Summary
В этом протоколе мы описывают методы для надлежащего вскрытия Arabidopsis цветов и siliques, некоторые методы расчистки основных и выбрали пятнать процедуры для наблюдений в целом гора репродуктивных структур.
Abstract
Благодаря своей грозной инструменты для молекулярно-генетические исследования Arabidopsis thaliana является одним из наиболее известных видов модели в биологии растений и, особенно, репродуктивной биологии растений. Однако завод морфологических, анатомические и ультраструктурные анализ традиционно включает длительным встраивание и секционирование процедуры светлые области, сканирование и электронной микроскопии. Недавний прогресс в конфокальных флуоресцентной микроскопии, 3-D-искусство автоматизированного микроскопические анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов для использования на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к увеличению спроса на Разработка эффективных и минимальный пример методов обработки. В этом протоколе мы описываем методы для правильно рассечения Arabidopsis цветы и siliques, основной очистки методы, и некоторые окрашивание процедур для всего гора наблюдений репродуктивных структур.
Introduction
Цветы одним из наиболее важных определение органов покрытосеменных растений. Цветковых растений появились около 90-130 миллионов лет назад1и диверсифицированной так быстро, что их быстрое появление был описан как «ужасные тайны» Чарльза Дарвина2. Разнообразны интересы завода исследователей в цветок развития. Некоторые исследования были направлены на понимание эволюционного происхождения цветок в целом, или эволюция определенных анатомических, структурных и функциональных свойств цветы3,4,5,6 . Высокая вариация в цветочные формы и структуры, а также виды сексуального и бесполого размножения, опираясь на них, сделать цветок очень сложную структуру. Это привело к разнообразные усилия для характеризуют анатомии и структурные особенности цветочные органов, используя свет и электрон микроскопические методы, которые можно было бы объединить с генетические и молекулярные исследования7. Кроме того, как источник плоды и семена Цветки имеют первостепенное значение для человека и животных питания. Таким образом характеристика развития цветка и плода имеет множество последствий для прикладных исследований, в том числе продовольственной безопасности растущего населения и сохранения экологических стратегий в рамках меняющейся окружающей среды8 , 9 , 10.
Цветок развития в проростках Arabidopsis начинается с цветок индукции и преобразование вегетативного Меристемы на Меристемы соцветия (группа цветов). Цветок Примордия инициируются боково на фланге соцветия Меристемы11. Примордия цветочные орган постепенно формируют концентрические мутовках от снаружи к центру цветка и в конечном итоге превратиться в7чашелистики, лепестки, тычинки и плодолистиков. Эти цветочные органов выполнять собственный питательная, защитных и функциональных (например, привлечение опылителей) ролей в различных видов растений, с половыми органами, устойчивого развития мужских и женских gametophytes, соответственно12 , 13. gametophytes, в свою очередь, каждый дифференцировать пару мужчин (спермы) и женские гаметы (яйца и центральная ячейка), которые объединяют по двойной оплодотворения в форме следующего поколения, зиготы и основной эндосперма, поддержка терминалов ткани развитие эмбриона14,15. Плоды и семена развития поддержки роста, созревания и сохранение эмбриона и, в конечном счете, ее разгон. Обширные исследования была выполнена характеризовать цветок и развития эмбриона в видов различных растений, особенно в модели вида Arabidopsis7,16,17.
Ранние микроскопические анализы цветок развития были основаны на времени пример обработки и наблюдения, что методы, такие как парафин или встраивание смолы и секционирование, в сочетании с легкими или электронной микроскопии. Эти традиционные микроскопические методы были часто используется в сочетании с молекулярные генетические исследования, такие как микроскопические анализы мутантов, локализация РНК путем в situ гибридизация или иммуно обнаружение белков. Недавний прогресс в-поля и конфокальный флуоресцентной микроскопии, в состояние искусства трехмерного компьютерного изображения анализы и непрерывное совершенствование молекулярных методов, которые могут быть использованы на минимально обработанных образцов состава Гора, привело к необходимости методы обработки образца эффективной и минимальным, которые поддаются преференциально количественного анализа. В последние годы был достигнут значительный прогресс в развитии методов очистки на целом гора животных образца. Они транспарентности образца либо с помощью водного раствора мочевины - или на основе сахара реагенты (например, масштаб, SeeDB, КУБИЧЕСКИЙ)18,19,20, или выборочно удалить липидов (с использованием моющего средства SDS) после Встраивание образцов в стабильных гидрогели; удаление липидов может быть достигнуто либо путем пассивной диффузии (например, изменение ЯСНОСТИ протокол21, Пакт-ПАРС-колеса22) или активно электрофорезом (оригинал ЯСНОСТИ протокол23 и акт-вуаля24). Воодушевленные этой быстрый прогресс, некоторые производные методы появляются также для использования в растениях.
В этом документе методы сосредоточены на модели Arabidopsisмы описываем порядок надлежащего вскрытия бутонов, цветов, и молодые siliques и очистки всего гора образцов для разнообразной окраски и процедуры наблюдения с помощью Классическая или недавно метод очистки на базе ИКБ. Даны примеры крахмал, callose и окрашивание хроматина. Хотя эти процедуры может понадобиться дальнейшего улучшения и адаптации при использовании с другими видами, мы надеемся, что они будут почву для дальнейших исследований на этих простых, но важных методов, которые являются отправной точкой многих научно-исследовательских проектов.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. цветок и стручок фиксации
- На открытии первого цветка синхронизации урожай цветы и siliques из растений.
Примечание: В экспериментальных условиях использовали здесь, растения начинают цветение около 21 дней после пересадки от плиты фотосинтетическую и Скуг (МС) в почву. Семена, стратифицированная по 3 – 4 дня при температуре 4 ° C и проросшие/выращенных на MS пластинки в свет 16 h/22 ° C и 18 ° C/8 h темный для 8-10 дней, до высадки рассаду на богатые питательными веществами почвы в горшках, хранится на тех же условиях (рис. 1). Количество реплицирует зависит от цели конкретных исследований, но минимум 5 соцветия (от 5 отдельных растений) для каждого лечения рекомендуется. Если цветы экспериментальное подразделение, рекомендуется минимум 10 цветов на репликацию. - Срезанные соцветия или цветы (Рисунок 1E-H), используя маленькие ножницы (например, ножницы для ногтей) и поместите их непосредственно в пробки microcentrifuge (для фиксации соцветия/цветок) или конической трубки (для коллективного записей) содержащие свежезаваренным сделал Карнуа 's, метанол/уксусной кислоты или FPA50 фиксаторы (в зависимости от приложения, см. ниже) на льду.
Примечание: Образцы необходимо полностью погружать в фиксатором. - Оставьте ткань внутри фиксатором для 4 h на ночь при 4 ° C.
Примечание: Инфильтрации вакуум может быть использован для ускорения проникновения фиксатором в ткани, но это может быть пагубным для сохранения структуры ткани. Авторы не реализуют вакуумные инфильтрации. - Снимите фиксатор, добавить достаточно 70% этанола для покрытия образцы и вернуть их до 4 ° C в течение 24 часов; образцы могут бесконечно оставаться в этом решении. После удаления этанола, немедленно приступить к следующему шагу; рассечение или SDS очистки.
2. диссекция под стереомикроскопом
- Положите свежеприготовленные 70% этанола в часы чайник стекла, помещаемых на небольшой Петри для поддержки.
-
Соцветие/цветок/стручок на этом свежезаваренным сделал фиксатором и вскрыть под стереомикроскопом, с помощью щипцов и шприц с иглой.
- Используйте часы maker стекла или подобное устройство, которое позволяет образцов быть полностью покрыты с этанолом (рекомендуется) для рассечения соцветия и разрывает цветочные органов Зрелые цветы (чашелистики, лепестки и тычинки могут быть расчленены на данном этапе ) чтобы избежать риска высыхания образцов.
-
Вскрыть siliques и небольшие бутоны на слайде, как описано ниже.
- Отложил часы чайник стекла с предварительно обработанные образцы и использовать обычный слайд для окончательного вскрытия.
- Переместите образец интерес к слайду и 10 мкл свежие на 70% спирте. Быстро работать на окончательный диссекции и 10 мкл этанола, при необходимости сохранить образец влажные без чрезмерной жидкости.
- Для выпуска зерна пыльцы из тычинок, смотрите шаг 5.1. Для рассечения плодолистиков и яйцеклеток, выполните процедуру, описанную на рисунке 2. Эта процедура применима ко всем этапам развития пестика, в том числе на стадии разработки зеленый siliques.
Примечание: Не добавлять этанола, если есть достаточно этанола перенос перемещение образцов; Пройдя через очень небольшие образцы намного проще в минимальное количество жидкости. Всегда держите только органы интерес (чашелистики, лепестки, тычинки, плодолистиков, яйцеклеток, семян или зерна пыльцы) на слайде. Эта процедура позволит обеспечить равномерную толщину между слайд и coverslip, соответствующий толщине органа под экспертизы, что приводит к более высокой однородности и таким образом эффективности микроскопических экзаменов (большее число целевых образцов в одной фокальной плоскости).
- Поглощать и удалить столько этанол как можно используйте небольшой кусок промокательной бумаги. Быстро переходите к следующему шагу (раздел 3, 4 или 6) перед образца сушит вне.
3. на основе хлораль гидрата клиринга и комбинированных информационно окрашивание
Примечание: Наилучшие результаты для очистки на основе хлораль гидрата получаются с фиксированной материала FPA50.
- Место 20 мкл очистки раствора (хлораль гидрата/глицерина, изменение Хойер средний, Herr в 4½ или Герр ИКИ-4½ решения) на слайде образца подшипника. С помощью пары шприцев с гиподермального иглы, поместите образцы, сокращения пространства между ними и листать те где орган интерес сталкивается вниз. Удалите любые оставшиеся пузырьков воздуха с помощью иглы.
- Нижняя coverslip боком и осторожно поместите его, нажав очень осторожно и подождать до тех пор, пока решение очистки заполняет пространство между ними. Добавьте решение минимальная очистка, если необходимо, чтобы заполнить все пространство под coverslip.
- Поместите слайд слайд держатель и оставить его под зонт. Перейти к микроскопические наблюдения после по крайней мере 4 ч и в течение следующих 4-5 дней.
4. Сводные Александр окрашивание и Герр в 4½ очистки пыльники
Примечание: Оригинальный Александр протокол основан на выпуск зерна пыльцы на слайде до окрашивания. Эффективной и более информативным, изменение Александр, окрашивание и очистки процедура является окрашивание зрелого зерна пыльцы в зрелый, но не вскрывающийся пыльники.
- Выберите свежеубранных бутоны, которые вы собираетесь открыть с не вскрывающийся пыльники.
Примечание: Не принимать маленьких бутонов, потому что Александр пятнать предназначен для зрелого зерна пыльцы и эффективно не испачкать Незрелые зерна пыльцы. Рекомендуется минимум 5 цветов за лечение, собирают из различных растений и соцветия. - Подготовьте 96-луночных плита с достаточно Александр решение погрузиться бутон цветка. Подвергать пыльники, удалив чашелистиков и лепестков и погрузить их в растворе Александра. Храните образцы под зонт для 1-3 ч.
- Замените Герр в 4½ решения Александра решение и место несколькими хорошо пластины обратно под зонт для ночи инкубации.
- С помощью щипцов, осторожно перемещайте очищается бутоны на новый слайд. Поскольку могут возникнуть некоторые вынос Александра решения, используйте промокательную бумагу для удаления столько очистки решения как можно скорее.
- Вскрыть тычинок и удалите все другие ткани. Следуйте инструкциям в разделе 3, с помощью Герр в 4½ решения.
5. Удаление Экзина из пыльцы
Примечание: Мы рекомендуем использовать Карнуа с фиксатором для окрашивания DAPI.
- Выполните фиксацию и рассечение процедуры, описанные в разделах 1 и 2. В настоящее время необходимо иметь один для много тычинок на слайде в течение минимум на 70% спирте.
- Для удаления избыточных этанола использовать промокательной бумаги и 5 – 10 мкл раствора DAPI. Используя пару шприцы с иглами, выпуск зерна пыльцы в пределах этого небольшое количество раствора (например, использовать один шприц для иммобилизации тычинки и других, чтобы освободить зерна пыльцы). Если раствор высыхает, добавьте еще 5 мкл DAPI.
- Удаление всех мусора тычинка является важным шагом, таким образом, что только пыльца зерна остаются между слайд и coverslip.
- Место coverslip на слайде образца подшипник, опустив ее в сторону и добавить минимальное количество DAPI решения, необходимые для заполнения пространства. Поместите указательный палец на coverslip, и без давя слишком много сделать быстро, фирмы и короткие скользящие движения.
Примечание: Чтобы оценить необходимую силу и амплитуда скользящие движения, этот шаг следует практиковать несколько раз, проверка результатов каждый раз под микроскопом. - При необходимости добавьте DAPI решение и место слайда в коробке влажный в темноте при температуре 4 ° C 15 мин до 1 ч. Продолжайте наблюдать за образцы под-поля флуоресценции или confocal микроскопии в течение 24 ч. попытаться объединить эту процедуру с SDS, очистка проверить ли дальнейшие улучшения ments могут быть получены.
6. лаурилсульфат натрия (SDS) очистка
Примечание: В зависимости от цветочные орган для анализа и исследователь навыки, чтобы вскрыть очень мягкий и малых образцов, SDS лечение может осуществляться либо перед (для опытных исследователей) или после вскрытия шаг (для менее опытных исследователи) на метанол уксусной кислоты фиксированной материала.
- Используйте часы чайник стекла, вогнутой слайд или пробки microcentrifuge для инкубации расчлененных или нерассеченный образцов в 1% SDS и 0,2 N NaOH решения на ночь при комнатной температуре.
- Обращаться с осторожностью, потому что образец очень мягкий и прозрачный вид. Несколько раз промыть водой.
Примечание: Остатки раствора ИКБ может привести к осадков при добавлении окрашивание раствора, например, анилиновый голубой. - Для образцов, нерассеченный следуйте рассечение процедуры, описанной в разделе 2, использование воды вместо 70% этиловом спирте. После рассечения желаемого ткани, удалить любые остатки и мусора и любой избыток воды с промокательной бумаги, а затем 20 – 40 мкл окрашивание раствора и переходите к шагу 6.5.
- Для образцов, расчлененный тщательно, переместить выборки из моющего раствора и поместите его на чистый слайд и 20 – 40 мкл окрашивание раствора.
- Осторожно поместите coverslip на слайде, опустив ее в сторону. Будьте осторожны, не Сквош подготовки. Если ткань является слишком мягким, место любого тонкого разделителя в слайд и coverslip по углам (например, ленты или сломанные coverslip), оставляя пространство камеры как между слайдов и coverslip, таким образом, что coverslip не раздавить образца.
- Поместите все слайды в поле влажный, накрыть алюминиевой фольгой и поместите его на 4 ° C для по крайней мере 1 ч. Продолжайте наблюдать за образец, используя widefield флуоресценции или confocal микроскопии в течение 24 ч.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Арабидопсис принадлежит к семейству Brassicacea, принимая соцветия цветками бисексуалов, организовал в цветет (рис. 1). Каждый цветок имеет четыре чашелистика, четырьмя лепестками, шесть тычинок (четыре длинный и два коротких) и синкарпная гинецея, состоящий из двух врожденно плавленого плодолистиков (Рисунок 1F-H) расположены в четырех концентрических мутовках25,26. Арабидопсис имеет tenuinucellate, anatropous яйцеклеток, расположенных в теменной плацентации в два ряда (12-20 яйцеклеток в каждой строке) в рамках каждой из двух гнезда яичников (в общей сложности 45 – 80 яйцеклеток) (неопубликованные данные и ссылки27, 28 , 29 , 30). для того, чтобы проводить надежный сравнительный анализ цветок и развития эмбриона в рамках отдельных растений или между различными растениями (как реплицирует или лечения), целесообразно использовать первый открытый цветок в качестве эталона (Рисунок 1В). на данном этапе, соцветия (Рисунок 1E) обычно имеет между 20 и 30 бутонов, охватывающей все этапы развития цветок и на примерно аналогичных этапах других лиц (неопубликованные данные). Более меристем цветок (формирование между 5 и 20 цветов) будет инициировано Меристемы соцветия после того, как открыл первый цветок. Первые два цветы могут показать плодородия дефекты и, следовательно, не должны быть включены в анализ.
Очистка Arabidopsis цветы и цветочные органов, используя хлораль гидрат очистка решения31,32, включая Герр в 4½ Очистка решения33, обычно выполняется для дифференциальной помехи (контраст DIC) микроскопические анализы цветок, стручок и развития эмбриона (Рисунок 3А-J). 4½ решение специально рекомендуется для анализа развития тычинки и органов, требующих укрепление координационного потенциала. Некоторые решения, основанные на хлораль гидрата используются для двойной цели очистки и окраски одновременно; Это случай для оригинального Александр34 и Герр ИКИ-4½35,36 решения. Александр пятнать широко используется в проростках Arabidopsis для оценки пыльцы аборт. Изменение и более информативным Александр пятная процедуру37 является выведение всего пыльники, содержащие зрелого зерна пыльцы. Эта процедура требует задней очистки пыльники, использования господин в 4½ решения (рис. 3 K-L). Другие пятная методы, используемые в различных видов растений может обеспечить лучшее оценки жизнеспособности пыльцы (например, fluorochromatic реакция с помощью флуоресцеин диацетат, окрашивание callose, крахмал, ДНК, РНК и ферментативные тесты, с помощью редокс красители)38,,3940. Однако большинство из этих методов оценки конкретного аспекта зерна пыльцы, что может не обязательно коррелирует с пыльцы жизнеспособность и, главное, фертильности пыльцы. Оценку способности прорастания пыльцы и ее способность эффект удобрения и семена могут быть более точные38–40. Гораздо меньше используется процедура очистки окрашивание — Герр ИКИ-4½, который сочетает в себе Клиринг и крахмал окрашивание решения. Помимо окрашивания для крахмала (рис. 4), эта процедура может использоваться для целей общей очистки при необходимости (например, на рисунке 3A, E) более высокий контраст.
Сочетание auramine и calcofluor используется в многих видов растений41 одновременно пятно Экзина пыльцы и intine (рис 5A). Большинство из этих и других химических красителей не испачкать один сотовых компонент и, следовательно, должны использоваться в сочетании с более прямой маркировки методы, такие как ГАС или дневно тегами маркера линии, антитела или гибридизации situ в . Они также могут показать несколько возбуждения и выбросов спектров. DAPI, напротив, является более конкретной и обычно используется для пятно хроматина и хромосомы спреды42 во время мейоза и следовать пыльцы развития43, помимо его многообразие приложений как изображение для ядра. Здесь мы покажем, как можно увеличить интенсивность окрашивания получить более подробное представление о хроматина спермы и вегетативных ядер, механически удаляя Экзина (Рисунок 5B-C). Хотя этот метод очень полезно для тех, кто заинтересован в выполнении подробный анализ хроматина, хромосом и ядерные структуры, механическое удаление Экзина могут повлиять на организацию зерна пыльцы, таким образом, что результаты должны быть интерпретировать с осторожностью.
Большинство из этих флуоресцентных красителей используются без предварительной очистки ткани; но в некоторых случаях, они совместимы с задней очистки на слайд44на основе хлораль гидрат. SDS очистка недавно был использован как очистка реагента в исследованиях на животных и растений и было показано, чтобы быть совместимыми с различными окрашивание процедурами widefield флуоресценции и confocal микроскопии (м/с PI45 в растениях и ясность23, Пакт22 или24 акта-вуаля у животных). С помощью SDS-NaOH, очистка до анилиновый голубой окраски (Рисунок 5 d-H), нам удалось достичь более высокой доступности внутренних тканей, а также лучше пятная для callose в цветочные ткани (Рисунок 5I-L). Аналогичные результаты были получены для calcofluor (данные не показаны).
Рисунок 1: Фотографии цветов и растений арабидопсиса . (A-D) Арабидопсис растений на разных этапах жизненного цикла: розетки перед болтовых соединений (A), на первый цветок открытия (B), с первичный и несколько вторичных соцветия (C) и в конце цветения (D). (E) типичный цветет Arabidopsis соцветия с цветами на разных этапах своего развития, созревание акропетально. (F-H) Арабидопсис цветок на цветения, иллюстрирующие Самоопыление (тычинки трогательно стигмы и выпуская пыльцы). Цифры E-H являются фокус стеки 36, 53, 42 и 32 фотографии, соответственно, собранные с помощью программного средства (например, Helicon Focus). F-H представляют же цветок, где один чашелистиков, двух лепестков и короткие тычинки были удалены в час. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 2: как вскрыть гинецея и яйцеклетки. (1-3) место гинецея на слайде с минимальное количество 70% этанола и положение руки, как показано на чертеже. Сделать разрезы 1-3 следующие направления обозначены красными стрелками. Используйте иглу с отверстием вверх и от яйцеклеток для резки 2-3. (4-6) повернуть пестика 180 градусов, как показано и сделать разрезы 4-6 как три первых сокращений. (7) удаление клапаны: использовать иглы с отверстием вниз, поместите его под яйцеклеток и быстро слайд иглы вправо вдоль окраины клапан. Для больше плодолистиков (цветения и вперед), или с некоторым опытом рассечение, один можно заменить этот шаг, повторяя шаги 2 и 5 другой стороны пестика. (8-9) удалить, стигма стиль и плодоножка с острыми отрубы с помощью иглы с его открытия боком и вдали от яйцеклеток. (10) сделать резкое малых вырезать на передающем ткани уровня на одной из двух крайностей. (11) Используйте щипцы и иглы разорвать две половинки. (12) с помощью щипцов и иглы, нежно флип одной строке яйцеклеток для получения двух параллельных строк. Кроме того место две строки по вертикали с replum, лежащие выше и сместите нежно вниз вдоль replum распространить две строки яйцеклетку с обеих сторон. Два уплощенная, но по-прежнему придает строк яйцеклеток после очистки и окраски раствором ИКИ-4½ Герр приводятся в качестве иллюстрации в результате вскрытия. Масштаб баров = 80 мкм пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 3: на основе хлораль гидрата очистки с или без окрашивания во время разработки цветок. (A) A молодой бутон цветка. (B-E) Тычинка развития с матерью микроспор клеток в тетрад Микроспоры (C), пыльца митоз цитокинез (B), I (D) и tricellular зерна пыльцы (E). (F-J) Гинецея, содержащих яйцеклеток с megaspore мать клетки (стрелка) до мейоз (F и G) и во время meiotic профазе I (H), с двуядерными эмбриона sac (стрелка) (я) и на оплодотворение (J). Обратите внимание на следы пыльцы трубки (стрелка) в micropylar область яйцеклетку в J. (K-L) Изменение Александр окрашивание пыльники с полной (K) или снижение жизнеспособности пыльцы из-за теплового стресса (L). Обратите внимание на пустую цитоплазмы и неправильной формы прерванных зерен пыльцы в пыльников гнезда в L. Arabidopsis одичал тип Col-0 присоединения. Очистка или окрашивание: Herr в 4½ для B-D и F-J, Herr ИКИ-4½ для A и E, а также изменение Александр пятная для K-L. Масштаб баров = 10 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 4: динамика крахмала в цветок и начале семян развития. Представитель результаты, иллюстрирующий динамический крахмала оборот во время разработки цветок. (A-C) Третья волна крахмала amylogenesis/amylolysis на последних этапах тычинка развития как недавно описал39. (D-G) Представитель результаты уникального крахмала волны в зерна пыльцы с пика amylogenesis на bicellular стадии. (H-N) Представитель результаты динамики крахмала в семяпочек в стадии megaspore мать клетки (H), в развитии женского gametophytes (K) и во время раннего развития семян (сразу после оплодотворения в L, binucleate эндосперма в М и Октант стадии эмбриона в N). Арабидопсис одичал тип присоединения Col-0. Масштаб баров = 20 мкм. пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Рисунок 5: некоторые классическое окрашивание процедуры для микроскопии флуоресцирования и эффект SDS-расчистка. (A) Calcofluor-Auramine окрашивание во время созревания пыльцы, где intine окрашивается в синий (calcofluor) и Экзина интенсивно зеленый (Auramine). (B-C) Механическое удаление Экзина и DAPI окрашивание tricellular зерен пыльцы. (D-H) Представитель фотографии соцветие перед (D, как оправилась от фиксатором) и после SDS, очистка (E-H). Обратите внимание, прозрачность ткани, что позволяет наблюдать сосудистую внутри стебля соцветия (G) и бутона плодоножки (H). (J) Анилиновый голубой пятная для callose в Микроспоры в тетраде стадии в рамках тычинки. Сравните ясность и интенсивность окрашивания между не SDS очистили пыльников (я) и очистили SDS пыльников (J). (K) SDS-очищены и анилиновый голубой окрашенных пыльников с Микроспоры во время митоза I. пыльцы внимание синхронности многих зерен пыльцы на данном этапе в эти два гнезда. (L) SDS-очищены и анилиновый голубой окрашенных яйцеклетку после оплодотворения. Обратите внимание, callose окрашивание в остатки пыльцы трубки и в оболочке семян. Арабидопсис одичал тип присоединения Col-0. Шкалы бар = 20 мкм (A-C,-L); 1 мм (D-H). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть большую версию этой фигуры.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Существование многих бутоны в пределах одного соцветия Arabidopsis, охватывающей все этапы развития цветок, предлагает уникальную возможность для исследований, направленных на характеристике эффект лечения или функцию развития одновременно через различные этапы развития цветка. Хорошей отправной точкой между различными отдельных растений является открытие первый цветок основных соцветий. Растения обрабатываются таким образом, что цветение синхронизированы как возможно (например, 3 – 4 дня, расслоение на 4 ° C максимизирует прорастания семян синхронных и следовательно более даже цветения) и только те растения, которые открывают их первый цветок в тот же день принятые в пакетном режиме для распределения между обработками и реплицирует; пакеты, готовые на последовательных дней может использоваться для репликации эксперимент. После этой процедуры, более надежной сравнительного анализа, контроля для окружающей среды и развития вариации в пределах и между растениями, может быть выполнена.
Сочетание Люголя в пятно с Герр очистка решения позволили нам не только улучшить контраст в свободные образцы, по сравнению с классической очистки решения, но и характеризовать динамику крахмала в цветок и развития эмбриона, как недавно сообщили для Арабидопсис 46. с помощью этой простой процедуры, мы были в состоянии разгадать существование новой волны крахмала amylogenesis-amylolysis во время разработки пыльников и соотнести крахмала динамика с глобальные изменения в экспрессии генов участвуют кодирования белков в метаболизм сахара и крахмала. Этот анализ показал, что GPT6 вступают сахара фосфата из цитозоль для Амилопласты для синтеза крахмала. Подробные результаты на динамику крахмала в различных тканях открывает возможность характеризации других важных генов в метаболизме крахмала и для решения нерешенных вопросов, касающихся менее изучены, но важные этапы развития растений. На основе йода крахмал окрашивания не количественных и должны дополняться другими методами46.
Исследования ищет Улучшена очистка процедур, которые совместимы с микроскопии флуоресцирования активизировалось за последние годы, особенно в области животных. Хотя области исследований растений отстает, и очистка в значительной степени опирается на традиционные очистки растворов для анализа ДВС (например, решения на базе хлораль гидрат, бензилбензоат, Дибутилфталат и метилсалицилат)31 ,33,47,48, вдохновленные быстрый прогресс, достигнутый в области животных, некоторые аналогичные методы формируются с помощью мочевины - (например, ClearSee49 и другие50), и 2, 2'-thiodiethanol-на основе очистка процедур51,52. Здесь мы покажем, что использование моющего средства SDS в сочетании с NaOH делает прозрачной ткани и улучшает некоторые классические флуоресценции, окрашивание процедур, таких как анилиновый голубой для callose и calcofluor для целлюлозы. Основываясь на эти обнадеживающие результаты, аналогичный прогресс в базе ИКБ селективное удаление липидов можно ожидать в поле завода в ближайшем будущем. Поскольку клетки растений имеют жесткой клеточной стенки, которые отсутствуют в животных клетках, предварительного внедрения в гидрогели может оказаться необходимым, как в случае для животных тканей. Другие Краски люминесцентные, флуоресцентные и флуорофоров, используемых в генетический маркер строки может быть assayed с помощью этой процедуры очистки.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторы не имеют ничего сообщать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана университета Цюриха, МЭФ Мари Кюри Грант (Грант нет. TransEpigen-254797 года хиджры), расширенный грант Европейского исследовательского совета (Грант нет. Medea-250358 уг) и исследования и разработки технологий проект (Грант MecanX уг) от SystemsX.ch, швейцарская инициатива по биологии систем.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and Materials | |||
| Ethanol | Scharlau | ET00102500 | |
| Acetic Acid | Applichem | A3686,2500 | 100% Molecular biology grade |
| Glacial Acetic Acid | Sigma-Aldrich | 320099 | Molecular Biology Grade |
| Methanol | Scharlau | ME03062500 | |
| Formaldehyde Solution | Sigma-Aldrich | F1635 | |
| Propionic acid | Sigma-Aldrich | 81910-250 ml | |
| Chloral hydrate | Sigma-Aldrich | 15307 | |
| Glycerol | Roth | 3783.1 | |
| Gum arabic | Fluka | 51198 | |
| Lactic acid | Fluka | 69773 | |
| Phenol | Sigma-Aldrich | 77607-250ML | We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution) |
| Clove oil | Sigma-Aldrich | C8392-100ML | |
| Xylene | Roth | 4436.1 | |
| Iodine | Fluka | 57665 | |
| Potassium iodide | Merck | 5043 | |
| Malachite Green | Fluka | 63160 | |
| Fuchsin acid | Fluka | 84600 | |
| Orange G | Sigma | 7252 | |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Sigma-Aldrich | L3771 | Molecular Biology Grade |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | 71690 | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate | Applichem | A1047,1000 | |
| Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | S9763-1KG | |
| Potassium phosphate | Sigma-Aldrich | 04347 | |
| EDTA | Applichem | A2937,1000 | |
| Calcofluor | Sigma | F6259 | Fluorescent brightener 28 |
| Auramine | Chroma | 10120 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | toxic |
| Triton-X-100 | Sigma | T8787 | |
| Aniline blue | Merck | 1275 | |
| MS medium | Carolina | 19-57030 | |
| Nutrient-rich substrate | Einheitserde | ED73 | |
| Watch maker's glass | No specific brand | ||
| 15 ml falcon centrifuge tubes | VWR | 62406-200 | |
| Dumond Forceps | Actimed | 0208-5SPSF-PS | |
| Forceps | DUMONT BIOLOGY | 0108-5 | |
| Syringe | BD | BD Plastipak 300013 | 1 ml |
| Preparation needle | BD | BD Microlance 304000 | |
| Microscope slides | Thermo Scientific | 10143562CE | cut edges |
| Coverslips | Thermo Scientific | DV40008 | |
| Humid box | A plastic box with damp paper towel and slide supports inside | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions | |||
| Fixatives | |||
| Carnoy's (Farmer's) fixative | Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml) | ||
| Methanol/acetic acid fixative | 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water | ||
| FPA50 fixative | Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml) | ||
| Clearing solutions | |||
| Chloral hydrate/glycerol | Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Modified Hoyer | Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| Herr's 4½ clearing fluid | Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50 | ||
| SDS/NaOH solution | Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution. | ||
| SDS stock solution | 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water. | ||
| NaOH stock solution | 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water | ||
| Combined clearing and staining solutions | |||
| Herr's IKI-4½ | To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis. | ||
| Alexander staining | Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material. | ||
| Staining solutions | |||
| Calcofluor solution | Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution. | ||
| Auramine solution | Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution | ||
| Calcofluor-Auramine mixture | Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine. | ||
| DAPI solution | DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm. | ||
| Sodium phosphate buffer (0.1 M) | Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7) | ||
| Aniline blue solution | 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining. |
References
- Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
- Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
- Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
- Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
- Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
- Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
- Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
- Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
- Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
- Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
- Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
- Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
- Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
- Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
- Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
- Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
- Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
- Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
- Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
- Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
- Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
- Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
- Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
- Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
- Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
- Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
- Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
- Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
- Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
- Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
- Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
- Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
- Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
- Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
- Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
- Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
- Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
- Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
- Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
- Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
- Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
- Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
- Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
- Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
- Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
- Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
- Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
- Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
- Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
- Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
- Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
- Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).
