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Immunology and Infection

Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness Leptospira Interrogans Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Wir beschreiben hier eine Technik, die verbindet Transposon Mutagenese mit Hochdurchsatz-Sequenzierung zu identifizieren und quantifizieren Transposon Leptospiral Mutanten im Gewebe nach einem Zweikampf von Hamstern. Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Bildschirm Mutanten für überleben und Verbreitung bei Tieren und kann auch auf in-vitro- Studien angewendet werden.

Abstract

In diesem Manuskript beschreiben wir ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik zu identifizieren und quantifizieren Leptospira Interrogans Mutanten in Fitness während der Infektion von syrischen Goldhamster verändert. TN-Seq kombiniert mit der Kraft der Hochdurchsatz-Sequenzierungstechnologie zufällige Transposon Mutagenese. Tiere sind gefordert, mit einem Pool von Transposon Mutanten (Eingang Schwimmbad), gefolgt von der Gewinnung von Blut und Gewebe ein paar Tage später zu identifizieren und zu quantifizieren, die Anzahl der Mutanten in jedes Organ (Ausgabe Pools). Die Ausgabe-Pools sind gegenüber den Eingang Pool, der in Vivo -Fitness jeden Mutante zu bewerten. Dieser Ansatz ermöglicht Screening von einem großen Pool von Mutanten in einer begrenzten Anzahl von Tieren. Mit geringfügigen Änderungen kann dieses Protokoll mit jeder Tiermodell der Leptospirose, Reservoir Host wie Ratten und akute Infektionsmodelle wie Hamster, sowie in-vitro- Studien durchgeführt werden. TN-Seq ist ein leistungsstarkes Tool zum Bildschirm für Mutanten mit in Vivo und in Vitro Fitness Mängel.

Introduction

Identifizierung von Genen Virulenz für manche Bakterien, wie z. B. Leptospira spp., ist schwierig, wegen der begrenzten Zahl der genetischen Werkzeuge zur Verfügung. Eine häufig verwendete Methode ist die Erstellung einer Sammlung von Mutanten durch zufällige Transposon Mutagenese, gefolgt von der Identifikation der Insertionsstelle in jeder Mutant und Virulenz von einzelnen Transposon Mutanten in einem Tiermodell testen. Dieser Ansatz ist zeitaufwendig, teuer und erfordert eine große Anzahl von Tieren.

Als zufällige Mutagenese zunächst für den Erreger Leptospira Interrogansentwickelt wurde, wurden an Virulenz beteiligten Gene identifiziert, durch die Prüfung einzelner Mutanten in einem Tiermodell1. Mutanten wurden basierend auf Kriterien wie ihre mögliche Rolle bei der Signalisierung oder Motilität oder ihrer vorhergesagten Außenmembran oder Oberfläche Speicherort ausgewählt. Da die Mehrzahl der Leptospiral Gene kodieren hypothetischen Proteine der unbekannten Funktion2, Auswahl durch Mutation entstehende Variationen anhand dieser Kriterien Grenzen die Möglichkeit, neuartige Leptospiral Virulenz Gene zu entdecken.

Pools von L. Interrogans Transposon Mutanten wurden in jüngerer Zeit, für die Infektiosität in der Hamster und Maus Modelle3gezeigt. Jedes Tier wurde mit einem Pool von bis zu 10 Mutanten in Frage gestellt. Infektiosität einer Mutante erzielte er als positiv, wenn sie durch PCR Kulturen gewonnenen Blut und Niere festgestellt worden. PCR-Tests war mühsam, weil es eine individuelle PCR-Reaktion für jede Mutante im Pool erforderlich. Da die Frequenz jeder Mutant in den Kulturen nicht quantifiziert wurde, war der Ansatz zur Identifizierung von stark abgeschwächte Mutanten voreingenommen.

Wir beschreiben ein Transposon Sequenzierung (Tn-Seq) Technik, als eine Strategie, um effizienter Bildschirm für Virulenz Gene. TN-Seq besteht aus der Erstellung einer Bibliothek von Mutanten durch Transposon Mutagenese gefolgt von massiven parallelen Sequenzierung4,5,6. Transposon Mutanten sind kurz, gebündelt, in die Tiere geimpft und später erholte sich von verschiedenen Organen (Ausgabe Pools). Die DNA von den Ausgabe-Pools wird extrahiert und mit Restriktionsenzymen verdaut oder durch Ultraschallbehandlung geschert. Zwei Runden von PCR gezielt die Kreuzungen der Transposon Einfügung Seiten erfolgen. Dieser Schritt ermöglicht die Zugabe von den Adaptern für die Sequenzierung erforderlich. Die daraus resultierende PCR-Produkte werden von Hochdurchsatz-Sequenzierung Transposon Insertionsstelle jede Mutante des Pools zusammen mit ihrer relativen Fülle, zu identifizieren, die im Vergleich zu der ursprünglichen Zusammensetzung der Pool der Mutant analysiert.

Der Hauptvorteil dieses Ansatzes ist die Fähigkeit, gleichzeitig eine große Anzahl von Mutanten mit einer kleinen Anzahl von Tieren auf den Bildschirm. TN-Seq erfordert keine Vorkenntnisse der Transposon Einfügung Websites die erhöht die Chancen der Entdeckung neuer Leptospiren-spezifischen Genen in Virulenz mit weniger Zeit und mehr Effizienz. Weil Leptospiral Belastung im Gewebe relativ hoch in Nagetier-Modelle anfällig für tödliche Infektion (in der Regel 104 108 Bakterien/g Gewebe)7,8,9 ebenso wie Reservoirwirten 10,11, Gewebe direkt analysiert werden können, ohne die Notwendigkeit, Kultur, Verringerung der Verzerrungen durch in-vitro- Wachstum.

In Tn-Seq-Studien mit den meisten bakteriellen Erregern, die bisher beschrieben erlaubt die hohe Frequenz der insertional Mutagenese Infektion mit großen Pools mit Mutanten, die gemeinsam mit mehreren eng beieinander liegender Transposon Einfügungen innerhalb jedes Gen4 ,12,13,14. TN-Seq wurde auch für ein Bakterium entwickelt für die Mutagenese-Frequenz viel niedriger6 ist. Mit Leptospirakann eine Bibliothek von Transposon Mutanten erzeugt werden, durch die Einführung des Transposons auf ein konduktiven Plasmid durch Konjugation wie von Slamti Et Al15beschrieben. Die Häufigkeit der Transposon Mutagenese von L. Interrogans ist jedoch gering. Wenn das Transposon Himar1 auf ein konjugative Plasmid eingeführt wurde, wurde die Transconjugant Häufigkeit berichtet, nur 8,5 x 10-8 pro Empfänger mit der Lai-Belastung von L. Interrogans16 Zelle und wird voraussichtlich ähnlich schlecht mit den meisten anderen Sorten von L. Interrogans. Das hier beschriebene Protokoll ist im Teil auf der Grundlage, die für Borrelia Burgdorferi, entwickelt in denen die Häufigkeit von Transposon insertional Mutagenese ist auch niedrig6.

Für unsere Pilotversuch mit der Protokoll-17führten wir Transposon Mutagenese mit L. Interrogans Serovar Manilae Stamm L495 aufgrund des Erfolges der anderen Gruppen isolieren Transposon Einfügung Mutanten in den Stamm zusammen mit seinem tief LD50 (letale Dosis) für Virulenz1. Wir 42 Mutanten durch Tn-Seq abgeschirmt und identifiziert mehrere mutierte Kandidaten in Virulenz, darunter zwei mit Einfügungen in einem Kandidaten-Adenylat-Cyclase-gen defekt. Einzelprüfung der beiden Mutanten in Hamster bestätigt, dass sie einen Mangel an Virulenz17waren.

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Protocol

Achtung: Pathogene Stämmen von Leptospira SPP müssen unter Biosafety Level 2 (BSL-2) Containment Verfahren behandelt werden. Geeigneter persönlicher Schutzausrüstung (PSA) muss getragen werden. Ein Klasse II Biosicherheit Kabinett zwingend erforderlich alle Manipulationen von pathogenen Leptospira spp.

1. Erstellung der das Transposon mutierten Bibliothek15

  1. Transfer von das Transposon in Leptospira Spp. durch Konjugation (Abbildung 1()
    1. Impfen Sie ein Volumen von exponentielle Phase Kultur der Pathogene Leptospira spp. in 10 mL Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris mittlerer (EMJH)18,19, 107 Zellen entspricht. Inkubation bei 30 ° C mit 150 u/min schütteln bis die Dichte 2-8 x 108 Zellen/mL erreicht.
      Hinweis: Die Verdopplungszeit pathogener Leptospiren ist 12 bis 24 h, abhängig von der Sorte.
    2. Impfen Sie 50 µL der Spender Escherichia coli Stamm β216320 der konduktiven Transposon Plasmid (pCjTKS2)16 in 5 mL von Luria Brühe (LB) ergänzt mit 0,3 mM 2,6-Diaminopimelicacid (DAP), 50 µg/mL zu tragen Kanamycin (Km) und 50 µg/mL Spectinomycin (Spc) und über Nacht in einem 37 ° C Inkubator bei 255 u/min statt.
    3. Impfen Sie 60 µL von E. Coli Zellen in 3 mL EMJH mit 0,3 mM der DAP (EMJH + DAP) ergänzt. Inkubation bei 37 ° C bei 255 u/min Agitation für 3-4 h bis zu einer OD600nm≈ 0,3.
    4. Um die Filtergruppe (Abbildung 1) zu montieren, stellen Sie den Fuß auf einen 125 mL Seitenarm Erlenmeyerkolben, positionieren Sie einen Acetat-Zellulose-Filter (Porengröße 0,1 mm; Durchmesser 25 mm) auf der Basis und Klemme den Trichter auf die Basis. Verbinden Sie die Filteranlage mit einer Vakuumanlage.
    5. Fügen Sie 5 mL Leptospira Spp. Kultur und 0,5 mL der E. Coli -Kultur in den Trichter. Saugen Sie die Flüssigkeit durch den Filter.
    6. Übertragen Sie den Filter mit der Oberfläche der Bakterien nach oben auf eine EMJH + DAPplate. Inkubation bei 30 ° C über Nacht mit dem Filter nach oben.
    7. Setzen Sie den Filter in einem 15 mL Röhrchen mit 1 mL EMJH und Vortex für 10 s, die Bakterien in den Medien zu veröffentlichen. 200 µL der Suspension auf 5 EMJH Platescontaining 50 µg/mL Km mit 10-15 1 mm sterile Glasperlen oder einer sterilen Einweg-Streuer zu verbreiten. Wickeln Sie die Platten mit Parafilm und 3 bis 4 Wochen, bis die Kolonien sichtbar werden kopfüber bei 30 ° C inkubieren.
    8. Übertragen Sie Kolonien einzeln in 3 mL EMJH mit 50 µg/mL Km (EMJH + Km) bei 30° C unter 150 u/min Agitation für 7 bis 10 Tage, bis die Kultur eine Dichte von ≈ 10 erreicht8/mL.
      Hinweis: Kulturen können bei-80 ° C oder in flüssigem Stickstoff (mit 4 % Glycerin) gespeichert werden.
  2. Identifikation der Insertionsstelle Transposon von verschachtelten PCR (Abbildung 2( )
    1. Lösen Sie 50 µL jeder Transposon-Mutante in PCR Schläuche durch Inkubation bei 95 ° C für 15 Minuten.
      Hinweis: DNA kann stattdessen mit einem DNA-Extraktion Kit gereinigt werden.
    2. Vorbereiten des PCR-Mixes mit Deg1 und Tnk1 Primern (Tabelle 3) gemäß Tabelle 1. Transfer 23,7 µL des Mixes zu jedem PCR-Röhrchen und 1.3 µL lysierten Zellen hinzufügen. Führen Sie das Programm: 95° C für 5 min; 40 Zyklen: 95 ° C für 15 s, 40 ° C für 1 min, 72 ° C für 2 min; 72 ° C für 10 Minuten.
    3. Stellen des PCR-Mixes mit Tag und TnkN1 Primern (Tabelle 3) nach Tabelle 2. Übertragen Sie 24,2 µL des Mixes zu jedem PCR-Röhrchen und fügen Sie 0,8 µL des PCR-#1-Reaktion. Führen Sie das Programm: 95 ° C für 5 min; 35 Zyklen: 95 ° C für 15 s, 55 ° C für 30 s, 72 ° C für 2 min; 72 ° C für 10 Minuten.
    4. Laufen Sie 3 µL des PCR-Produkte auf einem 1 % Agarose-Gel mit 1 X Tris-Acetat-EDTA (TAE) Puffer mit 10-15 V/cm (Abb. 2 b).
    5. PCR-Produkte der positiven Proben mit einem PCR-Reinigung-Kit zu reinigen. Eluieren Sie DNA mit dem niedrigsten Volumen erlaubt das Kit um die Konzentration von DNA erholt zu maximieren.
    6. Senden Sie gereinigten PCR-Produkte für die Sanger-Sequenzierung mit dem TnkN1 Primer (Tabelle 3).
    7. Vergleicht man die resultierende Sequenz mit der elterlichen Belastung Genomsequenz von BLASTN Analyse (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) oder über die SpiroScope Datenbank (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)21identifizieren Sie Einfügung.
    8. Bestätigen Sie die Einstichstelle das Transposon durch PCR Zündkapseln Tempern zu flankierenden Sequenzen Host verwenden.
      Hinweis: Das Transposon erhöht die Größe der Wildtyp Sequenz von ≈ 2 kb.

(2) Tierversuch (Abbildung 3)

  1. Kultur von Leptospiren Mutanten
    1. Wachsen Sie individuell jedem ausgewählten Transposon-Mutante in 10 mL EMJH + Km bei 30 ° C bei 150 u/min Agitation zu einer Dichte von 107-108 Leptospiren/mL.
    2. Rechnen Sie die Leptospiren durch Dunkelfeldmikroskopie mit einem Petroff-Hausser-Zähler oder wie beschrieben von Miller23.
    3. Jede Kultur in EMJH auf die gleiche Dichte, zum Beispiel 106 Zellen/mL zu verdünnen.
    4. Zur Montage am Eingang Pools vermischen Sie die verdünnten Kulturen in gleichen Volumina.
      Hinweis: Enthalten Sie Steuerelemente im Eingang Pool durch Zugabe von Mutanten mit bekannten Fitness Mängel wie z. B. loa2217,24 und Mutanten mit unveränderten Fitness wie LigB17,25, bzw.. Pools von Mutanten können mit 4 % Glycerin bei-80 ° C oder in flüssigem Stickstoff gelagert werden.
  2. Herausforderung
    Hinweis: Die hier beschriebenen Methoden wurden von den Veterans Affairs größere Los Angeles institutionelle Animal Care und Use Committee (Protokoll #09018-14) genehmigt.
    1. Intraperitoneal 1 mL des Eingabe-Pools für jedes Tier mit einer Insulin-Spritze U-100 mit 26 x ½" Nadel zu injizieren.
      Hinweis: In den Pilotversuch wurden 8 Tiere mit 1 mL der Eingabe Pool, d. h. 106 Bakterien insgesamt17herausgefordert. Die Infektion war, durfte für 4 Tage vor der Euthanasie zu gehen.
    2. Sammeln Sie 10 mL des Eingabe-Pools und spin für 20 min bei 3.220 x g. Entfernen Sie vorsichtig den Überstand ohne zu stören das Pellet. Speichern Sie die Zelle Pellet am - 80˚C bis zur Verwendung (Schritt 3.1.3).
    3. Beobachten Sie die Tiere täglich gekündigt am vorher festgelegten Endpunkt. Die Hamster täglich wiegen und Endpunkt Kriterien suchen: Appetitlosigkeit, Gang oder atmende Schwierigkeit, Niederwerfungen, gekräuselte Fell oder Verlust von > 10 % des maximalen Gewichts erreicht.
  3. In-vitro- experiment
    1. Am Tag der Herausforderung impfen Sie 3 Flaschen von 25 mL EMJH + Km mit 5 mL des Eingabe-Pools. Wachsen Sie Kulturen bei 30 ° C unter 150 u/min rühren.
    2. Zählen Sie die Leptospiren täglich mithilfe einer der Methoden der Abschnitt 2.1.2. Erreicht die Dichte ≈ 1 x 10-8/mL, spin-down jede Aussetzung für 20 min bei 3.220 x g.
    3. Speichern Sie die Zelle Pellets bei-80 ° C bis zur Verwendung.
  4. Ernte und Lagerung der Gewebe
    1. Einschläfern Sie die Tiere durch Isofluran Inhalation gefolgt von bilateralen Thorakotomie26.
    2. Sammeln Sie 1 bis 2 mL Blut sofort durch Herzpunktion mit einer 3 mL Spritze und Nadel 25 X 5/8". Übertragen Sie das Blut in Röhrchen mit EDTA. 5 bis 6 Mal durch Inversion, mischen.
    3. Sammeln Sie eine Niere und ⅓ bis ½ der ventrale Median Leberlappen in Cryoröhrchen.
    4. Gewebe bei-80 ° C bis zu seiner Verwendung zu speichern.

3. Aufbau der genomischen Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung (Abbildung 4)

  1. DNA-Extraktion
    1. DNA-Extraktion aus Blut.
      1. Übertragen Sie 100 µL Blut von EDTA-Röhrchen auf einem Microcentrifuge Schlauch.
      2. DNA mit Hilfe einen DNA-Extraktion Kit zu reinigen. Folgen Sie den Anweisungen des Herstellers.
    2. DNA-Extraktion aus den Geweben.
      1. Mit Skalpell und Schere, zwischen 50 bis 80 mg von jedem Organ in kleine Stücke (1 x 1 mm) in Würfel schneiden und in eine sterile Schraubverschluss Trockenrohr überführen. Messen Sie das Gewicht des Gewebes mit einer Präzisionswaage.
      2. Fügen Sie 500 µL steriler PBS in die Röhre.
      3. Homogenisieren von Proben mit den Disruptor für 1 min 5 Bewegungen pro Sekunde.
      4. Berechnen Sie das Volumen entspricht 25 mg des Gewebes unter Verwendung der folgenden Gleichung:
        Equation 1
      5. Übertragen Sie das berechnete Volumen in der DNA-Extraktion-Kit. Gehen Sie mit DNA-Reinigung nach den Anweisungen des Herstellers.
    3. DNA-Extraktion aus der Eingabe Pool und in-vitro- Kulturen.
      1. Bakterielle Pellets bei Raumtemperatur für ca. 5-10 min Auftauen.
      2. Gehen Sie mit DNA-Extraktion, folgen Sie den Anweisungen begleiten das Kit.
    4. Shop-DNA bei-80 ° C bis zur Verwendung.
  2. Scheren der DNS (Abbildung 5( )
    1. Übertragen Sie 50 µL der extrahierten DNA auf einem 1,5 mL Microcentrifuge Schlauch.
    2. Legen Sie die Rohre in das Gestell des Sonikator Cup Horn gefüllt mit kaltem Wasser (4 ° C).
    3. Führen Sie die Sonikator für 3 min bei 80 % Intensität mit 10 s auf Puls und 5 s aus Puls.
      Achtung: Tragen Sie Gehörschutz oder Ohrstöpsel, Gehörschutz.
    4. 2.5 µL der geschert DNA auf einem 2 % Agarosegel zu bestätigen, dass ein Großteil der DNA ist < 600 bp in der Größe.
  3. Ergänzung der C-Rute
    1. DNA-Konzentration zu messen, mit einem kleinen Volumen-Spektrophotometer.
    2. Berechnen Sie Volumen entspricht 500 ng DNA mithilfe der folgenden Gleichung:
      Equation 2
    3. Bereiten Sie Tailing Reaktion (Tabelle 4). Inkubieren Sie 1 h bei 37 ° C; bei 75 ° C für 20 Minuten inaktivieren.
      Hinweis: Für Proben, die Anpassung an ein Volumen von mehr als 14,5 µL erfordern, der letzte Band der Reaktion auf 40 µL zu erhöhen und die restlichen Komponenten entsprechend skalieren.
    4. Reinigen Sie die Proben mit einem PCR-Reinigung-Kit. Eluieren Sie die DNA mit 12 µL Elution Buffer.
  4. Nested PCR
    1. PCR #1
      1. Bereiten Sie PCR Mischungen gemäß Tabelle 3 und 5. Übertragen Sie 22 µL des Bibliothek-Mix zu jedem PCR-Röhrchen und fügen Sie 3 µL gereinigte DNA. Gehen Sie ebenso mit dem Steuerelement-Mix.
        Hinweis: Primer TnkN317 ist spezifisch für das Transposon und Grundierung olj3766 ist spezifisch für das C-Tail. Der Steuerelement-Mix fehlt die TnkN3 Grundierung, die richtet sich speziell an das Transposon.
      2. Führen Sie das folgende Programm: 95 ° C für 2 min; 24-Zyklen: 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 2 min; 72 ° C für 2 min.
    2. PCR #2.
      1. Bereiten Sie die zweite PCR Mischungen nach Tabellen 3 und 6. Übertragen Sie 49 µL des Bibliothek-Mix zu jedem PCR-Röhrchen und fügen Sie 1 µL des PCR #1 Bibliothek Reaktion. Übertragen Sie 24,5 µL des Kontrolle-Mix zu jedem PCR-Röhrchen und fügen Sie 0,5 µL des PCR #1 Kontrollreaktion.
        Hinweis: Primer pMargent2 ist spezifisch für das Transposon und IP-Primer6 enthalten sechs Basenpaare Barcode und spezifische Sequenzen von Next Generation Sequencing-Plattform erkannt.
      2. Führen Sie das folgende Programm: 95 ° C für 2 min; 18 Zyklen: 95 ° C für 30 s, 60 ° C für 30 s, 72 ° C für 2 min; 72 ° C für 2 min.
    3. Führen Sie 3 µL auf ein 2 % Agarose-Gel. Die Bibliothek sollte einen Abstrich mit der Mehrheit des Signals zwischen 200 bis 600 zeigen bp (Abbildung 6) und keine Verstärkung für die der Kontrollreaktion.
  5. Reinigung der PCR-Produkte.
    Hinweis: Reinigen Sie die genomischen Bibliotheken mit einem PCR-Reinigung-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Eluieren Sie die DNA mit 30 µL Elution Buffer.
  6. Messen Sie die DNA-Konzentration mit einem Fluorometer. Durchschnittlich 2 bis 3 mal gelesen.
  7. Berechnen Sie das Volumen jeder Bibliothek gleichbedeutend mit 15 oder 20 ng unter Verwendung der folgenden Gleichung:
    Equation 3
  8. Mischen alle Bibliotheken zusammen nach den bisherigen Berechnungen. Bestimmen Sie die molare Konzentration der DNA mit der folgenden Website Gleichung:
    http://www.MOLBIOL.edu.ru/eng/Scripts/01_07.HTML
    Achtung: DNA-Konzentration und Volumen Anforderungen richten sich nach der Sequenzierung Plattform.

4. Hochdurchsatz-Sequenzierung und Analyse von Daten

  1. Sequenzierung
    1. Sequenz-Bibliotheken als 64 bp Einend-liest mit benutzerdefinierten Sequenzierung Primer pMargent3 und die standard kommerzielle Sequenzierung Grundierung. Die Sequenzierung Plattform bieten Ihnen FastQ-Dateien mit allen Sequenzierung liest.
  2. Analyse mit Galaxy-software
    1. Die Genom-Sequenz-Datei herunterladen
      1. In der SpiroScope-Datenbank-Homepage (siehe Punkt 1.2.7 für Link), wählen Sie den Organismus für das Experiment verwendet und klicken Sie auf "LOAD in Genom-BROWSER".
      2. Wählen Sie in der Symbolleiste (im oberen Bereich der Homepage), "Suche/Export > Daten herunterladen", klicken Sie in der Zeile "Sequence (Fasta)", "Genom" um die Sequenz zu laden.
      3. Öffnen Sie die Datei mit Notepad (PC) oder TextEdit (Mac) und benennen Sie das Chromosom (z. B. "ChrI"). Das Fasta-Format zu erhalten.
      4. Befolgen Sie die gleichen Schritte aus, um die Sequenz des Chromosoms II herunterladen. Kombinieren Sie beide Chromosom-Sequenzen in einer einzigen .txt-Datei durch Kopieren und einfügen.
        Hinweis: Chromosom Sequenzen können auch von der NCBI-Website (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) heruntergeladen und kombiniert in einer einzigen .txt-Datei.
    2. Hochladen von Dateien auf den Server von Galaxy
      Hinweis: Galaxy ist ein open Source, Web-basierte Plattform für die Verwaltung der Daten intensive Bioinformatik Workflows27,28,29,30 und abrufbar unter https://usegalaxy.org/.
      1. Wählen Sie im Menü "Extras", "Daten > Datei von Ihrem Computer hochladen". Ziehen Sie und legen Sie die .fastq Datei(en) erzeugt durch die Sequenzierung Plattform in das Fenster und klicken Sie auf "Start".
      2. Die gleichen Schritte um die Leptospiren Genom-Sequenz .txt Datei hochzuladen.
    3. Bräutigam liest
      1. Wählen Sie "NGS: QC und Manipulation > FASTQ Groomer" aus dem Menü "Extras".
      2. Neben Datei zu pflegen wählen Sie die Bibliotheken in Schritt 4.2.2 hochgeladen. Eingabe FASTQ Qualität Noten Typ wählen Sie das entsprechende Sequenzierung System. Verlassen Sie für erweiterte Optionen ausblenden Advanced Büro ausgewählt.
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    4. Sequenzierung Artefakte zu entfernen
      1. Wählen Sie "NGS: QC und Manipulation > Sequenzierung Artefakte zu entfernen". Neben Bibliothek zu filtern, wählen die präparierten Dateien in Schritt 4.2.3 erzeugt. Klicken Sie auf "Ausführen".
    5. C-Tail-Sequenzen zu entfernen
      Hinweis: Wiederholen Sie diese Schritte einmal oder zweimal darauf alle C-Tails entfernt werden.
      1. Wählen Sie "NGS: QC und Manipulation > Clip Adapter Sequenzen".
      2. Wählen Sie oder geben Sie Folgendes ein:
        Bibliothek zum Clip: Wählen Sie die Dateien in Schritt 4.2.4 erzeugt.
        Minimale Sequenz Länge: 15
        Quelle: Geben Sie eine benutzerdefinierte
        Geben Sie eine benutzerdefinierte Clipping: CCCCCCC
        Geben Sie Null-Wert zu halten die Adapter-Sequenzen und X-Basen, die ihm folgen: 0
        Sequenzen mit unbekannt (N) Basen zu verwerfen: Ja
        Ausgabeoptionen: Ausgabe abgeschnittene und nicht abgeschnitten-Sequenzen
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    6. Entfernen Sie Adapter Sequenzen
      1. Wählen Sie "NGS: QC und Manipulation > Clip Adapter Sequenzen".
      2. Wählen Sie oder geben Sie Folgendes ein:
      3. Bibliothek zum Clip: Wählen Sie im Schritt 4.2.5 erzeugte Dateien.
      4. Minimale Sequenz Länge: 15
      5. Quelle: Geben Sie eine benutzerdefinierte
      6. Geben Sie eine benutzerdefinierte Clip: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Geben Sie Null-Wert zu halten die Adapter-Sequenzen und X-Basen, die ihm folgen: 0
      8. Sequenzen mit unbekannt (N) Basen zu verwerfen: Ja
      9. Ausgabeoptionen: Ausgabe abgeschnittene und nicht abgeschnitten-Sequenzen
      10. Klicken Sie auf "Ausführen".
    7. Filter liest auf ihre Qualität
      1. Wählen Sie "NGS: QC und Manipulation >" Filtern nach "Qualität".
        Hinweis: Dieses Tool wählt anhand von Qualitätskennzahlen liest.
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        Bibliothek zu filtern: Wählen Sie die Dateien in Schritt 4.2.6 erzeugt.
        Qualität-Grenzwert: 20
        Prozent der Basen in Reihenfolge, die Qualität muss gleich zu/höher als Cut-off-Wert: 95
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
        Hinweis: Mit diesen Einstellungen werden Lesevorgänge kürzer als 20 Nukleotide oder mit einem Qualitätsfaktor von 20 oder weniger für 95 % der Zyklen verworfen. Passen Sie strenge Einstellungen zu Ihrem Experiment.
    8. Karte liest32
      1. Wählen Sie "NGS: Mapping > Bowtie2"32.
      2. Wählen Sie Folgendes in die Felder im Hauptfenster:
        Ist dieser einzelne oder gekoppelte Bibliothek: Einend-
        FASTQ Datei: Wählen Sie die Bibliothek für Qualität aus Schritt 4.2.7 gefiltert.
        Schreiben (im Fastq Format) ausgerichteten liest um Dateien zu trennen: keine
        Schreiben (im Fastq Format) ausgerichteten liest um Dateien zu trennen: keine
        Sie wählen Sie eine Referenz-Genom aus Ihrem Verlauf oder verwenden Sie einen integrierten Index?: verwenden ein Genoms aus der Geschichte und bauen Index
        Wählen Sie die Referenz-Genom: Wählen Sie die Leptospiren genome.txt Datei in Schritt 4.2.2 hochgeladen.
        Gruppe Gruppen Informationen gelesen?: nicht festgelegt
        Wählen Sie Analysemodus: 1: Standardeinstellung nur
        Möchten Sie Presets benutzen?: Nein, nur die Standardeinstellungen verwenden
        Speichern Sie die bowtie2 Zuordnung Statistiken zur Geschichte: Nein
        Job-Ressourcenparameter: Job Ressource Standardparameter verwenden
      3. Klicken Sie auf "Ausführen" um Lesezugriffe auf das Genom auszurichten.
    9. Dateien konvertieren
      1. Wählen Sie "NGS: SAMtools > BAM-SAM SAM BAM umwandeln".
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        BAM-Datei zu konvertieren: Wählen Sie Bibliothek aus Schritt 4.2.8 zugeordnet.
        Kopfzeilen-Optionen: Header beinhalten, in der SAM-Ausgabe (-h)
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    10. Dateien konvertieren
      1. Wählen Sie "NGS: SAMtools > Intervall SAM umwandeln".
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        Dataset konvertieren auswählen: Wählen Sie die SAM-zugeordnete Bibliothek-Datei in Schritt 4.2.9 erzeugt.
        Drucken Sie alle?: Ja
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    11. Art mal gelesen
      1. Wählen Sie "Filtern und sortieren > Daten in aufsteigender oder absteigender Reihenfolge sortieren".
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        Art-Dataset: Wählen Sie die Intervall-Datei in Schritt 4.2.10 erzeugt.
        Spalte: 2
        mit Geschmack: Lfd.
        alles in: aufsteigend
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    12. Wählen Sie passende Chromosom liest ich
      1. Wählen Sie "Filtern und sortieren > Wählen Sie Zeilen, die einen Ausdruck entsprechen".
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        Wählen Sie Zeilen aus: Wählen Sie Datei mit sortierten liest im Schritt 4.2.11 erzeugt.
        : Matching
        das Muster: Geben Sie den Namen des Chromosoms, die ich als entschlossen im Schritt 4.2.1.3 (z. B. "ChrI").
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    13. Wählen Sie liest übereinstimmenden Chromosom II
      4.2.12 Schritt folgen.
    14. Gruppe, die nach den Standorten der Einfügungen in Chromosom ich liest
      1. Wählen Sie ", subtrahieren und Gruppe beitreten > Daten nach einer Spalte zu gruppieren und aggregieren Vorgang für andere Spalten".
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        Daten auswählen: Wählen Sie die resultierende Datei aus Schritt 4.2.12.
        Gruppieren nach Spalte: 2
        Ignorieren und Gruppierung?: Nein
        Zeilen beginnen mit diesen Zeichen zu ignorieren: Ø
        Betrieb > + Einfügevorgang
        Typ: Graf
        Spalte: 2
        Ergebnis auf die nächste ganze Zahl runden: Nein
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    15. Gruppe nach den Standorten der Einfügung in Chromosom II liest
      4.2.14 Schritt folgen.
    16. Art-Einfügung sites auf Chromosom ich
      1. Wählen Sie "Filtern und sortieren > Daten in aufsteigender oder absteigender Reihenfolge sortieren".
      2. Wählen Sie Folgendes aus:
        Art-Dataset: Wählen Sie Datei aus Schritt 4.2.14.
        Spalte: 1
        mit Geschmack: Lfd.
        alles in: aufsteigend
      3. Klicken Sie auf "Ausführen".
    17. Sortieren Sie Einfügung Websites auf Chromosom II
      4.2.16 Schritt folgen.
  3. Statistische Analyse
    1. Die Datenübertragung Galaxy in Tabellenkalkulationsdateien durch Kopieren und einfügen die zwei Spalten von Schritten 4.2.16. und 4.2.17. in einer Excel-Datei.
      Hinweis: Die erste Spalte ist die Nukleotid-Koordinate der Insertionsstelle Transposon, und die zweite Spalte ist die Anzahl der Lesevorgänge an jedem Standort einsetzen.
    2. Das Gen beherbergen das Transposon mit der Nukleotid-Koordinate in der Tabelle enthaltenen zu identifizieren.
      Hinweis: zum Beispiel ein Transposon eingefügt an Nukleotid #30718 des Chromosoms I ist befindet sich im LIC10024 -gen, die Nukleotide 29263-31539 in Chromosom überspannt ich.
    3. Berechnen Sie relative Häufigkeiten (F) für jede Mutant in jedem Gewebe und in den Eingang Pool nach untenstehender Formel:
      Equation 4
    4. Berechnen Sie Output/Input-Verhältnis (R) für jede Mutante und Gewebe mit Hilfe der folgenden Gleichung:
      Equation 5
    5. Wilcoxon-unterzeichnet-Rank-test
      1. Normalisieren Sie alle Kennzahlen der Ausgang/Eingang durch das mittlere Verhältnis für jedes Gewebe in jedes Tier auf 1,0 festlegen. Ein Verhältnis von 1,0 ist neutral, > 1.0 ist nachteilig, und < 1.0 ist vorteilhaft33.
      2. Ausgang/Eingang Verhältnisse bis 1.0 (neutrale Fitness) zu vergleichen mit dem Wilcoxon-Rang-Test mit P-Werten < 0,05 als statistisch signifikant angesehen.

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Representative Results

Aufbau einer Bibliothek von Transposon Mutanten in L. Interrogans durch Konjugation erfordert eine Filteranlage, wie in Abbildung 1dargestellt. Von jeder Paarung erholt wir 100-200 Transconjugants.

Transposon Insertionsstelle in jeder Mutant durch Sequenzierung das PCR-Produkt erzeugt durch semi-random PCR, die zum Jahresende das Transposon Ziel identifiziert und angrenzenden Host-Sequenzen15 (Abb. 2A). Ein Beispiel der Ergebnisse des semi-random PCR ist in Abbildung 2 bdargestellt. In den meisten Fällen wird eine dominante Amplikons Verwendung von Deg1 und Tnk1 Primer für die erste Runde der PCR und Tag und TnkN1 für die zweite Runde beobachtet werden. Aber durch die geringe Spezifität der Pentameric Sequenz (...) N10GATAT-3 ") am 3' Ende der Deg1 Primer, diese Grundierung wird an mehreren Standorten in der gesamten Leptospiral Genom Tempern. Wenn diese Seiten in der Nähe von Transposon Ende vorhanden sind, erhalten Sie mehrere PCR-Produkte. Wenn mehrere Amplifikate generiert werden, können sie gemeinsam von der PCR Mischung gereinigt und direkt sequenziert; Gel-Reinigung der einzelnen Amplifikate ist nicht notwendig, da sie alle die gleiche Sequenz stromabwärts enthalten von wo TnkN1 Grundierung glüht. Auf der anderen Seite kann PCR fehlschlagen, wenn die nächste Kopie der gezielt durch die Deg1 Primer Sequenz in großer Entfernung vom Transposon Ende befindet. Wenn keine PCR-Produkte erkannt werden, kann die erste Runde der semi-random PCR wiederholt werden, mit der Deg1 Primer und Tnk2 Grundierung, die auf der gegenüberliegenden Seite des das Transposon abzielt. In diesem Fall würde TnkN2 und Tag für die zweite Runde verwendet werden; mit der TnkN2 Primer (Abb. 2 b) würde der Amplifikate sequenziert werden. Alternativ kann die erste Runde der PCR erfolgen mit Deg2 Primer, deren 3' Ende (...) N10TCTT-3 ") zielt auf eine vier - statt einer fünf-Nukleotid-Sequenz. Vier verschiedene Sätze von Primer eignet sich für die erste Runde der PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1, Tnk1 + Deg2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + Deg2. Wenn ein Satz von Primern nicht funktioniert, verwenden Sie einen anderen Satz. Wenn diese zweite auch fehlschlägt festlegen, verwenden Sie eine andere und so weiter. Spontane Kanamycin resistente Mutanten sind sehr selten und entstehen bei einer Frequenz von < 10-10 34.

Während der Vorbereitung der genomischen Bibliotheken (Abbildung 4) kann ein paar Schritte überprüft werden. Die DNA durch Ultraschallbehandlung Scheren sollte durch Elektrophorese ein Aliquot in einer Agarosegel (Abbildung 5) bestätigt werden. Wenn DNA korrekt geschert, bilden DNA-Fragmente von 200 bis 600 bp wird einen Abstrich in ein 2 % Agarosegel. Vor dem Senden Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung, muss die Generation der PCR-Produkte von verschachtelten PCR-Reaktionen durch Agarose-Gelelektrophorese (Abbildung 6) bestätigt werden.

Nach der Verarbeitung der Sequenzierung liest nach dem hier beschriebenen Protokoll (Abschnitt 4.2), richtet sich die Häufigkeit von jeder Mutant im Eingang Pool und in allen Geweben unter Verwendung der Gleichung in Abschnitt 4.3.3. Der Ausgang/Eingang-Verhältnis für jede Mutante in jedem Gewebe wird mit der Gleichung in Abschnitt 4.3.4 berechnet. Abbildung 7 zeigt ein Beispiel der Ergebnisse, die mit dem Tn-Seq-Ansatz. Alternativ kann die MAGenTA-Tool verwendet werden, zu verarbeiten und analysieren die Sequenzierung Daten 31. Mutanten mit statistisch signifikant reduziert und erhöhte Fitness wurden identifiziert. Mutationen in den bekannten Leptospiral Virulenz Genen verursacht reduziert Fitness, Validierung des Tn-Seq-Ansatzes.

Figure 1
Abbildung 1: Filtrationseinheit für Konjugation verwendet. Die Filtergruppe wird zusammengebaut, indem man den Anschlag der Filter Unterstützung in einen Seitenarm Erlenmeyerkolben, Positionierung des Acetat-Zellulose-Filters auf den Sockel mit sterilen Pinzette, dann platzieren den Trichter auf den Sockel und Sicherung des Systems mit einer Klammer . Die Filtergruppe wird dann mit dem Vakuumsystem verbunden. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 2
Abbildung 2: Identifizierung von Transposon Einfügung Websites. (A) Schema zeigt Glühen Websites von semi-random PCR-Primer. Tnk1 und Tnk2 Zündkapseln Tempern nah an den gegenüberliegenden Enden des das Transposon (Tn). Deg1 ist eine 35-Nukleotid-Grundierung, die eine Strecke von 10 entartete Nukleotide, gefolgt von der Sequenz GATAT am 3'-Ende enthält. Die erste Runde der PCR (PCR #1) erfolgt mit Deg1 und Tnk1 oder mit Deg1 und Tnk2. TnkN1 und TnkN2 Primern, verwendet für PCR #2, Tempern zwischen Transposon enden und Tnk1 und Tnk2, beziehungsweise. Die Reihenfolge der Tag Grundierung ist identisch mit der 5'-Ende des Primers Deg1. (B) Beispiel Agarose-Gel nach der zweiten Runde der PCR mit 14 Transposon Mutanten (Bahnen 1 bis 14) erhalten. Die erste Runde der PCR wurde mit Deg1 und Tnk1 durchgeführt; die zweite Runde wurde mit Tag und TnkN1. Positive PCR ist vertreten durch "+" und eine negative PCR durch "-". "KmR"stellt die Kanamycin-Resistenz-Kassette. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 3
Abbildung 3: Flussdiagramm für den Erhalt des Ausgang Pools. Am Tag der Herausforderung (Tag 0) ist jede Leptospiral Mutant gezählt durch Dunkelfeld-Mikroskopie, verdünnt, um die gleiche Dichte und kombiniert, um die Eingabe Pool (Angaben in Abschnitt 2.1) bilden. Hamster sind mit dem Eingang Pool intraperitoneal gefordert. Darüber hinaus wurden drei Kulturen mit dem Eingang Pool begonnen. Am Tag der Impfung (Tag 0) und wenn die Kulturen eine Dichte von ≈ erreichen werden 108/mL, die Eingabe Pool und Kulturen durch Zentrifugation gesammelt und gespeichert als Pellets bei-80 ° C bis zur Verwendung (siehe Abschnitt 2.3). Auf den Endpunkt (Tag vorgewählt, um die Tiere, z.B., Tag 4 nach Herausforderung zu beenden) werden die Tiere eingeschläfert; Blut, Nieren und Leber werden gesammelt und bei-80 ° C bis zur Verwendung (siehe Abschnitt 2.4) gespeichert. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 4
Abbildung 4: Flussdiagramm der genomic Bibliothek Vorbereitung. (A) DNA aus Blut, Gewebe oder Kulturen, die nach dem in Abschnitt 3.1 beschriebenen Protokoll extrahiert. Das rote Feld stellt das Transposon (Tn). (B) der DNA wird durch Ultraschallbehandlung in Fragmente zwischen 200 und 600 bp geschert. Weitere Angaben unter Punkt 3.2. (C) C-Tails (gelbe Kästen) werden alle DNA-Fragmente mit Klemme Deoxynucleotidyl-Transferase (TdT) wie in Abschnitt 3.3 beschrieben und Tabelle 4 hinzugefügt. Die genomische Bibliothek ist für die Sequenzierung von verschachtelten PCR (D-E) vorbereitet. Die erste Runde der PCR erfolgt mit speziell für das Transposon und die C-Tail, TnkN3 und olj376 Primern. Siehe Tabelle 3 und 5. Nur Fragmente mit den Transposon enden (rot markiert) werden verstärkt. Hinweis: Verwenden Sie 3 Mal mehr olj376 Grundierung als TnkN3, da alle DNA-Fragmente C-Schwänzen haben. Die zweite Runde der PCR erfolgt mit pMargent2, speziell für das Transposon-Ende und eine Indizierung Grundierung, enthält eine sechs-Basenpaar Barcode-Sequenz (in rosa) ermöglicht alle Proben in einem einzigen Sequenzierung Lane gemultiplext werden. Siehe Tabelle 3 und 6. Beide Primer enthalten Sequenzen notwendig für die Bindung der Durchflusszelle bei Illumina Sequenzierung (grün und lila Box). (F) die resultierende PCR Produkte werden gereinigt, und dann ihre Konzentration wird gemessen, wie im Abschnitt 3.6 beschrieben. (G) alle genomische Bibliotheken gebündelt; Jede Bibliothek hat einen unterschiedlichen Barcode und (H) der Pool ist die Sequenzierung-Plattform an. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 5
Abbildung 5: Beschallung der DNA. DNA wurde aus der Leber von acht infizierten Hamster (Bahnen 1 bis 8), beschallt und geprüft durch Elektrophorese in einem 2 % Agarosegel gereinigt. Sheared DNA zeichnet sich durch einen Abstrich, in denen die Größe der Fragmente zwischen 200 und 600 BP ist. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 6
Abbildung 6: genomische Bibliotheken für Hochdurchsatz-Sequenzierung. Genomische Bibliotheken wurden von ressierten PCR mit DNA aus dem Blut von acht infizierten Hamstern (Bahnen 1 bis 8) vorbereitet und geprüft durch Elektrophorese in einem 2 % Agarose-Gel. Die Größe der Großteil der PCR-Produkte liegt zwischen 200 und 600bp. Negativkontrolle (keine TnkN3 Grundierung in PCR #1-Mix, siehe Tabelle 5) zeigt keine Verstärkung (nicht dargestellt). Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Figure 7
Abbildung 7: Fitness von Mutanten aus Tn-Seq Experiment. Fitness aus einem Pool von Mutanten in der Hamster Niere 4 Tage nach Herausforderung (adaptiert von Lourdaults Studie17). Der Ausgang/Eingang Verhältnis von allen 42 Mutanten wurde für jedes Tier bestimmt. Jeder Mutant ist durch das Gen (Lic) oder der intergenetischer Region benannt (inter) das Transposon in eingefügt wird oder der Name häufig in der Literatur verwendet. Jedes Verhältnis wird durch eine schwarze Raute dargestellt. Der Median der Verhältnisse (rote Linie) wurde für jedes Mutant ermittelt und im Vergleich zu 1.0 mit dem Wilcoxon-Rang-Test. Die gestrichelte Linie steht Fitness 1.0, das neutrale Fitness entspricht. Durch Mutation entstehende Variationen, deren Fitness erheblich beeinträchtigt, sind durch Sternchen gekennzeichnet: * P < 0,05; ** P < 0,01. Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.

Reagenzien Volumen für eine Reaktion
Master-Mix 2 X 12,5 ΜL
Grundierung 1, 10 mM (TnK1 oder TnK2) * 1,2 ΜL
Primer 2, 10 mM (Deg1 oder Deg2) * 1,2 ΜL
Wasser 8.8 ΜL
Vorlage (lysate Zellen oder DNA) 1.3 ΜL
Endvolumen 25 µL
* Primer-Sequenzen in Tabelle 3.

Tabelle 1: Identifikation der Insertionsstelle Transposon, semi-random PCR #1-Mix.

Reagenzien Volumen für eine Reaktion
Master-Mix 2 X 12,5 ΜL
Grundierung 1, 100 mM (TnKN1 oder TnKN2) * 0,2 ΜL
Primer 2, 100 mM (Tag) * 0,2 ΜL
Wasser 10.1 ΜL
PCR-Produkte von PCR #1 0,8 ΜL
Endvolumen 25 µL
* Primer-Sequenzen in Tabelle 3.

Tabelle 2: Identifikation der Insertionsstelle Transposon, semi-random PCR #2 Mix.

Name Sequenz (5' - 3') Referenz
Primer für semi-random PCR verwendet
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
Deg2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Tag GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Primer für Illumina Sequenzierung verwendet
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina Sequenzierung (Barcodes in Fettdruck)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP-seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tabelle 3: Grundierung Sequenzen.

Reagenzien Volumen für eine Reaktion
Sheared DNA 500 ng (siehe Gleichung in 3.3.2.)
Wasser Bis zu 14,5 µL
5 x TdT Puffer 4 ΜL
(9,5 mM dCTP + 0,5 mM DdCTP) Mix * 1 ΜL
TdT (30 U/µL) 0,5 ΜL
Endvolumen 20 µL
* Mix 3 µLof 10 mM DdCTP, 5,7 µL 100 mM dCTP und 51,3 µL Wasser

Tabelle 4: C-Tailing Reaktion mit Klemme Deoxynucleotidyl-Transferase (TdT).

Reagenzien Volumen für eine Reaktion
Bibliothek-Reaktion Kontrollreaktion
Master mix 2 x 12,5 ΜL 12,5 ΜL
Grundierung 1, 30 µM (TnkN3) * 0,5 ΜL -
Primer 2, 30 µM (olj376) * 1,5 ΜL 1.5
Wasser 7.5 ΜL 8 ΜL
C-angebundene DNA 3 ΜL 3 ΜL
Endvolumen 25 µL 25 µL
* Primer-Sequenzen in Tabelle 3.

Tabelle 5: Bau von genomic Bibliothek, PCR-#1-Mix.

Reagenzien Volumen für eine Reaktion
Bibliothek-Reaktion Kontrollreaktion
Master mix 2 x 25 ΜL 12,5 ΜL
Grundierung 1, 30 µM (pMargent2) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Primer 2, 30 µM (Indizierung Primer) * 0,5 ΜL 0,25 ΜL
Wasser 23 ΜL 11.5 ΜL
PCR-Produkte von PCR #1 1 ΜL 0,5 ΜL
Endvolumen 50 µL 25 µL
* Primer-Sequenzen in Tabelle 3.

Tabelle 6: Bau von genomic Bibliothek, PCR #2 Mischung.

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Discussion

Zwar ergibt sich aus unseren Pilotversuch für Hamster mit 42 L. Interrogans Mutanten intraperitoneal herausgefordert17präsentiert werden, erwarten wir, dass größere Pools von Mutanten durch Tn-FF abgeschirmt werden können Da die Frequenz der Transconjugants niedrig ist (100-200 Transconjugants/Paarungen), mehrere Paarungen sind notwendig, um eine ausreichende Anzahl von Mutanten für große Tn-Seq-Experimente zu erzeugen. Eine große Anzahl von Mutanten in flüssigen Kulturen pflegen präsentiert logistische Herausforderungen, die angegangen werden müssen. Kulturen können in Tiefe 96-Well Platten inkubiert werden. Kultur dichten lässt sich durch optische Dichte Lesungen in einem Spektrophotometer setzen auf 420 nm. Die Bestimmung der Anzahl von Tieren verwenden hängt zum Teil von der Größe des Eingabe-Pools und muss durch Power-Analyse ermittelt werden. Für umfangreiche Experimente empfehlen wir, dass die Power-Analyse in Absprache mit einem Biostatistiker durchgeführt werden.

Engpässe können sich die Erholung der zufälligen Mutanten aus dem Ausgabe-Pool auswirken. Obwohl schwere Engpässe in unserer Pilotstudie17 (Abbildung 7) nicht eingehalten wurden, können groß angelegte Experimente zufällige Verlust von Mutanten betroffen sein. Dosissteigerung Herausforderung durch Erhöhung der Anzahl der Zellen pro Mutant im Eingang Pool minimiert die Wahrscheinlichkeit, dass Engpässe35. Das neu erschienene Galaxy Tool MAGenTA bietet das notwendige Instrument, um Engpässe und Fitness31zu beurteilen.

TN-Seq Experimente geplant für eine alternative Route der Infektion, andere Leptospira Stämme oder andere Nager-Modelle erfordern zusätzliche Überlegungen. Wenn die Kinetik der Infektion in der Wirtsarten nicht bekannt ist oder nicht ständig exponentiell im Laufe der Infektion innerhalb jedes Gewebe untersucht werden, sollte DNA aus Kultivierung des Gewebes nicht direkt aus dem Gewebe erzielt werden. Dieser zusätzliche Schritt wird erfahrungsgemäß der mutierten Fitness durch Nachweis von DNA von Toten Spirochäten minimieren. Wenn der Ausgang-Pool von Kultivierung des Gewebes erreicht wird, sollten der Eingang Pool Adresse Auswirkungen der in-vitro- Wachstum kultiviert werden. Wir empfehlen auch einen Pilotversuch mit einer kleinen Anzahl von Mutanten zu bestimmen, ob Engpässe ein Anliegen sein und um die Power-Analyse für umfangreiche Experimente zu unterstützen.

Bestätigung der geänderten Fitness als bestimmt durch Tn-Seq erfordert individuelle Mutanten im Tiermodell testen. Derzeit muss jeder Mutant einzeln vor der Tn-Seq, die Mutante tragen die Einfügung in das gen des Interesses zu identifizieren sequenziert werden. Jedoch wenn Allel Ersatz in pathogener Leptospiren einfach wird, werden Sequenzierung des einzelnen durch Mutation entstehende Variationen nicht mehr notwendig. Alternativ wurden Transkription Aktivator-ähnlichen Effektoren erfolgreich eingesetzt, Lig Gene Expression in L. Interrogans36zu vermindern. Diese Technik könnte verwendet werden, um nach unten zu regulieren-Gene gestört in Mutanten mit veränderten Fitness identifiziert durch Tn-seq.

Bei der Interpretation der Tn-Seq-Daten sollten Interaktionen zwischen Bakterien berücksichtigt werden. Es ist theoretisch möglich, dass ein Rückgang der Fitness aufgrund des Wettbewerbs zwischen Mutanten, anstatt eine direkte Auswirkung der das Transposon einsetzen könnte. Darüber hinaus könnte eine Abwesenheit des Wandels in in Vivo Fitness eine Mutante in einem Pool durch Kooperation zwischen Mutanten. Zum Beispiel könnte eine Mutante, die einen wesentlichen Faktor produzieren nicht kann, intercellularly durch die Produktion des Faktors mit anderen Mutanten im Pool ergänzt werden. Wir beobachteten eine Zunahme in Fitness für mehrere Mutanten, die möglicherweise eine Folge der reduzierten metabolische Belastung durch nicht mehr synthetisieren Proteine, die nicht essentiell für das Wachstum, wie für Salmonella Enterica37gezeigt.

Dieses Protokoll kann verwendet werden, um Gene, die in den Stoffwechsel oder das Überleben unter schwierigen Bedingungen in Vitro 38,39zu identifizieren. Beispielsweise könnte wachsende Leptospiren unter verschiedenen Bedingungen wie hohe Natrium-Chlorid-Konzentration, begrenzte Eisen und sauren pH-Wert sauer überleben oder Stress-Beständigkeit verantwortlichen Gene zu identifizieren. Diese in-vitro- Experimente können auch durchgeführt werden mit saprophytischen Stämme wie L. Biflexa Stamm Kordilleren ich weil diese Tn-Seq-Methode angewendet werden kann alle sequenziert Leptospira Stämme.

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Disclosures

Die Autoren haben nichts preisgeben.

Acknowledgments

Diese Arbeit wurde unterstützt durch eine Veterans Affairs Merit Award (für D.A.H.) und eine National Institute of Health gewähren R01 AI 034431 (D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

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Hochdurchsatz-parallele Sequenzierung Maßnahme Fitness <em>Leptospira Interrogans</em> Transposon Insertion Mutanten während Golden syrischen Hamster Infektion
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Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

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