光または電子顕微鏡の観察に基づいていた。これらの伝統的な顕微鏡の技術は蛋白質の免疫検出の in situハイブリダイゼーションによる RNA の局在や突然変異体の顕微鏡分析などの分子遺伝の調査との組み合わせでよく使用されました。最新の 3次元コンピューター支援画像解析と最低限の処理のホール マウント標本で使用できる分子の方法の継続的な改良の広視野および共焦点蛍光顕微鏡の最近の進歩の必要性をもたらした優先的に定量分析に適している効率的かつ最小限のサンプル処理技術。近年、全体マウント動物標本のクリアリングの技術の開発の重要な進歩をしました。レンダリング サンプル透明水性尿素または砂糖ベースの試薬 (例えばスケール、SeeDB、立方体) を使用して18,19、20、または後の脂質 (洗剤 SDS を使用) の選択的除去安定したゲル; に試料を埋め込む脂質の除去をすることができます受動拡散によっていずれかを達成した (例えば、変更明確プロトコル21, 協定 PARS リム22) または電気泳動 (元明確プロトコル23と法律さきがけ24) によって積極的に。この高速の進歩に励まされて、いくつかの派生技術、プラント用も浮上しています。
シロイヌナズナのモデルに焦点を当てた本のメソッドで花蕾、花、そして若い siliques の適切な郭清と全体マウント多様な染色サンプルのクリアリングの手順と観察の手順について述べる古典的なまたは最近 SDS ベースのクリア方法。澱粉、カロース、クロマチン染色の例のとおりです。ただし、これらの手順は、使用すると他の種の適応の改善とさらに必要があります、彼らは多くの研究プロジェクトの出発点は、これらの単純ですが重要なメソッドのさらなる研究のための段階を設定いただければ幸いです。
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Protocol
1. 花と Silique 固定
- 収穫の花と植物から siliques 最初の花のオープニングで同期されます。
注: ここで使用される実験条件下で植物開花を開始土壌培地・培 (MS) 版の移植後約 21 日間。種子は 4 ° C で 3-4 日間の成層、発芽/暮れた 22 ° C/16 h 光と 18 ° C/8 時間で MS プレート上のもとに同じ条件 (図 1) 鍋で栄養豊富な土に苗を移植する前に、8 〜 10 日間。複製の数特定の研究の目的によって異なりますが、各治療のため (5 個体) から 5 花房の最小値をお勧めします。花は実験機である場合 10 花あたりの最小値をお勧めします。 - 花序または花 (図 1E-H) (例えば爪のはさみ) 小さいはさみを使って切り取り、(単一の花序/花固定) の微量遠心チューブまたは (の集団注視) 円錐管ですぐにそれらを配置新鮮なを含む製カルノワのやメタノール/酢酸 FPA50 定着剤 (アプリケーションによっては、下記参照) 氷の上。
注: のサンプルは、固定液で完全に水没する必要があります。 - 4 ° C で一晩に 4 h 用定着剤内の組織を残す
注: 真空浸透を組織に定着剤の浸透をスピードアップするため使用できますが、これは、組織の構造を維持する有害かもしれない。著者は、真空浸潤を実装しないでください。 - 定着剤を削除、サンプルをカバーする十分な 70% エタノールを追加し、少なくとも 24 時間; 4 ° C にそれらを返すサンプルは、このソリューションに無期限に滞在できます。エタノールを除去した後すぐに次のステップに進んでください。郭清、または SDS クリア。
2、実体顕微鏡下で解剖
- 入れて 70% エタノールを支える小さなシャーレ上に配置の時計メーカーのガラスで作られて。
-
場所この花房/花/silique は、定着剤をたてさせ、鉗子、注射器の針を用いた顕微鏡下で解剖。
- 時計メーカーのガラスまたはサンプル (がく片、花弁、雄しべはこの段階で切り裂かれる成熟した花の花器を離れて引き裂く、花序の解剖のためのエタノール (推奨) で完全にカバーすることができる同様のデバイスを使用して、) 乾燥のサンプルのリスクを回避します。
-
以下の説明に従って siliques およびスライドの小さなつぼみを解剖します。
- 処理済みサンプルの時計メーカーのガラスはさておき、最終的な郭清のため通常のスライドを使用します。
- スライドに興味のサンプルを移動し、新鮮な 70% エタノールを 10 μ l 添加します。最終的な郭清の迅速作業、サンプルの余分な液体ことがなく潤いを保つには、必要に応じて、エタノールの 10 μ L を追加します。
- おしべから花粉を解放する, ステップ 5.1 を参照してください。心皮および胚珠を解剖の図 2で説明されている手順に従います。この手順は、緑の siliques の開発の段階を含む、心皮の開発のすべての段階に適用されます。
注: は、サンプルの内容を移動から十分なエタノールのキャリー オーバーがある場合、エタノールを追加しないでください。非常に小さいサンプルを解剖は、液体の最小限の量ではるかに簡単です。スライドに関心 (がく片、花びら、雄しべ、心皮、胚珠、種子、または花粉) の器官だけを常に保ちます。この手順はスライドと高い均一性とこうして顕微鏡検査 (対象の標本のより高い数のための効率の結果、審査機関の厚さに対応する coverslip の一様な厚さを確保します。同じ焦点面)。
- 吸収し、可能な限りできるだけ多くのエタノールを削除するあぶらとり紙の小片を使用します。すぐにうちサンプル乾く前に (セクション 3、4、または 6) の次のステップに進みます。
3. 決済抱水クロラールと組み合わせたクリア染色
注: FPA50 材料を固定抱水クロラール ベース クリアするため最高の結果が得られました。
- クリア ソリューションの場所 20 μ L (抱水クロラール/グリセリン、変更 Hoyer の中、君の 4 または君の壱岐 4 ソリューション) 標本ベアリング スライドに。必要に応じて、それらの間のスペースを減らすことおよびそれらを反転、標本の位置皮下針と注射器のペアを使用して興味のオルガンが下向き。針を使って残りの空気の泡を削除します。
- 横の coverslip を下げると優しく非常に優しくを押すと、それを配置し、クリア ソリューションの間の隙間が埋まるまで待ちます。Coverslip の下で全体のスペースを埋めるために、必要な場合は、最小限のクリア ソリューションを追加します。
- スライド ホルダーにスライドを配置し、ヒューム フードの下でそれを残します。少なくとも 4 時間後、次の 4-5 日間顕微鏡による観察に進みます。
4. 結合染色アレクサンダーと葯の君の 4 クリア
注: 元のアレクサンダー ・ プロトコルは、染色する前にスライドの花粉を解放に基づいています。効率的でより有益な変更アレクサンダー染色し、プロシージャをクリアは成熟しているが非裂開葯内花粉粒の染色します。
- 非裂開葯を開こうとして新鮮な収穫の花蕾を選択します。
メモ: は、染色アレクサンダーは成熟した花粉を対象として、未熟花粉を効率的に染色されませんので若い花蕾になりません。別の植物と花序から収穫される治療あたり 5 花の最小値をお勧めします。 - 花のつぼみが水没する十分なアレキサンダーのソリューションと 96 ウェルのプレートを準備します。萼片と花弁を削除することによって葯を公開し、それらをアレキサンダーの溶液に浸します。1-3 h のヒューム フードの下でサンプルを保ちます。
- 君の 4 ソリューションとアレキサンダーのソリューションを交換し、一晩インキュベートの発煙のフードの下に戻ってウェル プレートを配置します。
- 鉗子を使用して、優しくクリアの花のつぼみを新しいスライドを移動します。アレキサンダーのソリューションのいくつかのキャリー オーバーが発生するため、可能な限りクリア ソリューションを削除するのにあぶらとり紙を使用します。
- 雄しべを解剖し、他のすべての組織を削除します。君の 4 ソリューションを使用して 3 のセクションで手順に従います。
5. 花粉から性物質が外殻を除去
注: DAPI 染色のカルノワの定着剤の使用をお勧めします。
- セクション 1 と 2 で固定と郭清の手順に従ってください。今では、1 つは、スライド内の 70% のエタノールの最小量の多くの雄蘂、一つをしてください。
- あぶらとり紙を使用して余分なエタノールを削除、DAPI 溶液の 5-10 μ L を追加します。針と注射器のいくつかを使用して、その少量の溶液 (例えばおしべと花粉を解放する他の固定化使用 1 つの注射器) の内で花粉を解放します。ソリューションが乾く場合は、DAPI の別の 5 μ L を追加します。
- 花粉粒のみがスライドと、coverslip の間残っていることなど重要なステップは、おしべのすべての残骸を削除します。
- 片軸受スライドの横にそれを下げることによって観察を配置し、最小限のスペースを埋めるために必要な DAPI ソリューションを追加します。上、人差し指を置きも退治することがなく多くが手っ取り早く、しっかりと短い滑り運動。
注: 必要な力と滑り運動の振幅を測定するには、このステップべきでは数回、たびに顕微鏡下で結果を確認します。 - DAPI ソリューションを必要な場合に追加し、1 h ワイド フィールド蛍光や 24 時間以内の共焦点顕微鏡下その場観察に進みます 4 ° C 15 分で暗闇の中で湿気のあるボックスでスライドかどうか、さらにチェックをクリア SDS とこの手順を結合する場所を向上させるメンツが得られます。
6. ナトリウム Dodecyl 硫酸塩 (SDS) をクリア
注: によって分析される花器と非常に柔らかく、小さな検体を分析する研究者のスキル、SDS の処置でも行えます (経験者) の前にいずれかまたは解剖手順 (少ない経験の後研究者) メタノール酢酸酸材料を固定します。
- 時計メーカーのガラス、凹面のスライド、または微量遠心チューブを使用して、1 %sds と室温で一晩 0.2 N 水酸化ナトリウム溶液中または非解剖解剖サンプルをインキュベートします。
- サンプルは非常に柔らかい透明な外観をしているので取り扱いに注意。数回を水ですすいでください。
注: SDS ソリューションの残党は、染色液、例えば、アニリン ブルーを追加するとき析出する可能性があります。 - 非解剖サンプルのセクション 2、70% エタノールではなく水を使用で説明した解剖手順に従います。目的の組織を解剖後残党と、破片、あぶらとり紙で、余分な水分を削除する染色液の 20-40 μ L を追加し、6.5 の手順に進みます。
- 切り裂かれたサンプルには、慎重に洗浄液からサンプルを移動しきれいなスライドに配置、染色液の 20-40 μ L を追加します。
- スライドの横にそれを下げることによって観察をそっと置きます。準備をスカッシュに注意してください。組織が柔らかすぎる場合は、いずれかの薄いスライドと (例えば、テープまたは壊れた coverslip)、その四隅に coverslip の間の区切り記号の場所は、coverslip 試料を粉砕しないように、スライドと観察の間商工会議所のようなスペースを残してください。
- 湿気の多いボックス内のすべてのスライドに配置、アルミ箔でカバーし、少なくとも 1 h. 広視野蛍光または 24 h 内共焦点の顕微鏡を使用して標本の観察に進みます 4 ° C で置きます。
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Representative Results
シロイヌナズナは花序 (図 1) に配置された両性花で花序を軸受、Brassicacea 家族に属しています。それぞれの花は 4 がく片、花びら、(4 つの長いおよび 2 つの短い)、六つの雄しべ、4 つの同心円状の渦巻き25,26で配置 2 先天性融合心皮 (図 1 階H) から成る syncarpous 雌ずい。シロイヌナズナは tenuinucellate、それぞれ卵巣 (45-80 胚珠の合計) の 2 つの locules の 2 つの行 (各行の 12-20 胚珠) 頭頂の胎盤に配置された倒胚珠 (未発表データおよび参照27,28,29,30). 花及び胚発育個体内または (レプリケートまたは治療) として別の植物間の堅牢な比較解析を実施するためにそれは非常に最初の開いている花を (図の参照として使用することをお勧め1 b). この段階で花序 (図 1E) は通常 20 〜 30 花芽、花の発育とほぼ同じ時期他の個人 (未発表データ) のすべての段階にわたる間が。最初の花を開いた後、花序メリステムによるより花分裂 (5 と 20 の花の間を形成) が開始されます。最初の 2 つの花は、不妊治療の欠陥を示す場合があり、したがって、分析する必要があります含まれません。
シロイヌナズナの花と花器抱水クロラールによるクリア クリア ソリューション31,32, 君の 4 ソリューション33をクリアを含む一般に対して実行される微分干渉コントラスト (DIC) の花、silique、および胚の開発 (図 3 aJ) の微視的解析。雄ずい、分析やより強力な消去能力を必要とする臓器、特に 4 ソリューション勧めします。クリアと同時に染色の二重目的のため使用されるいくつかの抱水クロラール ・ ベースのソリューションこれは、元のアレキサンダーの34と君の壱岐 435,36ソリューションの場合です。染色アレクサンダーは、花粉を評価するシロイヌナズナで使用されています。染色の手順37変更およびより有益なアレキサンダーは成熟した花粉を含む全体の葯を汚すことです。この手順には、君の 4 ソリューション (図 3 KL) を使用して葯の事後清算が必要です。別の植物種で使用される他の染色技術は花粉性 (例えばフルオレセイン ・ ジアセテート、カロース、澱粉、DNA と RNA および酵素を用いて染色を用いた fluorochromatic 反応のより良い推定を提供するかもしれない酸化還元色素)38,,3940。しかし、これらの技術のほとんどは、花粉と、重要なは, 花粉稔性は必ずしもないかもしれない花粉粒の特定の側面を評価します。正確な38-40花粉発芽能力の評価と効果の受精と種子を設定する能力があります。はるかに少ない使用のクリア汚損プロシージャは君の壱岐-4、消去および澱粉染色ソリューションを組み合わせたです。デンプン (図 4) の染色、ほかより高いコントラストが必要 (例えば図 3 a, E) 一般的なクリア目的のためこの手順を使用できます。
多くの植物種41オーラミンとでの組み合わせを使用して、花粉, 外壁模様と内壁 (図 5 a) を同時に染色します。これらのほとんどとその他の化学染料は単一細胞成分を染色しないし、それゆえ、ガスまたはタグ付きの蛍光マーカー ライン、抗体やin situハイブリダイゼーションなどより直接ラベリング技術との組み合わせで使用する必要があります。彼らはまた複数の励起・発光スペクトルを表示可能性があります。DAPI、対照的より具体的、減数分裂では、クロマチンと染色体のスプレッド42を染色して花粉開発43, 核の対比染色として、多種多様なアプリケーションとは別に、通常使用されます。ここでは、機械的に, 外壁模様 (図 5 b・ C) を削除することによって精子の栄養核クロマチンの詳細なビューを取得するどのように染色強度を増やすことができますを示す.その結果であるべき性物質が外殻の機械的な除去可能性があります花粉粒の組織に影響を与えるこの手法はクロマチン ・染色体・核構造の詳細な解析を実行することに興味のある方にとってとても役立ちますが、注意して解釈されます。
これらの蛍光染料のほとんどは、組織の事前清算せず使用されます。しかし、いくつかのケースで彼らは抱水クロラール ベース スライド44クリア後と互換性が。SDS をクリア最近の動物および植物の研究試薬をクリアとして使用されています、広視野蛍光と共焦点顕微鏡 (mPS PI45植物、および明快さ23、さまざまな染色手順に対応するが示されています。協定22または動物の行為-さきがけ24 )。SDS NaOH のアニリン ブルー染色 (図 5-H) 前にクリアを使用すると、花の組織 (図 5IL) 内のカロースの良い染色し同様、内部の組織に高いアクセシビリティを達成するためにできた。同様の結果得られたカルコフ (データは示されていない)。
図 1:シロイヌナズナの植物や花の写真です。(A ~ D)ライフ サイクルのさまざまな段階でのシロイヌナズナ植物: ロゼット (A) ボルトで固定する前に、プライマリといくつかの花序 (C) 最初の花開院 (B)、および開花の終わりに (D)。頂に成熟、さまざまな発達段階で花を (E)、シロイヌナズナの典型的な花序の花序。(F H)開花、受粉 (雄しべ汚名を触れると花粉を解放) を示すシロイヌナズナの花。図 E Hそれぞれ 36、53、42、および 32 の写真の焦点スタックで (例えば、ヘリコン フォーカス) のソフトウェア ツールを使用して組み立ています。F Hを表す 1 つのがく片、二つの花びら、雄しべは短いがHで削除された同じ花。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: 雌ずいと胚珠を分析する方法です。(1-3) 70% のエタノールおよび位置の最小量を持つスライドの雌ずいの場所手として、図面に描かれています。確認は、1-3 次の赤い矢印で示された方向をカットします。上方とカット 2-3 の胚珠から離れて直面しているオープニングと針を使用します。(4-6) 心皮 180 度を回転させるように、最初の 3 つの切り傷のようなカット 4-6.(7) バルブの取り外し: 開口部を下向きで針を使用、胚珠、下に配置、弁縁に沿って右に針をすばやくスライドします。大きな心皮の (開花以降)、またはいくつかの郭清の専門知識を持つ 1 つは、心皮の反対側の 2 と 5 の手順を繰り返して、この手順を置き換えることができます。(8-9) 汚名スタイルとシャープ花柄カット横と胚珠から離れて開業と針を使用して削除します。2 つの極端の 1 つのレベル送信組織で作る小さなシャープ (10) を切った。(11) ピンセットと針を使用して、2 つの半分をバラバラにします。(12) 2 つの並列の行を取得する胚珠の 1 つの行を反転鉗子と針を使用してゆっくり。また、replum の上横になっていると 2 つの行に縦置きし、どちら側でも 2 つの胚珠行を広めるため、replum に沿って軽く下方にプッシュします。2 つの平坦化がまだ胚珠の行後関連付けクリアと君の壱岐 4 溶液で染色が解剖の結果の例として表示されます。スケール バー 80 μ m =この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 抱水クロラール ベース クリア花開発時に染色の有無と。(A) A 若い花芽。(B E)雄ずい胞子母細胞細胞質分裂 (B)、小胞子 (C) 花粉有糸分裂のテトラッド 1 (D) と tricellular 花粉 (E)。(F J)雌ずいのう母細胞 (矢印) 減数分裂 (FおよびG) 前と減数分裂前期の胚珠を含んでいる私 (H)、複核胚嚢 (私)、(矢印) と受精 (J)。Jの胚珠の珠の領域内での花粉管 (矢印) のトレースに注意してください。(K L)変更されたアレキサンダー (K) と葯の染色または熱応力 (L) による花粉生存率を減少します。空の細胞質とL. シロイヌナズナ野生型 Col 0 加盟で葯 locules 内で中止された花粉の不規則な形状に注意してください。クリアまたは染色: B DとF J君の君の 4 AとE壱岐 4、アレクサンダー K Lの染色を変更します。スケール バー = 10 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: 花の中に早期の澱粉ダイナミクス種子開発。花の開発の間に動的な澱粉の転換を示す代表的な結果。(A ~ C)雄しべは開発の最後の段階で澱粉 amylogenesis/amylolysis の第三の波は、最近39を説明します。(D G)Bicellular の段階で amylogenesis のピークを持つ花粉粒におけるユニークな澱粉波の代表の結果。(H ・ N)のう母細胞段階 (H)、雌性配偶体 (-K) の開発と ( L, M 嬢胚乳の受精の直後に初期シード開発中で胚珠の澱粉ダイナミクスの代表の結果、およびN八分胚段階で)。シロイヌナズナ野生型 Col 0 加盟。スケール バー = 20 μ m.この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: いくつかの古典的な染色蛍光顕微鏡と SDS クリアリングの効果。(A) で-オーラミン、内壁は青いステンド グラス花粉成熟に伴う染色 (で) と, 外壁模様激しく緑 (オーラミン)。(B ・ C)機械的に除去, 外壁模様、DAPI 染色 tricellular 花粉。(D H)(D、定着剤から回復したと) 前に花房の代表的な写真と SDS (E H) をクリアした後。(G) 花房内の茎と花蕾柄 (H) 内にある血管の観察を可能にする組織の透明性に注意してください。(-J)アニリン ブルーが小胞子のカロースおしべ内四段階で染色します。明快さとの間の染色の強さ比較非 SDS (私) 葯と SDS クリア葯 (J) をオフにします。花粉有糸分裂 I. 中に小胞子と (K) の SDS クリアとアニリン青染色葯は、これらの 2 つの locules のこの段階で多くの花粉の同調を注意してください。(L) の SDS をクリアし、アニリン ブルーは、受精後胚珠を染色しました。カロース花粉管のままでは種皮を染色に注意してください。シロイヌナズナ野生型 Col 0 加盟。スケール バー = 20 μ m (A ~ C-L);1 mm (D ・ H)。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
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Discussion
シロイヌナズナ、すべて花の発達段階にまたがる単一の花序内の多くの花蕾の存在が治療や発達機能の効果を特徴を目指した研究のユニークな機会を提供しています花の開発のさまざまな段階で同時に異なる個体間の良好な基準点は主要な花序の最初の花の開いています。植物が開花が同期されているような方法で扱われる可能な (例えば、4 ° C で最大同期種子の発芽およびそれ故によりも開花 3 – 4 日) と同じ日に彼らの最初の花を開く植物のみが同じくらいトリートメントや複製; 間に配布するバッチとして撮影バッチ連続した日の準備ができては、実験を再現する使用できます。次のこの手順より堅牢な比較分析、環境と開発のバリエーション内と植物間の制御を実行できます。
最近の報告クラシック クリア ソリューションと比較してクリアのサンプルのコントラストを改善するのみならず、花と胚の開発の間にデンプンのダイナミクスを特徴付けることができました君のクリア ソリューションとルゴール染色を組み合わせて、シロイヌナズナ46. この簡単な手順を使用して、ことができました, 葯の発達中に澱粉 amylogenesis-amylolysis の新しい波の存在を解明し、グローバル関与する蛋白質を符号化する遺伝子の発現変化と澱粉ダイナミクスの相関砂糖とデンプン代謝。この分析は、GPT6 がアミロプ デンプンの合成のために細胞質から糖-リン酸の形質であることを示した。様々 な組織の澱粉動態に関する詳細な結果は、デンプン代謝、植物開発の少ない調査が重要な段階をに関する未解決の質問に対処する他の重要な遺伝子を特性化の可能性を開きます。デンプンのヨウ素系染色定量的ではなく、他の方法46で補完する必要があります。
動物の分野を中心に最後の年にわたって激化している研究を探して決済蛍光顕微鏡と互換性のある処理を改善します。植物研究の分野が遅れているし、DIC の分析 (例えば、抱水クロラール ベースのソリューション、安息香酸ベンジル、フタル酸ジブチル、サリチル酸メチル) の伝統的な決済ソリューションに依存している主にクリアが31 、33,47,48, 動物のフィールドでなされる高速の進歩に励まされいくつかの同様の技術を使用して新興が尿素 - (例えば、ClearSee49その他50)、と2, 2'-thiodiethanol ベースの手順51,52をクリアします。ここでは、NaOH との組み合わせで SDS 洗剤の使用組織を透明にレンダリングし、染色法、アニリン青カロースとセルロースのカルコフなどいくつかの古典的な蛍光を示します。これらの有望な結果に基づいて、脂質の SDS ベースの選択的な除去の進展が期待できるプラント分野で近い将来に。植物細胞は、欠席している剛の細胞壁を持っているので動物細胞における事前のヒドロゲルに埋め込みする必要はありません、動物組織の場合と同様です。他の蛍光染料と同時遺伝マーカー ラインで使用されるこのクリアリングの手順を使用して試金があります。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作品はチューリッヒ大学 IEF マリー キュリーの助成金によって支えられた (付与なし。A. h. に TransEpigen-254797)、欧州研究評議会の高度な許可 (許可なし。U. g. に MEDEA-250358)、および SystemsX.ch、システム生物学のスイスの取り組みから研究・技術開発のプロジェクト (u. g. に MecanX グラント)。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
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