Summary
ここで高スループット シーケンス ハムスターの挑戦後トランスポゾン レプトスピラ突然変異体組織の定量化とトランスポゾン変異を組み合わせた手法について述べる。このプロトコルは、生存と動物の普及のため画面変異体に使え、生体外で研究にも適用することができます。
Abstract
本稿では,レプトスピラ変異ゴールデン ハムスター感染中フィットネスに変更の定量化 (Tn Seq) 手法をシーケンス トランスポゾンをについて説明します。Tn Seq は高スループット シーケンス技術の力とランダムなトランスポゾン変異を兼ね備えています。動物は収穫血液と組織の数日後、各器官 (出力プール) の突然変異体の数を定量化することによって続いてトランスポゾン変異体 (入力プール) のプールに立ち向かっています。出力のプールは、各変異体の生体内で適性を評価する入力のプールと比較されます。このアプローチにより、動物の限られた数の突然変異体の大規模なプールのスクリーニングです。マイナーな変更とレプトスピラ症の動物モデル、ラットなど貯留層ホスト モデルとの in vitro研究と同様、ハムスターなどの急性感染症モデルでこのプロトコルを実行できます。Tn Seq は、体内と体外のフィットネス欠陥を持つ突然変異体の画面に強力なツールを提供します。
Introduction
遺伝学的ツールが利用可能な限られた数のため、レプトスピラなどのいくつかの細菌の病原性遺伝子の同定は難しい。一般的に使用される方法の 1 つは、各変異株における挿入部位の同定と病原性の動物モデルにおける個々 のトランスポゾン変異体のテストが続くランダムなトランスポゾン変異による変異体のコレクションの作成です。この方法は時間のかかる、高価なと多数の動物が必要です。
ランダム突然変異誘発はレプトスピラ病原体の開発当初、病原性に関与する遺伝子は動物モデル1に個々 の変異をテストによって識別されました。変異体は、その潜在的なシグナル伝達における役割または運動または予測外膜面の位置などの条件に基づいて選ばれました。レプトスピラの大半として遺伝子の未知関数2仮説蛋白質を符号化、選択する突然変異体は、これら条件制限に基づいて小説レプトスピラ病原性遺伝子を発見する能力。
最近では、 l. カバートランスポゾン変異体のプールは、ハムスターやマウスのモデル3の感染性の上映。各動物は、最大 10 の突然変異体のプールに挑戦しました。変異株の感染性は、それが血液や腎臓から得られる文化の PCR による検出された場合肯定的な得点されました。プールで各変異体の個々 の PCR 反応を必要とするため、PCR 検査は手間がかかっていました。文化各突然変異系統の周波数は定量化されていませんので、アプローチは高度弱毒化変異体の同定への試み偏っていた。
トランスポゾンの病原性遺伝子のスクリーニングより効率的にするための戦略として (Tn Seq) 手法をシーケンス処理について述べる.Tn seq は、大規模な並列シーケンス4,5,6続いてトランスポゾン変異による変異体のライブラリの作成で構成されます。簡単に言えば、トランスポゾン変異体がプール、動物に接種、さまざまな器官 (出力プール) が治った後。出力プールから DNA は抽出し、制限の酵素と消化されるか sonication によってせん断。PCR トランスポゾン挿入サイトの接合部の 2 つのラウンドが行われます。この手順は、シーケンスに必要なアダプターを追加をできます。結果として得られる PCR の製品は、各変異体変異体のプールの初期の組成と比較しての相対的な豊かさと共にプールのトランスポゾン挿入サイトを識別する高スループット シーケンスによって分析されます。
このアプローチの主な利点は、同時に数匹の動物の突然変異体の数が多いを選別する能力です。Tn Seq は新しいレプトスピラを発見のチャンスを高めるトランスポゾン挿入サイトの事前の知識を必要としない-より少ない時間と効率と病原性に関与する特定の遺伝子。致命的な影響を受けやすい感染組織におけるレプトスピラ負担が比較的高いため齧歯動物のモデル (通常 104 108細菌/g の組織に)7,8,9同様貯水池ホストのように10,11, 文化、生体外で成長に伴うバイアスを軽減することがなく直接組織を分析できます。
Tn Seq 日付に記載されているほとんどの細菌性病原体の研究で挿入の高周波はまとめて持つすべての遺伝子4 内の複数の密接に間隔トランスポゾン挿入変異体を含む大規模なプールで感染を許可 ,12,13,14。突然変異誘発頻度、程度の低い6細菌の Tn Seq も開発しました。レプトスピラとトランスポゾン変異体のライブラリは Slamtiら15のとおり活用によって子実プラスミド上のトランスポゾンを導入することで生成できます。しかし、 l. カバーのトランスポゾン誘発突然変異の頻度は低いです。受信者ごとの 10-8 x のみ 8.5 l. カバー16ライ株細胞とになりそうです transconjugant 周波数が報告されたHimar1トランスポゾンが接合性プラスミドを導入された、L. カバーの他のほとんどの株と同様に悪い。ここで説明されているプロトコルに基づいてボレリアブルグドルフェリ、トランスポゾン挿入変異の頻度が低い6ではまたのために開発される部分です。
と共に、低ひずみでトランスポゾン挿入変異体を分離することで他のグループの成功のためにl ・ カバー型 Manilae ひずみ L495 とトランスポゾン変異を実施しましたプロトコル17パイロット実験LD50 (致命的な線量) 病原性1。Tn Seq による 42 変異体をスクリーニングし、いくつかの突然変異体候補候補アデニル酸シクラーゼ遺伝子の 2 つの挿入を含む病原性の欠陥を識別しました。ハムスターの 2 つの突然変異体の個々 のテスト彼らは病原性17の欠乏だったことを確認しました。
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Protocol
注意:レプトスピラ属菌の病原性系統は、バイオ セーフティ レベル 2 (BSL-2) 封じ込めプロシージャの下処理する必要があります。適切な個人用保護具 (PPE) を着用する必要があります。病原性レプトスピラのすべての操作に使用されるクラス II バイオ セーフティ キャビネット
1. トランスポゾンの創造変異ライブラリー15
-
トランスポゾンの共役を用いたレプトスピラspp.に転送 (図 1)
- Ellinghausen ・ ・ マックロー-ジョンソン-ハリス中 (EMJH)18,1910 mL に 10 の7セルに対応する病原性レプトスピラの指数相培養量を接種します。150 rpm の振動密度 2-8 x 10 の8セル/mL に達するまでは、30 ° C で孵化させなさい。
注: 病原性レプトスピラの倍加時間は 12 に 24 h、株に応じて。 - 5 mL のルリア スープ (LB) 2, 6-diaminopimelicacid (DAP)、50 μ g/mL の 0.3 mM を添加した運び子実トランスポゾン プラスミド (pCjTKS2)16ドナー大腸菌株 β216320の 50 μ L を接種します。カナマイシン (Km)、および 50 μ G/ml のスペクチノマイシン (Spc) および 255 rpm で 37 ° C のインキュベーターで一晩場所。
- EMJH DAP (EMJH + DAP) の 0.3 mM を添加した 3 mL に 60 μ L の大腸菌の細胞を接種します。255 rpm 撹拌外径600 ナノメートル≒ 0.3 まで 3-4 時間で 37 ° C で孵化させなさい。
- ろ過装置 (図 1) をアセンブルする 125 mL 側腕三角フラスコに拠点を置き、酢酸セルロース フィルター (細孔サイズ 0.1 mm; 直径 25 mm) ベースとクランプ ベースの上に漏斗。ろ過装置を真空システムに接続します。
- レプトスピラ属の 5 mL を追加します。文化と漏斗にエシェリヒア属大腸菌文化の 0.5 mL。真空フィルターを通して液体。
- EMJH + DAPplate に上向きの細菌の表面にフィルターを転送します。上向きのフィルターで一晩 30 ° C でインキュベートします。
- EMJH と 10 の渦の 1 mL を含む 15 の mL の管にフィルターを置くメディアに細菌を解放する s。5 EMJH platescontaining 50 μ G/ml Km 10 15 1 mm 滅菌ガラス ビーズまたは滅菌使い捨てスプレッダーを使用しての上に懸濁液 200 μ L を広めます。パラフィルムでプレートをラップし、植民地が表示されるまで 3 〜 4 週間の上下 30 ° C でそれらを孵化させなさい。
- 7 〜 10 日間文化 ≈ 10 の密度に達するまで 150 rpm 撹拌下 30 ° C で 50 μ g/mL (EMJH + Km) を含む EMJH 3 mL に個別にコロニーを転送8/mL です。
注:-80 ° c または液体窒素 (4% グリセロール) とは、文化を格納できます。
- Ellinghausen ・ ・ マックロー-ジョンソン-ハリス中 (EMJH)18,1910 mL に 10 の7セルに対応する病原性レプトスピラの指数相培養量を接種します。150 rpm の振動密度 2-8 x 10 の8セル/mL に達するまでは、30 ° C で孵化させなさい。
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Nested pcr 法によるトランスポゾンの挿入部位の同定 (図 2)
- 15 分 95 ° C で培養で 50 μ L の PCR チューブ各トランスポゾン変異を溶解させます。
注: DNA 浄化することができる代わりに、DNA 抽出キットを使用します。 - 表 1によると Deg1 と Tnk1 のプライマー (表 3) PCR ミックスを準備します。ミックスの 23.7 μ L を各 PCR チューブに転送し、分離細胞の 1.3 μ L を追加します。プログラムを実行: 95 ° C、5 分。40 サイクル: 95 ° C、15 秒、1 分、2 分; 72 ° C の 40 ° C10 分のための 72 ° C。
- 表 2に従ってタグと TnkN1 のプライマー (表 3) を PCR ミックスを作る。ミックスの 24.2 μ L を各 PCR チューブに転送し、PCR #1 反応の 0.8 μ L を追加します。プログラムを実行: 95 ° C、5 分。35 サイクル: 95 ° C、15 s、55 ° C、30 秒、2 分; 72 ° C10 分のための 72 ° C。
- 10-15 V/cm (図 2 b) 1 X トリス酢酸 EDTA (TAE) バッファーと 1% の agarose のゲルに 3 μ L の PCR の製品を実行します。
- PCR 精製キットを使用して肯定的なサンプルの PCR の製品を浄化します。回復 DNA の濃度を最大化するキットによって許可される最も低いボリュームの DNA を溶出します。
- TnkN1 プライマー (表 3) を用いたシーケンス サンガーの精製 PCR 産物を送信します。
- BLASTN 分析法 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) による親の緊張のゲノム シーケンスの結果のシーケンスを比較するまたは SpiroScope データベース (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)21を使用して挿入サイトを識別します。
- 並ぶホスト シーケンスにアニールするプライマーを用いた PCR によるトランスポゾンの挿入部位を確認します。
注: トランスポゾン ≈ によって野生型シーケンスのサイズが増加 2 kb。
- 15 分 95 ° C で培養で 50 μ L の PCR チューブ各トランスポゾン変異を溶解させます。
2. 動物実験 (図 3)
-
レプトスピラ変異体の文化
- 個別に、それぞれ選択したトランスポゾンの変異体 EMJH + キロ 107-108レプトスピラ/mL の密度に 150 rpm 撹拌で 30 ° C で 10 mL に成長します。
- 暗視野顕微鏡によるピープル Hausser カウンターまたはミラー23で定義されている、レプトスピラをカウントします。
- 同じ密度、例えば 106セル/mL EMJH でそれぞれの文化を希釈します。
- 入力プールを組み立てる、ミックス一緒に等しいボリュームで希薄化後の文化。
注: 入力プールにloa2217,24など知られているフィットネス欠陥を持つ突然変異体および不変のフィットネスligB17,25, などの突然変異体を追加してコントロールを含めるそれぞれ。突然変異体のプールは、4% のグリセロール-80 ° c または液体窒素と共に格納できます。
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チャレンジ
注: ここで説明する方法は、ベテラン事務よりロサンゼルス機関動物ケアおよび使用委員会 (プロトコル #09018 14) によって承認されました。- 26 x ½"針とインスリン注射器 U-100 と入力がそれぞれの動物の腹腔内 1 mL を注入します。
注: パイロット実験 8 動物が入力プール、すなわち、106細菌合計17の 1 mL に挑戦しました。感染は、安楽死の前に 4 日間の続行を許可されました。 - 入力プールの 10 mL を収集し、スピン 3,220 x g に 20 分がペレットを乱すことがなく上澄みを慎重に削除します。使用 (手順 3.1.3) まで 80 ° c で細胞ペレットを格納します。
- 前もって決定されたエンドポイントで停止されるまで、動物を毎日監視します。毎日ハムスターの重量を量るし、エンドポイント基準を探す: 食欲不振、歩行や呼吸困難、虚脱、波立たせられた毛皮や達成した最大重量の > 10% の損失。
- 26 x ½"針とインスリン注射器 U-100 と入力がそれぞれの動物の腹腔内 1 mL を注入します。
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生体外実験
- 挑戦の日、EMJH + キロ入力プール 5 mL を 25 mL の 3 フラスコを接種します。150 rpm 撹拌下 30 ° C での文化を育てます。
- セクション 2.1.2 の方法のいずれかを使用して、レプトスピラを毎日カウントします。密度が ≈ 1 × 108/mL に達したら、スピン ・ ダウン 3,220 × g で 20 分間各サスペンション。
- -80 ° c 細胞ペレットを使用するまで保存します。
-
収穫と組織のストレージ
- 両側開胸下26イソフルラン吸入によって動物を安楽死させます。
- すぐに 3 mL の注射器と針 25 x 5/8"心臓穿刺による血の 1 ~ 2 mL を収集します。EDTA を含むチューブに血液を移します。5 〜 6 回反転してミックスします。
- Cryotubes に肝臓の腹側の中央葉の 1/2 に 1 つの腎臓と 1/3 を収集します。
- 使用するまで-80 ° C で組織を保存します。
3. 高スループット シーケンス (図 4) の Genomic ライブラリの構築
-
DNA の抽出
- 血からの DNA の抽出。
- 微量遠心チューブに EDTA 管から血液の 100 μ L を転送します。
- DNA 抽出キットを使用して DNA を浄化します。製造元の指示に従ってください。
- 組織からの DNA の抽出。
- メスやはさみを使用して、50 ~ 80 mg 小さな断片 (1 mm × 1 mm) に各器官の間にサイコロし、滅菌スクリュー キャップ ドライ チューブにそれらを転送します。精密バランスと組織の重量を測定します。
- チューブに 500 μ L の滅菌 PBS を追加します。
- 1 秒あたり 5 の動きを 1 分、ホルモンを使用してサンプルを均質化します。
- 次の方程式を使用して組織の 25 mg に対応する量を計算します。
- DNA 抽出キットに計算された容積を転送します。製造元の指示に従って DNA 精製を続行します。
- 入力プール、生体外で文化からの DNA の抽出。
- 5-10 分の室温で細菌のペレットを解凍します。
- DNA 抽出キットに付属の手順に進みます。
- 使用するまで-80 ° C で DNA の店。
- 血からの DNA の抽出。
-
DNA をせん断 (図 5)
- 1.5 mL 遠心チューブに抽出された DNA の 50 μ L を転送します。
- 冷たい水 (4 ° C) で満たされた超音波発生装置カップ角のラックにチューブを配置します。
- 10 で 80% の強度で 3 分間超音波発生装置を実行パルスと 5 のパルス オフです。
注意: は、聴覚を保護するために耳栓やイヤーマフを着用します。 - せん断の 2.5 μ L を実行する DNA のほとんどが、2% の agarose のゲルの DNA は < 600 サイズで bp。
-
C テール追加
- 少量の分光光度計と DNA 濃度を測定します。
- 500 に対応するボリュームを計算する次の数式を使用して DNA の ng:
- テーリング反応 (表 4) を準備します。37 ° C で 1 時間インキュベートします。75 ° C、20 分で不活化します。
注: 14.5 μ L より大きいボリュームに調整を必要とするサンプル、40 μ L を反応の最終的な音量を上げるし、それに応じて残りのコンポーネントをスケール アップします。 - PCR 精製キットのサンプルをクリーンアップします。12 μ L の溶出バッファーで DNA を溶出します。
-
Nested pcr 法
- PCR #1
- テーブル 3と5によると PCR ミックスを準備します。ライブラリ ミックスの 22 μ L を各 PCR チューブに転送し、浄化された DNA の 3 μ L を追加します。コントロール ミックスと同様に進みます。
注: はプライマー TnkN317はトランスポゾン、プライマー olj3766 C 尾に固有です。コントロールのミックスには、トランスポゾンを特に対象とする TnkN3 プライマーは欠けています。 - 次プログラムを実行: 95 ° C、2 分;24 サイクル: 95 ° C、30 秒、60 ° C、30 秒、2 分; 72 ° C2 分のための 72 ° C。
- テーブル 3と5によると PCR ミックスを準備します。ライブラリ ミックスの 22 μ L を各 PCR チューブに転送し、浄化された DNA の 3 μ L を追加します。コントロール ミックスと同様に進みます。
- PCR #2。
- テーブル 3と6によると第 2 PCR ミックスを準備します。ライブラリ ミックスの 49 μ L を各 PCR チューブに転送し、1 μ L の PCR #1 ライブラリ反応を追加します。コントロール ミックスの 24.5 μ L を各 PCR チューブに転送し、PCR #1 コントロール反応の 0.5 μ L を追加します。
注: プライマー pMargent2 は、トランスポゾンと IP プライマー6に 6 塩基対のバーコードと次世代シーケンシング プラットフォームによって認識される特定のシーケンスが含まれています。 - 次プログラムを実行: 95 ° C、2 分;18 サイクル: 95 ° C、30 秒、60 ° C、30 秒、2 分; 72 ° C2 分のための 72 ° C。
- テーブル 3と6によると第 2 PCR ミックスを準備します。ライブラリ ミックスの 49 μ L を各 PCR チューブに転送し、1 μ L の PCR #1 ライブラリ反応を追加します。コントロール ミックスの 24.5 μ L を各 PCR チューブに転送し、PCR #1 コントロール反応の 0.5 μ L を追加します。
- 2% の agarose のゲルに 3 μ L を実行します。ライブラリは、200 に 600 間の信号の大半の汚れを示すべきである bp (図 6) とコントロール反応の増幅などないです。
- PCR #1
-
PCR の製品の浄化。
メモ: は、製造元の指示に従って PCR 精製キットの genomic ライブラリを清掃します。溶出バッファーの 30 μ L の DNA を溶出します。 - 蛍光光度計を用いた DNA 濃度を測定します。平均 3 に 2 を読み取ります。
- 各ライブラリの次の式を使用して 15 または 20 ng に相当量を計算します。
-
以前の計算によれば、一緒にすべてのライブラリをミックスします。次の web サイトの方程式を用いた DNA のモル濃度を決定します。
http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
注意: DNA の濃度とボリュームの要件は、シーケンス処理プラットフォームによって異なります。
4. 高スループット シーケンスとデータ解析
- シーケンス
- カスタム配列のプライマー pMargent3 と標準的な商業配列のプライマーを使用して 64 bp シングル エンド読み取りとしてシーケンス ライブラリ。シーケンスのプラットフォームでは、シーケンスのすべての読み取りと FastQ ファイルが提供されます。
- Galaxy ソフトウェアによる解析
- ゲノム シーケンス ファイルをダウンロードします。
- SpiroScope データベースのホームページ (リンクの 1.2.7 のステップを参照)、実験用生物を選択し、"ゲノム ブラウザーにロード] をクリックします。
- (ホームページ上部) ツールバーで選択"検索/エクスポート > データ ダウンロード"、「シーケンス (fasta)」行のシーケンスをダウンロードする「ゲノム」をクリックします。
- メモ帳 (PC) またはテキストエディット (Mac) でファイルを開くし、染色体 (たとえば「クリ」) の名前を変更します。Fasta 形式を維持します。
- 染色体 II のシーケンスをダウンロードして同じ手順に従います。コピーと貼り付けで 1 つの .txt ファイルに両方の染色体のシーケンスを結合します。
注: 染色体シーケンスも NCBI ウェブサイト (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) からダウンロードでき単一の .txt ファイルに結合します。
- 銀河のサーバーにファイルをアップロードします。
注: 銀河オープン ソース、データ集中的なバイオインフォマティクス ワークフロー27,28,29,30を管理するための web ベースのプラットフォームは、https://usegalaxy.org/ にアクセスすることができます。- [ツール] メニューで、選択"データを取得 > お使いのコンピューターからファイルをアップロード"。ウィンドウにシーケンス処理プラットフォームで生成された .fastq ファイルにドラッグしてクリックして「スタート」。
- レプトスピラゲノム シーケンス .txt ファイルをアップロードする同じ手順に従います。
- 新郎を読み取ります
- 選択「NGS: QC および操作 > FASTQ Groomer"[ツール] メニューから。
- 新郎にファイル、横ステップ 4.2.2 アップロード ライブラリを選択します。入力 FASTQ 品質スコアの種類、適切なシーケンス システムを選択します。高度なオプションは、選択した非表示高度なオフィスを残します。
- 「実行」をクリックします。
- シーケンスの項目を削除します。
- 選択「NGS: QC および操作 > シーケンス アイテムの削除"。フィルターを適用するライブラリで、横には、4.2.3 のステップで生成されたファイルを手入れを選択します。「実行」をクリックします。
- C 尾シーケンスを削除します。
メモ: は、すべて C ツインテールように何回か手順が削除されますを繰り返します。- 選択「NGS: QC および操作 > アダプター シーケンスのクリップ」。
- オンまたは、次を入力します。
クリップをライブラリ: 4.2.4 のステップで生成されたファイルを選択します。
最小のシーケンスの長さ: 15
ソース: カスタム シーケンスを入力してください。
カスタムのクリップのシーケンスを入力: CCCCCCC
アダプター シーケンスおよびそれに続く x 脚を保つために非ゼロ値を入力: 0
不明な (N) 拠点を持つシーケンスを破棄: はい
出力オプション: クリップとクリップされていないシーケンスを出力 - 「実行」をクリックします。
- アダプターのシーケンスを削除します。
- 選択「NGS: QC および操作 > アダプター シーケンスのクリップ」。
- オンまたは、次を入力します。
- クリップをライブラリ: 4.2.5 のステップで生成されたファイルを選択します。
- 最小のシーケンスの長さ: 15
- ソース: カスタム シーケンスを入力してください。
- カスタムのクリップのシーケンスを入力: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
- アダプター シーケンスおよびそれに続く x 脚を保つために非ゼロ値を入力: 0
- 不明な (N) 拠点を持つシーケンスを破棄: はい
- 出力オプション: クリップとクリップされていないシーケンスを出力
- 「実行」をクリックします。
- その品質に基づくフィルターの読み込み
- 選択「NGS: QC および操作 > 品質フィルター」。
注: このツールは、品質スコアに基づいて読み取りを選択します。 - 次を選択します。
フィルターを適用するライブラリ: 4.2.6 のステップで生成されたファイルを選択します。
品質のカットオフ値: 20
品質を持っている必要があります順序で基地の占める割合均等に/より高いカットオフ値: 95 - 「実行」をクリックします。
注: これらの設定で読み取り 20 ヌクレオチド以上 20 の品質スコア短いまたは少ないサイクル数の 95% が破棄されます。テストに逼迫設定を適応します。
- 選択「NGS: QC および操作 > 品質フィルター」。
- マップ読み込み32
- 選択「NGS: マッピング > Bowtie2」32。
- メイン ウィンドウのフィールドに、次を選択します。
このシングルまたはペアのライブラリです: シングル エンド
FASTQ ファイル: ステップ 4.2.7 から品質フィルター ライブラリを選択します。
ファイルを分離する (fastq 形式) でアライメントされていない読み取りを書く: なし
ファイルを分離する (fastq 形式) の一直線に並べられた読み取りを書く: なし
あなたの履歴から参照ゲノムを選択するだろうか、組み込みインデックスを使用?: 歴史からのゲノムを使用し、インデックスを構築
参照ゲノムを選択: 4.2.2 の手順で、レプトスピラの genome.txt ファイルをアップロード] を選択します。
セットは、グループ情報を読み取る?: 設定されていません。
選択の分析モード: 1: 既定の設定のみ
プリセットを使用するか?: いいえ、ちょうどデフォルトを使用
歴史に bowtie2 マッピング統計を保存: なし
ジョブのリソース パラメーター: 既定ジョブ リソース パラメーターを使用 - ゲノムへの読み取りを配置する「実行」をクリックします。
- ファイルを変換します。
- 選択「NGS: SAMtools > サムに BAM BAM サムに変換する".
- 次を選択します。
変換する BAM ファイル: 選択マップからステップ 4.2.8 ライブラリ。
ヘッダー オプション: サム出力にヘッダーを含める (-h) - 「実行」をクリックします。
- ファイルを変換します。
- 選択「NGS: SAMtools > 間隔にサムを変換します".
- 次を選択します。
変換するデータセットを選択: 4.2.9 の手順で生成された SAM マップされたライブラリ ファイルを選択します。
すべて印刷ですか?: はい - 「実行」をクリックします。
- 並べ替えを読み取ります
- 選択"フィルターと並べ替え > 昇順または降順でデータを並べ替える」。
- 次を選択します。
並べ替えデータセット: 4.2.10 のステップで生成された間隔のファイルを選択します。
列: 2
風味: 順
すべて: 昇順 - 「実行」をクリックします。
- 一致する染色体の読み取りを選択私
- 選択"フィルターと並べ替え > 式に一致する行の選択」。
- 次を選択します。
行を選択: 並べ替えられた読み取り手順 4.2.11 で生成されたファイルを選択します。
いる: 一致します。
パターン: 4.2.1.3 (例えば、「クリ」) の手順で決定として染色体の名前を入力します。 - 「実行」をクリックします。
- 選択読み取り一致する染色体 II
次のステップ 4.2.12 進みます。 - グループが読み取り染色体の挿入サイトによると
- 選択"、減算し、グループに参加 > 列によってデータをグループ化し、他の列に集計操作を実行"します。
- 次を選択します。
データを選択: ステップ 4.2.12 から結果ファイルを選択します。
グループ化の列: 2
グループ化しながらケースを無視するか?: いいえ
これらの文字で始まる行を無視する: Ø
操作 > 挿入操作 +
タイプ: カウント
列: 2
結果は最も近い整数に丸める: なし - 「実行」をクリックします。
- グループ II の染色体に挿入サイトに従って読む
次のステップ 4.2.14 進みます。 - 並べ替え挿入がサイト染色体上
- 選択"フィルターと並べ替え > 昇順または降順でデータを並べ替える」。
- 次を選択します。
並べ替えデータセット: 4.2.14 のステップからファイルを選択します。
列: 1
風味: 順
すべて: 昇順 - 「実行」をクリックします。
- 染色体 II の挿入サイトを並べ替える
次のステップ 4.2.16 進みます。
- ゲノム シーケンス ファイルをダウンロードします。
- 統計解析
- 4.2.16 の手順から 2 つの列のコピーと貼り付けによってスプレッドシート ファイルに銀河のデータを転送します。4.2.17。Excel ファイル。
注: 最初の列はトランスポゾンの挿入部位のヌクレオチド座標と 2 番目の列は、各挿入部位での読み取りの数。 - テーブルで提供されるヌクレオチドの座標を使用してトランスポゾンをかくまっている遺伝子を特定します。
注: たとえば、トランスポゾンの染色体の塩基 #30718 に挿入私はヌクレオチド 29263 31539 の染色体にまたがるLIC10024遺伝子である私。 - 各組織では以下の方程式に従う入力プールで各変異体の相対周波数 (F) を計算します。
- 各変異体と以下の式を使用して組織の入力/出力比 (R) を計算します。
- ウィルコクソンの符号順位検定
- 1.0 にそれぞれの動物の各組織の中央値の比を設定することによってすべての入力/出力比を正常化します。1.0 の比率は中立、> 1.0 は、不利であると < 1.0 は、有利である33。
- Wilcoxon の順位検定による P 値 1.0 (中立的なフィットネス) に入力/出力比を比較する < 0.05 を有意と見なされます。
- 4.2.16 の手順から 2 つの列のコピーと貼り付けによってスプレッドシート ファイルに銀河のデータを転送します。4.2.17。Excel ファイル。
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Representative Results
活用によるl. カバーのトランスポゾン変異体のライブラリの作成では、図 1に示すように、ろ過装置が必要です。我々 はそれぞれの交配から 100-200 しかしながらを回復しました。
トランスポゾン挿入部位、各突然変異体におけるトランスポゾンの終わりをターゲットとする半ランダムな PCR によって生成された PCR の製品のシーケンスによって識別され、隣接するホスト系列15 (図 2 a)。半ランダムな PCR の結果の例を図 2 bに示します。ほとんどの場合 2 番目のラウンドのための PCR とタグ TnkN1 の最初のラウンドの Deg1、Tnk1 のプライマーを使用するとき支配的な増幅が観測されます。しかしながら、上のシーケンス (. 低特異性N10GATAT 3') Deg1 プライマーの 3' 端にこのプライマーがレプトスピラ ゲノム全体の複数の場所でアニールします。これらのサイトがトランスポゾンの終わり近くに存在する場合、複数の PCR の製品を得られるかもしれない。PCR ミックスから一緒に浄化され、直接シーケンスことができます複数の産物が生成されると、彼らはすべて TnkN1 プライマーが焼鈍の下流の同じシーケンスを含むために、各増幅のゲルの浄化は必要ではありません。その一方で、PCR がトランスポゾンの端から遠くに Deg1 プライマーによってターゲット シーケンスの最も近いコピーがある場合に失敗します。PCR の製品が検出されなかった場合は、Deg1 プライマー Tnk2 プライマーは、トランスポゾンの反対側の端をターゲットと半ランダムな PCR の最初のラウンドを繰り返すことができます。この場合 TnkN2 とタグされる第 2 ラウンド;増幅は、TnkN2 プライマー (図 2 b) とシーケンスでしょう。度 2 プライマー、その 3' 末端 (... また、PCR の最初のラウンドを行うことができます。N10TCTT 3') 4-よりもむしろ 5 塩基を対象とします。PCR (PCR #1) の最初のラウンドのためのプライマーの 4 種類のセットを使用できます: Tnk1 + Deg1、Tnk1 + 度 2、Tnk2 + Deg1、Tnk2 + 度 2。プライマーの 1 つのセットが動作しない場合は、別のセットを使用します。この第 2 セットも失敗のように別の 1 つを使用します。自然カナマイシン耐性突然変異株は非常にまれの周波数で発生する < 10-10 34。
ゲノム ライブラリ (図 4) の準備中、いくつかの手順を確認できます。Sonication によって DNA をせん断は agarose のゲル (図 5) の因数の電気泳動で確認すべき。DNA、正しく剪断、200 から 600 bp に及ぶ DNA のフラグメントは、2% の agarose のゲルの塗抹標本を形成します。高スループット シーケンス用のライブラリを送信する前にネストされた PCR の反作用によって PCR 産物の生成は agarose のゲルの電気泳動 (図 6) で確認する必要があります。
次のここで説明されているプロトコル シーケンスの読み込み (セクション 4.2) を処理した後セクション 4.3.3 で式を使用して入力のプールとすべての組織各変異体の頻度は決まります。各組織の各変異体の入力/出力比は、セクション 4.3.4 の方程式で計算されます。図 7は、Tn Seq のアプローチとその結果の例を示します。また、マゼンタのツールは、プロセスし、シーケンス データ31を分析を使用できます。有意に減少と増加のフィットネスの突然変異体を同定しました。引き起こされる知られているレプトスピラ病原性遺伝子の突然変異は、フィットネス、Tn Seq アプローチの検証を減少します。
図 1: 共役に使用されるろ過装置です。滅菌鉗子は、ベースの上に漏斗を配置し、クランプでシステムを保護するとベースの上に酢酸セルロース フィルターを位置決めサイドアーム エルレンマイヤー フラスコにフィルター サポートのストッパーを挿入してろ過ユニットは組み立て済み.ろ過装置は、真空システムに接続されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 2: トランスポゾン挿入部位の同定します。(A) 方式半ランダムな PCR のプライマーのアニーリングのサイトを表示します。Tnk1、Tnk2 のプライマーをアニール トランスポゾン (Tn) の反対の端の近くにあります。Deg1 3' 端に並び GATAT に続いて 10 塩基のストレッチが含まれています 35 塩基プライマーであります。Deg1 と Tnk1 または Deg1 PCR (PCR #1) の最初のラウンドを実施し、PCR #2 用 Tnk2 です。 TnkN1 と TnkN2 のプライマー アニール トランスポゾンの両端と Tnk1 と Tnk2、それぞれ。タグ プライマーのシーケンスは Deg1 のプライマーの 5' 末端のと同じです。14 トランスポゾン変異 (1 に 14 の車線) の PCR の第 2 ラウンド後に agarose のゲルの (B) の例が得られます。PCR の最初のラウンドを行った Deg1 と Tnk1。第 2 ラウンドは、タグで行われていた、TnkN1。 肯定的な PCR がで表されます"+"および否定的な PCR によって"-"。「KmR」は、カナマイシン耐性カセットを表します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 3: 出力のプールを取得するためのフロー チャート。チャレンジ (0 日) の日に、各レプトスピラ変異が暗視野顕微鏡によるカウントが同じ密度に希釈、入力プール (詳細はセクション 2.1 で説明) を形成するために結合します。ハムスターは、入力のプールと腹腔に挑戦されています。さらに、3 つの文化は、入力プールで開始されました。接種 (0 日目) の日と文化 ≈ の密度に達すると 108/mL、入力プール、文化は遠心分離によって収集された、(セクション 2.3 を参照) に使用されるまで-80 ° C でペレットとして格納されます。エンドポイント日 (日、動物、例えば挑戦後 4 日目を終了する選択された状態) で、動物を安楽死させて;肝臓、腎臓、血液は収集および使用 (セクション 2.4 を参照) まで-80 ° C で保存します。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 4: ゲノム ライブラリー作製のフローチャート。(A) DNA が血液、組織、セクション 3.1 で説明されたプロトコルを次の文化から抽出されます。赤いボックスは、トランスポゾン (Tn) を表します。(B) の DNA は、200 と 600 bp の断片に sonication によって剪断します。詳細については、セクション 3.2 で提供されます。(C) C ツインテール (黄色) はターミナルトランスフェラーゼ (TdT) セクション 3.3 で説明と表 4 のすべての DNA フラグメントに追加されます。ゲノム ライブラリーは、シーケンスのネストされた PCR (D E) によって準備されます。PCR の最初のラウンドは、それぞれ TnkN3 と olj376 のプライマー、トランスポゾンと C テールに固有で実行されます。表 3 と 5 を参照してください。トランスポゾンの両端 (赤のボックス) を含む唯一の断片が増幅されます。注: すべての DNA フラグメント C しっぽがあるため TnkN3 よりも 3 倍以上の olj376 のプライマーを使用します。PMargent2、トランスポゾン終了とプライマーをインデックス作成、単一シーケンス レーンで多重化するすべてのサンプルを許可する (ピンク) の 6 塩基対バーコード シーケンスを含む 1 つの特定の PCR の第 2 ラウンドが行われます。表 3 と 6 を参照してください。両方のプライマーには、イルミナ シーケンス (緑と紫ボックス) の中に、フローセルをバインドするために必要なシーケンスが含まれています。(F) 結果として得られる PCR の製品の清掃は、セクション 3.6 で説明されているように、濃度を測定する、.(G) ゲノムのすべてのライブラリが一緒にプール各ライブラリは、別のバーコードと (H) プールがシーケンスのプラットフォームに送信されます。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 5: DNA の超音波処理します。8 感染ハムスター (1 に 8 レーン)、超音波処理、および 2% の agarose のゲルの電気泳動を用いての肝臓から精製した DNA.DNA せん断はフラグメントのほとんどのサイズが 200 と 600 跪く間は塗抹標本によって特徴付けられるこの図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 6: 高スループット シーケンスのゲノム ライブラリ。Genomic ライブラリは、ested 8 感染ハムスター (1 に 8 車線) の血液から DNA を PCR によって準備され、2% の agarose のゲルの電気泳動を用いています。PCR の製品のほとんどのサイズが 200 と 600bp。 ネガティブ コントロール (TnkN3 プライマー PCR #1 ミックスでは表 5 参照なし) は増幅 (表示されません) を示しています。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
図 7: Tn Seq 実験から突然変異体のフィットネス.ハムスターの腎臓の突然変異体のプールのフィットネス チャレンジ (Lourdault の研究17から適応) 後 4 日。それぞれの動物のすべての 42 の突然変異体の入力/出力比を求めた。各変異体は (lic) 遺伝子と遺伝子間領域によって名付けられた (inter) トランスポゾンが挿入または文学で一般的に使用される名前。各比率は、ブラック ダイヤモンドで表されます。率 (赤い線) の中央値は各変異体の決定、Wilcoxon 順位検定を用いて 1.0 と比較します。点線は、1.0 は、中立的なフィットネスに対応のフィットネスを表します。突然変異体がフィットネスに大きく影響はアスタリスクでマークされます: * P < 0.05;* * P < 0.01。この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください。
| 試薬 | 1 つの反作用のためのボリューム |
| 2 × マスター ミックス | 12.5 Μ L |
| プライマー 1、10 mM (TnK1 または TnK2) * | 1.2 Μ L |
| プライマー 2、10 mM (Deg1 または度 2) * | 1.2 Μ L |
| 水 | 8.8 Μ L |
| テンプレート (細胞ライセートまたは DNA) | 1.3 Μ L |
| 最終巻 | 25 μ L |
| * 表 3 プライマー シーケンス。 |
表 1:半ランダムな PCR #1 ミックス トランスポゾン挿入部位の同定します。
| 試薬 | 1 つの反作用のためのボリューム |
| 2 × マスター ミックス | 12.5 Μ L |
| プライマー 1、100 mM (TnKN1 または TnKN2) * | 0.2 Μ L |
| プライマー 2、100 mM (タグ) * | 0.2 Μ L |
| 水 | 10.1 Μ L |
| PCR #1 からの PCR の製品 | 0.8 Μ L |
| 最終巻 | 25 μ L |
| * 表 3 プライマー シーケンス。 |
表 2:半ランダムな PCR #2 ミックス トランスポゾン挿入部位の同定します。
| 名 | シーケンス (5' 3') | 参照 | ||||
| 半ランダムな PCR 用プライマー | ||||||
| Tnk1 | CTTGTCATCGTCATCCTTG | 15 | ||||
| Tnk2 | GTGGCTTTATTGATCTTGGG | |||||
| Deg1 | GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT | |||||
| Deg2 | GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT | |||||
| TnkN1 | CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG | |||||
| TnKN2 | TGGGGATCAAGCCTGATTGGG | |||||
| タグ | GGCCACGCGTCGACTAGTAC | |||||
| イルミナ シーケンス用プライマー | ||||||
| TnkN3 | CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG | 17 | ||||
| olj376 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG | 6 | ||||
| pMargent2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA | |||||
| IP アドレス 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | イルミナ シーケンス (太字でバーコード) | ||||
| IP 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 13 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 14 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 15 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 16 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 17 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 18 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 19 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 21 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 22 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 23 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 24 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 25 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 26 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 27 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 28 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 29 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP seq | GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC | |||||
| pMargent3 | ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA | 6 | ||||
テーブル 3:のプライマー シーケンス。
| 試薬 | 1 つの反作用のためのボリューム |
| DNA のせん断 | 500 ng (3.3.2 で方程式を参照してください)。 |
| 水 | 14.5 μ L まで |
| TdT バッファー x 5 | 4 Μ L |
| (9.5 mM dCTP + 0.5 mM ddCTP) ミックス * | 1 Μ L |
| TdT (30 U/μ L) | 0.5 Μ L |
| 最終巻 | 20 μ L |
| * 水の 51.3 μ L、100 mM dCTP 5.7 μ ミックス 3 µLof 10 mM ddCTP | |
表 4:C テーリング反応ターミナルトランスフェラーゼ (TdT).
| 試薬 | 1 つの反作用のためのボリューム | |
| ライブラリの反応 | 制御反応 | |
| マスター ミックス 2 倍 | 12.5 Μ L | 12.5 Μ L |
| プライマー 1、30 μ M (TnkN3) * | 0.5 Μ L | - |
| プライマー 2、30 μ M (olj376) * | 1.5 Μ L | 1.5 |
| 水 | 7.5 Μ L | 8 Μ L |
| C 尾 DNA | 3 Μ L | 3 Μ L |
| 最終巻 | 25 μ L | 25 μ L |
| * 表 3 プライマー シーケンス。 | ||
表 5:ゲノム ライブラリー、PCR #1 ミックスの構築します。
| 試薬 | 1 つの反作用のためのボリューム | |
| ライブラリの反応 | 制御反応 | |
| マスター ミックス 2 倍 | 25 Μ L | 12.5 Μ L |
| プライマー 1、30 μ M (pMargent2) * | 0.5 Μ L | 0.25 Μ L |
| プライマー 2、30 μ M (インデックス プライマー) * | 0.5 Μ L | 0.25 Μ L |
| 水 | 23 Μ L | 11.5 Μ L |
| PCR #1 からの PCR の製品 | 1 Μ L | 0.5 Μ L |
| 最終巻 | 50 μ L | 25 μ L |
| * 表 3 プライマー シーケンス。 | ||
表 6: ゲノム ライブラリー、PCR #2 ミックスの建設。
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Discussion
Tn シーケンスによって突然変異体のより大きいプールを検査することを見込んでこの腹腔内 42 l. カバー変異挑戦のハムスターのためのパイロット実験からの結果は17を提示されて、しかしながらの頻度が低いので (100-200 しかしながら/交配)、いくつかの交配が大型の Tn Seq 実験の突然変異体の十分な数を生成する必要。液体培養変異体の大規模な数の維持の対処しなければならない物流の課題を提示します。文化は深い 96 ウェル プレートで培養することができます。420 に設定分光光度計の光学密度測定値によって文化の密度を監視できる nm。使用する動物の数の決定入力プールのサイズに依存し、パワー解析によって決定する必要があります。大規模な実験、生物統計学者との協議で電力解析を実行することをお勧めします。
ボトルネックは出力プールからランダムな突然変異体の回復に影響を与えます。私たちのパイロット研究17 (図 7) に深刻なボトルネックが認められないが突然変異体のランダムな損失によって大規模な実験があります。入力プールで変異あたりのセル数を増やすことによってチャレンジ投与量を増やすと、ボトルネックの35の可能性が最小限になります。新しく発行された銀河ツール マゼンタは、ボトルネックとフィットネス31を評価するために必要なツールを提供します。
Tn Seq 実験計画他のレプトスピラ感染症の代替ルートの系統、または他の齧歯動物モデルは、追加の考慮事項を必要とします。ホスト種の感染症の動態が不明または調査する各組織内感染の過程で継続的に指数は場合、は、組織から直接ではなく、組織の培養から DNA を取得必要があります。この追加の手順は、死んでいるスピロヘータから DNA の検出による突然変異のフィットネスの過大評価を最小限になります。組織培養から出力プールを取得すると、する場合入力プールは体外で成長のアドレスに対する培養する必要があります。また、ボトルネックが問題になるかどうかを決定するため、大規模な実験用電力解析を支援するために突然変異体の数が少ないとパイロット実験を勧め。
動物モデルの個々 の突然変異体のテスト Tn Seq によって決定される変更された適合性の確認が必要になります。現在、各変異体は、興味の遺伝子の挿入を運ぶ変異を識別するためにテネシー州 Seq の前に個別にシーケンスする必要があります。ただし、病原性レプトスピラに対立遺伝子交換が簡単になり場合、個々 の突然変異体のシーケンスは、もはや必要あります。また、転写活性化因子のようなエフェクタはl. カバー36における遺伝子発現の光を軽減するため正常に使用されています。ダウンは、Tn シーケンスによって識別される変更のフィットネスで突然変異体の破砕遺伝子を調整するこの手法を使用できます。
Tn Seq データを解釈するとき細菌間の相互作用は考慮されるべきであります。フィットネスの減少はトランスポゾン挿入の直接効果よりもむしろ突然変異体間の競争のためにされる可能性が理論的に可能です。さらに、変異体間協力体内フィットネス プール内の変異の変化がない可能性があります。たとえば、不可欠な要素を生成する失敗した変異体は、プール内の他の変異体による因子の生産によって intercellularly 補完でした。我々 はもはやサルモネラ37に示すように、成長のため必須ではないタンパク質の合成代謝負荷が減少の結果であるかもしれないいくつかの変異体のための適性の増加を観察しました。
このプロトコルは、代謝や38,39体外ストレス条件下での生存に関与する遺伝子を識別するために使用することができます。たとえば、高ナトリウム塩化物濃度、限られた鉄は、酸性 pH などさまざまな条件で成長しているレプトスピラは酸性の生存やストレス耐性に関与する遺伝子を識別できます。これらの in vitroの実験を行うこともできますひずみL. biflexa Patoc など腐生菌と私にこの Tn Seq メソッドを適用できるのですべてシーケンスレプトスピラ菌。
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Disclosures
著者が明らかに何もありません。
Acknowledgments
この作業にベテラン事務功労賞 (D.A.H.) に支えられ、国立衛生研究所 (D.A.H.) に R01 AI 034431 を付与します。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
- Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
- Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
- Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
- van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
- van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
- Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
- Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
- Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
- Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
- Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
- Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
- Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
- Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
- Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
- Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
- Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
- Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
- Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
- Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
- Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
- Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
- Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
- Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
- Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
- Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
- Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
- Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
- Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
- Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
- Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
- McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
- Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
- Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
- Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
- van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
- Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
- Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
- Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
- Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).
