Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Developmental Biology
Click here for the English version

Developmental Biology

Bütün Dağı takas ve Arabidopsis çiçek organ ve Siliques boyama

Published: April 12, 2018 doi: 10.3791/56441
Automatic Translation
1, 1, 1, 1
1Department of Plant and Microbial Biology, Zurich-Basel Plant Science Center, University of Zurich

Summary

Bu iletişim kuralı, biz teknikleri için uygun diseksiyon Arabidopsis çiçek ve siliques, bazı temel Temizleme teknikleri tarif ve yordamlar yapılar gözlemleri bütün-mount için boyama seçili.

Abstract

Moleküler genetik araştırmalar onun müthiş araçlar nedeniyle Arabidopsis thaliana bitki Biyoloji ve başta bitki üreme biyolojisi en önemli modeli türlerinden biridir. Ancak, bitki morfolojik, anatomik ve ultrastructural analizler geleneksel olarak zaman alıcı gömme ve yordamlar parlak alan, tarama ve elektron mikroskopi kesit olarak içerir. Confocal floresan mikroskopisi, state-of--art 3-b bilgisayar destekli Mikroskopik analizler ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılmak üzere moleküler teknikleri sürekli arıtma son ilerleme için artan bir talep yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri geliştirmek. Bu iletişim kuralı ' biz düzgün Arabidopsis çiçek ve siliques, temizleme teknikleri, temel anatomi tekniklerini tanımlamak ve bazı boyama işlemleri için bütün yapılar gözlemleri montaj.

Introduction

Çiçekler arasında en önemli organları kapalı tohumlular tanımlıyoruz. Çiçekli bitkiler ortaya çıktı bazı 90-130 milyon yıl önce1ve çeşitlendirilmiş hızlı rapid görünüşleri Charles Darwin2tarafından bir "iğrenç gizem" nitelendirildi. Bitki araştırmacılar çıkarlarını çiçek geliştirme çeşitlidir. Bir bütün veya belirli anatomik, yapısal ve işlevsel özellikleri çiçekler3,4,5,6 evrimi çiçek evrimsel kökeni anlamayla ilgili biraz araştırma odaklı . Çiçek formu ve yapısı, hem de onlara, güvenerek cinsel ve eşeysiz üremenin biçimi yüksek değişim son derece karmaşık bir yapı çiçek olun. Çiçek organlarını, genetik ve moleküler İncelemeler7ile kombine edilebilir ışık ve elektron microscopical teknikleri kullanarak anatomi ve yapısal özelliklerini tanımlamak için çeşitli çabalar yol açmıştır. Ayrıca, kaynak, meyve ve tohum, çiçek büyük önem insan ve hayvan beslenmesi için vardır. Bu nedenle, çiçek ve meyve geliştirme karakterizasyonu uygulamalı araştırma, gıda güvenliği için bir artan insan nüfusu ve ekolojik koruma stratejileri değişen çevre8 altında da dahil olmak üzere birçok etkileri vardır , 9 , 10.

Arabidopsis geliştirmede çiçek çiçek indüksiyon ve önümüzdeki (çiçek grubu) meristem için bitkisel meristem dönüşüm başlar. Çiçek primordia yanal önümüzdeki meristem11Açıl başlatılır. Çiçek organ primordia giderek çiçek ortasına dışarıdan konsantrik gözlemleyebileceğiniz form ve sonunda sepals, yaprakları, stamens ve carpels7geliştirmek. Çiçek Bu organların farklı besin, koruyucu ve fonksiyonel (örneğin, tozlayıcı cazibe) yerine farklı bitki türü, erkek ve dişi gametophytes, sırasıyla12 gelişimi sürdürülmesi cinsel organları ile rolleri , 13. gametophytes, buna karşılık, her bir çift erkek (sperm) ayırt etmek ve kadın gametler (yumurta ve merkezi hücre), üzerine birleştirmek çift döllenme nesil, zigot ve birincil endosperm oluşturmak için bir terminal doku destekleyen embriyo14,15geliştirilmesi. Meyve ve tohum geliştirme desteği büyüme, olgunlaşma ve embriyo ve sonunda, onun dağılma korunması. Kapsamlı bir araştırma modeli tür Arabidopsis7,16,17, özellikle farklı bitki türleri çiçek ve embriyo geliştirilmesinde karakterize etmek için yapıldı.

Çiçek gelişiminin erken Mikroskopik analizler zaman alıcı örnek işleme ve gözlem teknikleri, parafin veya reçine katıştırma ve kesit, gibi ışık ya da elektron mikroskobu ile birlikte dayalı idi. Bu geleneksel mikroskobik teknikler kez mutantlar, RNA Yerelleştirme in situ hibridizasyon tarafından veya IMMUNO-algılama proteinlerin microscopical analizleri gibi moleküler genetik araştırmalar ile birlikte kullanılmaya başlanmıştır. State-of--art 3 boyutlu bilgisayar destekli görüntü analizleri ve minimal işlenmiş bütün Dağı numuneler üzerinde kullanılabilir moleküler yöntemler sürekli arıtma geniş alanlı ve confocal floresan mikroskopi son ilerleme için bir ihtiyaç yol açmıştır verimli ve en az bir örnek işleme teknikleri kantitatif analizleri için tercihen mükellef bulunmaktadır. Son yıllarda, önemli bütün Dağı hayvan numune Temizleme teknikleri geliştirme konusunda ilerlemeler kaydedilmiştir. Onlar render örnek şeffaf Sulu üre veya şeker tabanlı reaktifler (örneğin, ölçek, SeeDB, kübik) kullanarak18,19,20, veya seçici (SDS deterjan kullanarak) lipidler sonra kaldırarak örnekleri istikrarlı hydrogels katıştırma; lipidler kaldırılması olabilir pasif Difüzyon tarafından elde (örneğin, değiştirilmiş NETLİK protokolü21, PAKTI-PARS-jantlar22) veya aktif Elektroforez (orijinal NETLİK protokolü23 ve hareket-PRESTO24). Bu hızlı ilerleme tarafından teşvik, türetilmiş bazı teknikler de bitkiler kullanmak için ortaya çıkıyor.

Bu yöntemleri kağıt model Arabidopsisüzerinde duruldu, biz için prosedür çiçek tomurcukları, çiçek ve genç siliques uygun diseksiyon ve tüm montaj örnekleri çeşitli boyama için takas ve gözlem yordamları kullanarak tarif Klasik veya son SDS-esaslı temizleme yöntemi. Nişasta, callose ve Kromatin boyama örnekleri verilmiştir. Her ne kadar bu yordamları daha fazla geliştirmeleri ve diğer türler ile kullanıldığında uyarlamalar ihtiyacınız, onlar için daha fazla araştırma birçok araştırma projelerinin başlangıç noktası olan bu basit ama kritik yöntemlere sahne umuyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. çiçek ve Silique fiksasyon

  1. Hasat çiçekler ve bitkiler siliques ilk çiçek açılışında senkronize.
    Not: Burada kullanılan deneysel koşullar altında yaklaşık 21 gün sonra Murashige ve Skoog (MS) plakalar üzerinden ekimi için toprak çiçekli bitkiler başlatın. Tohumları 4 ° C'de 3-4 gündür tabakalı ve germinated/MS plakaları 22 ° C/16 h ışık ve 18 ° C/8 h karanlık 8-10 gün önce besin açısından zengin toprak (şekil 1) aynı koşullarda muhafaza tencere fide dikim, yetiştirilen. Özel araştırma amaçta çoğaltır sayısını bağlıdır, ancak en az 5 çiçek (bitkilerden 5 bireysel) her tedavi için önerilir. Çiçekler deneysel birimi ise 10 çiçek REPLICATE başına en az önerilir.
  2. Çiçek veya küçük makas (örneğin, tırnak makası) kullanarak çiçek (şekil 1E-H) kesme ve onları hemen bir microcentrifuge tüp (için tek önümüzdeki/çiçek fiksasyon) veya (için toplu tespitlerin) konik tüp yerleştirin taze içeren yapılan Carnoy'nın, metanol/Asetik asit veya FPA50 Fiksajlar (uygulamaya bağlı olarak, aşağıya bakınız) buz üzerinde.
    Not: Örnekleri tamamen sabitleştirici ve sular altında.
  3. Mendil sabitleştirici 4 ° C'de bir gecede 4 h içinde bırak
    Not: Vakum infiltrasyon doku sabitleştirici penetrasyon kadar hızlandırmak için kullanılabilir, ancak bu doku yapısını koruyarak için zararlı olabilir. Yazarlar vakum infiltrasyon uygulamak değil.
  4. Sabitleştirici kaldırmak, örnekleri karşılamak için yeterli % 70 etanol eklemek ve onları 4 ° c en az 24 saat için dönmek; örnekleri Bu çözümde sonsuza kadar kalabilirsin. Etanol kaldırdıktan sonra hemen bir sonraki adıma geçin; diseksiyon veya SDS takas.

2. Stereomicroscope altında diseksiyon

  1. Yerine % 70 etanol küçük bir petri destek yerleştirilmiş bir saat maker's cam taze yapılmış.
  2. Yer önümüzdeki/çiçek/silique bu taze sabitleştirici yaptı ve bir iğne ile forseps ve bir şırınga kullanarak stereomicroscope altında incelemek.
    1. Bir saat maker's cam veya çiçeklenme diseksiyon ve olgun çiçek (sepals, yaprakları ve bu aşamada disseke ercik can çiçek organlarını parçalıyor (önerilen) etanol ile tamamen kapalı olmak örnekleri sağlar benzer aygıtı ) örnekleri kurumasını önlemek için.
  3. Siliques ve slayt üzerindeki küçük çiçek tomurcukları aşağıda açıklandığı gibi incelemek.
    1. Saat maker's cam önceden işlenmiş örnekleri ile bir kenara bırakıp normal bir slayt için son diseksiyon kullanın.
    2. Örnek ilgi slayta geçin ve taze % 70 etanol 10 µL ekleyin. Hızla son diseksiyon üzerinde çalışmak ve etanol, 10 µL örnek olmadan aşırı sıvı nemli tutmak gerekirse ekleyin.
    3. Polen taneleri stamens--dan serbest bırakmak için bkz: adım 5.1. Carpels ve ovules dissekan için Şekil 2' de açıklanan yordamı izleyin. Bu işlem gelişimi karpel yeşil siliques gelişimi aşaması dahil olmak üzere, tüm aşamaları için geçerlidir.
      Not: Eğer örnekleri hareket yeterli etanol etkilenmişimdir etanol eklemeyin; çok küçük örnekleri dissekan içinde en az bir miktar sıvı daha kolay olur. Her zaman sadece faiz (sepals, yaprakları, stamens, carpels, ovules, tohum veya polen taneleri) organlarının slayt üzerinde tutun. Bu yordam slayt arasındaki coverslip, muayene, bir daha yüksek homojenliği ve böylece verimliliği mikroskobik muayene (daha yüksek sayıda hedef örnekler için sonuçlanan altında organ kalınlığı karşılık gelen bir üniforma kalınlığı sağlayacak aynı odak düzlemi içinde).
  4. Küçük bir Bloting kağıt parçası emer ve mümkün olduğunca çok etanol kaldırmak için kullanın. Hızlı bir şekilde örnek kurur önce sonraki adıma (Bölüm 3, 4 veya 6) geçin.

3. kloral hidrat tabanlı takas ve kombine takas boyama

Not: En iyi sonuç için takas kloral hidrat tabanlı malzeme sabit FPA50 ile elde edilir.

  1. Çözüm açıklığın yer 20 µL (kloral hidrat/gliserol, değiştirilmiş Hoyer'ın orta, Herr'ın 4½ veya Bay'nın IKI-4½ çözümleri) numune taşıyan slayt üzerinde. Şırınga bir çift hypodermal iğne ile kullanarak aralarındaki boşluğu azaltmak ve o saygısız gerektiği gibi örnekler getirin nerede faiz organı yüzleri aşağıya doğru. Kalan herhangi bir hava kabarcığı iğne kullanarak kaldırın.
  2. Bir coverslip yana doğru alt ve yavaşça, yavaşça basarak yerleştirin ve takas çözüm arasındaki boşluğu doldurur kadar bekleyin. En az kliring çözüm, gerekirse coverslip altında tüm boşluğu doldurmak için ekleyin.
  3. Slayt yer bir slayt tutucu ve duman başlık altında bırakın. Mikroskobik gözlemler sonra en az 4 h ve aşağıdaki 4 – 5 gün boyunca devam edin.

4. kombine boyama Alexander ve nedir Herr'ın 4½ takas

Not: Özgün Alexander Protokolü boyama önce polen taneleri slayt üzerinde bırakmadan üzerinde dayanır. Bir verimli ve daha bilgilendirici, modifiye boyama ve yordam temizlemek olduğunu olgun ama dehiscent sigara nedir içinde olgun polen taneleri boyama Alexander.

  1. Dehiscent jwiles ile açmak üzere olduğunuz taze hasat çiçek tomurcukları seçin.
    Not: Alexander boyama olgun polen taneleri için tasarlanmıştır ve verimli bir şekilde olgunlaşmamış polen taneleri leke değil çünkü genç çiçek tomurcukları yapmayız. En az 5 çiçek başına hasat farklı bitki ve çiçek tedavi önerilir.
  2. 96-şey plaka bir çiçek tomurcuğu daldırın için yeterli Alexander'ın solüsyonu ile hazırlayın. Sepals ve yaprakları kaldırarak jwiles ortaya çıkarmak ve onları Alexander'ın çözümde bırakın. Örnek 1-3 h duman başlık altında tutun.
  3. Alexander'ın çözüm Herr'ın 4½ çözüm ile değiştirin ve geri bir gecede kuluçka için duman başlık altında çok iyi tabak yerleştirin.
  4. Forseps kullanarak, yeni bir slayt üzerine temizlenmiş çiçek tomurcukları yavaşça hareket. Alexander'ın çözüm bazı etkilenmişimdir oluşabilir beri Bloting kağıt kadar takas çözüm mümkün olduğunca kaldırmak için kullanın.
  5. Stamens incelemek ve tüm diğer dokulara kaldırın. 3-Herr'ın 4½ çözüm kullanımı bölümündeki adımları izleyin.

5. kaldırma Exine polen taneleri

Not: Carnoy'nın sabitleştirici DAPI boyama için kullanmanızı öneririz.

  1. 1 ve 2 bölümlerinde açıklandığı fiksasyon ve diseksiyon yordamları izleyin. Artık, bir slaytta yer alan en az miktarda % 70 etanol içinde birçok stamens birine olması gerekir.
  2. Aşırı etanol kaldırmak için Bloting kağıt kullanıp 5 – 10 µL DAPI çözüm ekleyebilirsiniz. Birkaç tane şırınga iğneleri ile kullanarak, polen taneleri içinde çözüm (örneğin, ercik ve diğer polen taneleri serbest bırakmak için hareketsiz için bir şırınga kullanılması) az bu miktarda serbest bırakın. Çözüm kurur, DAPI başka bir 5 µL ekleyin.
  3. Sadece polen taneleri slayt ve coverslip arasında kaldı böyle ercik tüm enkaz kaldırma önemli bir adım olduğunu.
  4. Bir coverslip yana düşürerek numune taşıyan slayt üzerinde yerleştirin ve DAPI çözüm boşluğu doldurmak için gereken en az miktarda ekleyebilirsiniz. Coverslip üzerinde bir işaret parmağı yerleştirin ve çok ezici olmadan çok yapmak hızlı, sağlam ve kısa hareket kayar.
    Not: gerekli kuvvet ve sürgülü hareket genliği ölçmek için bu adımı birkaç kez, sonuçlar her zaman mikroskop altında kontrol icra edilebilir.
  5. Gerekirse DAPI çözüm ekleyin ve 15 dakika 4 ° C'de karanlık nemli bir kutu içinde Slayt 1 h. örnekleri geniş alanlı floresan veya 24 h içinde confocal mikroskobu altında izlemeye devam etmek için deneyin bu yordamı daha fazla olup olmadığını kontrol etmek için takas SDS ile birleştirmek için yer geliştirmek ments elde edilebilir.

6. Sodyum Lauryl Sülfat (SDS) Temizleme

Not: Bağlı olarak çözümlenmesi için çiçek organ ve çok yumuşak ve küçük örnekleri incelemek için araştırmacı becerileri, SDS tedavi (için deneyimli araştırmacılar) ya da daha önce yapılabilir veya diseksiyon adım sonra (daha az deneyimli için araştırmacılar) metanol Asetik asit malzeme sabit.

  1. Bir saat maker's cam, içbükey bir slayt veya bir microcentrifuge tüp disseke veya sigara disseke örneklerinde % 1 SDS ve oda sıcaklığında gecede 0.2 N NaOH çözüm kuluçkaya için kullanın.
  2. Çünkü örnek çok yumuşak ve şeffaf bir görünüme sahip bakım ile başa. Birkaç kez su ile durulayın.
    Not: Kalıntıları SDS çözüm için yağış ekleyerek boyama çözüm, örneğin, anilin mavi neden olabilir.
  3. Sigara disseke örnekleri için Bölüm 2, % 70 etanol yerine su kullanarak açıklanan diseksiyon yordamı izleyin. İstenen doku anatomi sonra herhangi bir kalıntıları ve enkaz ve aşırı su bir Bloting kağıt kaldırmak sonra 20-40 µL boyama çözüm ekleyin ve 6.5 adımla devam edin.
  4. Disseke örnekleri, dikkatle örnek çamaşır çözümden taşıyın ve temiz bir slayt yerleştirin ve 20-40 µL boyama çözüm ekleyin.
  5. Yavaşça bir coverslip yana düşürerek slayt üzerinde yerleştirin. Hazırlık squash değil için dikkat ediniz. Doku çok yumuşak ise, öyle ki coverslip örnek ezmek değil herhangi onun köşe (örneğin, teyp veya kırık bir coverslip), coverslip ve slayt arasında ayırıcı olarak ince yer bir odası gibi coverslip ve slayt mesafesi.
  6. Tüm slaytlar yer nemli bir kutu içinde alüminyum folyo ile kapatın ve en az 1 h. widefield floresan veya 24 saat içinde confocal mikroskobu kullanarak numune izlemeye devam etmek için 4 ° C'de yerleştirin.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Arabidopsis bir corymb (şekil 1) biseksüel tanzimi ile çiçek taşıyan Brassicacea ailesine ait. Her çiçek dört sepals, dört yaprakları, altı stamens (dört uzun lafın kısası iki) ve dört konsantrik gözlemleyebileceğiniz25,26yılında düzenlenmiş iki doğuştan erimiş carpels (şekil 1F-H) oluşan bir syncarpous gynoecium var. Arabidopsis tenuinucellate, anatropous ovules iki satır (12-20 ovules her satırda) parietal placentation her Yumurtalık (45-80 ovules toplamda) iki locules içinde düzenlenen vardır (yayınlanmamış veri ve başvurular27, 28 , 29 , 30). çiçek ve embriyo gelişimi içinde bir bitki veya farklı bitkiler (olarak çoğaltır veya tedaviler) arasında sağlam karşılaştırmalı analizler üstlenmek için ilk açık çiçek (şekil başvurmak için tavsiye edilir 1B). bu aşamada önümüzdeki (şekil 1E) genellikle arasında çiçek geliştirme ve diğer bireylerin (yayınlanmamış veri) kabaca benzer aşamalarında tüm aşamaları kapsayan 20 ve 30 çiçek tomurcukları vardır. İlk çiçek açtıktan sonra daha fazla çiçek sürgen (5 ve 20 çiçekler arasında şekillendirme) önümüzdeki meristem tarafından başlatılacak. İlk iki çiçek doğurganlık hataları gösterebilir ve bu nedenle, analize dahil edilmemesini.

Takas Arabidopsis çiçek ve çiçek organlarını kullanarak kloral hidrat tabanlı çözümleri31,32, takas çözüm33takas Herr'ın 4½ de dahil olmak üzere yaygın olarak yürütülür fark girişim kontrast () için DIC) çiçek, silique ve embriyo gelişimi (şekil 3A-J) Mikroskopik analizler. 4½ çözüm özellikle ercik geliştirme analiz etmek için ve daha güçlü temizleme kapasitesi gerektiren organları için tavsiye edilir. Bazı kloral hidrat tabanlı çözümler temizlemek ve aynı anda boyama Çift Kişilik amacıyla kullanılır; Özgün İskender'in34 ve Bay'nın IKI-4½35,36 çözümler için durum böyle. Boyama Alexander Arabidopsis içinde polen kürtaj değerlendirmek için yaygın olarak kullanılır. Değiştirilmiş ve daha bilgilendirici Alexander yordamı37 boyama olgun polen tahıl içeren tüm jwiles leke etmektir. Bu yordam Herr'ın 4½ çözüm (şekil 3 K-L) kullanarak jwiles posterior bir takas gerekir. Diğer boyama teknikleri farklı bitki türü kullanılan polen canlılığı (örneğin, callose, nişasta, DNA ve RNA ve kullanarak tekrar tekrar enzimatik testleri için boyama floresein diacetate kullanarak fluorochromatic tepki daha iyi bir tahmini sağlayabilir Redoks boyalar)38,39,40. Ancak, bu tekniklerin çoğu mutlaka polen canlılığı ve polen doğurganlık ile önemlisi ilişkilendirmek değil polen tahıl belirli bir yönünü değerlendirmek. Polen çimlenme yeteneğini değerlendirilmesi ve döllenme etkisi ve tohum ayarlamak için onun yetenek daha doğru38-40olabilir. Bir daha az kullanılan Temizleme boyama Herr'ın IKI-takas ve nişasta boyama çözümleri birleştiren 4½, işlemdir. Daha yüksek kontrast gerekli (örneğin, şekil 3A, E) olduğunda nişasta (şekil 4) Boyama yanı sıra, bu yordam genel takas amaçlar için kullanılabilir.

Auramine ve calcofluor bir arada birçok bitki türü41 yılında aynı anda polen exine ve intine (şekil 5A) leke için kullanılır. Bunların çoğu ve diğer kimyasal boyalar tek bir hücresel bileşeni leke değil ve bu nedenle, GUS veya fluorescently öğesini işaret çizgiler, antikorlar veya içinde in situ hibridizasyon gibi daha doğrudan etiketleme teknikleri ile birlikte kullanılmalıdır. Ayrıca birden fazla uyarma ve emisyon spectra gösterebilir. DAPI, buna ek olarak, daha belirlidir ve genellikle mayoz sırasında Kromatin ve kromozom yayılır42 leke ve polen geliştirme43, çekirdek için bir counterstain olarak manifold uygulamaları dışında takip için kullanılır. İşte, boyama yoğunluğu mekanik olarak exine (şekil 5B-C) kaldırarak sperm ve bitkisel hücre çekirdeği, Kromatin daha ayrıntılı bir görünümünü elde etmek için nasıl artırılabilir göstermektedir. Bu teknik çok detaylı analizler, Kromatin, kromozom ve nükleer yapısı gerçekleştirmede ilgilenenler için yararlı olsa da, sonuçlar aşağıdaki gibi olmalı öyle ki exine mekanik kaldırılması polen tahıl organizasyonu etkileyebilir bakım ile yorumlanır.

Çoğu bu floresan boyalar doku önceki takas olmadan kullanılır; Ancak bazı durumlarda, bir arka kloral hidrat tabanlı slayt44tarihinde takas ile uyumlu. Takas SDS reaktif hayvan ve bitki araştırma takas olarak son zamanlarda kullanılmış olan ve widefield floresan ve confocal mikroskobu (mPS-PI45 bitkiler ve netlik23, farklı boyama prosedürleri ile uyumlu olacak şekilde gösterilmiştir ANLAŞMA22 veya hareket-PRESTO24 hayvanlarda). SDS-NaOH anilin (şekil 5 d-H) Boyama mavi önce Temizleme kullanarak, biz iç doku hem de bir daha iyi callose çiçek dokularda (şekil 5I-L) için boyama için daha yüksek erişilebilirlik elde başardı. Benzer sonuçlar calcofluor (veri gösterilmez) elde edilmiştir.

Figure 1
Resim 1: Fotoğraf Arabidopsis bitki ve çiçek. (A-D) Yaşam döngüsünün farklı aşamalarında Arabidopsis bitkiler: rozet açılışında ilk çiçek (B), birincil ve ikincil bir kaç çiçek (C),(a)civatalama öncesi ve çiçekli sonundaki (D). (E) bir Arabidopsis tipik corymb önümüzdeki acropetally olgunlaşması farklı gelişim aşamalarında çiçekli. (F-H) Anthesis, self-pollination (stigma dokunmaktan ve polen taneleri bırakmadan ercik) gösteren bir Arabidopsis çiçek. Rakamlar E-H yığınla odak 36, 53, 42 ve 32 resimler, sırasıyla, bir yazılım aracı (örneğin, Helicon Focus) kullanarak monte. F-H Hiçinde bir çanak yaprak, iki yaprakları ve kısa ercik nerede kaldırıldı aynı çiçek temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Şekil 2: nasıl bir gynoecium ve ovules incelemek için. Çizimde gösterildiği gibi (1-3) yer gynoecium % 70 etanol ve pozisyon çok az bir miktarı ile bir slaytta eller. Yapmak 1-3 aşağıdaki yönergeleri kırmızı oklarla gösterilen keser. Kesim 2-3 ovules uzakta ve yukarı bakacak şekilde açılması ile iğne kullanın. (4-6) gösterildiği gibi karpel 180 derece döndürmek ve kesim 4-6 ilk üç keser gibi yapmak. (7) vanaları kaldırma: aşağı doğru bakacak şekilde açılması ile iğne kullanın, ovules yerleştirin ve iğne hızlı bir şekilde Vana kenar boşluğu boyunca sağa doğru kaydırın. Daha büyük carpels için (anthesis ve aynı zamanda), veya bazı diseksiyon uzmanlığı ile bir bu adımı karpel diğer tarafında 2 ve 5 numaralı adımları yineleyerek yerine kullanabilirsiniz. (8-9) iğne delikle yanlara doğru ve uzak ovules gelen kullanarak kesim leke tarzı ve keskin ile peduncle kaldır. (10) yapmak keskin bir küçük verici doku iki uç birinde düzey kesti. (11) iki yarısı parçalar için forseps ve iğne kullanın. (12) forseps ve iğne kullanarak yavaşça çevirmek ovules iki paralel satır elde etmek için bir satır. Alternatif olarak, iki satır yukarıda yalan replum dikey olarak yerleştirin ve hafifçe aşağı doğru her iki yanında iki ovule satırda yaymak için replum itin. İki basık ama temizlenmesi ve Bay'nın IKI-4½ çözüm ile boyama diseksiyon sonucu bir örnek olarak gösterilir sonra hala ovules satırlarının bağlı. Ölçek çubukları 80 µm = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: kloral hidrat tabanlı takas ya da çiçek geliştirme sırasında boyama olmasın. (A) A genç çiçek bud. (B-E) Ercik geliştirme microspore annesi ile sitokinez (B), microspores (C), Polen mitoz tetrads ben (D) ve tricellular polen taneleri (E) hücreleri. (F-J) Ovules megaspore anne hücreler (ok) mayoz (F ve G) öncesinde ve sırasında segregasyonun profaz içeren gynoecium ben (H), bir binuclear embriyo kesesi (ok) (Ben) ile ve gübreleme (J). Jovule micropylar bölgesi içinde bir polen tüpü (ok) iz unutmayın. (K-L) Değiştirilmiş Alexander ile dolu (K) nedir, boyama Dünün veya polen canlılığı ısı stres (L) nedeniyle azalmış. Not boş sitoplazma ve düzensiz şekiller L. Arabidopsis vahşi tipi Col-0 katılım Anter locules içinde iptal edilen polen taneleri. Takas veya boyama: Herr'ın 4½ B-D ve F-J, Herr için IKI-4½ A ve Eiçin 's ve K-Liçin boyama Alexander değiştirilmiş. Ölçek çubukları 10 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: nişasta dynamics sırasında çiçek ve erken tohum geliştirme. Temsilcisi çiçek geliştirme sırasında dinamik nişasta ciro gösteren sonuçlanır. (A-C) Nişasta amylogenesis/amylolysis ercik geliştirme son aşamalarında üçüncü dalga gibi son39nitelendirdi. (D-G) Polen tahıl benzersiz nişasta dalga temsilcisi sonuçları ile amylogenesis bicellular aşamada bir zirve. (H-N) Ovules megaspore anne hücre aşamasında (H), gelişmekte olan kadın gametophytes (ben-K) ve (sadece sonra gübreleme M, M binucleate endosperm içinde erken tohum geliştirme sırasında nişasta dinamiklerini temsilcisi sonuçları ve octant Nembriyo aşamasında). Arabidopsis vahşi tipi Col-0 katılım. Ölçek çubukları 20 µm. = Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: bazı klasik Floresans mikroskobu ve SDS Temizleme etkisi için prosedürleri boyama. (A)Calcofluor-Auramine (calcofluor) nerede intine mavi lekeli polen olgunlaşma sırasında boyama ve exine yoğun yeşil (Auramine). (B-C) Mekanik kaldırma exine ve DAPI tricellular polen taneleri boyama. (D-H) (Sabitleştirici yeniden elde etmek gibiD,) önce bir önümüzdeki temsilcisi resimleri ve SDS (E-H) temizledikten sonra. Önümüzdeki kök (G) ve (H) çiçek tomurcuk peduncle içinde damarlara gözlenmesi sağlar doku saydamlığını unutmayın. (I-J) Anilin mavi ercik içinde dörtlü aşamada microspores içinde callose için boyama. Netlik ve yoğunluğu arasında boyama karşılaştırmak sigara-SDS Anter (Ben) ve SDS temizlenmiş Anter (J) temizlenir. (K) bir SDS temizlenir ve anilin mavi lekeli Anter ile microspores Polen mitoz ı. sırasında bu iki locules içinde bu aşamada çok polen taneleri senkronizasyonu unutmayın. (L) bir SDS temizlenir ve anilin mavi lekeli ovule sonra gübreleme. Polen tüpü kalıntıları ve tohum ceket boyama callose unutmayın. Arabidopsis vahşi tipi Col-0 katılım. Ölçek çubuğu 20 µm = (A-C, ı-L); 1 mm (D-H). Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Birçok çiçek tomurcukları Arabidopsistüm çiçek gelişim aşamalarında, kapsayan, tek bir önümüzdeki içinde varlığını bir tedavi ya da bir gelişimsel özelliği bir etkisi karakterize yönelik çalışmalar için eşsiz bir fırsat sunuyor aynı anda farklı gelişimin çiçek arasında. Farklı bireysel bitkiler arasında iyi bir referans noktası ana önümüzdeki ilk çiçek açıyor. Bitkiler çiçekli eşitlenir şekilde tedavi edilir (örneğin, 3-4 gün stratifikasyon 4 ° C'de en üst düzeye çıkarır zaman uyumlu tohum çimlenme ve dolayısıyla daha bile çiçekli) mümkün ve aynı gün onların ilk çiçek açan bitkiler kadar tedaviler ve çoğaltır arasında dağıtmak için bir toplu iş olarak geçen; toplu işlemler birbirini izleyen günlerde hazır deneme çoğaltmak için kullanılabilir. Ardından bu yordamı, çevre ve gelişim çeşitleri içinde ve arasında bitkiler için kontrol daha sağlam karşılaştırmalı analizler yapılabilir.

Lugol'ın leke Herr'ın takas çözüm bize sadece temizlenmiş örneklerinde klasik takas çözümleri karşılaştırıldığında karşıtlığı artırmak için aynı zamanda nişasta dinamikleri çiçek ve embriyo gelişimi sırasında karakterize etmek için izin ile birleştirerek, son için bildirilen Arabidopsis 46. bu basit işlemi uygulayarak, biz Anter geliştirme sırasında nişasta amylogenesis-amylolysis yeni bir dalga varlığını çözmeye ve nişasta dynamics genel değişiklikler kodlama proteinler söz konusu genlerin ifadesi ile ilişkilendirmek için başardık şeker ve nişasta metabolizmasında. Bu analiz GPT6 şeker-fosfat amyloplasts nişasta sentezi için için sitozol üzerinden Yerleştirici olduğunu gösterdi. Nişasta dynamics çeşitli dokularda detaylı sonuçları diğer önemli genler nişasta metabolizma ve daha az okudu ama önemli bitki gelişim aşamalarında ilgili çözülmemiş sorular yönelik olarak karakterize olasılığı açılır. İyot tabanlı nişasta boyama nicel değildir ve diğer yöntemleri46ile tamamlanmalıdır.

Floresans mikroskobu ile uyumlu olan yordamlar takas geliştirilmiş araştırma arıyorsunuz son yıl içinde özellikle hayvan alanında şiddetlendi. Ne kadar bitki araştırma alanı gerisinde ve büyük ölçüde temizlenmesi dayanır DIC analizi (örneğin, kloral hidrat tabanlı çözümler, Benzil benzoat, Dibutil ftalat ve Metil salisilat) için geleneksel takas çözümler üzerinde31 ,33,47,48, hayvan alanında yapılan hızlı ilerleme tarafından teşvik bazı benzer teknikler ortaya çıkan kullanarak üre - (örneğin, ClearSee49 ve diğerleri50), ve 2, 2' thiodiethanol-tabanlı yordamlar51,52takas. İşte, NaOH ile birlikte SDS deterjan kullanımı doku şeffaf işler ve anilin mavi callose ve calcofluor için selüloz gibi prosedürler boyama bazı klasik Floresans geliştirir göstermektedir. Bu umut verici sonuçlarına göre SDS-esaslı seçici kaldırılması lipidler benzer devam eden bitki alanında yakın gelecekte beklenebilir. Bitki hücreleri bulunmadığına katı hücre duvarları beri hayvan dokuları için olduğu gibi hayvan hücrelerinde hydrogels içinde gömme izni gerekli olmayabilir. Diğer floresan boyalar ve fluorophores genetik satırlarında kullanılan bu takas yordam kullanılarak denenecektir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser Zürih Üniversitesi tarafından bir IEF Marie Curie Grant desteklenmiştir (Hayır verin. A.H. TransEpigen-254797), Avrupa Araştırma Konseyi gelişmiş verilmesi (Hayır verin. MEDEA-250358 U.G. için) ve bir araştırma ve teknoloji geliştirme projesi (grant MecanX U.G. için) SystemsX.ch, İsviçreli girişimi sistemleri Biyoloji.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Reagents and Materials
Ethanol Scharlau ET00102500
Acetic Acid Applichem A3686,2500 100% Molecular biology grade
Glacial Acetic Acid Sigma-Aldrich 320099 Molecular Biology Grade
Methanol Scharlau ME03062500
Formaldehyde Solution Sigma-Aldrich F1635
Propionic acid Sigma-Aldrich 81910-250 ml
Chloral hydrate Sigma-Aldrich 15307
Glycerol Roth 3783.1
Gum arabic Fluka 51198
Lactic acid Fluka 69773
Phenol Sigma-Aldrich 77607-250ML We used liquid phenol (use the density to find the required volume for your solution)
Clove oil Sigma-Aldrich C8392-100ML
Xylene Roth 4436.1
Iodine Fluka 57665
Potassium iodide Merck 5043
Malachite Green Fluka 63160
Fuchsin acid Fluka 84600
Orange G Sigma 7252
Sodium Dodecyl Sulfate Sigma-Aldrich L3771 Molecular Biology Grade
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich 71690
Sodium di-Hydrogen Phosphate Applichem A1047,1000
Sodium phosphate dibasic Sigma-Aldrich S9763-1KG
Potassium phosphate Sigma-Aldrich 04347
EDTA Applichem A2937,1000
Calcofluor Sigma F6259 Fluorescent brightener 28
Auramine Chroma 10120
DAPI Sigma D9542 toxic
Triton-X-100 Sigma T8787
Aniline blue Merck 1275
MS medium Carolina 19-57030
Nutrient-rich substrate Einheitserde ED73
Watch maker's glass No specific brand
15 ml falcon centrifuge tubes VWR 62406-200
Dumond Forceps Actimed 0208-5SPSF-PS
Forceps DUMONT BIOLOGY 0108-5
Syringe BD BD Plastipak 300013 1 ml
Preparation needle BD BD Microlance 304000
Microscope slides Thermo Scientific 10143562CE cut edges
Coverslips Thermo Scientific DV40008
Humid box A plastic box with damp paper towel and slide supports inside
Name Company Catalog Number Comments
Solutions
Fixatives
Carnoy's (Farmer's) fixative Absolute ethanol : glacial acetic acid, 3:1 (ml:ml)
Methanol/acetic acid fixative 50 % (v/v) methanol, 10 % (v/v) glacial acetic acid in deionized water
FPA50 fixative Formalin, propionic acid, 50% ethanol; 5:5:90 (ml:ml:ml)
Clearing solutions
Chloral hydrate/glycerol Chloral hydrate : glycerol : water, 8:1:2 (g:ml:ml). Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Modified Hoyer Gum arabic 7.5 g, chloral hydrate 100 g, glycerol 5 ml , water 30 ml. Can be used for all flower developmental stages and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
Herr's 4½ clearing fluid Lactic acid, chloral hydrate, phenol crystals, clove oil, xylene; 2:2:2:2:1, by weight. Can be used for all flower developmental stages (especially for stamen development) and for silique development with DIC microscopy. The best fixative is the formaline based FPA50
SDS/NaOH solution Mix-dilute the the SDS and the NaOH stock solution to 1% SDS / 0.2 N NaOH (10x dilution). For all stages of flower and silique developmental stages. The best fixative is the methano/acetic acid fixative; the other two fixatives can also be used. Can be combined with calcofluor, auramine, DAPI, and aniline blue staining solution.
SDS stock solution 10 % (w/v) sodium dodecyl sulphate. Dissolve 10 g sodium dodecyl sulphate in 80 ml deionized water and make up to 100 ml with deionized water.
NaOH stock solution 2 N NaOH solution: dissolve 4 g of NaOH in 40 ml of deionized water and make up to 100 ml with deionized water
Combined clearing and staining solutions
Herr's IKI-4½ To a standard 4½ (9 g in total) add: 100 mg iodine, 500 mg potassium iodide. This clearing solution can be used for all flower developmental stages and for silique development, either for increasing contrast or for characterizing starch dynamics. Use FPA50 for structural analysis and Carnoy's fixative for quantitative starch analysis.
Alexander staining Ethanol 95% 10ml, malachite green (1% in 95% EtOH) 1 ml, fuchsin acid (1% in ddH2O) 5ml, orange G (1% in ddH2O) 0.5ml, phenol 5g, chloral hydrate 5g, glacial acetic acid 2ml, glycerol 25ml . This clearing/staining alone or in combination with Herr's 4½ solution can be used to evaluate pollen abortion in flowers with mature and tricellular pollen grains. It's used on freshly harved non-fixed material.
Staining solutions
Calcofluor solution Calcofluor 0.007% in water (g:ml). Originally used as an optical brightner. Can be used for staining cellulose, carboxylated polysaccharides and callose in cell walls. Frequently used to stain the intine of the pollen grain. All three fixatives can be used with this solution.
Auramine solution Auramine 0.01% in water (g:ml). This lipophilic fluorscent dye can be used for staining cuticles, cutin, and exine among others. All three fixatives can be used with this solution
Calcofluor-Auramine mixture Auramine solution : Calcofluor solution, 3:1. Can be used for a combined staining by both solutions. Other proportions can be assayed maintaining a smaller proportion of calcofluor with respect to auramine.
DAPI solution DAPI 0.4 ug/ml, 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7), 0.1% Triton-X-100, 1 mM EDTA. This solution can be used for staining chromosome spreads during male and female meiosis, and cell nuclei of any tissue. Frequently used for studying pollen grain development. Carnoy's and methanol/ acetic acid are the best fixatives for this solution. Formaldehyde-based fixatives such as FPA50 may interfere with the staining. Excitation in the UV and maximum emission around 461 nm.
Sodium phosphate buffer (0.1 M) Proton receptor: 0.2 M Na2HPO4, proton donor: 0.2 M NaH2PO4, ratio proton donor / proton receptor: 1.364 ( for a pH 7)
Aniline blue solution 0.1% (w/v) aniline blue, 108 mM K3PO4 (pH 11), 2% glycerol. This solution can be used for staining callose and cellulose of many stages of development (e.g callose deposition in male and female terads, callose plugs in pollen tubes). Excitation in the UV and maximum emission around 455. It can also be excited at 514 nm with emission in the red for cell content staining.

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Crane, P. R., Friis, E. M., Pedersen, K. R. The origin and early diversification of angiosperms. Nature. 374 (6517), 27-33 (1995).
  2. Friedman, W. E. The meaning of Darwin's 'abominable mystery'. Am J Bot. 96 (1), 5-21 (2009).
  3. Sun, G., Dilcher, D. L., Zheng, S., Zhou, Z. In search of the first flower: A Jurassic angiosperm, Archaefructus, from Northeast China. Science. 282 (5394), 1692-1695 (1998).
  4. Mulcahy, D. L. The rise of the angiosperms: a genecological factor. Science. 206 (4414), 20-23 (1979).
  5. Friedman, W. E., Moore, R. C., Purugganan, M. D. The evolution of plant development. Am J Bot. 91 (10), 1726-1741 (2004).
  6. Endress, P. K. Angiosperm floral evolution: morphological developmental framework. Advances in botanical research Volume 44: Developmental genetics of the flower. Soltis, D., Soltis, P., Leebens-Mack, J. , Academic Press. 1-61 (2006).
  7. Alvarez-Buylla, E. R., et al. Flower development. Arabidopsis Book. 8, 30127 (2010).
  8. Beddington, J. Food security: contributions from science to a new and greener revolution. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 365 (1537), 61-71 (2010).
  9. Godfray, H. C., et al. Food security: The challenge of feeding 9 billion people. Science. 327 (5967), 812-818 (2010).
  10. Burkle, L. A., Alarcón, R. The future of plant-pollinator diversity: understanding interaction networks across time, space, and global change. Am J Bot. 98 (3), 528-538 (2011).
  11. Meyerowitz, E. M., et al. A genetic and molecular model for flower development in Arabidopsis thaliana. Dev Suppl. 1, 157-167 (1991).
  12. Hafidh, S., Fíla, J., Honys, D. Male gametophyte development and function in angiosperms: a general concept. Plant Reprod. 29 (1-2), 31-51 (2016).
  13. Schmidt, A., Schmid, M. W., Grossniklaus, U. Plant germline formation: common concepts and developmental flexibility in sexual and asexual reproduction. Development. 142 (2), 229-241 (2015).
  14. Sprunck, S., Dresselhaus, T. Three cell fusions during double fertilization. Cell. 161 (4), 708-709 (2015).
  15. Dresselhaus, T., Sprunck, S., Wessel, G. M. Fertilization mechanisms in flowering plants. Curr Biol. 26 (3), R125-R139 (2016).
  16. Smyth, D. R., Bowman, J. L., Meyerowitz, E. M. Early flower development in Arabidopsis. Plant Cell. 2 (8), 755-767 (1990).
  17. Roeder, A. H., Yanofsky, M. F. Fruit development in Arabidopsis. Arabidopsis Book. 4, e0075 (2006).
  18. Hama, H., et al. Scale, a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain. Nat Neurosci. 14 (11), 1481-1488 (2011).
  19. Ke, M. -T., Fujimoto, S., Imai, T. SeeDB. a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction. Nat Neurosci. 16 (8), 1154-1161 (2013).
  20. Susaki, E. A., et al. Whole-brain imaging with single-cell resolution using chemical cocktails and computational analysis. Cell. 157 (3), 726-739 (2014).
  21. Tomer, R., Ye, L., Hsueh, B., Deisseroth, K. Advanced CLARITY for rapid and high-resolution imaging of intact tissues. Nat Protoc. 9 (7), 1682-1697 (2014).
  22. Yang, B., et al. Single-cell phenotyping within transparent intact tissue through whole-body clearing. Cell. 158 (4), 945-958 (2014).
  23. Chung, K., Deisseroth, K. CLARITY for mapping the nervous system. Nat Methods. 10 (6), 508-513 (2013).
  24. Lee, E., et al. ACT-PRESTO: rapid and consistent tissue clearing and labeling method for 3-dimensional (3D) imaging. Sci Rep. 6, 18631 (2016).
  25. Endress, P. K. Evolution and floral diversity: the phylogenetic surroundings of Arabidopsis and Antirrhinum. Int J Plant Sci. 153 (3, Part 2), S106-S122 (1992).
  26. Reyes-Olalde, J. I., Zuñiga-Mayo, V. M., Chávez Montes, R. A., Marsch-Martínez, N., de Folter, S. Inside the gynoecium: at the carpel margin. Trends Plant Sci. 18 (11), 644-655 (2013).
  27. Hill, J. P., Lord, E. M. Floral development in Arabidopsis thaliana: a comparison of the wild type and the homeotic pistillata mutant. Can J Bot. 67 (10), 2922-2936 (1989).
  28. Sessions, R. A., Zambryski, P. C. Arabidopsis gynoecium structure in the wild type and in ettin mutants. Development. 121 (5), 1519-1532 (1995).
  29. Schneitz, K., Hülskamp, M., Pruitt, R. E. Wild-type ovule development in Arabidopsis thaliana: a light microscope study of cleared whole-mount tissue. Plant J. 7 (5), 731-749 (1995).
  30. Sundberg, E., Ferrándiz, C. Gynoecium patterning in Arabidopsis: a basic plan behind a complex structure. Annual Plant Reviews Volume 38: Fruit Development and Seed Dispersal. Østergaard, L. , Wiley-Blackwell. Oxford, UK. 35-69 (2009).
  31. Meinke, D. W. 10 seed development in Arabidopsis thaliana. Cold Spring Harbor Monograph Archive. 27, 253-295 (1994).
  32. Weigel, D., Glazebrook, J. Arabidopsis: a laboratory manual. , Cold Spring Harbour Laboratory Press. Cold Spring Harbour, N.Y. (2002).
  33. Herr, J. M. A new clearing-squash technique for the study of ovule development in angiosperms. Am J Bot. 58 (8), 785-790 (1971).
  34. Alexander, M. P. A versatile stain for pollen fungi, yeast and bacteria. Stain Technol. 55 (1), 13-18 (1980).
  35. Herr, J. M. Jr Applications of a new clearing technique for the investigation of vascular plant morphology. J Elisha Mitchell Sci Soc Chapel Hill N C. 88 (3), 137-143 (1972).
  36. Herr, J. M. Clearing techniques for the study of vascular plant tissues in whole structures and thick sections. Tested studies for laboratory teaching. Proceedings of the Fifth Workshop/Conference of the Association for Biology Laboratory Education (ABLE). Goldman, C. A., Hauta, P. L., O'Donnell, M. A., Andrews, S. E., van der Heiden, R. 5, Toronto, Ontario, Canada. 63-84 (1993).
  37. Colcombet, J., Boisson-Dernier, A., Ros-Palau, R., Vera, C. E., Schroeder, J. I. Arabidopsis somatic embryogenesis receptor kinases1 and 2 are essential for tapetum development and microspore maturation. Plant Cell. 17 (12), 3350-3361 (2005).
  38. Heslop-Harrison, J., Heslop-Harrison, Y., Shivanna, K. R. The evaluation of pollen quality and a further appraisal of the fluorochromatic (FCR) test procedure. Theor Appl Genet. 67 (4), 367-379 (1984).
  39. Stone, J. L., Thomson, J. D., Dent-Acosta, S. J. Assessment of pollen viability in handpollination experiments: A review. Amer J Bot. 82 (9), 1186-1197 (1995).
  40. Dafni, A., Firmage, D. Pollen viability and longevity: practical, ecological and evolutionary implications. Plant Syst Evol. 222 (1-4), 113-132 (2000).
  41. Lora, J., Testillano, P. S., Risueño, M. C., Hormaza, J. I., Herrero, M. Pollen development in Annona cherimola Mill. (Annonaceae). Implications for the evolution of aggregated pollen. BMC Plant Biol. 9, 129 (2009).
  42. Ross, K. J., Fransz, P., Jones, G. H. A light microscopic atlas of meiosis in Arabidopsis thaliana. Chromosome Res. 4 (7), 507-516 (1996).
  43. Park, S. K., Howden, R., Twell, D. The Arabidopsis thaliana gametophytic mutation gemini pollen1 disrupts microspore polarity, division asymmetry and pollen cell fate. Development. 125 (19), 3789-3799 (1998).
  44. Haseloff, J. Old botanical techniques for new microscopes. BioTechniques. 34 (6), 1174-1182 (2003).
  45. Truernit, E., et al. High-resolution whole-mount imaging of three-dimensional tissue organization and gene expression enables the study of phloem development and structure in Arabidopsis. Plant Cell. 20 (6), 1494-1503 (2008).
  46. Hedhly, A., et al. Starch turnover and metabolism during flower and early embryo development. Plant Physiol. 172 (4), 2388-2402 (2016).
  47. Crane, C. F., Carman, J. G. Mechanisms of apomixis in Elymus rectisetus from eastern Australia and New Zealand. Am J Bot. 74 (4), 477-496 (1987).
  48. Young, B. A., Sherwood, R. T., Bashaw, E. C. Cleared-pistil and thick-sectioning techniques for detecting aposporous apomixis in grasses. Can J Bot. 57 (15), 1668-1672 (1979).
  49. Kurihara, D., Mizuta, Y., Sato, Y., Higashiyama, T. ClearSee: a rapid optical clearing reagent for whole-plant fluorescence imaging. Development. 142, 4168-4179 (2015).
  50. Warner, C. A., et al. An optical clearing technique for plant tissues allowing deep imaging and compatible with Fluorescence Microscopy. Plant Phys. 166, 1684-1687 (2014).
  51. Hasegawa, J., Sakamoto, Y., Nakagami, S., Aida, M., Sawa, S., Matsunaga, S. Three-dimensional imaging of plant organs using a simple and rapid transparency technique. Plant Cell Physiol. 57 (3), 462-472 (2016).
  52. Musielak, T. J., Slane, D., Liebig, C., Bayer, M. A Versatile Optical Clearing Protocol for Deep Tissue Imaging of Fluorescent Proteins in Arabidopsis thaliana. PLoS ONE. 11 (8), e0161107 (2016).

Tags

Gelişim biyolojisi sayı: 134 Herr'ın takas Hoyer'ın takas SDS Temizleme Boyama Boyama anilin mavi DAPI Lugol'ın iyot ovule geliştirme polen geliştirme
Bütün Dağı takas ve <em>Arabidopsis</em> çiçek organ ve Siliques boyama
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Hedhly, A., Vogler, H.,… More

Hedhly, A., Vogler, H., Eichenberger, C., Grossniklaus, U. Whole-mount Clearing and Staining of Arabidopsis Flower Organs and Siliques. J. Vis. Exp. (134), e56441, doi:10.3791/56441 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter