Summary
يصف لنا هنا أسلوب الذي يجمع بين الطفرات ينقول مع التسلسل الفائق لتحديد وتقدير حجم ينقول ليبتوسبيرال طفرات في الأنسجة بعد تحديا الهامستر. هذا البروتوكول يمكن استخدامها لطفرات الشاشة للبقاء على قيد الحياة، ونشر في الحيوانات، ويمكن تطبيقها أيضا على الدراسات في المختبر .
Abstract
في هذه المخطوطة، يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية لتحديد وتقدير حجم Leptospira إينتيروجانس طفرات غيرت في اللياقة البدنية خلال عدوى الهامستر السوري الذهبي. تينيسي-Seq يجمع بين الطفرات ينقول عشوائي مع قوة تكنولوجيا التسلسل الفائق. وتحدي الحيوانات مع مجموعة من ينقول طفرات (تجمع الإدخال)، متبوعاً بحصاد الدم والأنسجة بضعة أيام في وقت لاحق لتحديد وقياس عدد طفرات في كل جهاز (مجمعات الإنتاج). تتم مقارنة في تجمعات الإخراج إلى تجمع الإدخال لتقييم اللياقة في فيفو كل متحولة. ويتيح هذا النهج فحص مجموعة كبيرة من طفرات في عدد محدود من الحيوانات. مع تعديلات طفيفة، يمكن تنفيذ هذا البروتوكول مع أي نموذج من نماذج حيوانية لداء البريميات، وخزان المضيف نماذج مثل الفئران، ونماذج الإصابة الحادة مثل الهامستر، فضلا عن الدراسات في المختبر . تينيسي-Seq يوفر أداة قوية للشاشة لطفرات بعيوب اللياقة البدنية في الجسم الحي وفي المختبر .
Introduction
من الصعب تحديد الجينات الفوعة لبعض أنواع البكتيريا، مثل Leptospira spp.، بسبب العدد المحدود من الأدوات الجينية المتاحة. أحد النهج استخداماً هو إنشاء مجموعة من طفرات من الطفرات العشوائية ينقول متبوعاً بتحديد موقع الإدراج في كل متحولة واختبار الفوعة طفرات ينقول الفردية في نموذج حيوان. وهذا النهج هو مضيعة للوقت ومكلفة، ويتطلب عدد كبير من الحيوانات.
عندما الطفرات العشوائية وضعت أولاً لمسببات المرض Leptospira إينتيروجانس، حددت الجينات المعنية بضراوة عن طريق اختبار طفرات الفردية في نموذج حيوان1. واختيرت طفرات استناداً إلى معايير مثل أدوارها المحتملة في الإشارات أو حركية أو الغشاء الخارجي المتوقعة أو موقع السطحية. كما أن غالبية ليبتوسبيرال ترميز الجينات البروتينات افتراضية لدالة غير معروفة2، اختيار طفرات استناداً إلى هذه الحدود معايير القدرة على اكتشاف الجينات الفوعة ليبتوسبيرال الرواية.
في الآونة الأخيرة، تم فحص برك طفرات ينقول إينتيروجانس L. للعدوى في نماذج الهامستر والفأر3. وطعن كل الحيوانات مع مجموعة طفرات تصل إلى 10. وكان سجل العدوى متحولة إيجابية لو أنه تم الكشف عن طريق PCR للثقافات التي تم الحصول عليها من الدم والكلى. وكان اختبار PCR شاقة لأنه يتطلب فعل PCR فردية لكل متحولة في حوض السباحة. لأنه كان لم يحدد كمياً تواتر كل متحولة في الثقافات، كان متحيزا النهج نحو تحديد طفرات عالية الموهن.
يصف لنا ينقول التسلسل (Tn-Seq) تقنية، كاستراتيجية للشاشة أكثر كفاءة للجينات الفوعة. تينيسي-seq يتكون من إنشاء مكتبة طفرات من الطفرات ينقول متبوعاً تسلسل المتوازية الضخمة4،،من56. بإيجاز، تجميع طفرات ينقول وطعمت في الحيوانات واستردادها في وقت لاحق من أجهزة مختلفة (مجمعات الإنتاج). استخراج الحمض النووي من مجمعات الإنتاج ويهضم مع إنزيمات التقييد أو المنفصمة ب sonication. يتم إجراء جولتين من PCR استهداف وصلات مواقع الإدراج ينقول. هذه الخطوة يمكن إضافة المحولات اللازمة للتسلسل. ويتم تحليل منتجات PCR الناتجة بالتسلسل الفائق لتحديد موقع الإدراج ينقول كل متحولة تجمع جنبا إلى جنب مع هذه الوفرة النسبية، الذي هو مقارنة مع التكوين الأولى لمجمع المسخ.
الميزة الرئيسية لهذا النهج هو القدرة على الشاشة في نفس الوقت عدد كبير من طفرات مع عدد قليل من الحيوانات. تينيسي-Seq لا تتطلب معرفة مسبقة من مواقع الإدراج ينقول مما يزيد من فرص اكتشاف جديد Leptospira-جينات معينة تشارك في الفوعة بأقل وقت وقدر أكبر من الكفاءة. نظراً للعبء ليبتوسبيرال في أنسجة مرتفع نسبيا في القوارض نماذج العدوى عرضه لقاتله (عادة 104 إلى 108 البكتيريا/غرام من الأنسجة)7،،من89 كذلك كما هو الحال في مستودعات مضيفة 10،11، يمكن تحليل الأنسجة مباشرة دون الحاجة إلى الثقافة والحد من التحيز بسبب النمو في المختبر .
في تينيسي Seq الدراسات مع معظم مسببات الأمراض البكتيرية ووصف حتى الآن، سمح عالية التردد من الطفرات insertional العدوى مع تجمعات كبيرة تحتوي على طفرات جماعياً بعد غرز متباعدة عن كثب ينقول متعددة داخل كل الجينات4 ،،من1213،14. كما وضعت Tn Seq لبكتيريا التي تردد الطفرات هو كثير أقل من6. مع Leptospira، يمكن إنشاء مكتبة طفرات ينقول بإدخال ينقول على بلازميد متمركزة بالاقتران كما هو موضح سلامتي وآخرون15. ومع ذلك، تواتر الطفرات ينقول لام إينتيروجانس منخفض. عندما ينقول Himar1 أدخل على بلازميد كونجوجاتيفي، تواتر ترانسكونجوجانت أفيد بأن الخلية مع الضغط لأي من إينتيروجانس ل16 فقط 8.5 × 10-8 كل مستلم ومن المرجح أن تكون وبالمثل الفقيرة مع معظم السلالات الأخرى لام إينتيروجانس. بروتوكول الموصوفة هنا في جزء على أساس أن البلدان المتقدمة النمو البورليه burgdorferi، الذي هو أيضا تواتر الطفرات insertional ينقول منخفضة6.
لدينا تجربة رائدة مع بروتوكول17، أجرينا الطفرات ينقول مع إينتيروجانس L. سرفار مانيلا سلالة L495 بسبب نجاح الفئات الأخرى في عزل ينقول الإدراج طفرات في سلالة جنبا إلى جنب مع انخفاض LD50 (جرعة مميتة) لضراوة1. نحن فحص طفرات 42 من تينيسي-Seq وحددت العديد من المرشحين متحولة معيبة في الفوعة، بينهم اثنان مع الملاحق في جين adenylate cyclase مرشح. وأكدت التجارب الفردية من طفرات اثنين في الهامستر أن كانت قاصرة في الفوعة17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تنبيه: يجب معالجة سلالات ممرضة من Leptospira spp. تحت إجراءات الاحتواء 2 مستوى السلامة الأحيائية (BSL-2). يجب ارتداء معدات الوقاية الشخصية المناسبة (معدات الوقاية الشخصية). ثانيا فئة السلامة الأحيائية مجلس الوزراء يجب أن يستخدم لجميع المعالجات من الممرضة Leptospira spp.
1-إنشاء ينقول مكتبة متحولة15
-
نقل ينقول إلى spp Leptospira . بتصريف (رقم 1)
- تطعيم كمية من ثقافة المرحلة الأسية spp المسببة للأمراض في. Leptospira الموافق 107 الخلايا إلى 10 مل من الينغاوسين-مكولوغ-جونسون-هاريس متوسطة18،(امجه)19. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز حتى الكثافة تصل إلى 2-8 × 108 خلايا/مل.
ملاحظة: مضاعفة وقت ليبتوسبيريس المسببة للمرض ح 12 إلى 24، اعتماداً على سلالة. - تلقيح 50 ميليلتر من المانحين الإشريكيّة القولونية سلالة β216320 تحمل ينقول متمركزة بلازميد (pCjTKS2)16 إلى 5 مل من مرق لوريا (رطل) وتستكمل مع 0.3 مم 2, 6-ديامينوبيميليكاسيد (حزب العمل الديمقراطي)، 50 ميكروغرام/مل من كاناميسين (كم)، و 50 ميكروغرام/مل بالسبيكتينوميسين (Spc) ومكان بين عشية وضحاها في حاضنة 37 درجة مئوية 255 لفة في الدقيقة.
- تطعيم 60 ميليلتر من الخلايا كولاي إلى 3 مل أمية وتستكمل مع 0.3 مم من حزب العمل الديمقراطي (أمية + سماد). احتضان عند 37 درجة مئوية في الانفعالات 255 لفة في الدقيقة ح 3-4 حتى ≈600nmOD 0.3.
- لتجميع وحدة الترشيح (الشكل 1)، وضع القاعدة على 125 مل جانب-ذراع قارورة Erlenmeyer، وضع عامل تصفية خلات السليولوز (المسام حجم 0.1 مم؛ وقطرها 25 ملم) على قاعدة، والمشبك القمع على القاعدة. قم بتوصيل وحدة الترشيح إلى نظام فراغ.
- إضافة 5 مل من Leptospira spp. الثقافة و 0.5 مل من الثقافة كولاي إلى القمع. الفراغ السائل من خلال عامل تصفية.
- نقل عامل التصفية مع سطح البكتيريا التي تواجه على امجه + دابلاتي. احتضان عند 30 درجة مئوية بين عشية وضحاها مع عامل التصفية مواجهة.
- وضع عامل التصفية في أنبوب 15 مل يحتوي على 1 مل امجه ودوامه 10 s لإطلاق سراح البكتيريا في وسائل الإعلام. انتشار ميليلتر 200 تعليق على 5 أمية بلاتيسكونتاينينج 50 ميكروغرام/مل كم استخدام 10-15 ملم 1 زجاج معقمة الخرز أو الناشرة المتاح عقيمة. التفاف اللوحات مع بارافيلم واحتضانها لهم رأسا على عقب عند 30 درجة مئوية لمدة 3 إلى 4 أسابيع حتى مستعمرات مرئية.
- نقل مستعمرات منفردة إلى 3 مل أمية التي تحتوي على 50 ميكروغرام/مل من كم (أمية + كم) عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 150 دورة في الدقيقة لمدة 7 إلى 10 أيام حتى تصل إلى الثقافة كثافة ≈ 108/mL.
ملاحظة: يمكن تخزين الثقافات في-80 درجة مئوية أو في النتروجين السائل (مع والغليسيرول 4%).
- تطعيم كمية من ثقافة المرحلة الأسية spp المسببة للأمراض في. Leptospira الموافق 107 الخلايا إلى 10 مل من الينغاوسين-مكولوغ-جونسون-هاريس متوسطة18،(امجه)19. احتضان عند 30 درجة مئوية مع 150 دورة في الدقيقة تهتز حتى الكثافة تصل إلى 2-8 × 108 خلايا/مل.
-
تحديد موقع الإدراج ينقول من يعشق [بكر] (الشكل 2)
- 50 ميليلتر من كل متحولة ينقول في أنابيب PCR بالحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
ملاحظة: الحمض النووي يمكن أن تكون تنقية بدلاً من ذلك، استخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي. - إعداد مزيج PCR مع الإشعال Deg1 و Tnk1 (الجدول 3) وفقا الجدول 1. نقل 23.7 ميليلتر من المزيج لكل أنبوبة بكر وإضافة 1.3 ميليلتر من تفكيك الخلايا. تشغيل البرنامج: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 40: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 40 درجة مئوية لمدة 1 دقيقة، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- جعل هذا المزيج PCR مع الإشعال العلامة و TnkN1 (الجدول 3) وفقا الجدول 2. نقل 24.2 ميليلتر من المزيج لكل أنبوبة بكر وإضافة ميليلتر 0.8 لتفاعل PCR #1. تشغيل البرنامج: 95 درجة مئوية لمدة 5 دقائق؛ دورات 35: 95 درجة مئوية لمدة 15 ثانية، 55 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
- تشغيل 3 ميليلتر من منتجات بكر على 1% [اغروس] هلام مع المخزن المؤقت تريس-خلات-يدتا X (تاي) 1 في 10-15 V/سم (الشكل 2).
- تنقية منتجات PCR إيجابية العينات باستخدام مجموعة أدوات تنقية PCR. الوتي الحمض النووي مع حجم أدنى يسمح به عدة لزيادة تركيز الحمض النووي استردادها.
- إرسال المنتجات بكر المنقي سانغر التسلسل باستخدام التمهيدي TnkN1 (الجدول 3).
- تحديد مواقع الإدراج بمقارنة التسلسل الناتج مع تسلسل الجينوم للسلالة الأبوية بتحليل بلاستن (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) أو باستخدام قاعدة البيانات (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) سبيروسكوبي21.
- تأكيد موقع الإدراج ينقول واسطة PCR باستخدام كبسولة تفجير الصلب إلى تسلسل المضيف ترافقه.
ملاحظة: ينقول يزيد من حجم تسلسل البرية من نوع من ≈ 2 كيلو بايت.
- 50 ميليلتر من كل متحولة ينقول في أنابيب PCR بالحضانة عند 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة.
2-تجربة الحيوان (الشكل 3)
-
ثقافة طفرات Leptospira
- تنمو منفردة كل متحولة ينقول المحدد في 10 مل من أمية + كم عند 30 درجة مئوية في الانفعالات 150 لفة في الدقيقة بكثافة من8 107-10 ليبتوسبيريس/mL.
- عد ليبتوسبيريس بالفحص المجهري الظلام--الميدانية مع عداد هاوسير بيتروف، أو كما وصفت ميلر23.
- تمييع كل ثقافة في أمية بنفس الكثافة، وعلى سبيل المثال 106 خلايا/مل.
- لتجميع مجموعة الإدخال، تخلط معا ثقافات المخفف بكميات متساوية.
ملاحظة: تتضمن عناصر التحكم في تجمع الإدخال عن طريق إضافة طفرات بعيوب اللياقة البدنية المعروفة مثل loa2217،24 وطفرات مع غير معدلة اللياقة البدنية مثل ليجب17،25، على التوالي. ويمكن تخزين برك طفرات مع والغليسيرول 4 ٪ في-80 درجة مئوية أو في سائل النيتروجين.
-
التحدي
ملاحظة: الأساليب الموصوفة هنا وافق قدامى المحاربين في الشؤون أكبر لوس أنجليس المؤسسية الحيوان الرعاية واستخدام اللجنة (بروتوكول #09018-14).- حقن إينترابيريتونيلي 1 مل تجمع الإدخال لكل الحيوانات حقنه الأنسولين U-100 مع 26 x ½ "إبرة.
ملاحظة: في تجربة رائدة، تم طعن الحيوانات 8 مع 1 مل تجمع المدخلات، أي 106 البكتيريا إجمالي17. العدوى سمح بالمضي قدما لمدة 4 أيام قبل القتل الرحيم. - جمع 10 مل تجمع الإدخال، وتدور عن 20 دقيقة في غ. س 3,220 بعناية إزالة المادة طافية دون إزعاج بيليه. تخزين بيليه الخلية في-80˚C حتى استخدام (الخطوة 3.1.3).
- مراقبة الحيوانات يوميا حتى أنها تنتهي في نقطة نهاية محددة سلفا. تزن الهامستر يوميا، والبحث عن معايير نقطة النهاية: فقدان الشهية أو مشيه أو تنفس صعوبة، والسجود، والفراء تكدرت، أو فقدان > 10% من بلوغ الحد الأقصى للوزن.
- حقن إينترابيريتونيلي 1 مل تجمع الإدخال لكل الحيوانات حقنه الأنسولين U-100 مع 26 x ½ "إبرة.
-
تجربة في المختبر
- في يوم التحدي، تطعيم 3 قوارير 25 مل من أمية + كم مع 5 مل مجموعة الإدخال. تنمو الثقافات عند 30 درجة مئوية تحت الانفعالات 150 دورة في الدقيقة.
- عد ليبتوسبيريس يوميا باستخدام أحد أساليب الفقرة 2.1.2. عندما تصل الكثافة إلى ≈ 1 × 108/mL، تدور أسفل كل تعليق لمدة 20 دقيقة في 3,220 س ز.
- تخزين الكريات الخلية في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
-
الحصاد والتخزين للأنسجة
- Euthanize الحيوانات باستنشاق isoflurane تليها thoracotomy الثنائية26.
- جمع فورا 1 إلى 2 مل دم من خلال ثقب القلب مع 3 مل حقنه وابرة 25 x 5/8 ". نقل الدم في أنبوب يحتوي على يدتا. مزيج من انعكاس، 5 إلى 6 مرات.
- جمع أحد الكلي و ⅓ إلى ½ الفص المتوسط البطني من الكبد إلى كريوتوبيس.
- تخزين الأنسجة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
3-تشييد المكتبات الجينوم للتسلسل الفائق (الشكل 4)
-
استخراج الحمض النووي
- استخراج الحمض النووي من الدم.
- نقل 100 ميليلتر من الدم من الأنبوب أدتا إلى أنبوب ميكروسينتريفوجي.
- تنقية الحمض النووي باستخدام مجموعة أدوات استخراج الحمض النووي. اتبع إرشادات الشركة المصنعة.
- استخراج الحمض النووي من الأنسجة.
- استخدام المشارط والمقص، النرد بين 50 إلى 80 ملغ كل جهاز إلى قطع صغيرة (1 مم × 1 مم)، وتحويلها إلى أنبوب جاف ملولبة عقيمة. قياس وزن الأنسجة بدقة توازن.
- إضافة 500 ميليلتر من PBS العقيمة في الأنبوب.
- مجانسة العينات باستخدام disruptor 1 دقيقة في حركات 5 في الثانية الواحدة.
- حساب حجم الموافق 25 ملغ أنسجة باستخدام المعادلة التالية:
- نقل وحدة التخزين المحسوبة في الطقم استخراج الحمض النووي. المضي قدما في تنقية الحمض النووي اتباع إرشادات الشركة المصنعة.
- استخراج الحمض النووي من ثقافات حوض سباحة و في المختبر الإدخال.
- ذوبان الجليد الكريات البكتيرية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5-10 دقائق.
- المضي قدما في استخراج الحمض النووي اتباع التعليمات المصاحبة لهذه المجموعة.
- تخزين الحمض النووي في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام.
- استخراج الحمض النووي من الدم.
-
قص الحمض النووي (الرقم 5)
- نقل 50 ميليلتر من الحمض النووي المستخرج على أنبوب ميكروسينتريفوجي 1.5 مل.
- ضع الأنابيب في الرف سونيكاتور القرن الأفريقي كأس مليء بالماء البارد (4 درجات مئوية).
- قم بتشغيل سونيكاتور لمدة 3 دقائق في كثافة 80% مع 10 ق على النبض و 5 s إيقاف النبض.
تنبيه: ارتداء الإذن قد يفشل أو سدادات الإذن لحماية السمع. - تشغيل 2.5 ميليلتر من المنفصمة الحمض النووي على 2% [اغروس] هلام للتأكد من أن معظم من الحمض النووي < 600 شركة بريتيش بتروليوم في الحجم.
-
إضافة ج-الذيل
- قياس تركيز الحمض النووي مع جهاز المطياف الضوئي صغيرة حجم.
- حساب حجم المقابلة إلى 500 نانوغرام من الحمض النووي باستخدام المعادلة التالية:
- إعداد رد فعل تراجع (الجدول 4). احتضان ح 1 في 37 درجة مئوية؛ إلغاء تنشيط عند 75 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
ملاحظة: للعينات التي تحتاج إلى تعديل لوحدة تخزين أكبر من 14.5 ميليلتر، زيادة حجم النهائي من رد فعل ميليلتر 40 والارتقاء بالمكونات المتبقية وفقا لذلك. - تنظيف العينات مع مجموعة تنقية PCR. الوت الحمض النووي مع 12 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت.
-
يعشق [بكر]
- بكر #1
- إعداد يمزج PCR وفقا الجداول 3 و 5. نقل 22 ميليلتر من مزيج مكتبة لكل أنبوبة بكر وإضافة 3 ميليلتر لتنقية الحمض النووي. المضي قدما وبالمثل مع مزيج التحكم.
ملاحظة: TnkN3 التمهيدي17 محددة إلى ينقول والتمهيدي olj3766 محددة إلى ج-الذيل. مزيج التحكم ينقصنا التمهيدي TnkN3، التي تستهدف على وجه التحديد ينقول. - تشغيل البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ دورات 24: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إعداد يمزج PCR وفقا الجداول 3 و 5. نقل 22 ميليلتر من مزيج مكتبة لكل أنبوبة بكر وإضافة 3 ميليلتر لتنقية الحمض النووي. المضي قدما وبالمثل مع مزيج التحكم.
- بكر #2.
- إعداد يمزج PCR الثانية وفقا الجداول 3 و 6. نقل ميليلتر 49 من هذا المزيج مكتبة لكل أنبوبة بكر وإضافة 1 ميليلتر من رد فعل المكتبة بكر #1. نقل ميليلتر 24.5 مزيج التحكم لكل أنبوبة بكر وإضافة 0.5 ميليلتر بكر #1 مراقبة رد الفعل.
ملاحظة: pMargent2 التمهيدي محددة إلى ينقول، و الإشعال الملكية الفكرية6 تحتوي على ستة-قاعدة-زوج الباركود وتسلسل معين المعترف بها منصة الجيل المقبل تسلسل. - تشغيل البرنامج التالي: 95 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ دورات 18: 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 60 درجة مئوية لمدة 30 ثانية، 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة؛ 72 درجة مئوية لمدة 2 دقيقة.
- إعداد يمزج PCR الثانية وفقا الجداول 3 و 6. نقل ميليلتر 49 من هذا المزيج مكتبة لكل أنبوبة بكر وإضافة 1 ميليلتر من رد فعل المكتبة بكر #1. نقل ميليلتر 24.5 مزيج التحكم لكل أنبوبة بكر وإضافة 0.5 ميليلتر بكر #1 مراقبة رد الفعل.
- تشغيل 3 ميليلتر 2% [اغروس] هلام. يجب أن تظهر المكتبة تشويه مع غالبية إشارة بين 200 إلى 600 شركة بريتيش بتروليوم (الشكل 6) وأي تضخيم لمراقبة رد فعل.
- بكر #1
-
تنقية منتجات PCR.
ملاحظة: تنظيف المكتبات الجينوم مع مجموعة تنقية PCR اتباع إرشادات الشركة المصنعة. الوت الحمض النووي مع 30 ميليلتر من شطف المخزن المؤقت. - قياس تركيز الحمض النووي باستخدام فلوروميتير. متوسط القراءات 2 إلى 3.
- حساب حجم كل مكتبة ما يعادل 15 أو 20 نانوغرام باستخدام المعادلة التالية:
-
ميكس جميع المكتبات معا وفقا لحسابات سابقة. تحديد التركيز المولى من الحمض النووي مع المعادلة في الموقع التالي:
http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
تنبيه: تعتمد متطلبات تركيز وحجم الحمض النووي على منصة التسلسل.
4-الفائق تسلسل وتحليل البيانات
- التسلسل
- تسلسل المكتبات ك 64 بي بي واحد في نهاية ما يلي: استخدام pMargent3 التمهيدي تسلسل مخصصة والتمهيدي تسلسل التجارية القياسية. سوف توفر لك منصة تسلسل ملفات فستق مع جميع ما يلي التسلسل.
- تحليل مع برنامج غالاكسي
- تحميل ملف تسلسل الجينوم
- في الصفحة الرئيسية قاعدة البيانات سبيروسكوبي (راجع الخطوة 1.2.7 للارتباط)، حدد الكائن المستخدمة للتجربة، وانقر فوق "تحميل في مستعرض الجينوم".
- في شريط الأدوات (بالقرب من الجزء العلوي من الصفحة الرئيسية)، حدد "البحث والتصدير > تحميل البيانات"، في السطر "تسلسل (فاستا)"، انقر فوق "الجينوم" لتحميل التسلسل.
- افتح الملف باستخدام المفكرة (PC) أو TextEdit (Mac) وإعادة تسمية الكروموسوم (على سبيل المثال "شري"). الاحتفاظ بتنسيق فاستا.
- اتبع نفس الخطوات لتحميل تسلسل كروموسوم الثاني. الجمع بين كلا تسلسل كروموسوم في ملف txt واحد عن طريق النسخ واللصق.
ملاحظة: تسلسل كروموسوم يمكن أيضا تحميلها من موقع نكبي (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ودمجها في ملف txt واحد.
- تحميل ملفات إلى ملقم غالاكسي
ملاحظة: نظام غالاكسي هو مفتوح مصدر، منصة المستندة إلى ويب لإدارة البيانات المعلوماتية الحيوية المكثفة مهام سير العمل27،،من2829،30 ويمكن الوصول إليها في https://usegalaxy.org/.- في القائمة أدوات، حدد "الحصول على البيانات > تحميل ملف من جهاز الكمبيوتر الخاص بك". سحب وإسقاط الملفات.fastq المتولدة عن منهاج التسلسل في الإطار ثم انقر فوق "ابدأ".
- اتبع نفس الخطوات لتحميل الملف.txt Leptospira تسلسل الجينوم.
- العريس يقرأ
- حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > فستق [غروومر]" من القائمة أدوات.
- بجوار الملف العريس، حدد في المكتبات التي تم تحميلها في الخطوة 4-2-2. في "فستق مدخلات" نوعية عشرات نوع، حدد نظام التسلسل الملائم. "الحصول على خيارات متقدمة"، ترك "إخفاء مكتب متقدمة" مختارة.
- انقر فوق "تنفيذ".
- إزالة التحف التسلسل
- حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > إزالة تسلسل القطع الأثرية". بجوار مكتبة للتصفية، قم بتحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.3 أعدادهم. انقر فوق "تنفيذ".
- إزالة تسلسل ج-الذيل
ملاحظة: تكرار تتم إزالة هذه الخطوات مرة واحدة أو مرتين لضمان جميع ج-ذيول.- حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > مقطع تسلسل محول".
- حدد أو أدخل ما يلي:
مكتبة قصاصة: قم بتحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4-2-4.
طول التسلسل الحد الأدنى: 15
المصدر: أدخل تسلسل مخصص
أدخل تسلسل القطع المخصصة: ككككككك
قم بإدخال قيمة غير صفرية للحفاظ على تسلسل محول وقواعد x التي تليه: 0
تجاهل تسلسل مع غير معروف (ن) القواعد: نعم
خيارات الإخراج: إخراج تسلسل المقطوعة وغير قص - انقر فوق "تنفيذ".
- إزالة تسلسل محول
- حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > مقطع تسلسل محول".
- حدد أو أدخل ما يلي:
- مكتبة قصاصة: قم بتحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.5.
- طول التسلسل الحد الأدنى: 15
- المصدر: أدخل تسلسل مخصص
- أدخل تسلسل القطع المخصصة: كجتاتجككجتكتكتجكتج
- قم بإدخال قيمة غير صفرية للحفاظ على تسلسل محول وقواعد x التي تليه: 0
- تجاهل تسلسل مع غير معروف (ن) القواعد: نعم
- خيارات الإخراج: إخراج تسلسل المقطوعة وغير قص
- انقر فوق "تنفيذ".
- تصفية ما يلي بناء على جودتها
- حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > تصفية حسب نوعية".
ملاحظة: هذه الأداة بتحديد ما يلي: استناداً إلى نقاط الجودة. - حدد ما يلي:
مكتبة لتصفية: تحديد الملفات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.6.
قيمة إنتاج نوعية: 20
في المئة من قواعد في التسلسل الذي يجب أن يكون لديك نوعية على قدم المساواة إلى/أعلى من قيمة الوقف: 95 - انقر فوق "تنفيذ".
ملاحظة: هذه الإعدادات، يتم تجاهل ما يلي: أقصر من النيوكليوتيدات 20 أو مع درجة جودة من 20 أو أقل من 95 في المائة من الدورات. التكيف مع إعدادات التقشف للتجربة الخاصة بك.
- حدد "خ ع: مراقبة الجودة والتلاعب > تصفية حسب نوعية".
- يقرأ الخريطة32
- حدد "خ ع: رسم الخرائط > Bowtie2"32.
- حدد ما يلي في الحقول في الإطار الرئيسي:
هو مكتبة مفردة أو إقران هذه: واحدة في نهاية
ملف فستق: حدد المكتبة التي تمت تصفيتها للجودة من الخطوة 4.2.7.
كتابة القراءات محازى (في شكل فاستق) لفصل الملف (الملفات): لا يوجد
كتابة القراءات المنحازة (في شكل فستق) لفصل الملف (الملفات): لا يوجد
سوف حدد جينوم إشارة من التاريخ الخاص بك أو استخدام فهرس مدمج؟: استخدام جينوم من التاريخ وبناء الفهرس
حدد مرجع الجينوم: اختر تحميل الملف genome.txt Leptospira في خطوة 4-2-2.
مجموعة قراءة معلومات مجموعات؟: لا تقم بتعيين
حدد تحليل الوضع: 1: الإعداد الافتراضي فقط
هل تريد استخدام الإعدادات المسبقة؟: لا، مجرد استخدام الإعدادات الافتراضية
حفظ الإحصاءات رسم الخرائط bowtie2 للتاريخ: لا
وظيفة معلمات الموارد: استخدام المعلمات الافتراضية مورد الوظيفة - انقر فوق "تنفيذ" لمحاذاة ما يلي للجينوم.
- تحويل الملفات
- حدد "خ ع: سامتولس > تحويل سوق بكارا للأسلحة إلى سام أم سام".
- حدد ما يلي:
ملف أم لتحويل: حدد تعيين مكتبة من الخطوة 4.2.8.
خيارات رأس: تضمين رأس في إخراج سام (-h) - انقر فوق "تنفيذ".
- تحويل الملفات
- حدد "خ ع: سامتولس > تحويل سام للفاصل الزمني".
- حدد ما يلي:
حدد مجموعة البيانات لتحويل: حدد ملف المكتبة المعينة سام التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.9.
طباعة كافة؟: نعم - انقر فوق "تنفيذ".
- فرز ما يلي:
- حدد "عامل تصفية وفرز > فرز البيانات في ترتيب تصاعدي أو تنازلي".
- حدد ما يلي:
نوع البيانات: حدد ملف الفاصل الزمني التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.10.
في عمود: 2
مع نكهة: الترتيب العددي
كل شيء في: ترتيب تصاعدي - انقر فوق "تنفيذ".
- حدد ما يلي: مطابقة كروموسوم أنا
- حدد "عامل تصفية وفرز > حدد الخطوط التي تتطابق مع تعبير".
- حدد ما يلي:
حدد أسطر من: حدد ملف مع فرز القراءات التي تم إنشاؤها في الخطوة 4.2.11.
أن: مطابقة
النمط: أدخل اسم كروموسوم كما تحدد في الخطوة 4.2.1.3 (على سبيل المثال، "تشري"). - انقر فوق "تنفيذ".
- حدد مطابقة الكروموسوم الثاني ما يلي:
المضي قدما في أعقاب الخطوة 4.2.12. - مجموعة يقرأ وفقا لمواقع عمليات الإدراج في كروموسوم
- حدد "Join، طرح والمجموعة > تجميع البيانات حسب عمود وتنفيذ عملية تجميعية على الأعمدة الأخرى".
- حدد ما يلي:
حدد البيانات: حدد الملف الناتج من الخطوة 4.2.12.
مجموعة من الأعمدة: 2
تجاهل القضية أثناء التجميع؟: لا
تجاهل الأسطر التي تبدأ بهذه الأحرف: Ø
العملية > + عملية الإدراج
النوع: العد
في عمود: 2
تقريب النتيجة إلى أقرب عدد صحيح: لا - انقر فوق "تنفيذ".
- يقرأ مجموعة وفقا لمواقع الإدراج في الكروموسوم الثاني
المضي قدما في أعقاب الخطوة 4.2.14. - الإدراج فرز المواقع على كروموسوم
- حدد "عامل تصفية وفرز > فرز البيانات في ترتيب تصاعدي أو تنازلي".
- حدد ما يلي:
نوع Dataset: حدد الملف من الخطوة 4.2.14.
في عمود: 1
مع نكهة: الترتيب العددي
كل شيء في: ترتيب تصاعدي - انقر فوق "تنفيذ".
- فرز المواقع الإدراج على كروموسوم الثاني
المضي قدما في أعقاب الخطوة كلية 4.2.16.
- تحميل ملف تسلسل الجينوم
- التحليل الإحصائي
- نقل البيانات غالاكسي في ملفات جدول بيانات عن طريق نسخ ولصق العمودين من الخطوات كلية 4.2.16. و 4.2.17. إلى ملف Excel.
ملاحظة: العمود الأول هو إحداثي الموقع الإدراج ينقول النوكليوتيدات، والعمود الثاني هو عدد ما يلي في كل موقع الإدراج. - تحديد الجينات إيواء ينقول استخدام تنسيق النوكليوتيدات المنصوص عليها في الجدول.
ملاحظة: على سبيل المثال، ينقول إدراجها في النوكليوتيدات #30718 من كروموسوم الموجود في الجينات LIC10024 ، الذي يمتد النيوكليوتيدات كروموسوم في 29263-31539 أنا. - حساب الترددات النسبية (و) لكل متحولة في كل الأنسجة وفي تجمع الإدخال بعد المعادلة أدناه:
- حساب نسب الإخراج/الإدخال (R) لكل المسخ والأنسجة باستخدام المعادلة التالية:
- اختبار رتبة وقعت الرتبي
- تطبيع جميع النسب الإدخال/الإخراج بتعيين نسبة متوسط لكل الأنسجة في كل الحيوانات إلى 1.0. أي بنسبة 1.0 محايد، > 1.0 غير ملائم، و < 1.0 هو مفيد33.
- مقارنة نسب الإخراج/الإدخال إلى 1.0 (اللياقة البدنية المحايدة) باستخدام اختبار التصنيف الرتبي مع قيم P < 0.05 نظرت يعتد به إحصائيا.
- نقل البيانات غالاكسي في ملفات جدول بيانات عن طريق نسخ ولصق العمودين من الخطوات كلية 4.2.16. و 4.2.17. إلى ملف Excel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
إنشاء مكتبة طفرات ينقول في إينتيروجانس L. بالاقتران يتطلب وحدة ترشيح، كما هو مبين في الشكل 1. أننا تعافي ترانسكونجوجانتس 100-200 من كل التزاوج.
يتم تحديد موقع الإدراج ينقول في كل متحولة حسب تسلسل المنتج بكر ولده بكر شبه عشوائي يستهدف نهاية ينقول والمضيفة المجاورة تسلسل15 (الشكل 2A). ويرد مثال على نتائج PCR شبه عشوائي في الشكل 2. في معظم الحالات سوف لاحظ amplicon مهيمنة عند استخدام الإشعال Deg1 و Tnk1 للجولة الأولى بكر والعلامة TnkN1 للجولة الثانية. ومع ذلك، نظراً لخصوصية منخفضة للتسلسل بينتاميريك (... ن10جاتات-3 ') في 3' نهاية التمهيدي Deg1، وسوف يصلب هذا الكتيب في مواقع متعددة في جميع أنحاء الجينوم ليبتوسبيرال. إذا كانت هذه المواقع موجودة بالقرب من نهاية ينقول، ويمكن الحصول على منتجات PCR متعددة. عندما يتم إنشاء أمبليكونس متعددة، ويمكن تنقيته معا من مزيج PCR ومتسلسلة مباشرة؛ هلام تطهير كل أمبليكون ليس من الضروري نظراً لأنها ستحتوي كل تسلسل نفس المصب حيث التمهيدي TnkN1 أنيالس. من ناحية أخرى، قد تفشل PCR إذا كانت نسخة أقرب من التسلسل الذي يستهدفها التمهيدي Deg1 يقع على مسافة كبيرة من نهاية ينقول. إذا تم الكشف عن أية منتجات PCR، يمكن أن تتكرر في الجولة الأولى من بكر شبه عشوائي مع التمهيدي Deg1 و Tnk2 التمهيدي، الذي يستهدف الطرف الآخر من ينقول. وفي هذه الحالة ستستخدم TnkN2 والعلامة للجولة الثانية؛ أن التسلسل أمبليكون مع التمهيدي TnkN2 (الشكل 2). وبدلاً من ذلك، يمكن أن يتم في الجولة الأولى من PCR مع التمهيدي Deg2، الذين 3 ' نهاية (... ن10تكتت-3 ') الأهداف الأربعة-بدلاً من تسلسل النوكليوتيدات خمسة. يمكن أن تستخدم أربع مجموعات مختلفة من كبسولة تفجير للجولة الأولى من بكر (PCR #1): Tnk1 + Deg1، Tnk2 + Deg1 Tnk2 + Deg2، Tnk1 + Deg2. عندما لا تعمل مجموعة واحدة من الإشعال، استخدم مجموعة أخرى. إذا كان هذا الثاني مجموعة أيضا فشل، استخدم واحد آخر وهلم جرا. طفرات مقاومة كاناميسين عفوية نادرة جداً، وتنشأ على تردد < 10-10 34.
أثناء إعداد مكتبات الجينوم (الشكل 4)، يمكن التحقق من بضع خطوات. قص الحمض النووي من سونيكيشن ينبغي التأكد منه بالتفريد قاسمة في [اغروس] هلام (الشكل 5). عندما يتم المنفصمة الحمض النووي بشكل صحيح، شظايا من الحمض النووي يتراوح من 200 إلى 600 شركة بريتيش بتروليوم الإرادة تشويه في شكل 2% [اغروس] هلام. قبل إرسال مكتبات للتسلسل الفائق، توليد منتجات PCR فعل PCR المتداخلة يجب أن يؤكده [اغروس] هلام استشراد (الشكل 6).
بعد تجهيز ما يلي تسلسل يتبع البروتوكول هو موضح هنا (الجزء 4-2-)، تحدد تواتر كل متحولة في تجمع الإدخال وفي جميع الأنسجة باستخدام المعادلة في قسم 4.3.3. يتم حساب نسبة الإدخال/الإخراج لكل متحولة في كل الأنسجة مع المعادلة في القسم 4.3.4. يبين الشكل 7 مثالاً على النتائج التي تم الحصول عليها مع اقتراب Tn Seq. بدلاً من ذلك، يمكن استخدام الأداة الأرجواني لمعالجة وتحليل البيانات تسلسل 31. وتم تحديد طفرات بشكل يعتد به إحصائيا انخفاض وزيادة اللياقة البدنية. الطفرات في الجينات الفوعة ليبتوسبيرال المعروفة بسبب انخفاض اللياقة البدنية، والتحقق من صحة النهج Seq تينيسي.
رقم 1: وحدة الترشيح المستخدمة للاقتران. وحدة الترشيح يتم تجميعها عن طريق إدراج السدادة لدعم مرشح إلى جانب ذراع قارورة Erlenmeyer، تحديد المواقع مرشح اسيتات السليلوز إلى القاعدة مع الملقط المعقم، ثم وضع القمع على القاعدة، وتأمين النظام مع المشبك . وحدة الترشيح ثم متصل بنظام الشفط. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 2: تحديد مواقع الإدراج ينقول. (أ) نظام عرض مواقع انلينغ شبه عشوائي [بكر] كبسولة تفجير. كبسولة تفجير Tnk1 و Tnk2 يصلب قريبة من طرفي نقيض من ينقول (تينيسي). Deg1 هو أول كتاب 35-النوكليوتيدات يحتوي على امتداد 10 النيوكليوتيدات منحط متبوعاً تسلسل جاتات في نهاية 3 '. وتجري الجولة الأولى من بكر (PCR #1) مع Deg1 و Tnk1 أو Deg1 وكبسولة تفجير Tnk2. TnkN1 و TnkN2، تستخدم لبكر #2، يصلب بين نهايات ينقول و Tnk1 و Tnk2، على التوالي. تسلسل علامة التمهيدي مطابق لنهاية 5 ' التمهيدي Deg1. (ب) مثال على [اغروس] هلام التي تم الحصول عليها بعد الجولة الثانية من PCR مع 14 ينقول طفرات (الممرات 1 إلى 14). أجريت الجولة الأولى من PCR مع Deg1 و Tnk1؛ كان يتم في الجولة الثانية مع العلامة ويمثلها TnkN1. PCR إيجابي "+" و PCR سلبي ب "-". ويمثل "كمR" كاسيت المقاومة كاناميسين. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 3: الرسم البياني للحصول على بركة الإخراج. في يوم التحدي (يوم 0)، هو كل متحولة ليبتوسبيرال حسابها عن طريق الفحص المجهري الساحة المظلمة والمخفف بنفس الكثافة وجنبا إلى جنب لتشكيل تجمع الإدخال (التفاصيل الواردة في الفرع 2-1). وتحدي الهامستر إينترابيريتونيلي مع تجمع الإدخال. وبالإضافة إلى ذلك، بدأت الثقافات الثلاث مع تجمع الإدخال. في يوم التطعيم (يوم 0) وعندما تصل الثقافات كثافة ≈ 108/mL، وحوض الإدخال والثقافات التي تم جمعها باستخدام الطرد المركزي وتخزينها الكريات في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام (انظر الفرع 2-3). اليوم نقطة النهاية (اليوم مقدما تحديد إنهاء الحيوانات، مثلاً، بعد التحدي يوم 4)، هي euthanized الحيوانات؛ جمع الدم والكلى والكبد والمخزنة في-80 درجة مئوية حتى الاستخدام (انظر الفرع 2-4). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الشكل 4: مخطط تدفق إعداد مكتبة الجينوم. يتم استخراج الحمض النووي (A) من الدم والأنسجة أو الثقافات بعد البروتوكول هو موضح في القسم 3.1. مربع أحمر يمثل ينقول (تينيسي). (ب) "الحمض النووي" هو المنفصمة قبل سونيكيشن إلى شظايا بين 200 و 600 شركة بريتيش بتروليوم. وترد تفاصيل أخرى في المقطع 3.2. (ج) ج-ذيول (المربعات الصفراء) إضافة إلى جميع أجزاء الحمض النووي مع المحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT) كما هو موضح في القسم 3، 3 والجدول 4. مكتبة الجينوم أعدتها لتسلسل PCR المتداخلة (د-ه). يتم إجراء الجولة الأولى من PCR مع الإشعال TnkN3 و olj376 الخاصة ينقول وج-الذيل، على التوالي. انظر الجدول 3 و 5. تتضخم فقط الأجزاء التي تحتوي على نهايات ينقول (مربع أحمر). ملاحظة: استخدم التمهيدي olj376 3 مرات أكثر من TnkN3 لأن جميع شظايا من الحمض النووي ج-ذيول. وتجري الجولة الثانية من PCR مع pMargent2، المحددة لنهاية ينقول، والفهرسة التمهيدي، والذي يحتوي على تسلسل باركود ستة-قاعدة-زوج (باللون الوردي) السماح لجميع العينات يكون متعدد في ممر تسلسل واحد. انظر الجدول 3 و 6. كلا كبسولة تفجير تحتوي على تسلسلات اللازمة لربط التدفق الخلية أثناء إيلومينا التسلسل (المربع الأخضر والأرجواني). يتم تنظيف المنتجات (و) PCR الناتجة ومن ثم يتم قياس التركيز كما هو موضح في المقطع 3.6. (ز) ويتم تجميع كافة مكتبات الجينوم معا؛ كل مكتبة باركود مختلفة ويتم إرسالها (ح) التجمع إلى منصة التسلسل. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
الرقم 5: سونيكيشن من الحمض النووي- تمت تنقية الحمض النووي من الكبد الهامستر المصابين الثمانية (الممرات 1 إلى 8)، سونيكاتيد، ودرست بالتفريد في 2% [اغروس] هلام. الحمض النووي المنفصمة يتسم بمسحه التي يكون فيها حجم معظم الشظايا بين 200 و 600 هناك الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 6: مكتبات الجينوم للتسلسل الفائق. وأعدت أستيد بكر مع الحمض النووي من دم قداد المصابين الثمانية (الممرات 1 إلى 8) مكتبات الجينوم ودرست بالتفريد في 2% [اغروس] هلام. حجم معظم منتجات PCR بين 200 ويظهر 600bp-مراقبة سلبية (لا التمهيدي TnkN3 في مزيج PCR #1، انظر الجدول 5) أي تضخيم (غير معروضة). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 7: اللياقة بدنية طفرات من تجربة تينيسي Seq. اللياقة بدنية بركة طفرات في الكلي الهامستر 4 أيام بعد التحدي (مقتبس من لورداولت لدراسة17). تم تحديد نسبة الإدخال/الإخراج جميع طفرات 42 لكل الحيوانات. يدعى كل متحولة بالجينات (يسانس) أو منطقة إينتيرجينيك (إنتر) ينقول ويتم إدراج أو الاسم استخداماً في الأدب. ويمثل كل نسبة الماس الأسود. كان متوسط نسب (الخط الأحمر) مصممة لكل متحولة ومقارنة 1.0 باستخدام اختبار التصنيف الرتبي. ويمثل الخط المنقط اللياقة بدنية 1.0، الذي يتوافق مع اللياقة البدنية محايدة. يتم وضع علامة طفرات اللياقة البدنية الذي يتأثر إلى حد كبير بعلامات نجمية: * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| الكواشف | وحدة التخزين لرد فعل واحد |
| مزيج الرئيسي 2 X | ميليلتر 12.5 |
| التمهيدي 1، 10 مم (TnK1 أو TnK2) * | ميليلتر 1.2 |
| التمهيدي 2، 10 مم (Deg1 أو Deg2) * | ميليلتر 1.2 |
| المياه | ميليلتر 8.8 |
| قالب (الخلايا ليستي أو الحمض النووي) | 1.3 ميليلتر |
| الحجم النهائي | 25 ميليلتر |
| * التمهيدي متواليات في الجدول 3. |
الجدول 1: تحديد موقع الإدراج ينقول، شبه عشوائي بكر #1 ميكس-
| الكواشف | وحدة التخزين لرد فعل واحد |
| مزيج الرئيسي 2 X | ميليلتر 12.5 |
| التمهيدي 1، 100 ملم (TnKN1 أو TnKN2) * | ميليلتر 0.2 |
| التمهيدي 2، 100 ملم (العلامة) * | ميليلتر 0.2 |
| المياه | ميليلتر 10.1 |
| [بكر] منتوجات من [بكر] #1 | ميليلتر 0.8 |
| الحجم النهائي | 25 ميليلتر |
| * التمهيدي متواليات في الجدول 3. |
الجدول 2: تحديد موقع الإدراج ينقول، شبه عشوائي بكر #2 ميكس-
| الاسم | تسلسل (5 '-3') | مرجع | ||||
| الإشعال المستخدمة لبكر شبه عشوائي | ||||||
| Tnk1 | كتجتكاتكجتكاتككتج | 15 | ||||
| Tnk2 | جتجكتتاتجاتكتجج | |||||
| Deg1 | جككاكجكجتكجاكتاجتاك جاتاتننننننننن | |||||
| Deg2 | جككاكجكجتكجاكتاجتاكنننننننننتكتت | |||||
| TnkN1 | كجتكاتجتكتتجتاجتكتاتج | |||||
| TnKN2 | تجججاتكاجككتجاتجج | |||||
| العلامة | جككاكجكجتكجاكتاجتاك | |||||
| الإشعال المستخدمة للتسلسل إيلومينا | ||||||
| TnkN3 | كجججاجاكاجتاتجتكجاجكتاتتتتتجاكتاكتجججاتكاجككتجاتجج | 17 | ||||
| olj376 | جتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكتججججججججججججججج | 6 | ||||
| pMargent2 | آتجاتاكجكجاككاككجاجاتكتاكاكتكتتككجججاكتاتكاجككاككتجتا | |||||
| الملكية الفكرية 1 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | إيلومينا التسلسل (الرموز الشريطية بخط غامق) | ||||
| الملكية الفكرية 2 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأكاتكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 3 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 4 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتجتكاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 5 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكاكتجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 6 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأتتجكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 7 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاتكتججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 8 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتكاجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 9 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتجاتكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية في 10 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتآجكتاجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 11 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجتاجككجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 12 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتاكاججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 13 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتجاكتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 14 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاكتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 15 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتجاكاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| IP 16 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجاكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 17 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتكتاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 18 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجكجاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 19 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتتكاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| IP 20 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجككاكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| IP 21 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجااكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 22 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكجتاكججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 23 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتككاكتكجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 24 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجكتاككجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 25 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأتكاجتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 26 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتجكتكاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 27 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتأجاتجتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 28 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتكتتتتججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| الملكية الفكرية 29 | كاجكاجاجاكجكاتاكجاجاتتاجتججتجاكتجاجتكاجاكجتجتجكتكتككجاتكت | |||||
| IP seq | جاتكجاجاجكاكاكجتكتجاكتككاجتكاك | |||||
| pMargent3 | أكاكتكتتككجججاكتاتكاجككاككتجتا | 6 | ||||
الجدول 3: تسلسل التمهيدي.
| الكواشف | وحدة التخزين لرد فعل واحد |
| الحمض النووي المنفصمة | 500 نانوغرام (انظر المعادلة في 3.3.2). |
| المياه | ميليلتر تصل إلى 14.5 |
| 5 x TdT المخزن المؤقت | 4 ميليلتر |
| (9.5 مم دكتب + دكتب 0.5 مم) مزيج * | 1 ميليلتر |
| TdT (30 U/ميليلتر) | 0.5 ميليلتر |
| الحجم النهائي | 20 ميليلتر |
| * 3 ميكس µLof 10 مم دكتب وميليلتر 5.7 من 100 مم دكتب 51.3 ميليلتر من الماء | |
الجدول 4: ج-تراجع رد الفعل مع المحطة الطرفية ديوكسينوكليوتيديل ترانسفيراز (TdT)-
| الكواشف | وحدة التخزين لرد فعل واحد | |
| رد مكتبة | مراقبة رد فعل | |
| ماجستير مزيج 2 x | ميليلتر 12.5 | ميليلتر 12.5 |
| التمهيدي 1، 30 ميكرون (TnkN3) * | 0.5 ميليلتر | - |
| التمهيدي 2، 30 ميكرون (olj376) * | 1.5 ميليلتر | 1.5 |
| المياه | ميليلتر 7.5 | ميليلتر 8 |
| ج-الذيل الحمض النووي | 3 ميليلتر | 3 ميليلتر |
| الحجم النهائي | 25 ميليلتر | 25 ميليلتر |
| * التمهيدي متواليات في الجدول 3. | ||
الجدول 5: بناء الجينومي المكتبة، مزيج PCR #1-
| الكواشف | وحدة التخزين لرد فعل واحد | |
| رد مكتبة | مراقبة رد فعل | |
| ماجستير مزيج 2 x | 25 ميليلتر | ميليلتر 12.5 |
| التمهيدي 1، 30 ميكرون (pMargent2) * | 0.5 ميليلتر | ميليلتر 0.25 |
| التمهيدي 2، 30 ميكرون (الفهرسة التمهيدي) * | 0.5 ميليلتر | ميليلتر 0.25 |
| المياه | ميليلتر 23 | ميليلتر 11.5 |
| [بكر] منتوجات من [بكر] #1 | 1 ميليلتر | 0.5 ميليلتر |
| الحجم النهائي | 50 ميليلتر | 25 ميليلتر |
| * التمهيدي متواليات في الجدول 3. | ||
الجدول 6: بناء مكتبة الجينوم، مزيج PCR #2.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
على الرغم من أن يتم عرض النتائج من لدينا تجربة رائدة لتحدي إينترابيريتونيلي مع 42 إينتيروجانس L. طفرات الهامستر17، ونتوقع أن تجمعات أكبر من طفرات يمكن أن يكون صاحبها ما يليها تينيسي لأن تواتر ترانسكونجوجانتس منخفضة (100-200 ترانسكونجوجانتس/التزاوج)، ماتينجس عدة ضرورية لإنشاء عدد كاف من طفرات كبيرة Tn Seq التجارب. الحفاظ على عدد كبير من طفرات في الثقافات السائل يعرض التحديات اللوجستية التي يجب معالجتها. يمكن المحتضنة الثقافات في لوحات عميقة 96-جيدا. يمكن رصد كثافة الثقافة بقراءات الكثافة البصرية في جهاز المطياف الضوئي تعيين إلى 420 نانومتر. تحديد عدد الحيوانات استخدام يعتمد جزئيا على حجم تجمع الإدخال ويجب أن تتقرر بتحليل الطاقة. لإجراء تجارب على نطاق واسع، نوصي بإجراء تحليل السلطة بالتشاور مع بيوستاتيستيسيان.
يمكن أن تؤثر الاختناقات استرداد طفرات عشوائية من تجمع الإخراج. على الرغم من أن لم تراع اختناقات شديدة في الدراسة التجريبية لدينا17 (الشكل 7)، تجارب واسعة النطاق قد تتأثر بفقدان طفرات عشوائية. زيادة جرعة التحدي عن طريق زيادة عدد الخلايا كل المسخ في تجمع الإدخال سيتم تقليل احتمالية حدوث اختناقات35. توفر أداة غالاكسي المنشورة حديثا أرجواني الأداة اللازمة لتقييم الاختناقات واللياقة البدنية31.
تجارب Tn Seq المخططة لمسار بديل للعدوى، الأخرى Leptospira السلالات، أو نماذج القوارض الأخرى تتطلب اعتبارات إضافية. إذا كان لا يعرف الحركية العدوى في الأنواع المضيفة أو ليس الأسى باستمرار أثناء الإصابة داخل كل الأنسجة لفحصها، ينبغي الحصول على الحمض النووي من استزراع الأنسجة بدلاً من الأنسجة مباشرة. هذه الخطوة الإضافية سيتم تصغير الإفراط متحولة اللياقة البدنية بسبب الكشف عن الحمض النووي من القتلى اللولبية. إذا كان يتم الحصول على التجمع الناتج من استزراع الأنسجة، ينبغي مثقف تجمع الإدخال لمعالجة الآثار للنمو في المختبر . كما نوصي بتجربة رائدة مع عدد صغير من طفرات لتحديد ما إذا كانت الاختناقات ستكون مصدر قلق ومساعدة تحليل السلطة لإجراء تجارب على نطاق واسع.
سوف تتطلب تأكيدا للياقة غيرت حسبما تقرره Tn Seq اختبار طفرات الفردية في نموذج الحيوان. حاليا، يجب أن التسلسل كل متحولة على حدة قبل Tn-Seq تحديد المسخ تحمل الإدراج في الجينات للفائدة. ومع ذلك، إذا كان استبدال اليل في الممرضة Leptospira يصبح من السهل، تسلسل طفرات الفردية لم يعد سيكون ضروريا. بدلاً من ذلك، استخدمت بنجاح النسخ الشبيهة بالمنشط المستجيبة يقلل ولنس تعبير الجينات في إينتيروجانس ل36. يمكن استخدام هذا الأسلوب لأسفل-تنظيم الجينات تعطل في طفرات مع اللياقة البدنية غيرت حددها Tn-ما يليها
عند تفسير البيانات Seq تينيسي، والتفاعلات بين البكتيريا ينبغي أن تؤخذ في الاعتبار. فمن الممكن نظرياً أن انخفاض اللياقة البدنية يمكن أن يكون نتيجة للتنافس بين طفرات بدلاً من تأثير مباشر للإدراج ينقول. بالإضافة إلى ذلك، يمكن أن يكون عدم وجود تغيير في فيفو اللياقة البدنية من متحولة في بركة بسبب التعاون بين طفرات. على سبيل المثال، يمكن استكمال متحولة يفشل في إنتاج عامل أساسي إينتيرسيلولارلي بإنتاج عامل بطفرات أخرى في المجمع. لاحظنا زيادة في اللياقة البدنية لطفرات عدة، التي قد تكون نتيجة لانخفاض عبء الأيضية توليف لم تعد البروتينات التي ليست ضرورية للنمو، كما هو مبين على انتيريكا السالمونيلا37.
يمكن استخدام هذا البروتوكول لتحديد الجينات المتورطين في عملية الأيض أو البقاء على قيد الحياة تحت ظروف ضاغطة في المختبر 38،39. على سبيل المثال، تزايد Leptospira في ظروف مختلفة مثل تركيز عالية من كلوريد الصوديوم والحديد المحدودة، والأس الهيدروجيني الحمضية يمكن التعرف على الجينات المسؤولة عن مقاومة حمضية البقاء على قيد الحياة أو الإجهاد. يمكن أيضا إجراء هذه التجارب في المختبر مع saprophytic سلالات مثل سلالة بيفليكسا L. باتك أنا لأنه يمكن تطبيق هذا الأسلوب Tn Seq لكل متسلسلة سلالات Leptospira .
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
أيد هذا العمل على "جائزة الجدارة شؤون قدامى المحاربين" (إلى D.A.H.)، و "المعهد الوطني للصحة" منح R01 منظمة العفو الدولية 034431 (D.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
