Summary
Aqui descrevemos uma técnica que combina o mutagenesis transposon com sequenciamento de alto rendimento para identificar e quantificar os mutantes leptospiral de transposon em tecidos após um desafio de hamsters. Este protocolo pode ser usado para mutantes de tela para a sobrevivência e disseminação em animais e também pode ser aplicado aos estudos em vitro .
Abstract
Este manuscrito, descrevemos um transposon sequenciamento (Tn-Seq) técnica para identificar e quantificar os mutantes de Leptospira interrogans alterados em fitness durante a infecção de hamsters sírios dourados. TN-Seq combina o mutagenesis aleatório transposon com o poder da tecnologia de sequenciamento de alta produtividade. Animais são desafiados com uma piscina de mutantes transposon (pool de entrada), seguida de colheita de sangue e tecidos alguns dias mais tarde para identificar e quantificar o número de mutantes em cada órgão (piscinas de saída). As piscinas de saída são comparadas com o pool de entrada para avaliar a aptidão na vivo de cada mutante. Esta abordagem permite a triagem de uma grande piscina de mutantes em um número limitado de animais. Com pequenas modificações, este protocolo pode ser executado com qualquer modelo animal de leptospirose, modelos de hospedeiro reservatório tais como ratos e modelos de infecção aguda, tais como os hamsters, bem como estudos em vitro . TN-Seq fornece uma ferramenta poderosa para a tela para mutantes com defeitos de aptidão in vivo e in vitro .
Introduction
Identificação de genes de virulência para algumas bactérias, tais como Leptospira spp., é difícil devido ao número limitado de ferramentas genéticas disponíveis. Uma abordagem comumente utilizada é a criação de uma colecção de mutantes por mutagênese aleatória transposon, seguido da identificação do local de inserção em cada mutante e virulência testes de mutantes transposon individuais em um modelo animal. Essa abordagem é demorado, caro e requer um grande número de animais.
Quando o mutagenesis aleatório foi desenvolvido para o patógeno Leptospira interrogans, genes envolvidos na virulência foram identificados pelo teste mutantes individuais em um modelo animal1. Os mutantes foram selecionados com base em critérios como suas potenciais funções na sinalização ou motilidade ou sua membrana externa prevista ou superfície local. Como a maioria dos leptospiral genes codificam proteínas hipotéticas de função desconhecida2, selecionando os mutantes baseiam em limites esses critérios a capacidade de detectar genes de virulência leptospiral romance.
Mais recentemente, piscinas de mutantes de transposon L. interrogans foram projectadas para infecciosidade no hamster e mouse modelos3. Cada animal foi desafiado com uma piscina de até 10 mutantes. Infecciosidade de um mutante foi marcada como positivo se foi detectado por PCR das culturas obtidos de sangue e rim. Teste de PCR foi trabalhoso porque necessitava de uma reação de PCR individual para cada mutante na piscina. Porque a frequência de cada mutante nas culturas não foi quantificada, a abordagem foi inclinada para identificação de mutantes altamente atenuadas.
Descrevemos um transposon sequenciamento (Tn-Seq) técnica, como uma estratégia para a tela de forma mais eficiente para genes de virulência. TN-seq consiste da criação de uma biblioteca de mutantes por mutagénese transposon seguido por sequenciamento paralelo maciço4,5,6. Brevemente, transposon mutantes são agrupados, inoculados em animais e posteriormente recuperados de diferentes órgãos (piscinas de saída). O DNA das piscinas saída é extraído e digerido com enzimas de restrição ou distorcido pelo sonication. São realizadas duas rodadas de PCR direcionamento das junções dos locais de inserção de transposon. Esta etapa permite a adição dos adaptadores necessários para o sequenciamento. Os produtos resultantes da PCR são analisados por sequenciamento de alto rendimento para identificar o local de inserção do transposon de cada mutante da piscina junto com a sua abundância relativa, que é comparada com a composição inicial do grupo de mutantes.
A principal vantagem desta abordagem é a capacidade de tela simultaneamente um grande número de mutantes com um pequeno número de animais. TN-Seq não exige o conhecimento prévio dos locais de inserção do transposon que aumenta as chances de descobrir novos Leptospira-genes específicos envolvidos na virulência com menos tempo e maior eficiência. Porque leptospiral fardo nos tecidos é relativamente alto em roedores modelos suscetíveis a letal infecção (tipicamente 104 108 bactérias/g de tecido)7,8,9 , bem como em hospedeiros reservatório 10,11, os tecidos podem ser analisados diretamente sem a necessidade de cultura, reduzindo preconceitos devido ao crescimento em vitro .
Em estudos de Tn-Seq com a maioria dos patógenos bacterianos descritos até à data, a alta frequência de mutagênese insercional permitido infecção com grandes piscinas contendo mutantes coletivamente tendo múltiplas inserções espaçadas transposon dentro de cada gene4 ,12,13,14. TN-Seq também foi desenvolvido para uma bactéria, para o qual a frequência de mutagênese é muito inferior6. Com Leptospira, uma biblioteca de mutantes transposon pode ser gerada introduzindo o transposon em um plasmídeo sequência por conjugação, como descrito por Slamti et al.15. No entanto, a frequência de mutagénese transposon de L. interrogans é baixa. Quando o transposon Himar1 foi introduzido em um plasmídeo conjugativo, a frequência de transconjugant foi relatada para ser apenas 8,5 x 10-8 por beneficiário da pilha com a cepa de Lai de L. interrogans16 e é provável que seja da mesma forma pobre com a maioria das outras cepas de L. interrogans. O protocolo descrito aqui é em parte com base no que desenvolvi para Borrelia burgdorferi, em que a frequência de mutagênese insercional transposon é também baixa6.
Para a nossa experiência piloto com o protocolo17, realizamos mutagênese transposon com L. interrogans sorovar Manilae estirpe L495 por causa do sucesso de outros grupos em isolamento de mutantes de inserção de transposon na estirpe juntamente com a sua baixa DL50 (dose letal) para virulência1. Nós selecionados 42 mutantes por Tn-Seq e identificou vários candidatos mutantes defeituosos em virulência, incluindo dois com inserções em um gene de adenilato ciclase de candidato. O teste individual dos dois mutantes em hamsters confirmou que eles estavam deficientes em virulência17.
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Protocol
Cuidado: Cepas patogênicas de Leptospira spp. devem ser tratadas no âmbito de procedimentos de contenção do nível de biossegurança 2 (BSL-2). Equipamento de protecção adequado (EPI) deve ser usado. Uma armário de biossegurança classe II deve ser utilizada para todas as manipulações de patogenicidade Leptospira spp..
1. criação do Transposon Mutant biblioteca15
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Transferência do transposon para Leptospira spp. por conjugação (Figura 1)
- Inocule um volume de cultura exponencial-fase de patogenicidade Leptospira spp, correspondente a 107 células em 10 mL de Ellinghausen McCullough-Johnson-Harris médio (EMJH)18,19. Incube a 30 ° C, com 150 rpm, agitando até que a densidade atinge 2-8 x 108 células/mL.
Nota: O tempo de duplicação das leptospiras patogênicas é de 12 a 24 h, dependendo da estirpe. - Inocular 50 µ l do doador Escherichia coli estirpe β216320 carregando a sequência transposon plasmídeo (pCjTKS2)16 em 5 mL de caldo Luria (LB) para suplementado com 0,3 mM de 2,6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µ g/mL de canamicina (Km) e 50 µ g/mL de espectinomicina (Spc) e lugar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C em 255 rpm.
- Inocule 60 µ l de células de Escherichia coli em 3 mL de EMJH suplementado com 0,3 mM de DAP (EMJH + DAP). Incube a 37 ° C, a agitação de 255 rpm para 3-4 h até uma OD600nm≈ 0,3.
- Para montar a unidade de filtração (Figura 1), coloque a base sobre uma tubuladura lateral 125 mL frasco Erlenmeyer, coloque um filtro de acetato-celulose (tamanho de poros 0,1 mm; diâmetro 25mm) sobre o base e prenda o funil na base. Ligue a unidade de filtração para um sistema de vácuo.
- Adicione 5 mL de Leptospira spp. cultura e 0,5 mL de cultura de e. coli dentro do funil. O líquido através do filtro de vácuo.
- Transferi o filtro com a superfície de bactérias, virada para cima para um EMJH + DAPplate. Incube a 30 ° C durante a noite com o filtro virado para cima.
- Coloque o filtro em um tubo de 15 mL contendo 1 mL de EMJH e vórtice para 10 s para liberar as bactérias em meios de comunicação. Espalhou-se 200 µ l da suspensão em 5 EMJH platescontaining 50 µ g/mL de Km usando contas de vidro estéril de 1 mm de 10-15 ou um espalhador estéril descartável. Embrulhe as placas com parafilm e incube-os de cabeça para baixo a 30 ° C para 3 a 4 semanas até que colônias são visíveis.
- Transferência de colônias individualmente em 3 mL de EMJH contendo 50 µ g/mL de Km (EMJH + Km) a 30° C, sob agitação a 150 rpm por 7 a 10 dias até que a cultura atinge uma densidade de ≈ 108/mL.
Nota: As culturas podem ser armazenadas a-80 ° C ou em nitrogênio líquido (com 4% de glicerol).
- Inocule um volume de cultura exponencial-fase de patogenicidade Leptospira spp, correspondente a 107 células em 10 mL de Ellinghausen McCullough-Johnson-Harris médio (EMJH)18,19. Incube a 30 ° C, com 150 rpm, agitando até que a densidade atinge 2-8 x 108 células/mL.
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Identificação do local de inserção do transposon pelo PCR aninhado (Figura 2)
- Lyse 50 µ l de cada mutante transposon em cadeia da polimerase por incubação a 95 ° C por 15 min.
Nota: DNA pode ser purificado em vez disso, usando um kit de extração de DNA. - Prepare a mistura PCR com primers Deg1 e Tnk1 (tabela 3), de acordo com a tabela 1. Transferência de 23,7 µ l da mistura para cada tubo PCR e adicionar 1,3 µ l de células lisadas. Execute o programa: 95° C por 5 min; 40 ciclos: 95 ° C por 15 s, 40 ° C por 1 min, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 10 min.
- Fazer a mistura PCR com primers Tag e TnkN1 (tabela 3), de acordo com a tabela 2. Transferência de 24,2 µ l da mistura para cada tubo PCR e adicionar 0,8 µ l de reação de PCR #1. Execute o programa: 95 ° C por 5 min; 35 ciclos: 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 10 min.
- Execute 3 µ l de produtos do PCR em um gel de agarose 1% com 1 buffer X Tris-Acetato-EDTA (TAE) em 10-15 V/cm (Figura 2B).
- Purifica os produtos de PCR das amostras positivas, usando um kit de purificação de PCR. Eluir o DNA com o volume mais baixo permitido pelo kit para maximizar a concentração de DNA recuperado.
- Envie produtos PCR purificados por Sanger sequenciamento usando o primer TnkN1 (tabela 3).
- Identifica os locais de inserção comparando a sequência resultante com a sequência do genoma da estirpe parental pela análise BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) ou usando o SpiroScope banco de dados (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)21.
- Confirme o local de inserção do transposon por PCR utilizando primers recozimento para as sequências flanqueando do anfitrião.
Nota: O transposon aumenta o tamanho da sequência de tipo selvagem de ≈ 2 kb.
- Lyse 50 µ l de cada mutante transposon em cadeia da polimerase por incubação a 95 ° C por 15 min.
2. animal experimento (Figura 3)
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Cultura de Leptospira mutantes
- Cresce individualmente cada mutante transposon selecionado em 10 mL de EMJH + Km a 30 ° C, a agitação a 150 rpm para uma densidade de7-108 as leptospiras/10ml.
- Conte as leptospiras pela microscopia de campo escuro com um contador de Petroff-Hausser ou como descrito por Miller23.
- Dilua cada cultura EMJH para a mesma densidade, por exemplo 106 células/mL.
- Para montar a entrada piscina, misture as culturas diluídas em volumes iguais.
Nota: Incluir controles na piscina entrada adicionando os mutantes com defeitos de aptidão conhecido como loa2217,24 e mutantes com fitness inalterado como ligB17,25, respectivamente. Piscinas de mutantes podem ser armazenadas com 4% de glicerol a-80 ° C ou em nitrogênio líquido.
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Desafio
Nota: Os métodos descritos aqui foram aprovados pelo Comitê de uso (protocolo #09018-14) e veteranos assuntos maior Los Angeles institucional Cuidado Animal.- Injecte intraperitonealmente 1ml da entrada piscina para cada animal com uma seringa de insulina U-100 com 26 x ½" agulha.
Nota: No experimento piloto, 8 animais foram desafiados com 1 mL de entrada piscina, ou seja, 106 bactérias total17. A infecção foi autorizada a prosseguir por 4 dias antes da eutanásia. - Coletar 10 mL de entrada piscina e girar para 20 min no x 3.220 g. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Armazene o centrifugado em - 80˚C até o uso (passo 3.1.3).
- Monitore os animais diariamente, até que eles são finalizados no ponto de extremidade predeterminado. Pesar os hamsters diariamente e procurar por critérios de ponto de extremidade: perda de apetite, marcha ou respirar, dificuldade, prostração, peles de babados, ou perda de > 10% do peso máximo atingido.
- Injecte intraperitonealmente 1ml da entrada piscina para cada animal com uma seringa de insulina U-100 com 26 x ½" agulha.
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Experimento in vitro
- No dia do desafio, inocule 3 frascos de 25 mL de EMJH + Km com 5 mL de entrada piscina. Cultivar culturas a 30 ° C, sob agitação a 150 rpm.
- Conte as leptospiras diariamente usando um dos métodos da secção 2.1.2. Quando a densidade atinge ≈ 1 x 108/mL, spin para baixo cada suspensão por 20 min a 3.220 x g.
- Armazene as pelotas de célula a-80 ° C até o uso.
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Colheita e armazenamento dos tecidos
- Eutanásia dos animais por inalação de isoflurano, seguida por toracotomia bilateral26.
- Imediatamente colete 1 a 2 mL de sangue por punção cardíaca com uma seringa de 3 mL e uma agulha 25 x 5/8". Transferi o sangue no tubo contendo EDTA. Misture por inversão, 5 a 6 vezes.
- Colete um rim e ⅓ para ½ do lobo mediano ventral do fígado em cryotubes.
- Loja de tecidos a-80 ° C até o uso.
3. construção de bibliotecas genômicas para arranjar em sequência do elevado-throughput (Figura 4)
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Extração de DNA
- Extração de DNA do sangue.
- Transferi 100 µ l de sangue do tubo EDTA para um tubo de microcentrifugadora.
- Purifica DNA usando um kit de extração de DNA. Siga as instruções do fabricante.
- Extração de DNA de tecidos.
- Usando bisturis e tesouras, entre 50 a 80 mg de cada órgão em pedaços pequenos (1 mm x 1 mm) com dados e transferi-los para um tubo seco estéril de tampa de rosca. Medir o peso do tecido com uma balança de precisão.
- Adicione 500 µ l de PBS estéril no tubo.
- Homogeneizar as amostras usando o disruptor por 1 min em 5 movimentos por segundo.
- Calcule o volume correspondente a 25 mg de tecido utilizando a seguinte equação:
- Transferi o volume calculado para o kit de extração de DNA. Prosseguir com a purificação de DNA, seguindo as instruções do fabricante.
- Extração de DNA das culturas entrada de piscina e in vitro .
- Descongele o pelotas bacterianas em temperatura ambiente por 5-10 min.
- Prosseguir com a extração de DNA, seguindo as instruções que acompanham o kit.
- DNA de loja a-80 ° C até o uso.
- Extração de DNA do sangue.
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O DNA de corte (Figura 5)
- Transferi 50 µ l de DNA extraído em um tubo de microcentrifugadora de 1,5 mL.
- Coloque os tubos dentro do rack do chifre sonicador copo cheio de água fria (4 ° C).
- Executar o sonicador por 3 min a 80% de intensidade com 10 s no pulso e 5 s do pulso.
Atenção: Usar aquecedores de orelha ou tampões para os ouvidos para proteger a audição. - Executar 2,5 µ l do cortado o DNA em um gel de agarose 2% para confirmar que a maioria do DNA é < 600 bp em tamanho.
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Adição da cauda-C
- Medir a concentração de DNA com um Espectrofotômetro de pequeno volume.
- Calcular o volume correspondente a 500 ng de DNA usando a seguinte equação:
- Prepare a reação de rejeito (tabela 4). Incubar a 1 h a 37 ° C; inativar a 75 ° C por 20 min.
Nota: Para amostras que exigem ajuste para um volume superior a 14,5 µ l, aumentar o volume final de reação de 40 µ l e scale-up os componentes restantes em conformidade. - Limpe as amostras com um kit de purificação de PCR. Eluir o DNA com 12 µ l de tampão de eluição.
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PCR aninhado
- PCR #1
- Prepare a mistura PCR de acordo com tabelas 3 e 5. Transferência de 22 µ l do mix biblioteca para cada tubo PCR e adicione 3 µ l de DNA purificado. Proceda da mesma forma com a mistura de controle.
Nota: Primer TnkN317 é específico para o transposon e cartilha olj3766 é específico para o C-cauda. A mistura de controle está faltando o primer TnkN3, que visa especificamente o transposon. - Execute o seguinte programa: 95 ° C por 2 min; 24 ciclos: 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 2 min.
- Prepare a mistura PCR de acordo com tabelas 3 e 5. Transferência de 22 µ l do mix biblioteca para cada tubo PCR e adicione 3 µ l de DNA purificado. Proceda da mesma forma com a mistura de controle.
- #2 DE PCR.
- Prepare a mistura PCR segunda de acordo com tabelas 3 e 6. Transferência de 49 µ l do mix biblioteca para cada tubo PCR e adicione 1 µ l de reação de PCR #1 biblioteca. Transferência de 24,5 µ l do mix controle para cada tubo PCR e adicione 0,5 µ l de reação de PCR #1 controle.
Nota: PMargent2 Primer é específico para o transposon, e as primeiras demão IP6 conter código de barras do seis-base-par e reconhecidas pela plataforma de próxima geração de sequenciamento de sequências específicas. - Execute o seguinte programa: 95 ° C por 2 min; 18 ciclos: 95 ° C por 30 s, 60 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 2 min.
- Prepare a mistura PCR segunda de acordo com tabelas 3 e 6. Transferência de 49 µ l do mix biblioteca para cada tubo PCR e adicione 1 µ l de reação de PCR #1 biblioteca. Transferência de 24,5 µ l do mix controle para cada tubo PCR e adicione 0,5 µ l de reação de PCR #1 controle.
- Execute 3 µ l em um gel de agarose 2%. A biblioteca deve mostrar um esfregaço com a maioria do sinal entre 200 a 600 bp (Figura 6) e sem amplificação para a reação de controle.
- PCR #1
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Purificação de produtos PCR.
Nota: Limpe as bibliotecas genômicas com um kit de purificação de PCR seguindo as instruções do fabricante. Eluir o DNA com 30 µ l de tampão de eluição. - Medir a concentração de DNA usando um dados. Médias 2 a 3 leituras.
- Calcule o volume de cada biblioteca equivalente a 15 ou 20 ng usando a equação abaixo:
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Misturar todas as bibliotecas juntos de acordo com os cálculos anteriores. Determine a concentração molar do DNA com equação do seguinte site:
http://www.molbiol.edu.ru/ENG/scripts/01_07.html
Cuidado: Requisitos de volume e concentração de DNA dependem da plataforma de sequenciamento.
4. elevado-throughput sequenciamento e análise de dados
- Sequenciamento
- Bibliotecas de sequência como 64 leituras de único-extremidade bp usando o sequenciamento personalizado cartilha pMargent3 e o primer de sequenciamento comercial padrão. A plataforma de sequenciamento irá fornecer-lhe FastQ arquivos com todas as leituras de sequenciamento.
- Análise com o software Galaxy
- Baixe o arquivo da sequência do genoma
- Na homepage SpiroScope banco de dados (consulte a etapa 1.2.7 para link), selecione o organismo usado para o experimento e clique em "LOAD em navegador do GENOMA".
- Na barra de ferramentas (perto do topo da página inicial), selecione "busca/exportação > Baixar dados", na linha de "Sequência (fasta)", clique em "Genoma" para baixar a sequência.
- Abra o arquivo com o bloco de notas (PC) ou TextEdit (Mac) e renomear o cromossomo (por exemplo, "Cristo"). Manter o formato fasta.
- Siga os mesmos passos para baixar a sequência do cromossoma II. Combine ambas as sequências de cromossomos em um arquivo. txt simples copiando e colando.
Nota: Cromossomo sequências também podem ser baixadas do site do NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) e combinadas em um arquivo único. txt.
- Upload de arquivos para o servidor da galáxia
Nota: A galáxia é uma fonte aberta, plataforma baseada na web para o gerenciamento de dados intensivos bioinformática fluxos de trabalho27,28,29,30 e pode ser acessada em https://usegalaxy.org/.- No menu ferramentas, selecione "obter dados > Enviar arquivo do seu computador". Arraste e solte os arquivos de .fastq gerados pela plataforma de sequenciamento para a janela, em seguida, clique em "Iniciar".
- Siga as mesmas etapas para carregar o arquivo. txt de sequência de genoma de Leptospira .
- Noivo lê
- Selecione "NGS: QC e manipulação > FASTQ Groomer" do menu ferramentas.
- Ao lado de arquivo ao noivo, selecione as bibliotecas carregadas na etapa 4.2.2. Em tipo de escores de qualidade de FASTQ de entrada, selecione o sistema de sequenciamento adequado. Para opções avançadas, deixe esconder Advanced Office selecionado.
- Clique em "Executar".
- Remover artefatos de sequenciamento
- Selecione "NGS: QC e manipulação > remover artefatos de sequenciamento". Ao lado da biblioteca para filtrar, selecione os arquivos preparados gerados na etapa 4.2.3. Clique em "Executar".
- Remover sequências C-cauda
Nota: Repita estes passos uma vez ou duas vezes para garantir que todos os C-caudas são removidos.- Selecione "NGS: QC e manipulação > Clip sequências de adaptador".
- Selecione ou digite o seguinte:
Biblioteca de clip: selecione os arquivos gerados na etapa 4.2.4.
Comprimento de sequência mínima: 15
Fonte: digite a sequência personalizada
Digite a sequência de recorte personalizado: CCCCCCC
Digite o valor diferente de zero para manter o adaptador sequências e bases de x que seguem-lo: 0
Descarte de sequências com desconhecidos (N) bases: Sim
Opções de saída: saída sequências recortadas e não-cortada - Clique em "Executar".
- Remover sequências de adaptador
- Selecione "NGS: QC e manipulação > Clip sequências de adaptador".
- Selecione ou digite o seguinte:
- Biblioteca de clip: selecione os arquivos gerados na etapa 4.2.5.
- Comprimento de sequência mínima: 15
- Fonte: digite a sequência personalizada
- Digite a sequência de recorte personalizado: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
- Digite o valor diferente de zero para manter o adaptador sequências e bases de x que seguem-lo: 0
- Descarte de sequências com desconhecidos (N) bases: Sim
- Opções de saída: saída sequências recortadas e não-cortada
- Clique em "Executar".
- Leituras de filtro com base em sua qualidade
- Selecione "NGS: QC e manipulação > filtro de qualidade".
Nota: Esta ferramenta seleciona leituras com base em resultados de qualidade. - Selecione o seguinte:
Biblioteca para filtrar: selecione os arquivos gerados na etapa 4.2.6.
Valor de corte de qualidade: 20
Por cento das bases em sequência que deve ter qualidade igual a/superior valor de Cut-off: 95 - Clique em "Executar".
Nota: Com essas configurações, leituras mais curtas do que 20 nucleotídeos ou com um índice de qualidade de 20 ou menos para 95% dos ciclos são descartadas. Adaptar-se as configurações de rigor a sua experiência.
- Selecione "NGS: QC e manipulação > filtro de qualidade".
- Mapa lê32
- Selecione "NGS: mapeamento > Bowtie2"32.
- Selecione o seguinte nos campos na janela principal:
É esta biblioteca única ou a par: single-final
Arquivo FASTQ: selecione a biblioteca filtrada pela qualidade da etapa 4.2.7.
Escrever leituras desalinhadas (no formato fastq) para separar os arquivo (s): não
Escrever leituras alinhadas (no formato fastq) para separar os arquivo (s): não
Você irá selecionar um genoma de referência de sua história ou usar um índice interno?: Use um genoma da história e construir o índice
Selecione o genoma de referência: selecione o arquivo de genome.txt de Leptospira carregado na etapa 4.2.2.
Conjunto ler informações de grupos?: não definida
Modo de análise selecione: 1: configuração padrão somente
Você quer usar predefinições?: não, é só usar padrões
Salve as estatísticas de mapeamento de bowtie2 para a história: não
Parâmetros do recurso de trabalho: usar parâmetros de recurso de trabalho padrão - Clique em "Executar" para alinhar leituras para o genoma.
- Converter arquivos
- Selecione "NGS: SAMtools > BAM BAM-para-SAM converter SAM".
- Selecione o seguinte:
Arquivo de BAM para converter: selecione mapeado biblioteca da etapa 4.2.8.
Opções de cabeçalho: incluir cabeçalho na saída de SAM (-h) - Clique em "Executar".
- Converter arquivos
- Selecione "NGS: SAMtools > converter SAM em intervalo".
- Selecione o seguinte:
Selecione o conjunto de dados a converter: selecione o arquivo de biblioteca mapeada SAM gerado na etapa 4.2.9.
Imprimir tudo?: Sim - Clique em "Executar".
- Tipo de leituras
- Selecione "filtrar e classificar > classificar dados em ordem crescente ou decrescente".
- Selecione o seguinte:
Conjunto de dados tipo: selecione o arquivo de intervalo gerado na etapa 4.2.10.
na coluna: 2
com sabor: ordem numérica
tudo em: ordem crescente - Clique em "Executar".
- Selecione lê correspondência cromossomo eu
- Selecione "filtrar e classificar > selecione as linhas que correspondem a uma expressão".
- Selecione o seguinte:
Selecione as linhas de: selecione o arquivo com leituras classificadas gerado na etapa 4.2.11.
isso: correspondência
o padrão: digite o nome de cromossomo eu como determinado na etapa 4.2.1.3 (por exemplo, "Cristo"). - Clique em "Executar".
- Selecione lê correspondência cromossomo II
Prossiga seguindo passo 4.2.12. - Grupo lê de acordo com os sites de inserções no cromossomo eu
- Selecione "unir, subtrair e grupo > agrupar dados por uma coluna e executar operação agregada em outras colunas".
- Selecione o seguinte:
Selecionar dados: selecione o arquivo resultante da etapa 4.2.12.
Agrupar por coluna: 2
Ignorar o caso enquanto agrupamento?: não
Ignorar as linhas que começam com esses personagens: Ø
Operação > + insert operação
Tipo: contagem
Na coluna: 2
Arredondar o resultado para o inteiro mais próximo: N - Clique em "Executar".
- Grupo lê de acordo com os locais de inserção no cromossomo II
Prossiga seguindo passo 4.2.14. - Locais de introdução da espécie no cromossomo eu
- Selecione "filtrar e classificar > classificar dados em ordem crescente ou decrescente".
- Selecione o seguinte:
Conjunto de tipo de dados: Selecione o arquivo da etapa 4.2.14.
na coluna: 1
com sabor: ordem numérica
tudo em: ordem crescente - Clique em "Executar".
- Locais de inserção tipo no cromossomo II
Prossiga seguindo passo 4.2.16.
- Baixe o arquivo da sequência do genoma
- Análise estatística
- Transferi os dados de galáxia em arquivos de planilha, copiando e colando as duas colunas de passos 4.2.16. e 4.2.17. em um arquivo do Excel.
Nota: A primeira coluna é a coordenada de nucleotídeo transposon local de introdução, e a segunda coluna é o número de leituras em cada local de inserção. - Identifica o gene abrigando o transposon usando a coordenada de nucleótidos fornecida na tabela.
Nota: por exemplo, um transposon inserido no nucleotídeo #30718 do cromossomo é localizado no gene LIC10024 , que se estende por nucleotídeos em cromossomo 29263-31539 eu. - Calcule as frequências relativas (F) para cada mutante em cada tecido e na piscina entrada seguinte a equação abaixo:
- Calcule índices de entrada/saída (R) para cada mutante e tecido, usando a equação abaixo:
- Teste de Wilcoxon rank-assinado
- Normalize todos os rácios de entrada/saída, definindo a relação mediana para cada tecido em cada animal para 1.0. Uma razão de 1.0 é neutra, > 1.0 é desvantajoso, e < 1.0 é vantajoso33.
- Comparar os rácios de saída/entrada para 1.0 (aptidão neutro) usando o teste de Wilcoxon rank com valores de P < 0,05 considerado estatisticamente significativo.
- Transferi os dados de galáxia em arquivos de planilha, copiando e colando as duas colunas de passos 4.2.16. e 4.2.17. em um arquivo do Excel.
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Representative Results
Criação de uma biblioteca de mutantes transposon em L. interrogans por conjugação requer uma unidade de filtração, como mostrado na Figura 1. Recuperamos a 100-200 transconjugants de cada acasalamento.
O local de inserção do transposon é identificado em cada mutante pelo sequenciamento do produto do PCR gerado pelo PCR semi-aleatório que tem como alvo o fim do transposon e acolhimento adjacente sequências15 (Figura 2A). Um exemplo dos resultados de PCR semi-aleatório é mostrado na Figura 2B. Na maioria dos casos um amplicon dominante será observado quando os primers Deg1 e Tnk1 são usados para a primeira rodada de PCR e o Tag e TnkN1 para a segunda fase. No entanto, devido à baixa especificidade da sequência pentamérica (... N10GATAT-3') no final 3' do primer Deg1, esta cartilha será anneal em vários locais em todo o genoma de leptospiral. Se estes sites estiverem presentes perto do fim do transposon, múltiplos produtos PCR podem ser obtidos. Quando vários amplicons gerados, podem ser purificados juntos a partir da mistura PCR e sequenciados diretamente; gel de purificação de cada amplicon não é necessária, porque todos eles conterá a mesma sequência a jusante de onde anneals TnkN1 da primeira demão. Por outro lado, a PCR pode falhar se a cópia mais próxima da sequência alvejada de primer Deg1 está localizada em uma grande distância entre a extremidade do transposon. Se os produtos de PCR não são detectados, a primeira rodada de PCR semi-aleatório pode ser repetida com a primeira demão de Deg1 e Tnk2 cartilha, que tem como alvo a extremidade oposta do transposon. Neste caso TnkN2 e Tag seria usado para a segunda fase; o amplicon iria ser sequenciado com o primer TnkN2 (Figura 2B). Alternativamente, a primeira rodada de PCR pode ser feita com a primeira demão de grau 2, cuja extremidade 3' de (... N10TCTT-3') alveja um quatro - em vez de uma sequência de cinco-nucleotide. Quatro diferentes conjuntos de primers podem ser usados para a primeira rodada de PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1 Tnk1 + grau 2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + grau 2. Quando um conjunto de primers não funciona, use outro conjunto. Se este segundo conjunto também falhar, use um outro e assim por diante. Espontâneos mutantes resistentes canamicina são muito raros e surgir com uma frequência de < 10-10 , 34.
Durante a preparação das bibliotecas genômicas (Figura 4), algumas etapas podem ser verificadas. Corte o DNA pelo sonication deve ser confirmada pela electroforese da alíquota em um gel de agarose (Figura 5). Quando o DNA é cortado corretamente, fragmentos de DNA que variam de 200 a 600 bp vai formam uma mancha em um gel de agarose 2%. Antes de enviar a bibliotecas para sequenciamento de alta produtividade, a geração de produtos PCR por reações de PCR aninhados deve ser confirmado por eletroforese em gel de agarose (Figura 6).
Depois de processar as leituras de sequenciamento seguindo o protocolo descrito aqui (secção 4.2.), a frequência de cada mutante no pool de entrada e em todos os tecidos é determinada usando a equação em secção 4.3.3. A taxa de entrada/saída para cada mutante em cada tecido é calculada com a equação na secção 4.3.4. A Figura 7 mostra um exemplo dos resultados obtidos com a abordagem de Tn-Seq. Alternativamente, a ferramenta MAGenTA pode ser usada para processar e analisar dados de sequenciamento 31. Os mutantes com aptidão estatisticamente significativamente reduzida e aumento foram identificados. Mutações nos genes de virulência conhecido leptospiral causadas reduziram aptidão, validando a abordagem Tn-Seq.
Figura 1: unidade de filtração usada para conjugação. A unidade de filtração é montada inserindo o batente do suporte do filtro em um lado do braço-frasco de Erlenmeyer, posicionamento do filtro de acetato-celulose na base com pinça estéril, em seguida, colocando o funil na base e prendendo o sistema com uma pinça . A unidade de filtração é conectada ao sistema de vácuo. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 2: identificação dos sítios de inserção transposon. (A) esquema mostrando sites recozimento semi-aleatório primers de PCR. Tnk1 e Tnk2 as primeiras demão recozem perto os extremos opostos do transposon (Tn). Deg1 é um primer de 35-nucleotide que contém um trecho de 10 nucleotídeos degenerados, seguido pela sequência GATAT na extremidade 3'. A primeira rodada de PCR (PCR #1) é conduzida com Deg1 e Tnk1 ou Deg1 e Tnk2. TnkN1 e TnkN2 as primeiras demão, usadas para PCR #2, recozem entre as extremidades do transposon e Tnk1 e Tnk2, respectivamente. A sequência da primeira demão Tag é idêntica da extremidade 5' do primer Deg1. (B) exemplo de gel de agarose obtidos após a segunda rodada do PCR com 14 mutantes transposon (faixas 1 a 14). A primeira rodada de PCR foi realizada com Deg1 e Tnk1; a segunda rodada foi feita com Tag e TnkN1. PCR positivo é representado por "+" e um PCR negativo por "-". "KmR"representa a gaveta de resistência canamicina. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 3: fluxograma para a obtenção da piscina saída. No dia do desafio (dia 0), cada mutante leptospiral é contado pela microscopia de campo escuro, dilui-se com a mesma densidade e combinado para formar o pool de entrada (dados fornecidos na seção 2.1). Os hamsters são desafiados intraperitonealmente com o pool de entrada. Além disso, três culturas foram iniciadas com o pool de entrada. No dia da inoculação (dia 0) e quando as culturas atingem uma densidade de ≈ 108/mL, a entrada da piscina e culturas são coletadas por centrifugação e armazenadas como Pelotas a-80 ° C até o uso (ver secção 2.3). Sobre o ponto de extremidade (dia pré-selecionados para finalizar os animais, por exemplo, dia 4, após o desafio), os animais são sacrificados; sangue, nos rins e fígado são coletados e armazenados a-80 ° C até o uso (ver secção 2.4). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 4: fluxograma de preparação da biblioteca genômica. (A) DNA é extraído do sangue, tecidos ou culturas seguindo o protocolo descrito na secção 3.1. A caixa vermelha representa o transposon (Tn). (B) o DNA é cortado pelo sonication em fragmentos entre 200 e 600 bp. Para mais informações são fornecidas na seção 3.2. (C) C-caudas (caixas amarelas) são adicionados a todos os fragmentos de DNA com terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT), conforme descrito na seção 3.3 e tabela 4. A biblioteca genômica é preparada para sequenciamento por PCR aninhado (D-E). A primeira rodada de PCR é realizada com TnkN3 e olj376 primers específicos para o transposon e o C-cauda, respectivamente. Consulte a tabela 3 e 5. Apenas fragmentos contendo as extremidades do transposon (caixa vermelha) são amplificados. Nota: Use a primeira demão de olj376 3 vezes mais do que TnkN3 porque todos os fragmentos de DNA tem C-caudas. A segunda rodada do PCR é realizada com pMargent2, específicos para o fim de transposon e uma cartilha de indexação, que contém uma sequência de seis-pares de base de código de barras (em rosa) permitindo que todas as amostras ser multiplexados em uma pista única sequenciamento. Consulte a tabela 3 e 6. As duas primeiras demão contêm sequências necessárias para ligação da célula de fluxo durante Illumina sequenciamento (caixa verde e roxa). (F), a PCR resultante produtos são limpos, e então sua concentração é medida conforme descrito na seção 3.6. (G) todas as bibliotecas genômicas são agrupadas; cada biblioteca tem um código de barras diferente e (H) a piscina é enviada para a plataforma de sequenciamento. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 5: Sonication da DNA. DNA foi purificado a partir de fígados de oito hamster infectados (faixas 1 a 8), lisados e analisado por eletroforese em um gel de agarose 2%. DNA cortado é caracterizada por um esfregaço em que o tamanho da maioria dos fragmentos está entre 200 e 600 BP clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 6: bibliotecas genômicas para arranjar em sequência do elevado-throughput. Bibliotecas genômicas foram elaboradas por ested PCR com DNA do sangue de oito hamsters infectados (faixas 1 a 8) e analisadas por eletroforese em gel de agarose a 2%. O tamanho da maioria dos produtos de PCR é entre 200 e 600bp. controle negativo (sem primer TnkN3 na mistura de PCR #1, ver tabela 5) mostra sem amplificação (não mostrada). Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Figura 7: adequação dos mutantes do experimento Tn-Seq. Aptidão de um grupo de mutantes no rim de hamster 4 dias após o desafio (adaptado de estudo17 do Lourdault). A proporção de saída/entrada de 42 mutantes foi determinada para cada animal. Cada mutante é nomeado pelo gene (lic) ou a região intergênica (inter) o transposon é inserido ou o nome comumente usado na literatura. Cada relação é representada por um diamante negro. A mediana dos rácios (linha vermelha) foi determinada para cada mutante e comparada ao 1.0 usando o teste de Wilcoxon rank. A linha pontilhada representa a aptidão de 1.0, que corresponde à forma neutra. Os mutantes cuja aptidão é significativamente afetada são marcados por asteriscos: * P < 0,05; * * P < 0,01. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
| Reagentes | Volume para uma reação |
| Mistura de mestre 2 X | 12,5 Μ l |
| Cartilha 1, 10mm (TnK1 ou TnK2) * | 1.2 Μ l |
| Cartilha 2, 10mm (Deg1 ou grau 2) * | 1.2 Μ l |
| Água | Μ l 8.8 |
| Modelo (lisado de células ou DNA) | 1.3 Μ l |
| Volume final | 25 µ l |
| * Sequências de primer na tabela 3. |
Tabela 1: Identificação do local de inserção de transposon, mistura de PCR #1 semi-aleatório.
| Reagentes | Volume para uma reação |
| Mistura de mestre 2 X | 12,5 Μ l |
| Cartilha 1, 100mm (TnKN1 ou TnKN2) * | 0,2 Μ l |
| Cartilha 2, 100mm (Tag) * | 0,2 Μ l |
| Água | 10.1 Μ l |
| Produtos PCR, PCR # 1 | 0,8 Μ l |
| Volume final | 25 µ l |
| * Sequências de primer na tabela 3. |
Tabela 2: Identificação do local de inserção de transposon, mistura de PCR #2 semi aleatória.
| Nome | Sequência (5' - 3') | Referência | ||||
| Primers utilizados para PCR semi-aleatório | ||||||
| Tnk1 | CTTGTCATCGTCATCCTTG | 15 | ||||
| Tnk2 | GTGGCTTTATTGATCTTGGG | |||||
| Deg1 | GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT | |||||
| Grau 2 | GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT | |||||
| TnkN1 | CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG | |||||
| TnKN2 | TGGGGATCAAGCCTGATTGGG | |||||
| Marca | GGCCACGCGTCGACTAGTAC | |||||
| Primers usados para sequenciamento Illumina | ||||||
| TnkN3 | CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG | 17 | ||||
| olj376 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG | 6 | ||||
| pMargent2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA | |||||
| IP 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | Illumina sequenciamento (códigos de barras em negrito) | ||||
| IP 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 13 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 14 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 15 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 16 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 17 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 18 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 19 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 21 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 22 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 23 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 24 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 25 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 26 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 27 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 28 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 29 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| Seq IP | GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC | |||||
| pMargent3 | ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA | 6 | ||||
Tabela 3: Sequências primer.
| Reagentes | Volume para uma reação |
| DNA cortado | 500 ng (ver equação em 3.3.2). |
| Água | Até 14,5 µ l |
| 5 x tampão TdT | 4 Μ l |
| (dCTP 9,5 mM + 0.5 mM ddCTP) mistura * | 1 Μ l |
| TdT (30 U / µ l) | 0,5 Μ l |
| Volume final | 20 µ l |
| * Mix 3 µLof 10mm ddCTP, 5,7 µ l de 100 mM dCTP e 51.3 µ l de água | |
Tabela 4: C-tailing reação com terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT).
| Reagentes | Volume para uma reação | |
| Reação de biblioteca | Reação de controle | |
| Master mix 2x | 12,5 Μ l | 12,5 Μ l |
| Cartilha 1, 30 µM (TnkN3) * | 0,5 Μ l | - |
| Cartilha 2, 30 µM (olj376) * | 1,5 Μ l | 1.5 |
| Água | 7,5 Μ l | 8 Μ l |
| DNA-de-cauda-C | 3 Μ l | 3 Μ l |
| Volume final | 25 µ l | 25 µ l |
| * Sequências de primer na tabela 3. | ||
Tabela 5: Construção de biblioteca genômica, mistura de PCR #1.
| Reagentes | Volume para uma reação | |
| Reação de biblioteca | Reação de controle | |
| Master mix 2x | 25 Μ l | 12,5 Μ l |
| Cartilha 1, 30 µM (pMargent2) * | 0,5 Μ l | 0,25 Μ l |
| Cartilha 2, 30 µM (cartilha indexação) * | 0,5 Μ l | 0,25 Μ l |
| Água | Μ L 23 | Μ l 11.5 |
| Produtos PCR, PCR # 1 | 1 Μ l | 0,5 Μ l |
| Volume final | 50 µ l | 25 µ l |
| * Sequências de primer na tabela 3. | ||
Tabela 6: Construção de biblioteca genômica, mistura de PCR #2.
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Discussion
Embora os resultados de nossa experiência piloto para hamster desafiada intraperitonealmente com 42 L. interrogans mutantes são apresentados17, esperamos que os maiores piscinas de mutantes podem ser rastreadas por Tn-Seq Porque a frequência de transconjugants é baixa (100-200 transconjugants/acasalamento), vários acasalamentos são necessários para gerar um número suficiente de mutantes para grandes experiências de Tn-Seq. Manter um grande número de mutantes em culturas líquidas apresenta desafios logísticos que devem ser abordados. Culturas podem ser incubadas em placas de 96 poços profundos. Densidades de cultura podem ser monitoradas por leituras da densidade óptica em um espectrofotômetro definir a 420 nm. A determinação do número de animais para usar depende em parte do tamanho da entrada piscina e deve ser determinada pela análise do poder. Para experimentos em grande escala, recomendamos que a análise de poder ser realizada em consulta com um biostatistician.
Gargalos podem afetar a recuperação dos mutantes aleatórias da área de saída. Embora graves gargalos não foram observados em nosso estudo piloto17 (Figura 7), experimentos em grande escala podem ser afetados pela perda aleatória de mutantes. Aumentando a dose de desafio, aumentando o número de células por mutante na entrada piscina irá minimizar a probabilidade de gargalos35. A ferramenta de galáxia recém-publicado MAGenTA fornece a ferramenta necessária para avaliar os gargalos e aptidão31.
TN-Seq experimentos planejado para uma rota alternativa de infecção, outros Leptospira cepas, ou outros modelos de roedores exigem considerações adicionais. Se a cinética da infecção da espécie do hospedeiro não é conhecida ou não é exponencial continuamente durante o curso da infecção dentro de cada tecido para ser examinado, DNA deve ser obtido do cultivo de tecidos em vez diretamente de tecidos. Este passo adicional irá minimizar a superestimativa da aptidão mutante devido à deteção do ADN de espiroquetas mortas. Se o pool de saída é obtido a partir dos tecidos de cultivo, o pool de entrada deve ser cultivado para efeitos de endereço de crescimento em vitro . Recomendamos também uma experiência piloto com um pequeno número de mutantes determinam se os gargalos serão uma preocupação e auxiliar a análise do poder para experimentos em grande escala.
Confirmação da aptidão alterado conforme determinado pelo Tn-Seq exigirá testes individuais mutantes no modelo animal. Atualmente, cada mutante deve ser sequenciado individualmente antes da Tn-Seq para identificar o mutante carregando a inserção no gene de interesse. No entanto, se a substituição do alelo em patogenicidade Leptospira torna-se fácil, sequenciamento de mutantes individuais já não será necessário. Alternativamente, efetores, como ativador de transcrição têm sido utilizados com sucesso para diminuir a expressão de genes lig em L. interrogans36. Esta técnica poderia ser usada para baixo-regular genes interrompidos em mutantes com aptidão alterado identificado pelo Tn-Seq
Ao interpretar os dados de Tn-Seq, interações entre bactérias devem ser tidos em conta. É teoricamente possível que uma diminuição da aptidão pode ser devido à concorrência entre os mutantes, ao invés de um efeito direto da inserção do transposon. Além disso, a ausência de alteração na aptidão na vivo de um mutante numa piscina poderia ser devido à cooperação entre os mutantes. Por exemplo, um mutante que não produz o factor essencial poderia ser complementado intercellularly pela produção do fator por outros mutantes na piscina. Observamos um aumento na aptidão para vários mutantes, que pode ser uma consequência da reduzida carga metabólica já não conseguiram sintetizar proteínas que não são essenciais para o crescimento, como mostrado por Salmonella enterica37.
Este protocolo pode ser usado para identificar os genes envolvidos no metabolismo ou sobrevivência sob condições estressantes em vitro 38,39. Por exemplo, a crescente Leptospira em diferentes condições, como a concentração elevada de cloreto de sódio, ferro limitado e pH ácido poderia identificar genes responsáveis pela resistência ácida de sobrevivência ou estresse. Esses experimentos em vitro também podem ser realizados com cepas saprófitas como cepa L. biflexa Pita eu porque esse método Tn-Seq pode ser aplicado a todos sequenciados cepas de Leptospira .
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Disclosures
Os autores não têm nada para divulgar.
Acknowledgments
Este trabalho foi apoiado por um prêmio de mérito de assuntos de veteranos (a D.A.H.) e um Instituto Nacional de saúde conceder R01 AI 034431 (a D.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
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