Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום Leptospira interrogans Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

נתאר כאן טכניקה המשלבת מוטגנזה מכוונת transposon עם תפוקה גבוהה רצף כדי לזהות ולכמת transposon מוטציות leptospiral ברקמות לאחר אתגר של אוגרים. פרוטוקול זה יכול לשמש המוטנטים מסך עבור הישרדות והפצה בבעלי חיים, ניתן להחיל גם על מחקרים במבחנה .

Abstract

כתב יד זה, אנו מתארים transposon של רצף (Tn-Seq) טכניקה כדי לזהות ולכמת מוטציות Leptospira interrogans משתנה בכושר במהלך זיהום של אוגרים סוריים הזהב. Tn-Seq משלב מוטגנזה מכוונת transposon אקראיים עם הכוח של טכנולוגיה רצף תפוקה גבוהה. חיות מאותגרים עם בריכה של מוטציות transposon (בריכה קלט), ואחריו לקצירת של דם ורקמות כמה ימים מאוחר יותר כדי לזהות ולכמת את מספר מוטציות כל איבר (פלט בריכות). הבריכות פלט מושווים למאגר הקלט כדי להעריך את כושר ויוו של כל מוטציה. גישה זו מאפשרת הקרנת בריכה גדולה של מוטציות במספר מוגבל של בעלי חיים. עם שינויים מזעריים, פרוטוקול זה יכול להתבצע עם כל במודל חיה של לפטוספירוזיס, מאגר מודלים מארח כגון חולדות ומודלים זיהום אקוטי כמו אוגרים, כמו גם מחקרים במבחנה . Tn-Seq מספק כלי רב עוצמה למסך מוטנטים בעלי מומים כושר ב- vivo ו- in vitro לקשרי .

Introduction

זיהוי של גנים התקפה אלימה של חיידקים מסוימים, כגון Leptospira spp., קשה בגלל מספר מוגבל של גנטי הכלים הזמינים. גישה אחת נפוץ הוא יצירת אוסף של מוטציות על-ידי transposon אקראיים מוטגנזה מכוונת ואחריו הזיהוי של האתר הכניסה כל מוטציה ובדיקות התקפה אלימה של מוטציות transposon בודדים במודל חיה. גישה זו היא גוזלת זמן יקר, ודורש מספר גדול של בעלי חיים.

כאשר מוטגנזה מכוונת אקראי פותחה לראשונה על המחלה Leptospira interrogans, גנים המעורבים התקפה אלימה אותרו על-ידי בדיקת מוטציות בודדות המודל החייתי1. מוטציות נבחרו על סמך קריטריונים של תפקידיהם פוטנציאליים איתות או תנועתיות או שלהם החזוי הממברנה החיצונית או מיקום משטח. כמו ברוב חלקי leptospiral גנים קידוד חלבונים היפותטי של פונקציה לא מוכרות2, בחירת מוטציות בהתבסס על מגבלות קריטריונים אלה היכולת לגלות leptospiral הרומן גנים התקפה אלימה.

לאחרונה, בריכות של ל' interrogans transposon מוטציות הוקרנו על infectivity של אוגר ועכבר מודלים3. כל בעל חיים היה אתגר עם בריכה של מוטציות עד 10. Infectivity של מוטציה היה הבקיע חיובי אם זה זוהה על ידי ה-PCR של תרבויות המתקבל דם וכליות. בדיקת PCR היה מפרך כי זה נדרש לתגובה PCR נפרדים עבור כל מוטציה בבריכה. בגלל התדירות של כל מוטציה בתרבויות לא הייתה לכמת, הגישה היה מוטה לטובת זיהוי של מוטציות הקלוש ביותר.

אנו מתארים transposon של רצף (Tn-Seq) טכניקה, כאסטרטגיה למסך בצורה יעילה יותר עבור גנים התקפה אלימה. Tn-seq מורכב היצירה של ספריה של מוטציות על ידי מוטגנזה מכוונת transposon ואחריו רצף מקביל מסיבי4,5,6. בקצרה, מוטציות transposon איחדו, מחוסן חיות, התאוששה מאוחר יותר איברים שונים (פלט בריכות). ה-DNA של הבריכות פלט חילוץ, מתעכל עם אנזימי הגבלה או לכסנתם על ידי sonication. שני סיבובים של PCR פילוח של צמתים של האתרים ההכנסה transposon מבוצעות. שלב זה מאפשר התוספת של מתאמים הצורך עבור הרצף. המוצרים PCR וכתוצאה מכך הם נותחו על ידי רצף תפוקה גבוהה לזיהוי האתר הכניסה transposon של כל מוטציה של הבריכה יחד עם שפע היחסי שלהם, אשר הוא לעומת ההרכב הראשוני של הבריכה של מוטציה.

היתרון העיקרי של גישה זו היא היכולת למסך בו זמנית מספר רב של מוטציות עם מספר קטן של בעלי חיים. Tn-Seq אינו דורש ידע מוקדם של האתרים ההכנסה transposon אשר מגדיל את הסיכויים של גילוי חדש Leptospira-גנים ספציפיים המעורבים התקפה אלימה עם פחות זמן ויעילות רבה יותר. כי נטל leptospiral ברקמות הוא גבוה יחסית מכרסם מודלים זיהום רגישים קטלני (בדרך כלל 104 108 חיידקים/גרם של רקמת)7,8,9 באותה מידה כמו מאגר המארחים 10,11, רקמות ניתן לנתח ישירות ללא צורך תרבות, צמצום הטיות עקב הצמיחה במבחנה .

במחקרים Tn-Seq עם רוב פתוגנים חיידקיים שתוארו עד כה, התדר של מוטגנזה מכוונת insertional מותרים זיהום עם בריכות גדולות המכיל מוטציות קולקטיבי שיש הוספות המרווחות מקרוב transposon מרובות בתוך כל ג'ין4 ,12,13,14. Tn-Seq גם פותחה עבור חיידק אשר תדירות מוטגנזה מכוונת היא נמוכה יותר,6. עם Leptospira, ספרייה של מוטציות transposon יכול להיווצר על ידי החדרת את transposon על פלסמיד mobilizable על-ידי ההטיה כפי שתואר על ידי Slamti et al15. עם זאת, התדירות של מוטגנזה מכוונת transposon של ל' interrogans הוא נמוך. כאשר transposon Himar1 הוצג על פלסמיד conjugative, תדירות transconjugant דווחה רק 8.5 x 10-8 לכל נמען תא עם המתח לאי של ל' interrogans16 , סביר להניח שתהיה מסכן באופן דומה עם רוב זנים אחרים של ל' interrogans. פרוטוקול המתואר כאן הוא בחלקו מבוסס על שפותחה עבור Borrelia burgdorferi, שבו תדירות מוטגנזה מכוונת insertional transposon היא גם נמוכה6.

עבור שלנו פיילוט עם פרוטוקול ה-17, ערכנו מוטגנזה מכוונת transposon עם ל' interrogans serovar Manilae זן L495 בגלל ההצלחה של קבוצות אחרות לבודד מוטציות ההכנסה transposon בנימה זו יחד עם שלה נמוך LD50 (מנה קטלנית) התקפה אלימה1. אנו מוקרן מוטציות 42 על ידי Tn-Seq, זיהו כמה מועמדים מוטציה פגומה בהתקפה אלימה, כולל שני עם הוספות בגן אדנילאט cyclase המועמד. בדיקה אישית של המוטציות שני באוגרים אישר כי הם היו בנכונותם התקפה אלימה17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

התראה: זנים פתוגניים של Leptospira spp. להיות מטופלת תחת נהלים הבלימה אבטחה ברמה 2 (BSL-2). חובה ללבוש ציוד מגן אישי המתאים (עיקרון השוויון הפוליטי). הקבינט Class II אבטחה יש להשתמש עבור כל המניפולציות של פתוגניים Leptospira spp.

1. הקמת Transposon ספריית מוטנטים15

  1. העברת transposon לתוך spp Leptospira . על ידי ההטיה (איור 1)
    1. לחסן נפח של מעריכי-פאזי התרבות של spp. Leptospira פתוגניים המתאים 107 תאים לתוך 10 מ"ל של Ellinghausen-מקלו-ג'ונסון-האריס-18,(EMJH)-בינוני-19. דגירה ב 30 ° C עם סל"ד 150 לרעוד עד הצפיפות מגיע 2-8 x 108 תאים למ"ל.
      הערה: הזמן ההכפלה של leptospires פתוגניים הוא 12 עד 24 שעות, בהתאם המתח.
    2. לחסן µL 50 מתוך התורם Escherichia coli זן β216320 נושאת את פלסמיד (pCjTKS2) mobilizable transposon16 לתוך 5 מ"ל לוריא מרק (LB) בתוספת 0.3 מ מ 2, 6-diaminopimelicacid (DAP), µg 50/מיליליטר kanamycin (ק מ), 50 µg/mL spectinomycin (Spc) ומקום לילה בחממה 37 ° C-255 סל ד.
    3. לחסן µL 60 של e. coli תאים לתוך 3 מ"ל של EMJH בתוספת 0.3 מ מ של DAP (EMJH + DAP). דגירה ב 37 מעלות צלזיוס ב 255 rpm עצבנות עבור 3-4 h עד ≈600nmOD 0.3.
    4. להרכיב את יחידת סינון (איור 1), מניחים את הבסיס על 125 מ לנשק צד Erlenmeyer את הבקבוק, מקם מסנן תאית אצטט (גודל הנקבוביות 0.1 מ"מ; קוטר 25 מ מ) על בסיס, ו מהדק המשפך על גבי הבסיס. לחבר את יחידת סינון מערכת ואקום.
    5. הוסף 5 מ של Leptospira spp. תרבות, 0.5 mL התרבות החיידק לאבדון. אני יודע את הנוזל דרך המסנן.
    6. להעביר את המסנן עם פני השטח של חיידקים פונה כלפי מעלה אל EMJH + DAPplate. דגירה ב 30 מעלות צלזיוס למשך הלילה עם המסנן פונה כלפי מעלה.
    7. למקם את המסנן לתוך צינור 15 מ"ל המכיל 1 מ"ל של EMJH ו מערבולת 10 s כדי לשחרר את החיידקים לתוך כלי התקשורת. מורחים µL 200 של התליה על 5 EMJH platescontaining 50 µg/mL של ק מ באמצעות חרוזי זכוכית סטריליים 1 מ 10-15 או של מפזר חד פעמי סטרילי. לעטוף את הצלחות עם מצלמות-מיקרוסקופים, דגירה אותם הפוך ב 30 מעלות צלזיוס במשך 3-4 שבועות עד מושבות גלויים.
    8. העברת המושבות בנפרד לתוך 3 מ"ל של EMJH המכילה µg/mL 50 ק מ (EMJH + ק מ) ב 30° C תחת סל ד 150 עצבנות 7 עד 10 ימים עד התרבות מגיע צפיפות של ≈ 108/mL.
      הערה: תרבויות שניתן לאחסן ב- 80 ° C או בחנקן נוזלי (עם 4% גליצרול).
  2. זיהוי של אתר ההכנסה transposon על ידי ה-PCR מקוננים (איור 2)
    1. Lyse 50 µL של כל מוטציה transposon ב המבחנות על ידי דגירה ב 95 מעלות צלזיוס למשך 15 דקות.
      הערה: ה-DNA אפשר לטהר במקום, באמצעות ערכת חילוץ הדנ א.
    2. הכינו את התמהיל PCR עם Deg1 ו- Tnk1 תחל (טבלה 3) על פי טבלה 1. להעביר כל שפופרת PCR µL 23.7 של לערבב ולהוסיף 1.3 µL של תאים lysed. הפעל את התוכנית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; 40 מחזורי: 95 ° C 15 s, 40 ° C עבור 1 דקות, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    3. לעשות את המיקס PCR עם תג ו TnkN1 תחל (טבלה 3) על פי בטבלה 2. להעביר כל שפופרת PCR 24.2 µL של לערבב ולהוסיף 0.8 µL של ה-PCR #1 תגובה. הפעל את התוכנית: 95 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות; מחזורים 35: 95 ° C 15 s, 55 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
    4. להפעיל 3 µL של מוצרי ה-PCR על 1% agarose ג'ל עם מאגר 1 X טריס-אצטט-EDTA (טה) ב 10-15 V/ס מ (איור 2B).
    5. לטהר את מוצרי ה-PCR של דגימות חיוביות באמצעות ערכת טיהור PCR. Elute DNA עם נפח הנמוך ביותר המותר ע י הערכה על מנת למקסם את הריכוז של ה-DNA התאושש.
    6. שולח המוצרים PCR מטוהרים סנגר רצף באמצעות פריימר של TnkN1 (טבלה 3).
    7. לזהות את האתרים הכניסה על ידי השוואת את הרצף שנוצר עם רצף הגנום של המתח הורים על ידי ניתוח BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) או באמצעות מסד הנתונים (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) SpiroScope21.
    8. אשר האתר ההכנסה של transposon על ידי ה-PCR באמצעות תחל ועוברים תהליך ריפוי כדי הרצפים מארח איגוף.
      הערה: transposon מגדילה את הגודל של הרצף פראי-סוג ≈ 2 kb.

2. חיות ניסוי (איור 3)

  1. תרבות של מוטציות Leptospira
    1. לגדול באופן אינדיבידואלי לכל transposon שנבחר מוטציה ב- 10 מ"ל של EMJH + ק ב 30 ° C-150 סל ד עצבנות על צפיפות של7-108 10 leptospires/mL.
    2. את leptospires בדילוגים של מיקרוסקופיית שדה אפל עם מונה Petroff-Hausser, או כפי שמתואר על ידי מילר23.
    3. לדלל כל תרבות ב EMJH כדי צפיפות זהה, למשל 106 תאים למ"ל.
    4. להרכיב את הבריכה קלט, מערבבים יחד את התרבויות מדולל בכמויות שוות.
      הערה: כוללים פקדים בבריכה קלט על-ידי הוספת מוטנטים בעלי כושר הידוע מומים כגון loa2217,24 מוטציות עם כושר שהודעה כגון ligB17,25, בהתאמה. ניתן לאחסן בריכות של מוטציות עם 4% גליצרול ב-80 מעלות צלזיוס או חנקן נוזלי.
  2. אתגר
    הערה: בשיטות המתוארות כאן אושרו על ידי ותיקי לענייני גדול בלוס אנג'לס מוסדיים חיה על עצמך ועל שימוש הוועדה (פרוטוקול #09018-14).
    1. מזריקים intraperitoneally 1 מ"ל של מאגר קלט כדי כל חיה מזרק אינסולין U-100 עם מחט 26G x ½".
      הערה: בניסוי פיילוט, חיות 8 היו תגר עם 1 מ"ל של מאגר קלט, קרי, 106 חיידקים סה כ17. הזיהום הורשה להמשיך במשך 4 ימים לפני המתת חסד.
    2. לאסוף 10 מ"ל של מאגר קלט, ספין במשך 20 דקות ב- 3,220 x g... הסר בזהירות את תגובת שיקוע מבלי להפריע בגדר. לאחסן בגדר תא ב- 80˚C עד לשימוש (שלב 3.1.3).
    3. לפקח על החיות מדי יום עד שהם מסתיימות כאשר הקצה שנקבע מראש. שוקל את האוגרים מדי יום ולחפש נקודת הקצה קריטריונים: אובדן תיאבון, הילוך או נושם קושי, השתטחות, פרווה הסתור, או אובדן > 10% מן המשקל המרבי השיגו.
  3. ניסויים במבחנה
    1. ביום של אתגר, לחסן 3 מבחנות של 25 מ של EMJH + ק מ 5 מ של מאגר קלט. לגדול תרבויות ב 30 ° C תחת סל ד 150 עצבנות.
    2. לספור את leptospires מדי יום באמצעות אחת מהשיטות של סעיף 2.1.2. הצפיפות מגיעה ≈ 1 x 108/mL, ספין לאורך כל השעיה במשך 20 דקות ב 3,220 x g.
    3. לאחסן את כדורי תא ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  4. איסוף ואחסון של רקמות
    1. המתת חסד החיות באמצעות אינהלציה איזופלוריין ואחריו ניקור חזה הדו-צדדיים26.
    2. מיד לאסוף 1 עד 2 מ של דם על ידי ניקוב לב עם מזרק 3 מ"ל ו מחט 25G x 5/8". להעביר את הדם לתוך שפופרת המכילה EDTA. מערבבים על-ידי היפוך, 5-6 פעמים.
    3. לאסוף את אחת הכליות לתבנית ל ½ של האונה החציוני הגחון של הכבד לתוך cryotubes.
    4. לאחסן לרקמות ב- 80 ° C עד השימוש.

3. הקמת ספריות גנומית עבור תפוקה גבוהה רצף (איור 4)

  1. הפקת דנ א
    1. מיצוי DNA מהדם.
      1. העברה µL 100 של דם EDTA ברכבת התחתית צינור microcentrifuge.
      2. לטהר הדנ א באמצעות ערכת חילוץ הדנ א. בצע הוראות היצרן.
    2. מיצוי הדנ א של רקמות.
      1. באמצעות ואזמלי מנתחים ומספריים, הקוביות בין 50 ל-80 מ"ג של כל איבר לחתיכות קטנות (1 מ"מ x 1 מ"מ), להעביר אותם לתוך צינור יבשה סטרילית בורג-קאפ. למדוד את המשקל של רקמות עם מאזן דיוק.
      2. להוסיף 500 µL ל- PBS סטרילי לתוך הצינור.
      3. Homogenize דגימות באמצעות מפצל עבור 1 דקות ב- 5 תנועות לשניה.
      4. לחשב את עוצמת הקול המתאים 25 מ ג של רקמה באמצעות המשוואה הבאה:
        Equation 1
      5. להעביר את אמצעי האחסון מחושב לתוך ערכת חילוץ דנ א. להמשיך עם טיהור DNA ההוראות של היצרן.
    3. מיצוי DNA מתרבויות בריכה, במבחנה קלט.
      1. הפשרת כדורי חיידקי בטמפרטורת החדר למשך 5-10 דקות.
      2. להמשיך עם מיצוי DNA ההוראות המלווה את הקיט.
    4. מאגר DNA ב-80 מעלות צלזיוס עד השימוש.
  2. הטיית ה-DNA (איור 5)
    1. העברת µL 50 של DNA שחולץ על גבי צינור microcentrifuge 1.5 mL.
    2. מקם את הצינורות לתוך ארון התקשורת של הקרן sonicator כוס מלאה במים קרים (4 ° C).
    3. הפעל את sonicator למשך 3 דקות בעוצמה 80% עם 10 s על הדופק ו- 5 s מחוץ דופק.
      התראה: ללבוש מצמדים האוזן או אטמי אוזניים להגן על השמיעה.
    4. לרוץ µL 2.5 של הוטו דנ א על 2% agarose ג'ל כדי לאשר כי רוב ה-DNA הוא < 600 bp בגודלם.
  3. תוספת של C-זנב
    1. למדוד ריכוז ה-DNA עם ספקטרופוטומטרים נפח קטן.
    2. חישוב נפח המתאימים 500 ננוגרם של ה-DNA באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 2
    3. להכין את התגובה עוקב (טבלה 4). דגירה h 1 ב 37 מעלות צלזיוס; הפוך ללא פעיל ב 75 מעלות צלזיוס למשך 20 דקות.
      הערה: לקבלת דוגמאות המחייבים התאמת נפח גדול מ- 14.5 µL, להגדיל את נפח סופי של תגובה 40 µL ולמדרג הרכיבים הנותרים בהתאם.
    4. לנקות את הדגימות עם ערכת טיהור PCR. Elute ה-DNA עם µL 12 • תנאי המאגר.
  4. PCR מקוננים
    1. PCR #1
      1. הכנת תערובות PCR על פי טבלאות 3 ו -5. להעביר µL 22 של המיקס ספריית כל שפופרת PCR ולהוסיף 3 µL של ה-DNA מטוהרים. להמשיך באופן דומה עם המיקס שליטה.
        הערה: פריימר TnkN317 היא ספציפית transposon והיא תחל olj3766 ספציפי זנב C. המיקס שליטה חסר מן המפתח TnkN3, אשר במיוחד מטרות של transposon.
      2. הפעל את התוכנית הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; מחזורים 24: 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    2. PCR #2.
      1. להכין את תערובות PCR השני על פי טבלאות 3 ו 6. µL 49 של המיקס ספריית להעביר כל שפופרת PCR ולהוסיף 1 µL של תגובה ספריית ה-PCR #1. להעביר µL 24.5 של המיקס שליטה כל שפופרת PCR ולהוסיף 0.5 µL של ה-PCR #1 שליטה תגובה.
        הערה: פריימר pMargent2 ספציפית transposon, תחל IP6 מכילים 6-בסיס-זוג ברקוד רצפים ספציפיים מזוהה על-ידי פלטפורמת הדור הבא רצפי.
      2. הפעל את התוכנית הבאה: 95 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 18 מחזורים: 95 ° C ל 30 s, 60 ° C ל 30 s, 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות; 72 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות.
    3. הפעל 3 µL על 2% agarose ג'ל. הספרייה צריכה להראות כתם עם הרוב של האות בין 200 ל 600 bp (איור 6) ואין הגברה עבור התגובה שליטה.
  5. טיהור של מוצרי ה-PCR.
    הערה: לנקות את ספריות גנומית עם ערכת טיהור PCR ההוראות של היצרן. Elute ה-DNA עם 30 µL • תנאי המאגר.
  6. מודדים את ריכוז הדנ א באמצעות של fluorometer. קריאות בממוצע 2-3.
  7. לחשב את הנפח של כל ספריה שקול ל- 15 או 20 ng באמצעות המשוואה הבאה:
    Equation 3
  8. לערבב כל ספריות יחד על פי חישוב הקודם. לקבוע את ריכוז מולרי של ה-DNA עם המשוואה באתר האינטרנט הבא:
    http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
    התראה: ריכוז ה-DNA ובדרישות אחסון תלויים פלטפורמת רצף.

4. תפוקה גבוהה רצף וניתוח נתונים

  1. רצף
    1. רצף ספריות כמו 64 bp יחיד-end קריאות באמצעות pMargent3 תחל את רצף מותאם אישית ומהצמיגים רצף מסחרי רגיל. פלטפורמת רצף יספק לכם FastQ קבצים עם כל רצף קריאות.
  2. לניתוח עם גלקסיה תוכנה
    1. הורד את הקובץ רצף הגנום
      1. בהבית של מסד הנתונים של SpiroScope (ראה שלב 1.2.7 בקישור), בחר את האורגניזם המשמש את הניסוי ולחץ על "טען לתוך הגנום הדפדפן".
      2. הכלים (בסמוך לחלקו העליון של דף הבית), בחר באפשרות "חיפוש/ייצוא > להוריד נתונים", בשורה "רצף (fasta)", לחץ על הגנום"כדי להוריד את הרצף.
      3. פתח את הקובץ באמצעות פנקס רשימות (PC) או TextEdit (Mac) ושנה את הכרומוזום (לדוגמה "המו"). לשמור על הפורמט fasta.
      4. בצע את השלבים אותם להוריד את רצף כרומוזום II. לשלב שני רצפים כרומוזום לתוך קובץ. txt יחיד על-ידי העתקה והדבקה.
        הערה: רצף כרומוזום יכול גם להיות שהורדה מהאתר NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) ושולבו קובץ. txt יחיד.
    2. העלאת קבצים לשרת גלקסי
      הערה: גלקסיה הוא קוד פתוח, הפלטפורמה מבוססת אינטרנט לניהול נתונים ביואינפורמטיקה אינטנסיבית זרימות עבודה27,28,29,30 , ניתן לגשת https://usegalaxy.org/.
      1. בתפריט כלים, בחר "לקבל נתונים > העלאת קובץ מהמחשב שלך". גרור להוריד את הקבצים .fastq שנוצר על-ידי הפלטפורמה רצף לתוך החלון ולאחר מכן לחץ על "התחל".
      2. בצע את השלבים באותו להעלות את הקובץ. txt Leptospira רצף הגנום.
    3. החתן קורא
      1. בחר "הגדרות: QC ומניפולציה > FASTQ התספורת" מתפריט כלים.
      2. ליד קובץ החתן, בחר את הספריות להעלות בשלב 4.2.2. בסוג ציוני איכות FASTQ קלט, בחר את מערכת רצף המתאים. לאפשרויות מתקדמות, תעזוב להסתיר מתקדם המשרד נבחר
      3. לחץ על "בצע".
    4. הסרת לכלוכים רצף
      1. בחר "הגדרות: QC ומניפולציה > להסיר לכלוכים רצף". ליד ספריה כדי לסנן, בחר את הקבצים מטופח שנוצר בשלב 4.2.3. לחץ על "בצע".
    5. להסיר את רצפי C-פלי
      הערה: חזור על שלבים אלה פעם או פעמיים כדי להבטיח כל C-פלי יוסרו.
      1. בחר "הגדרות: QC ומניפולציה > קליפ מתאם רצפים".
      2. בחר או הזן את הטקסט שלהלן:
        ספריית לקליפ: בחר את הקבצים שנוצרו בשלב 4.2.4.
        רצף מינימלי אורך: 15
        מקור: להזין רצף מותאם אישית
        הזן רצף מסיכה אישית: CCCCCCC
        הזן ערך שאינו אפס כדי לשמור על רצפים מתאם ובסיסים x שבאות אחריה: 0
        למחוק את רצפי עם בסיסים (N) לא ידוע: כן
        אפשרויות פלט: פלט רצפים החתוכים והן שאינם נחתכים
      3. לחץ על "בצע".
    6. הסר מתאם רצפים
      1. בחר "הגדרות: QC ומניפולציה > קליפ מתאם רצפים".
      2. בחר או הזן את הטקסט שלהלן:
      3. ספריית לקליפ: בחר קבצים שנוצרו בשלב 4.2.5.
      4. רצף מינימלי אורך: 15
      5. מקור: להזין רצף מותאם אישית
      6. הזן רצף מסיכה אישית: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. הזן ערך שאינו אפס כדי לשמור על רצפים מתאם ובסיסים x שבאות אחריה: 0
      8. למחוק את רצפי עם בסיסים (N) לא ידוע: כן
      9. אפשרויות פלט: פלט רצפים החתוכים והן שאינם נחתכים
      10. לחץ על "בצע".
    7. קריאות מסנן בהתבסס על האיכות שלהם
      1. בחר "הגדרות: QC ומניפולציה > סנן לפי איכות".
        הערה: כלי זה בוחר קריאות בהתבסס על איכות התוצאות.
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        ספריית לסינון: בחר את הקבצים שנוצרו בשלב 4.2.6.
        איכות ניתוק הערך: 20
        אחוז בסיסים ברצף כי חייב להיות באיכות שווה ל/גבוה יותר מהערך ניתוק: 95
      3. לחץ על "בצע".
        הערה: עם הגדרות אלו, קריאות קצר יותר מאשר 20 נוקלאוטידים או עם ציון האיכות של 20 או פחות 95% של המחזורים מתבטלים. להתאים הגדרות לכתחילה כדי הניסוי שלך.
    8. מפת קורא32
      1. בחר "הגדרות: מיפוי > Bowtie2"32.
      2. בחר את הפריטים הבאים את השדות בחלון הראשי:
        הוא יחיד או מזווג הספרייה: יחיד-end
        FASTQ קובץ: בחר את הספריה מסוננים לאיכות מהשלב 4.2.7.
        לכתוב קריאות unaligned (בפורמט fastq) כדי להפריד בין קבצים: אין
        לכתוב מיושר (בפורמט fastq) קריאות להפריד קבצים: אין
        האם תבחר גנום הפניה מההיסטוריה שלך או להשתמש ליצירת אינדקס מובנה?: להשתמש גנום מההיסטוריה ולבנות אינדקס
        בחר את הגנום הפניה: בחר לטעון את הקובץ genome.txt Leptospira בשלב 4.2.2.
        סט קריאת קבוצות מידע?: לא הוגדר
        בחירת ניתוח מצב: 1: ברירת המחדל של הגדרה בלבד
        האם ברצונך להשתמש בהגדרות קבועות מראש?: לא, פשוט להשתמש ברירות מחדל
        שמור את הנתונים הסטטיסטיים מיפוי bowtie2 ההיסטוריה: לא
        עבודה משאב פרמטרים: להשתמש בפרמטרים משאב העבודה המהווה ברירת מחדל
      3. לחץ על "לבצע" ליישור שאוחזרו כדי הגנום.
    9. להמיר קבצים
      1. בחר "הגדרות: SAMtools >. באם אל-סם להמיר באם סאם".
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        באם קובץ להמרת: בחר מיפוי ספריית מהשלב 4.2.8.
        אפשרויות כותרת: כלול כותרת בפלט סאם (-h)
      3. לחץ על "בצע".
    10. להמיר קבצים
      1. בחר "הגדרות: SAMtools > להמיר סאם מרווח".
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        בחר את הנתונים (dataset) כדי להמיר: בחרו בקובץ הספרייה ממופה סאם שנוצר בשלב 4.2.9.
        להדפיס את כל?: כן
      3. לחץ על "בצע".
    11. מיון קורא
      1. בחר "סינון ומיון > למיין נתונים לפי סדר עולה או סדר יורד".
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        מיון הנתונים (dataset): בחר את הקובץ מרווח שנוצר בשלב 4.2.10.
        עמוד: 2
        בטעם: סדר מספרי
        הכל: סדר עולה
      3. לחץ על "בצע".
    12. בחר קריאות התאמת כרומוזום אני
      1. בחר "סינון ומיון > בחר שורות התואמות את הביטוי".
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        בחר של קווים: בחר קובץ עם קריאות ממוינים שנוצר בשלב 4.2.11.
        זה: התאמת
        התבנית: הזן את השם של כרומוזום כמו החלטתי בשלב 4.2.1.3 (למשל, "אלוהים").
      3. לחץ על "בצע".
    13. בחר קריאות התאמת כרומוזום II
      המשך בעקבות צעד 4.2.12.
    14. קבוצה קורא על פי האתרים הוספות כרומוזום
      1. בחר "Join, להחסיר וקבוצת > לקבץ נתונים לפי עמודה ולבצע פעולה צבירה על עמודות אחרות".
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        בחר נתונים: בחר קובץ שנוצר משלב 4.2.12.
        קבץ לפי עמודה: 2
        התעלמות מרישיות תוך קיבוץ?: לא
        להתעלם שורות המתחילות בתווים אלה: Ø
        מבצע > + פעולת הוספת
        סוג: ספירה
        עמוד: 2
        לעגל את התוצאה למספר השלם הקרוב: לא
      3. לחץ על "בצע".
    15. קבוצה קורא על פי האתרים ההכנסה כרומוזום II
      המשך בעקבות שלב 4.2.14.
    16. מיון הכנסה אתרים על כרומוזום
      1. בחר "סינון ומיון > למיין נתונים לפי סדר עולה או סדר יורד".
      2. בחר את הפריטים הבאים:
        סוג נתונים: בחר קובץ משלב 4.2.14.
        עמוד: 1
        בטעם: סדר מספרי
        הכל: סדר עולה
      3. לחץ על "בצע".
    17. למיין אתרים ההכנסה על כרומוזום II
      המשך בעקבות שלב 4.2.16.
  3. ניתוח סטטיסטי
    1. להעביר את הנתונים גלקסי לתוך גיליון אלקטרוני קבצים על-ידי העתקה והדבקה של שתי העמודות מצעדי 4.2.16. 4.2.17. לתוך קובץ Excel.
      הערה: העמודה הראשונה הוא הקואורדינטה נוקלאוטיד של אתר הכניסה transposon, העמודה השניה הוא מספר הקריאות בכל אתר ההכנסה.
    2. לזהות את הגן מסתירים את transposon באמצעות הקואורדינטה נוקלאוטיד בטבלה.
      הערה: לדוגמה, transposon להוסיפה אצל נוקלאוטיד #30718 של כרומוזום זה ממוקם הגן LIC10024 , אשר משתרע על פני נוקלאוטידים כרומוזום בתוך 29263-31539.
    3. לחישוב יחסי תדרים (F) כל מוטציה בכל רקמה, בבריכה קלט בעקבות המשוואה להלן:
      Equation 4
    4. חישוב יחסי הקלט/פלט (R) לכל מוטציה או רקמות באמצעות המשוואה הבאה:
      Equation 5
    5. מבחן דרגה חתם Wilcoxon
      1. לנרמל את כל יחסי הקלט/פלט על-ידי הגדרת היחס החציוני עבור כל רקמות כל חיה ל- 1.0. יחס של 1.0 הוא נייטרלי, > 1.0 הוא חסרון, ו < 1.0 הוא יתרון33.
      2. להשוות בין יחסי קלט פלט ל- 1.0 (כושר נייטרלי) באמצעות הבדיקה דרגה Wilcoxon עם ערכים P < 0.05 נחשב משמעותי סטטיסטית.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

יצירה של ספריה של transposon מוטציות בל' interrogans על ידי ההטיה דורש יחידת סינון, כפי שמוצג באיור1. מצאנו את 100-200 transconjugants של כל הזדווגות.

האתר ההכנסה transposon מזוהה כל מוטציה על ידי קביעת רצף המוצר PCR שנוצר על ידי ה-PCR אקראי למחצה שמכוונת בסוף transposon, מארח סמוכים רצף15 (איור 2 א). דוגמה של התוצאות של ה-PCR אקראי למחצה מוצג באיור 2B. ברוב המקרים אמפליקון דומיננטי יתקיימו מתי תחל Deg1 ואת Tnk1 משמשים בסיבוב הראשון של ה-PCR ואת תג TnkN1 לסיבוב השני. עם זאת, בשל יחודיות נמוכה של הרצף pentameric (... N10GATAT-3') בקצה 3' של ומהצמיגים Deg1, זה פריימר anneal במיקומים מרובים ברחבי הגנום leptospiral. אתרים אלה הנמצאות ליד הקצה transposon, ניתן לקבל מוצרים PCR מרובים. כאשר amplicons מרובים נוצרים, הם להיות מטוהרים יחד מהתערובת PCR, וסודרו ישירות; ג'ל טיהור של כל אמפליקון אינה נחוצה מכיוון כל יכיל אותו רצף במורד הזרם של איפה תחל TnkN1 anneals. מצד שני, PCR עלולה להיכשל אם העותק הקרובה של רצף ממוקד על ידי ומהצמיגים Deg1 ממוקם במרחק רב מן הסוף transposon. אם אין מוצרים PCR מזוהים, בסיבוב הראשון של ה-PCR אקראי למחצה יכול לחזור עם פריימר Deg1, פריימר Tnk2, אשר בצד השני של transposon מטרות. במקרה זה TnkN2 ותג ישמש לסיבוב השני; אמפליקון רציף עם ומהצמיגים TnkN2 (איור 2B). לחלופין, ניתן לעשות בסיבוב הראשון של ה-PCR עם פריימר Deg2, של מי 3' הקצה (... N10TCTT-3') מטרות ארבע - יותר מאשר רצף חמש-נוקלאוטיד. ארבעה סטים שונים של צבעי יסוד יכול לשמש את הסיבוב הראשון של ה-PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1 Tnk1 + Deg2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + Deg2. כאשר ערכה אחת של תחל אינה פועלת, השתמש קבוצה אחרת. אם ברגע זה מגדיר גם נכשל, להשתמש עוד אחד וכן הלאה. ספונטני מוטנטים עמידים kanamycin הם נדירים מאוד, מתעוררות בתדר של < 10-10 34.

במהלך הכנת ספריות גנומית (איור 4), כמה צעדים יכול לאמת. הטיית ה-DNA על ידי sonication צריך להיות מאושרות על ידי אלקטרופורזה של aliquot ב agarose ג'ל (איור 5). כאשר הדנ א הוא לכסנתם כראוי, שברי DNA ועד 200 יהיה 600 bp בצורה כתם ג'ל agarose 2%. לפני שליחת ספריות עבור תפוקה גבוהה רצף, הדור של PCR מוצרים לפי תגובות PCR מקוננים חייב להיות מאושרות על ידי אלקטרופורזה בג'ל agarose (איור 6).

לאחר עיבוד של רצף קריאות בעקבות פרוטוקול המתוארים כאן (סעיף 4.2.), התדירות של כל מוטציה בבריכה קלט, ברקמות כל נקבעת באמצעות המשוואה בסעיף 4.3.3. היחס פלט/קלט עבור כל מוטציה בכל רקמה מחושבת עם המשוואה בסעיף 4.3.4. איור 7 מראה דוגמה של התוצאות המתקבלות עם הגישה Tn-Seq. לחלופין, הכלי מגנטה ניתן לעבד ולנתח נתונים רצף 31. זוהו מוטציות עם כושר מופחתת באופן משמעותי מבחינה סטטיסטית, מוגברת. מוטציות בגנים התקפה אלימה leptospiral ידוע נגרם צמצום כושר, אימות הגישה Tn-Seq.

Figure 1
איור 1: מתקן לסינון המשמש ההטיה. יחידת הסינון מורכב על-ידי הוספת את הפקק של התמיכה מסנן נשק צד Erlenmeyer את הבקבוק, מיקום המסנן תאית אצטט על גבי הבסיס עם מלקחיים סטרילי, ולאחר מכן ממקם את המשפך על גבי הבסיס, אבטחת המערכת עם מלחציים . יחידת סינון מחובר אז מערכת ואקום. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 2
איור 2: זיהוי של האתרים ההכנסה transposon. סכימת (A) מציג אתרים מחזק של תחל PCR אקראי למחצה. תחל Tnk1 ו Tnk2 anneal קרוב בקצוות מנוגדים של transposon (Tn). Deg1 הוא פריימר 35-נוקלאוטיד המכיל רצועה של 10 נוקלאוטידים מנוונת ואחריו את רצף GATAT בקצה 3'. הסיבוב הראשון של ה-PCR (PCR #1) מתנהל עם Deg1 ו- Tnk1 או עם Deg1, תחל Tnk2. TnkN1, TnkN2, משמש ה-PCR #2, anneal בין הקצוות transposon, Tnk1 Tnk2, בהתאמה. רצף ומהצמיגים תג הוא זהה לזה של 5' סוף ומהצמיגים Deg1. (B) דוגמה agarose ג'ל מתקבל לאחר הסיבוב השני של ה-PCR עם transposon 14 מוטציות (מסלולים 1-14). הסיבוב הראשון של ה-PCR בוצעה עם Deg1 ו- Tnk1; בסיבוב השני נעשה עם תג, TnkN1. PCR חיובית מיוצג על ידי "+" ו- PCR שלילי על ידי "-". "קR"מייצג את הקלטת ההתנגדות kanamycin. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 3
איור 3: תרשים זרימה להשגת מאגר הפלט. ביום של אתגר (יום 0), כל מוטציה leptospiral נספר לפי מיקרוסקופיית שדה אפל, מדולל זהה לצפיפות, המשולבים כדי ליצור מאגר קלט (פרטי ההתקשרות בסעיף 2.1). אוגרים מאותגרים intraperitoneally עם מאגר קלט. בנוסף, שלוש התרבויות היו התחיל עם מאגר קלט. על היום של חיסון (יום 0), כאשר התרבויות להגיע צפיפות של ≈ 108/mL, מאגר קלט תרבויות והאחסון על ידי צנטריפוגה של כמו כדורי ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (ראו סעיף 2.3). ביום קצה (יום בחר לסיים את חיות, למשל, יום 4 לאחר אתגר), בעלי החיים מורדמים; הדם, הכליות והכבד הם נאספים ומאוחסנים ב-80 מעלות צלזיוס עד לשימוש (ראו סעיף 2.4). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 4
איור 4: תרשים זרימה של הכנת ספריה גנומית. דנ א (א) מופק דם, רקמות או תרבויות בעקבות הפרוטוקול המתואר בסעיף 3.1. התיבה האדומה מייצגת את transposon (Tn). (B) ה-DNA הוא לכסנתם על ידי sonication לחלקים בין 200 ו- 600 bp. פרטים נוספים ניתנים בסעיף 3.2. (ג) C-פלי (תיבות צהובות) מתווספים כל שברי DNA עם מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז (TdT) כמתואר בסעיף 3.3, בטבלה 4. בספרייה גנומית מוכן עבור רצף על ידי ה-PCR מקוננים (D-E). הסיבוב הראשון של ה-PCR מבוצע עם ספיציפית של transposon ו- C-הזנב, TnkN3, olj376 תחל בהתאמה. ראה טבלה 3 ו- 5. שברי היחיד המכיל את הקצוות transposon (התיבה האדומה) הם מוגבר. הערה: השתמש פריימר olj376 פי 3 מאשר TnkN3 כי כל שברי DNA יש C-פלי. בסיבוב השני של ה-PCR מתנהל עם pMargent2, ספציפיות עבור הסוף transposon, ואחד אינדוקס פריימר, המכיל רצף שש-בסיס-זוג ברקוד (בורוד) המאפשר כל דוגמאות להיות מרובב בסמטה רצף יחיד. ראה טבלה 3 ו- 6. שני צבעי יסוד מכילים רצפי הכרחי עבור איגוד הזרימה-התא במהלך אילומינה רצף (תיבת ירוק וסגול). (F) ה-PCR וכתוצאה מכך מוצרים מנוקים ולאחר מכן נמדד הריכוז שלהם כמתואר בסעיף 3.6. (G) כל ספריות גנומית הם איחדו יחד; כל ספריה יש ברקוד שונים ונשלחת (H) הבריכה פלטפורמת רצף. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 5
איור 5: Sonication של דנ א. דנ א היה טהור מן הכבדים של שמונה נגוע אוגר (נתיבים 1 ל 8), sonicated, ובחן על ידי אלקטרופורזה ב 2% agarose ג'ל. DNA הוטו מאופיין על-ידי כתם שבו הגודל של רוב השברים הוא בין 200 ל 600 bp. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 6
איור 6: ספריות גנומית עבור תפוקה גבוהה רצף. ספריות גנומית שהוכן על-ידי ested PCR עם ה-DNA מהדם של שמונה אוגרים הנגוע (מסלולים 1 ל 8), נבדק על ידי אלקטרופורזה ב 2% agarose ג'ל. הגודל של רוב המוצרים PCR הוא בין 200 ומראה 600bp. בקרה שלילית (אין פריימר TnkN3 בתמהיל PCR #1, ראה טבלה 5) אין הגברה (לא מוצג). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

Figure 7
איור 7: כושר של מוטציות מהניסוי Tn-Seq. כושר של בריכה של מוטציות של האוגר כליה 4 ימים לאחר אתגר (חיבור מקורי של Lourdault המחקר17). היחס פלט/קלט של כל המוטציות 42 נקבע עבור כל חיה. כל מוטציה הוזכר על ידי הגן (lic) או באזור intergenic (אינטר) transposon מוכנס לתוך או השם נפוץ בספרות. כל יחס מיוצג על ידי יהלום שחור. החציון של יחסי (הקו האדום) היה נחוש עבור כל מוטציה, בהשוואה ל- 1.0 באמצעות מבחן דרגה Wilcoxon. הקו המנוקד מייצג כושר של 1.0, המתאים כושר נייטרלי. מוטציות כושר אשר מושפע באופן משמעותי מסומנים על ידי כוכביות: * P < 0.05; * * P < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.

ריאגנטים נפח עבור תגובה אחת
מיקס מאסטר 2 X 12.5 ΜL
פריימר 1, 10 מ מ (TnK1 או TnK2) * 1.2 ΜL
פריימר 2, 10 מ מ (Deg1 או Deg2) * 1.2 ΜL
מים 8.8 ΜL
תבנית (תאים lysate או ה-DNA) 1.3 ΜL
נפח סופי 25 µL
* פריימר רצפים בטבלה 3.

טבלה 1: זיהוי של אתר הכניסה transposon, שילוב אקראי למחצה PCR #1-

ריאגנטים נפח עבור תגובה אחת
מיקס מאסטר 2 X 12.5 ΜL
פריימר 1, 100 מ מ (TnKN1 או TnKN2) * 0.2 ΜL
פריימר 2, 100 מ מ (תג) * 0.2 ΜL
מים 10.1 ΜL
מוצרי ה-PCR PCR #1 0.8 ΜL
נפח סופי 25 µL
* פריימר רצפים בטבלה 3.

בטבלה 2: זיהוי של אתר הכניסה transposon, שילוב אקראי למחצה PCR #2-

שם רצף (5' - 3') הפניה
תחל המשמש PCR אקראי למחצה
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
Deg2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
תג GGCCACGCGTCGACTAGTAC
תחל המשמש אילומינה רצף
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT אילומינה רצף (ברקודים בכתב מודגש)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

טבלה 3: רצפים של פריימר.

ריאגנטים נפח עבור תגובה אחת
DNA הוטו 500 ננוגרם (ראה משוואה ב 3.3.2).
מים µL עד 14.5
5 x TdT מאגר 4 ΜL
(9.5 מ מ dCTP + 0.5 מ מ ddCTP) מיקס * 1 ΜL
TdT (U 30/µL) 0.5 ΜL
נפח סופי 20 µL
* לערבב 3 µLof 10 מ מ ddCTP, µL 5.7 של 100 מ מ dCTP ו- µL 51.3 מים

בטבלה 4: C-עוקב התגובה עם מסוף deoxynucleotidyl טרנספראז (TdT).

ריאגנטים נפח עבור תגובה אחת
ספריית התגובה התגובה שליטה
מאסטר לערבב 2 x 12.5 ΜL 12.5 ΜL
פריימר 1, 30 מיקרומטר (TnkN3) * 0.5 ΜL -
פריימר 2, 30 מיקרומטר (olj376) * 1.5 ΜL 1.5
מים 7.5 ΜL 8 ΜL
C-זנב דנ א 3 ΜL 3 ΜL
נפח סופי 25 µL 25 µL
* פריימר רצפים בטבלה 3.

טבלה 5: בניית ספריה גנומית, מיקס PCR #1-

ריאגנטים נפח עבור תגובה אחת
ספריית התגובה התגובה שליטה
מאסטר לערבב 2 x 25 ΜL 12.5 ΜL
פריימר 1, 30 מיקרומטר (pMargent2) * 0.5 ΜL 0.25 ΜL
פריימר 2, 30 מיקרומטר (יצירת אינדקס פריימר) * 0.5 ΜL 0.25 ΜL
מים 23 ΜL 11.5 ΜL
מוצרי ה-PCR PCR #1 1 ΜL 0.5 ΜL
נפח סופי 50 µL 25 µL
* פריימר רצפים בטבלה 3.

טבלה 6: בניית ספריה גנומית, מיקס PCR #2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

למרות תוצאות שלנו פיילוט עבור hamster תיגר intraperitoneally עם מוטציות ל' interrogans 42 מוצגים17, אנו מצפים כי בריכות גדולות יותר של מוטציות יכולים להיות מוקרן על ידי Tn-תת סעיף. בגלל התדירות של transconjugants הוא נמוך (100-200 transconjugants/הזדווגות), מספר matings נחוצים ליצור מספר מספיק של מוטציות לניסויים Tn-Seq גדולים. שמירה על מספר רב של מוטציות בתרבויות נוזלי מציג אתגרים לוגיסטיים שמחייבות. יכול להיות מודגרות תרבויות בתוך צלחות עמוק 96-ובכן. תרבות צפיפויות ניתן יהיה פיקוח על ידי צפיפות אופטית קריאות בספקטרופוטומטר מוגדר כ- 420 ננומטר. קביעת מספר החיות להשתמש בחלק תלויה בגודל של מאגר קלט, חייבים להיקבע על ידי כוח ניתוח. עבור ניסויים בקנה מידה גדול, אנו ממליצים כי הניתוח כוח להתבצע תוך התייעצות עם biostatistician.

"צווארי בקבוק" יכול להשפיע על ההתאוששות של מוטציות אקראיות מתוך מאגר הפלט. למרות צווארי בקבוק חמור לא נצפו שלנו מחקר פיילוט17 (איור 7), ניסויים בקנה מידה גדול עשוי להיות מושפע אובדן אקראי של מוטציות. להגדיל את המינון אתגר על ידי הגדלת מספר התאים לכל מוטציה בבריכה קלט יצמצם את הסבירות של צווארי בקבוק35. הכלי גלקסי שפורסם לאחרונה מגנטה מספק את הכלי הדרוש כדי להעריך את צווארי בקבוק, כושר31.

Tn-Seq ניסויים תננכותמה תוואי חלופי של זיהום, אחרים Leptospira זנים, או מודלים אחרים מכרסמים דורשים שיקולים נוספים. אם קינטיקה של זיהום אצל המינים המארח אינו ידוע או אינו מעריכית באופן רציף במהלך זיהום בתוך כל רקמת להיבדק, דנ א צריכה להתקבל מתוך culturing של הרקמות, ולא ישירות מן הרקמות. שלב נוסף זה יצמצם מגזים בהערכת הכושר מוטציה עקב זיהוי ה-DNA מ שמרכז מת. אם מאגר הפלט המתקבל culturing הרקמות, מאגר קלט צריכה להיות מחונן להשפעות כתובת של צמיחה במבחנה בנוסף, אנו ממליצים על פיילוט עם מספר קטן של מוטציות כדי לקבוע אם צווארי בקבוק יהיה חשש וכדי לסייע הניתוח כוח עבור ניסויים בקנה מידה גדול.

אישור כושר שינו כפי שנקבע על ידי Tn-Seq ידרשו בדיקות של מוטציות בודדות במודל החייתי. כיום, כל מוטציה חייב להיות רציף בנפרד לפני Tn-Seq לזהות את המוטציה נושאת את ההוספה בגן של עניין. עם זאת, אם אלל להחלפת ב פתוגניים Leptospira הופך להיות קל, רצף של מוטציות בודדות כבר לא יהיה צורך. לחלופין, תמלול activator דמוי effectors שימשו בהצלחה לצמצם lig ביטוי גנים ל' interrogans36. טכניקה זו יכול היה לשמש למטה-להסדיר גנים שיבשו ב מוטציות עם כושר שינו המזוהה על-ידי Tn-תת סעיף.

בעת פירוש הנתונים Tn-Seq, האינטראקציות בין חיידקים צריך להילקח בחשבון. זה אפשרי תיאורטית כי ירידה ברמת כושר יכול להיות עקב תחרות בין מוטציות ולא השפעה ישירה של הכניסה transposon. בנוסף, היעדרות של שינוי ויוו הכושר של מוטציה בבריכה יכול להיות בגלל שיתוף פעולה בין מוטנטים. לדוגמה, מוטנט זה מצליח לייצר גורם חיוני יכול להיות כהשלמה intercellularly הייצור של הגורם מאת מוטאנטים אחרים בבריכה. הבחנו עלייה בכושר עבור מספר מוטציות, אשר עשוי להיות תוצאה של הנטל מטבולית מופחתת של כבר לא סינתזה חלבונים שאינם חיוניים לצמיחה, כפי שמוצג על סלמונלה enterica37.

פרוטוקול זה יכול לשמש לזיהוי גנים המעורבים בחילוף החומרים או הישרדות תחת מצבים מלחיצים במבחנה 38,39. לדוגמה, גדל Leptospira בתנאים שונים כמו ריכוז גבוה נתרן כלורי, ברזל מוגבל ו pH חומצי יכול לזהות הגנים אחראית חומצי התנגדות הישרדות או מתח. ניתן גם לבצע ניסויים אלה במבחנה עם זנים saprophytic כגון זן ל' biflexa Patoc אני כי שיטה זו Tn-Seq ניתן ליישם כל וסודרו זנים Leptospira .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

המחברים אין לחשוף.

Acknowledgments

עבודה זו נתמכה על ידי פרס הצטיינות לענייני חיילים משוחררים (עד D.A.H.), המכון הלאומי לבריאות להעניק R01 AI 034431 (D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

אימונולוגיה גיליון 130 תפוקה גבוהה רצף מוטגנזה מכוונת אקראי PCR מקוננים נטיה Leptospira כושר מוטציות ספריה
רצף מקביל בתפוקה גבוהה כדי כושר מדד לזיהום <em>Leptospira interrogans</em> Transposon ההכנסה מוטציות במהלך הזהב הסורי אוגר
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,… More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter