Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Høy gjennomstrømming parallelle sekvensering å måle Fitness Leptospira interrogans Transposon innsetting mutanter under Golden Syrian Hamster infeksjon

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Her beskriver vi en teknikk som kombinerer transposon mutagenese med høy gjennomstrømming sekvensering å identifisere og telle transposon leptospiral mutanter i vev etter en utfordring hamstere. Denne protokollen kan brukes til skjermen mutanter for overlevelse og spredning i dyr og kan også bli brukt i vitro studier.

Abstract

I dette manuskriptet beskriver vi en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknikk for å identifisere og telle Leptospira interrogans mutanter endret i fitness under infeksjon av Golden syrer hamsters. TN-Seq kombinerer tilfeldig transposon mutagenese med kraften av høy gjennomstrømming sekvensering teknologi. Dyr blir utfordret med en pool av transposon mutanter (input pool), etterfulgt av høsting av blod og vev noen dager senere for å identifisere og telle antall mutanter i hvert organ (output bassenger). Utgang bassengene er sammenlignet med inndata bassenget evaluere i vivo egnethet av hver mutant. Denne tilnærmingen gjør screening av en stor pool av mutanter i et begrenset antall dyr. Med mindre modifikasjoner, kan denne protokollen utføres med noen dyr modell for leptospirose, reservoaret vert modeller som rotter og akutt infeksjon modeller som hamsters, samt i vitro studier. TN-Seq gir et kraftig verktøy til skjermen for mutanter med i vivo og i vitro fitness defekter.

Introduction

Identifikasjon av virulens gener for noen bakterier, som Leptospira spp., er vanskelig på grunn av begrenset antall genetisk verktøy tilgjengelig. En brukte tilnærming er etableringen av en samling av mutanter av tilfeldige transposon mutagenese etterfulgt av identifisering av innsetting site i hver mutant og virulens testing av personlige transposon mutanter i en dyremodell. Denne metoden er tidkrevende, dyre, og krever et stort antall dyr.

Når tilfeldig mutagenese ble først utviklet for patogen Leptospira interrogans, ble gener involvert i virulens identifisert ved å teste individuelle mutanter i en dyremodell1. Mutanter ble valgt basert på kriterier som deres potensielle roller i signalering eller motilitet eller deres spådd ytre membran eller overflate plassering. Som fleste leptospiral gener kode hypotetisk proteiner av ukjent funksjon2, velge mutanter basert på disse vilkår begrenser muligheten til å oppdage romanen leptospiral virulens gener.

Flere nylig, av L. interrogans transposon mutanter ble vist for infectivity i hamster og musen modeller3. Hvert dyr ble utfordret med basseng av opp til 10 mutanter. Infectivity av en mutant ble scoret som positive hvis det ble oppdaget av PCR kulturer blod og nyre. PCR testing var arbeidskrevende fordi det kreves en personlige PCR-reaksjon for hver mutant i bassenget. Fordi frekvensen av hver mutant i kulturer ikke var kvantifisert, var tilnærming forutinntatt mot identifikasjon av svært dempes mutanter.

Vi beskriver en transposon sekvensering (Tn-Seq) teknikk, som en strategi for å mer effektivt skjermen for virulens gener. TN-seq består av etableringen av et bibliotek av mutanter av transposon mutagenese etterfulgt av massiv parallelle sekvenser4,5,6. Kort, transposon mutanter er samlet inokulert til dyr og senere utvinnes fra ulike organer (output bassenger). DNA fra utdataene bassengene er trukket ut og fordøyd med begrensning enzymer eller skåret av sonication. To rundene PCR målretting knutepunktene i webområdene transposon innsetting utføres. Dette trinnet gjør tillegg av adaptere nødvendig for sekvensering. De resulterende PCR-produktene analyseres av høy gjennomstrømming sekvensering å identifisere webområdet transposon innsetting av hver mutant av basseng samt deres relative overflod, som er i forhold til første sammensetningen av bassenget til mutant.

Den primære fordelen med denne tilnærmingen er muligheten til å samtidig skjermen et stort antall mutanter med et lite antall dyr. TN-Seq ikke krever forutgående kunnskap om transposon innsetting nettsteder som øker sjansene for å oppdage nye Leptospira-bestemte gener involvert i virulens med mindre tid og større effektivitet. Fordi leptospiral byrden i vev er relativt høy i gnager modeller utsatt for dødelige infeksjoner (vanligvis 104 til 108 bakterier/g av vev)7,8,9 så vel som i reservoaret verter 10,11, vev kan analyseres direkte uten å måtte kultur, redusere fordommer på grunn av veksten i vitro .

Tn-Seq studier med de fleste bakterielle patogener beskrevet hittil, den høye frekvensen av insertional mutagenese tillatt infeksjon med store bassenger med mutanter kollektivt har flere kryr transposon innsettinger i hver genet4 ,12,13,14. TN-Seq har også blitt utviklet for en bakterie som mutagenese frekvensen er mye lavere6. Med Leptospira, kan et bibliotek med transposon mutanter genereres ved å innføre transposon på en mobilizable plasmider av Bøyning som beskrevet av Slamti et al15. Men er frekvensen av transposon mutagenese av L. interrogans lav. Da Himar1 transposon ble innført på en konjugerbart plasmider, ble transconjugant frekvensen rapportert å være bare 8,5 x 10-8 per mottaker cellen med Lai belastningen av L. interrogans16 og trolig bli tilsvarende dårlig med de fleste andre stammer av L. interrogans. Protokollen beskrevet her er delvis basert på som utviklet for Borrelia burgdorferi, der frekvensen av transposon insertional mutagenese er også lav6.

For våre pilotprosjekt med protokollen17gjennomførte vi transposon mutagenese med L. interrogans serovar Manilae belastning L495 på grunn av andre grupper i isolere transposon innsetting mutanter i belastningen med sin lave LD50 (dødelig dose) for virulens1. Vi vist 42 mutanter av Tn-Seq og identifisert flere mutant kandidater defekt i virulente, inkludert to med innsettinger i en kandidat adenylate cyclase genet. Personlige testing av to mutanter i hamstere bekreftet at de var mangelfull i virulens17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

FORSIKTIG: Sykdomsfremkallende stammer av Leptospira spp. må håndteres under grad 2 (BSL-2) containment prosedyrer. Riktig personlig verneutstyr (PVU) må brukes. En klasse II biosafety kabinettet må brukes for alle manipulasjoner av patogene Leptospira spp.

1. opprettelsen av Transposon Mutant biblioteket15

  1. Overføring av transposon til Leptospira spp. av Bøyning (figur 1)
    1. Vaksinere et volum på eksponentiell-fase kultur patogene Leptospira spp. tilsvarer 107 celler i 10 mL av Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris middels (EMJH)18,19. Ruge på 30 ° C med 150 rpm risting til tetthet når 2-8 x 108 celler/mL.
      Merk: Dobling tid sykdomsfremkallende leptospires er 12 til 24 h, avhengig av belastningen.
    2. Vaksinere 50 µL av donor Escherichia coli belastning β216320 frakte mobilizable transposon plasmider (pCjTKS2)16 inn 5 mL av Luria kjøttkraft (LB) med 0,3 mM 2,6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µg/mL kanamycin (Km), og 50 µg/mL av spectinomycin (Spc) og sted over natten i en 37 ° C inkubator på 255 rpm.
    3. Vaksinere 60 µL av E. coli celler i 3 mL EMJH med 0,3 mM DAP (EMJH + DAP). Ruge på 37 ° C på 255 rpm agitasjon for 3-4 h til et OD600nm≈ 0,3.
    4. For å montere filtrering enhet (figur 1), sett foten på en 125 mL side-arm Erlenmeyer kolbe, plasserer en acetat innen filter (pore størrelse 0,1 mm; diameter 25 mm) på base og klemme trakten på bunnen. Koble filtrering til et system.
    5. Legge til 5 mL Leptospira spp. kultur og 0,5 mL av E. coli kultur i trakten. Vakuum væsken gjennom filteret.
    6. Overføre filteret med overflaten av bakterier vendt opp på en EMJH + DAPplate. Ruge på 30 ° C over natten med filteret grossist.
    7. Plasser filteret i en 15 mL tube som inneholder 1 mL av EMJH og vortex for 10 å slipper bakterier i media. Spre 200 µL av suspensjon på 5 EMJH platescontaining 50 µg/mL km 10-15 1 mm sterilt glassperler eller en steril disponibel sprederen. Pakk platene med parafilm og ruge dem opp ned på 30 ° C i 3 til 4 uker til koloniene er synlige.
    8. Overføre kolonier individuelt i 3 mL EMJH som inneholder 50 µg/mL km (EMJH + Km) på 30° C under 150 rpm agitasjon for 7-10 dager til kultur når en tetthet av ≈ 108/mL.
      Merk: Kulturer kan lagres på-80 ° C eller i flytende nitrogen (med 4% glyserol).
  2. Identifisering av transposon innsetting site av nestede PCR (figur 2)
    1. Lyse 50 µL av hver transposon mutert i PCR rør av inkubasjon 95 ° c i 15 min.
      Merk: DNA kan bli renset i stedet bruker en DNA utvinning kit.
    2. Klargjør PCR blandingen med Deg1 og Tnk1 primer (tabell 3) etter tabell 1. Overføre 23,7 µL av miksen til hver PCR-rør og legge 1.3 µL av lysed celler. Kjør programmet: 95° C i 5 min; 40 sykluser: 95 ° C i 15 s, 40 ° C for 1 min, 72 ° C i 2 min; 72 ° C i 10 min.
    3. Gjøre PCR blandingen med koden og TnkN1 primer (tabell 3) etter tabell 2. Overføre 24.2 µL av miksen til hver PCR-rør og legge 0,8 µL PCR #1 reaksjon. Kjør programmet: 95 ° C i 5 min; 35 sykluser: 95 ° C i 15 s, 55 ° C for 30 s, 72 ° C i 2 min; 72 ° C i 10 min.
    4. Kjøre 3 µL av PCR-produkter på en 1% agarose gel med 1 X Tris Acetate EDTA (TAE) buffer på 10-15 V/cm (figur 2B).
    5. Rense PCR produkter av positiv prøver ved en PCR rensing kit. Elute DNA med lavest volumet tillatt av kit å maksimere konsentrasjonen av DNA utvinnes.
    6. Sende renset PCR produkter for Sanger sekvensering bruker TnkN1 primer (tabell 3).
    7. Identifisere innsetting nettsteder ved å sammenligne den resulterende sekvensen med foreldrekontroll Belastningens Genova orden av BLASTN analyse (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) eller SpiroScope (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)-databasen21.
    8. Bekreft innsetting site av transposon av PCR bruker primere annealing til flankemanøveren vert sekvenser.
      Merk: Transposon øker størrelsen på vill-type sekvensen av ≈ 2 kb.

2. dyr eksperimentet (Figur 3)

  1. Kultur Leptospira mutanter
    1. Vokse individuelt hver valgte transposon mutant i 10 mL EMJH + km på 30 ° C for 150 rpm agitasjon til en tetthet på 107-108 leptospires/mL.
    2. Telle leptospires dark-feltet mikroskopi med en Petroff-Hausser teller eller som beskrevet av Miller23.
    3. Fortynn hver kultur i EMJH til den samme tettheten, for eksempel 106 celler/mL.
    4. For å montere input bassenget, bland sammen utvannet kulturer i like volum.
      Merk: Inkluder kontrollene i input bassenget ved å legge mutanter med kjente fitness defekter som loa2217,24 og mutanter med uendret fitness som ligB17,25, henholdsvis. Bassenger av mutanter kan lagres med 4% glyserol-80 ° C eller i flytende nitrogen.
  2. Utfordring
    Merk: Metodene som er beskrevet her ble godkjent av Veterans Affairs større Los Angeles institusjonelle Animal Care og bruk Committee (protocol #09018-14).
    1. Injiser intraperitoneally 1 mL av inndata til hvert dyr med en insulinsprøyte U-100 med 26G x ½" nål.
      Merk: I pilotprosjekt, 8 dyrene ble utfordret med 1 mL av input bassenget, dvs 106 bakterier totalt17. Infeksjonen var lov til å fortsette i 4 dager før euthanasia.
    2. Samle 10 mL av inndata, og spinn for 20 min på 3,220 x g. forsiktig fjerne nedbryting uten å forstyrre pellet. Lagre celle pellet på - 80˚C til bruk (trinn 3.1.3).
    3. Overvåke dyrene daglig før de avsluttes ved forhåndsbestemte endepunktet. Veie hamstere daglig og se endepunktet vilkår: tap av appetitt, gangart eller åndedrag vanskeligheter, sammenbrudd, ruffled pels eller tap av > 10% av den maksimale vekten oppnådd.
  3. In vitro eksperiment
    1. På dag utfordring, vaksinere 3 flasker av 25 mL EMJH + km med 5 mL av input. Vokse kulturer på 30 ° C under 150 rpm agitasjon.
    2. Telle leptospires daglig ved hjelp av metodene i delen 2.1.2. Når tettheten når ≈ 1 x 10-8/mL, spinne ned hver suspensjon for 20 min 3,220 x g.
    3. Lagre celle pellets ved-80 ° C før bruk.
  4. Fangst og lagring av vev
    1. Avlive dyrene ved isoflurane innånding etterfulgt av bilaterale thoracotomy26.
    2. Umiddelbart samle 1 til 2 mL blod av cardiac punktering med en 3 mL sprøyte og en 25G x 5/8-tommers nål. Overføre blod inn i rør med EDTA. Bland ved inversjon, 5 til 6 ganger.
    3. Samle en nyre- og ⅓ til ½ av det ventrale median flik av leveren i cryotubes.
    4. Lagre vev ved-80 ° C før bruk.

3. bygging av genomisk biblioteker for høy gjennomstrømming sekvensering (Figur 4)

  1. DNA utvinning
    1. DNA utvinning fra blod.
      1. Overføre 100 µL av blod fra EDTA røret slik microcentrifuge.
      2. Rense bruker en DNA utvinning kit. Følg instruksjonene fra produsenten.
    2. DNA utvinning fra vev.
      1. Bruke skalpeller og saks, terninger mellom 50 til 80 mg av hvert organ i små biter (1 mm x 1 mm), og overføre dem inn i et sterilt skruen-cap tørr rør. Måle vekten av vev med en presisjon balanse.
      2. Legg til 500 µL av sterile PBS inn i røret.
      3. Homogenize prøver ved hjelp av disruptor for 1 min på 5 bevegelser per sekund.
      4. Beregne volumet tilsvarende 25 mg vev ved hjelp av følgende ligning:
        Equation 1
      5. Overføre beregnet volumet til DNA utvinning kit. Fortsett med DNA rensing følge instruksjonene fra produsenten.
    3. DNA utvinning fra input basseng og i vitro kulturer.
      1. Tine bakteriell pellets ved romtemperatur for 5-10 min.
      2. Fortsett med DNA utvinning følge instruksjonene følger med settet.
    4. Lagre DNA ved-80 ° C før bruk.
  2. Skjæring DNA (figur 5)
    1. Overføre 50 µL av utdraget DNA på en 1,5 mL microcentrifuge tube.
    2. Plassere rør i rack med sonicator kopp Hornet fylt med kaldt vann (4 ° C).
    3. Kjøre sonicator for 3 min 80% intensitet med 10 s på puls og 5 s av puls.
      FORSIKTIG: Bruk Ørevarmere eller ørepluggene å beskytte høring.
    4. Kjøre 2,5 µL av det skråstilte DNA på en 2% agarose gel å bekrefte at de fleste av DNA er < 600 bp i størrelse.
  3. Tillegg C-halen
    1. Måler DNA konsentrasjon med et lite volum spektrofotometer.
    2. Beregne volumet tilsvarende 500 ng DNA ved hjelp av følgende ligning:
      Equation 2
    3. Forberede tailing reaksjon (Tabell 4). Inkuber 1t på 37 ° C; Deaktiver ved 75 ° C i 20 min.
      Merk: For prøver som krever justering til et volum større enn 14,5 µL, øke siste bind i reaksjon på 40 µL og skalere opp de resterende komponentene tilsvarende.
    4. Rengjør prøvene med en PCR rensing kit. Elute DNA med 12 µL av elueringsbufferen.
  4. Nestede PCR
    1. PCR #1
      1. Forberede PCR mikser etter 3 og 5. Overføre 22 µL av biblioteket blandingen til hver PCR-rør og legge 3 µL av renset DNA. Fortsett på samme måte med kontroll mix.
        Merk: Primer TnkN317 er spesifikk for transposon og primer olj3766 gjelder C-halen. Kontroll mix mangler TnkN3 primer, som er spesielt rettet i transposon.
      2. Kjøre følgende program: 95 ° C i 2 min; 24 sykluser: 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C i 2 min; 72 ° C i 2 minutter.
    2. PCR #2.
      1. Forberede andre PCR mikser etter 3 og 6. Overføre 49 µL av biblioteket blandingen til hver PCR-rør og legge 1 µL PCR #1 bibliotek reaksjon. Overføre 24,5 µL av kontroll blandingen til hver PCR-rør og Legg til 0,5 µL av PCR #1 kontroll reaksjonen.
        Merk: Primer pMargent2 gjelder transposon, og IP primere6 inneholder seks-base-par strekkode og bestemt sekvenser anerkjent av neste generasjons sekvensering plattformen.
      2. Kjøre følgende program: 95 ° C i 2 min; 18 sykluser: 95 ° C for 30 s, 60 ° C for 30 s, 72 ° C i 2 min; 72 ° C i 2 minutter.
    3. Kjøre 3 µL på en 2% agarose gel. Biblioteket skal vise en smøre med fleste signalet mellom 200 til 600 bp (figur 6) og ingen forsterkning for kontroll reaksjonen.
  5. Rensing av PCR produkter.
    Merk: Rengjør genomisk bibliotekene med en PCR rensing kit følge instruksjonene fra produsenten. Elute DNA med 30 µL av elueringsbufferen.
  6. Måle DNA konsentrasjonen med en fluorometer. Gjennomsnittlig 2 til 3 leser.
  7. Beregne volumet av hvert bibliotek tilsvarende 15 eller 20 ng ved hjelp av formelen nedenfor:
    Equation 3
  8. Blande alle biblioteker sammen ifølge tidligere beregninger. Bestemme molar konsentrasjonen av DNA med følgende webområdets ligningen:
    http://www.molbiol.edu.ru/ENG/scripts/01_07.html
    FORSIKTIG: DNA konsentrasjon og volum krav, avhenger av sekvensering plattformen.

4. høy gjennomstrømming sekvensering og dataanalyse

  1. Sekvensering
    1. Sekvens biblioteker som 64 bp single-end lyder ved hjelp av egendefinerte sekvensering primer pMargent3 og standard kommersielle sekvensering primer. Sekvensering plattformen får du FastQ filer med alle sekvensering leser.
  2. Analyse med Galaxy programvare
    1. Last ned filen genomet sekvens
      1. I SpiroScope database hjemmeside (se trinn 1.2.7 for kobling), Velg organismen brukes for eksperimentet og klikk "Last i GENOMET BROWSER".
      2. Verktøylinjen (øverst på hjemmesiden), velg "Søk/eksport > laste ned data", "Sequence (fasta)" linjen, velg "Genome" for å laste ned sekvensen.
      3. Åpne filen i Notepad (PC) eller TextEdit (Mac) og endre navnet på kromosom (for eksempel "ChrI"). Opprettholde fasta formatet.
      4. Følg de samme trinnene for å laste ned en rekke kromosom II. Kombinere begge kromosom sekvenser i en enkelt txt-fil ved å kopiere og lime inn.
        Merk: Kromosom sekvenser kan også lastes ned fra NCBI nettsted (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) og kombinert i en enkelt txt-fil.
    2. Laste opp filer til serveren galaksen
      Merk: Galaxy er en åpen kildekode, web-basert plattform for å administrere data intensive bioinformatikk arbeidsflyter27,28,29,30 og kan nås på https://usegalaxy.org/.
      1. I Verktøy-menyen velger du "få data > Last opp fil fra datamaskinen". Dra og slipp .fastq fil(er) generert av sekvensering plattformen til vinduet og klikk "Start".
      2. Følg de samme trinnene for å laste opp filen Leptospira genomet sekvens txt.
    3. Brudgommen leser
      1. Velg "NGS: QC og manipulasjon > FASTQ Groomer" fra Verktøy-menyen.
      2. Ved siden av filen til brudgommen, velge bibliotekene du lastet opp i trinn 4.2.2. Input FASTQ kvalitet score type, Velg aktuell sekvensering systemet. La Skjul avansert Office valgt for avanserte alternativer.
      3. Klikk "Kjør".
    4. Fjerne sekvensering gjenstander
      1. Velg "NGS: QC og manipulasjon > fjerne sekvensering gjenstander". Velg preparerte filer generert i trinn 4.2.3 ved biblioteket å filtrere. Klikk "Kjør".
    5. Fjerne C-tail sekvenser
      Merk: Gjenta fremgangsmåten en eller to ganger for å sikre alle C haler fjernes.
      1. Velg "NGS: QC og manipulasjon > klippet kort sekvenser".
      2. Velg eller angi følgende:
        Bibliotek klipp: Velg filer generert i trinn 4.2.4.
        Minimum sekvens lengde: 15
        Kilde: angi Egendefinert rekkefølge
        Angi egendefinerte klipping sekvensen: CCCCCCC
        Angi ikke-null verdi for å holde kortet sekvenser og x baser som følger den: 0
        Forkaste sekvenser med ukjent (N) baser: Ja
        Leveringsvalg: utgang både kuttet og ikke-avkuttet sekvenser
      3. Klikk "Kjør".
    6. Fjern adapter sekvenser
      1. Velg "NGS: QC og manipulasjon > klippet kort sekvenser".
      2. Velg eller angi følgende:
      3. Bibliotek klipp: Velg filer generert i trinn 4.2.5.
      4. Minimum sekvens lengde: 15
      5. Kilde: angi Egendefinert rekkefølge
      6. Angi egendefinerte klipping sekvensen: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Angi ikke-null verdi for å holde kortet sekvenser og x baser som følger den: 0
      8. Forkaste sekvenser med ukjent (N) baser: Ja
      9. Leveringsvalg: utgang både kuttet og ikke-avkuttet sekvenser
      10. Klikk "Kjør".
    7. Filter leser basert på kvaliteten
      1. Velg "NGS: QC og manipulasjon > Filtrer etter kvalitet".
        Merk: Dette verktøyet merker leser basert på kvalitetspoeng.
      2. Velg følgende:
        Bibliotek for å filtrere: Velg filer generert i trinn 4.2.6.
        Kvalitet cut-off verdi: 20
        Prosent av baser i sekvens må ha kvalitet lik til/høyere enn cut-off: 95
      3. Klikk "Kjør".
        Merk: Med disse innstillingene, leser kortere enn 20 nukleotider eller med kvalitetspoeng på 20 eller mindre 95% av sykluser forkastes. Tilpasse stringens innstillinger i eksperimentet.
    8. Kart leser32
      1. Velg "NGS: tilordne > Bowtie2"32.
      2. Velg følgende i feltene i hovedvinduet:
        Er dette enkelt eller sammenkoblet bibliotek: single-ende
        FASTQ-filen: Velg biblioteket filtrert for kvalitet fra trinn 4.2.7.
        Skrive unaligned (i fastq format) leser til separate filer: ingen
        Skrive justert (i fastq format) leser til separate filer: ingen
        Vil du velge en referanse genomet fra loggen eller bruke en innebygd indeks?: Bruk en genomet fra historien og bygger stikkordregisteret
        Velg referanse genomet: Velg Leptospira genome.txt filen lastet opp i trinn 4.2.2.
        Sett lese grupper informasjon?: Angi
        Velg analyse modus: 1: standardinnstillingen bare
        Vil du bruke forhåndsinnstillingene?: Nei, bare bruke standard
        Lagre bowtie2 kartlegging statistikk historie: Nei
        Jobb ressurs parametere: bruke standard jobbparametere ressurs
      3. Klikk "Kjør" for å justere leser til genomet.
    9. Konvertere filer
      1. Velg "NGS: SAMtools > BAM-til-SAM konvertere BAM til SAM".
      2. Velg følgende:
        BAM-fil å konvertere: Velg tilordnet biblioteket fra trinn 4.2.8.
        Topp valg: ta med hode i SAM produksjon (-h)
      3. Klikk "Kjør".
    10. Konvertere filer
      1. Velg "NGS: SAMtools > konvertere SAM til intervall».
      2. Velg følgende:
        Velg dataset konvertere: Velg SAM tilordnede bibliotekfilen generert i trinn 4.2.9.
        Skrive ut alt?: Ja
      3. Klikk "Kjør".
    11. Sorter leser
      1. Velg "Filtrer og Sorter > sortere i stigende eller synkende rekkefølge".
      2. Velg følgende:
        Sorter datasett: Velg intervallet filen genereres i trinn 4.2.10.
        kolonne: 2
        med smak: numerisk rekkefølge
        alt i: stigende rekkefølge
      3. Klikk "Kjør".
    12. Velg leser matchende kromosom jeg
      1. Velg "Filtrer og Sorter > Velg linjene som samsvarer med et uttrykk".
      2. Velg følgende:
        Velg linjer fra: Velg fil med sorterte leser generert i trinn 4.2.11.
        som: matchende
        mønsteret: Angi navnet på kromosom jeg som bestemmes i trinn 4.2.1.3 (f.eks "ChrI").
      3. Klikk "Kjør".
    13. Velg leser samsvarende kromosom II
      Fortsette etter trinn 4.2.12.
    14. Gruppen leser ifølge webområdene innsettinger i kromosom jeg
      1. Velg «delta, subtrahere og gruppe > gruppere data i en kolonne, og utføre samlet operasjon på andre kolonner ".
      2. Velg følgende:
        Velg data: Velg filen fra trinn 4.2.12.
        Grupper etter kolonnen: 2
        Ignorere saken mens du grupperer?: Nei
        Ignorere linjer som begynner med disse tegnene: Ø
        Operasjonen > + innsettingsoperasjonen
        Type: antall
        Kolonne: 2
        Rundt resultatet til nærmeste heltall: Nei
      3. Klikk "Kjør".
    15. Gruppen leser etter innsetting områdene i kromosom II
      Fortsette etter trinn 4.2.14.
    16. Sorter innsetting nettsteder på kromosom jeg
      1. Velg "Filtrer og Sorter > sortere i stigende eller synkende rekkefølge".
      2. Velg følgende:
        Sorter datasett: Velg fil fra trinn 4.2.14.
        kolonne: 1
        med smak: numerisk rekkefølge
        alt i: stigende rekkefølge
      3. Klikk "Kjør".
    17. Sorter innsetting områder på kromosom II
      Fortsette etter trinn 4.2.16.
  3. Statistisk analyse
    1. Overføre Galaxy dataene til regnearkfiler ved å kopiere og lime inn de to kolonnene fra trinn 4.2.16. og 4.2.17. i en Excel-fil.
      Merk: Den første kolonnen er nukleotid koordinatet transposon innsetting site, og den andre kolonnen er antall leser på hver innsetting området.
    2. Identifisere genet skjuler transposon bruker nukleotid koordinat i tabellen.
      Merk: For eksempel en transposon inn på nukleotid #30718 av kromosom jeg er lokalisert i LIC10024 genet, som nukleotider 29263-31539 i kromosom jeg.
    3. Beregne relative frekvenser (F) for hver mutant i hvert vev og input bassenget etter formelen nedenfor:
      Equation 4
    4. Beregne utgang/input prosenter (R) for hver mutant og vev ved hjelp av formelen nedenfor:
      Equation 5
    5. Diversified signert-rank test
      1. Normalisere alle utgang/input prosenter ved å angi median forholdet for hvert vev i hvert dyr 1.0. En 1.0 er nøytral, > 1.0 er uheldig, og < 1.0 er fordelaktig33.
      2. Sammenligne utgang/input prosenter 1.0 (nøytral fitness) ved å bruke Diversified rank test med P-verdier < 0,05 ansett som statistisk signifikant.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Etableringen av et bibliotek med transposon mutanter i L. interrogans av Bøyning krever en filtrering enhet, som vist i figur 1. Vi funnet 100-200 transconjugants fra hver parring.

Transposon innsetting site identifiseres i hver mutant med sekvensering PCR produktet generert av semi-tilfeldige PCR som er rettet mot slutten av transposon og tilstøtende vert sekvenser15 (figur 2A). Et eksempel på resultatene av den halvt tilfeldig PCR vises i figur 2B. I de fleste tilfeller vil en dominerende amplicon observeres når Deg1 og Tnk1 primerne brukes for første runde PCR Tag og TnkN1 for andre runde. Men på grunn av lav spesifisitet av pentameric sekvensen (... N10GATAT-3 ") på 3 slutten av Deg1 primer, dette primer vil anneal på flere steder i leptospiral genomet. Hvis disse finnes nesten transposon, kan flere PCR-produkter fås. Når flere amplicons genereres, kan de renset sammen fra PCR mix og sekvensert direkte. gel rensing av hver amplicon er ikke nødvendig fordi de alle inneholder samme sekvens nedstrøms av hvor TnkN1 primer anneals. På den annen side, kan PCR mislykkes hvis den nærmeste kopien av sekvensen målrettet av Deg1 primer ligger på god avstand fra transposon slutten. Hvis ingen PCR produkter oppdages, kan den første runden av semi-tilfeldige PCR gjentas med Deg1 primer og Tnk2 primer, som rettet mot den motsatte enden av transposon. I dette tilfellet vil TnkN2 og kode bli brukt for den andre runden; amplicon ville være sekvensielt med TnkN2 primer (figur 2B). Også kan den første runden av PCR gjøres med Deg2 primer, som har 3 slutten (... N10TCTT-3 ") mål en fire - snarere enn en fem-nukleotid sekvens. Fire forskjellige sett med primere kan brukes til første runde av PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1 Tnk1 + Deg2 Tnk2 + Deg1, Tnk2 + Deg2. Når ett sett med primere ikke fungerer, kan du bruke et annet sett. Hvis denne andre også mislykkes, bruk en annen og så videre. Spontan kanamycin resistente mutantene er svært sjeldne, og oppstår med en frekvens på < 10-10 34.

Under utarbeidelsen av genomisk biblioteker (Figur 4), kan et par skritt verifiseres. Klipping DNA av sonication bør bli bekreftet av geleelektroforese av en aliquot i en agarose gel (figur 5). Når DNA er skåret riktig, danne DNA fragmenter spenner fra 200 til 600 bp vil en smear i en 2% agarose gel. Før du sender biblioteker for høy gjennomstrømming sekvensering, må generering av PCR produkter av nestede PCR reaksjoner bekreftes av agarose gel geleelektroforese (figur 6).

Etter behandling sekvensering leser følger protokollen beskrevet her (inndelingen 4.2.), bestemmes hyppigheten av hver mutant input bassenget og alle vev ved hjelp av formelen i kapittel 4.3.3. Utgang/input forholdet for hver mutant i hvert vev beregnes med ligningen i delen 4.3.4. Figur 7 viser et eksempel på resultatene med Tn-Seq tilnærming. Alternativt, MAGenTA verktøyet kan brukes til å behandle og analysere sekvenser data 31. Mutanter med statistisk signifikant redusert og økt fitness ble identifisert. Mutasjoner i kjente leptospiral virulens gener forårsaket redusert fitness, validere Tn-Seq tilnærming.

Figure 1
Figur 1: filtrering enhet brukes til Bøyning. Filtrering enheten er montert ved å sette inn stopperen av filteret støtte i en side-arm Erlenmeyer kolbe, posisjonering acetate innen filteret på bunnen med sterilt tang, deretter plassere trakten på bunnen, og å sikre systemet med en klemme . Filtrering enheten er deretter koblet vakuum systemet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 2
Figur 2: Identifikasjon av webområdene transposon innsetting. (A) ordningen viser annealing områder i semi-tilfeldige PCR primere. Tnk1 og Tnk2 primere anneal nær de motsatte endene av transposon (Tn). Deg1 er en 35-nukleotid primer som inneholder en strekning av 10 degenerert nukleotider etterfulgt av sekvensen GATAT på 3 slutten. Den første runden av PCR (PCR #1) er gjennomført med Deg1 og Tnk1 eller Deg1 og Tnk2. TnkN1 og TnkN2 primere, brukes for PCR #2, anneal mellom transposon ender og Tnk1 og Tnk2, henholdsvis. Sekvensen av Tag primer er identisk med 5' slutten av Deg1 primer. (B) eksempel på agarose gel innhentet etter den andre runden av PCR med 14 transposon mutanter (baner 1 til 14). Den første runden av PCR ble utført med Deg1 og Tnk1; andre runde ble gjort med koden og TnkN1. Positive PCR representeres av "+" og en negativ PCR av "-". "KmR"representerer kanamycin motstand kassetten. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 3
Figur 3: flytskjema for å få utgang bassenget. På dag utfordring (dag 0), er hver leptospiral mutant telles etter darkfield mikroskopi, utvannet til samme tetthet og kombineres for å danne input bassenget (detaljer i delen 2.1). Hamsters er utfordret intraperitoneally med input bassenget. I tillegg ble tre kulturer startet med input bassenget. På dagen for vaksinering (dag 0) og når kulturer når en tetthet av ≈ er 108/mL, input bassenget og kulturer samlet inn av sentrifugering og lagret som pellets ved-80 ° C før bruk (se avsnitt 2.3). Endepunktet dag (dag forhåndsvalgt for å avslutte dyrene, f.eks, til dag 4 etter utfordring), euthanized dyr; blod, nyre og lever er samlet inn og lagret ved-80 ° C før bruk (se avsnitt 2.4). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 4
Figur 4: flytdiagram for genomisk biblioteket utarbeidelse. (A) DNA trekkes fra blod, vev eller kulturer følger protokollen beskrevet i avsnitt 3.1. Den røde boksen representerer transposon (Tn). (B) The DNA er skåret av sonication i fragmenter mellom 200 og 600 bp. Nærmere opplysninger er gitt i del 3.2. (C) C haler (gule bokser) legges til alle DNA fragmenter med terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) som beskrevet i Seksjon 3.3 og tabell 4. Genomic biblioteket er utarbeidet for sekvensering av nestede PCR (D-E). Den første runden av PCR utføres med TnkN3 og olj376 primere gjelder transposon og C-halen, henholdsvis. Se tabell 3 og 5. Bare fragmenter som inneholder transposon ender (rød boks) er forsterket. Merk: Bruk 3 ganger mer olj376 primer enn TnkN3 fordi alle DNA fragmenter har C-haler. Den andre runden av PCR er gjennomført med pMargent2, bestemt for hele transposon, og en indeksering primer, som inneholder en seks-base-par strekkode sekvens (i rosa) slik at alle prøver å være multiplekset i en enkelt sekvensering kjørefelt. Se tabell 3 og 6. Begge primere inneholder sekvenser nødvendig for bindende flyt-cellen under Illumina sekvensering (grønn og lilla boks). (F) den resulterende PCR produkter er renset, og deretter deres konsentrasjon måles som beskrevet i delen 3.6. (G) alle genomic biblioteker er gruppert sammen. Hvert bibliotek har en annen strekkode og (H) bassenget sendes til sekvensering plattformen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 5
Figur 5: Sonication DNA. DNA var renset fra lever åtte infiserte hamster (baner 1 til 8), sonicated og undersøkt av geleelektroforese i en 2% agarose gel. Skråstilte DNA er preget av en smear som størrelsen på de fleste av fragmenter er mellom 200 og 600 bp. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 6
Figur 6: Genomic biblioteker for høy gjennomstrømming sekvensering. Genomic biblioteker ble utarbeidet av ested PCR med DNA fra blod åtte infiserte hamstere (baner 1 til 8) og undersøkt av geleelektroforese i en 2% agarose gel. Det meste av PCR produkter er mellom 200 og 600bp. negativ kontroll (ingen TnkN3 primer i PCR #1 blanding, se tabell 5) viser ingen forsterkning (vises ikke). Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figure 7
Figur 7: Fitness mutanter fra Tn-Seq eksperiment. Fitness av en pool av mutanter i hamster's nyre 4 dager etter utfordring (tilpasset fra Lourdaults studie17). Utgang/input forholdet mellom alle 42 mutantene var bestemt for hvert dyr. Hver mutant kalles av genet (lic) eller intergenisk regionen (inter) transposon settes inn i eller navnet brukt i litteraturen. Hver forholdet representeres av en svart diamant. Medianen for prosenter (rød linje) var bestemt for hver mutant og forhold til 1.0 bruker Diversified rank test. Den stiplede linjen representerer fitness av 1.0, som tilsvarer nøytral fitness. Mutanter som fitness er betydelig påvirket er merket med stjerner: * P < 0,05; ** P < 0,01. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Reagenser Volumet for én reaksjon
Master mix 2 X 12.5 ΜL
Primer 1, 10 mM (TnK1 eller TnK2) * 1.2 ΜL
Primer 2, 10 mM (Deg1 eller Deg2) * 1.2 ΜL
Vann 8,8 ΜL
Mal (celler lysate eller DNA) 1.3 ΜL
Siste volum 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 1: Identifisering av transposon innsetting området, halvt tilfeldig PCR #1 blanding.

Reagenser Volumet for én reaksjon
Master mix 2 X 12.5 ΜL
Primer 1, 100 mM (TnKN1 eller TnKN2) * 0,2 ΜL
Primer 2, 100 mM (Tag) * 0,2 ΜL
Vann 10.1 ΜL
PCR produkter fra PCR #1 0,8 ΜL
Siste volum 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 2: Identifisering av transposon innsetting området, halvt tilfeldig PCR #2 mix.

navn Sekvens (5 - 3') Referanse
Primere brukt for semi-tilfeldige PCR
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
Deg2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Tag GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Primere brukt for Illumina sekvensering
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina sekvensering (strekkoder i fet skrift)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tabell 3: Primer sekvenser.

Reagenser Volumet for én reaksjon
Skråstilte DNA 500 ng (se ligningen i 3.3.2.)
Vann Opptil 14,5 µL
5 x TdT buffer 4 ΜL
(9,5 mM dCTP + 0,5 mM ddCTP) blanding * 1 ΜL
TdT (30 U/µL) 0,5 ΜL
Siste volum 20 µL
* Blanding 3 µLof 10 mM ddCTP, 5.7 µL av 100 mM dCTP og 51,3 µL av vann

Tabell 4: C tailing reaksjon med terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT).

Reagenser Volumet for én reaksjon
Biblioteket reaksjon Kontroll reaksjon
Master blande 2 x 12.5 ΜL 12.5 ΜL
Primer 1, 30 µM (TnkN3) * 0,5 ΜL -
Primer 2, 30 µM (olj376) * 1,5 ΜL 1.5
Vann 7.5 ΜL 8 ΜL
C-tailed DNA 3 ΜL 3 ΜL
Siste volum 25 µL 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 5: Bygging av genomisk bibliotek, PCR #1 blanding.

Reagenser Volumet for én reaksjon
Biblioteket reaksjon Kontroll reaksjon
Master blande 2 x 25 ΜL 12.5 ΜL
Primer 1, 30 µM (pMargent2) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Primer 2, 30 µM (indeksering primer) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Vann 23 ΜL 11.5 ΜL
PCR produkter fra PCR #1 1 ΜL 0,5 ΜL
Siste volum 50 µL 25 µL
* Primer sekvenser i tabell 3.

Tabell 6: Byggingen av genomisk bibliotek, PCR #2 blanding.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Selv om resultatene fra våre pilotprosjekt for hamster utfordret intraperitoneally med 42 L. interrogans mutanter presenteres17, forventer vi at større bassenger av mutanter kan bli vist av Tn-Seq. Fordi frekvensen av transconjugants er lav (100-200 transconjugants/parring), flere parring er nødvendig for å generere et tilstrekkelig antall mutanter for store Tn-Seq eksperimenter. Opprettholde et stort antall mutanter i flytende kulturer presenterer logistiske utfordringer som må løses. Kulturer kan være ruges i dypt 96-brønns plater. Kultur tettheter kan overvåkes av optisk densitet målinger i et spektrofotometer satt til 420 nm. Fastsettelse av antall dyr bruke avhenger delvis av størrelsen av input og må avgjøres av makt analyse. Store eksperimenter anbefaler vi at makt analysen utføres i samråd med en biostatistician.

Flaskehalser kan påvirke utvinning av tilfeldige mutanter av utdata-bassenget. Selv om alvorlige flaskehalser ikke ble observert i vår pilotstudie17 (figur 7), kan storskala eksperimenter påvirkes av tilfeldig tap av mutanter. Øke dosen utfordring ved å øke antall celler per mutant i input bassenget vil redusere sannsynligheten for flaskehalser35. Nylig publiserte Galaxy verktøyet MAGenTA gir verktøyet nødvendig å vurdere flaskehalser og fitness31.

TN-Seq eksperimenter planlagt for en alternativ rute av infeksjon, andre Leptospira stammer, eller andre gnager modeller krever ytterligere vurderinger. Hvis the kinetics av infeksjon i vert arter ikke er kjent, eller er ikke kontinuerlig eksponentiell i løpet av infeksjon i hvert vev undersøkes, skal DNA være Hentet fra dyrking av vev og ikke direkte fra vev. Dette ekstra trinnet vil redusere overvurderer av mutant kondisjon på grunn av oppdagelsen av DNA fra døde Spiroketer. Hvis utdataene utvalget skaffes fra dyrking vev, bør innspill bassenget kultivert adresse effekter i vitro vekst. Vi anbefaler også et pilotprosjekt med et lite antall mutanter å avgjøre om flaskehalser vil være en bekymring og hjelpe makt analyse for storskala eksperimenter.

Bekreftelse av endrede fitness som bestemmes av Tn-Seq vil kreve testing av personlige mutanter i dyr modellen. Foreløpig må hver mutant være sekvensielt individuelt før Tn-Seq å identifisere mutant bærer innsetting i genet av interesse. Men hvis allelet erstatning i patogene Leptospira blir lett, vil sekvensering av personlige mutanter ikke lenger være nødvendig. Alternativt har transkripsjon aktivator som effektor blitt brukt til å dempe lig gener uttrykk i L. interrogans36. Denne teknikken kan brukes til ned-regulere gener forstyrret i mutanter med endrede fitness identifisert av Tn-Seq.

Når den tolker dataene Tn-Seq, bør interaksjoner mellom bakterier tas i betraktning. Det er teoretisk mulig at en nedgang i fitness kan være konkurranse mellom mutanter i stedet for en direkte effekt av transposon innsetting. I tillegg kan et fravær av endring i i vivo fitness av en mutant i et basseng skyldes samarbeid mellom mutanter. For eksempel kan en mutant som ikke klarer å produsere en viktig faktor suppleres intercellularly av produksjonen av faktoren andre mutanter i bassenget. Vi observerte en økning i egnethet for flere mutanter, som kan være en konsekvens av redusert metabolske byrden av ikke syntetisere proteiner som ikke er avgjørende for vekst, som vist for Salmonella enterica37.

Denne protokollen kan brukes til å identifisere tilblivelse involvert i stoffskiftet eller overlevelse under stressende forhold i vitro 38,39. Voksende Leptospira i ulike forhold som høy natriumklorid konsentrasjon, begrenset jern og surt pH kan for eksempel identifisere gener ansvarlig for surt overlevelse eller stress motstand. Disse i vitro eksperimenter kan også utføres med saprophytic belastninger L. biflexa belastning Patoc jeg fordi denne Tn-Seq-metoden kan brukes på alle sekvensert Leptospira stammer.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne ikke avsløre.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av en Veterans Affairs Merit Award (til D.A.H.), og en National Institute of Health gi R01 AI 034431 (til D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

Immunologi problemet 130 høy gjennomstrømming sekvensering tilfeldig mutagenese nestede PCR Bøyning Leptospira fitness mutanter bibliotek
Høy gjennomstrømming parallelle sekvensering å måle Fitness <em>Leptospira interrogans</em> Transposon innsetting mutanter under Golden Syrian Hamster infeksjon
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,… More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter