Summary
여기를 식별 하 여 조직에서 transposon leptospiral 돌연변이 햄스터의 도전 후 계량 높은 처리량 시퀀싱 transposon mutagenesis 결합 기술을 설명 합니다. 이 프로토콜 생존 및 동물에 보급에 대 한 화면 돌연변이를 사용할 수 있습니다 하 고 생체 외에서 연구에도 적용 될 수 있습니다.
Abstract
이 원고에서 우리는 transposon 시퀀싱 (Tn-Seq) 기술을 식별 하 고 계량 Leptospira interrogans 돌연변이 피트 니스 시리아 황금 햄스터의 감염 시 변경 설명 합니다. 테네시-Seq 임의의 transposon mutagenesis 높은 처리량 시퀀싱 기술의 힘 결합합니다. 동물 뒤에 수확 혈액과 조직의 몇 일 후 식별 하 고 각 기관 (출력 풀)에 있는 돌연변이의 수를 계량 transposon 돌연변이 (입력된 풀)의 수영장 도전입니다. 출력 풀 각 돌연변이의 vivo에서 적합성을 평가 하는 입력에 비교 됩니다. 이 방법은 돌연변이 동물의 제한 된 수에서의 대형 수영장의 수 있습니다. 사소한 수정이 프로토콜 렙의 어떤 동물 모델, 저수지 호스트 모델 쥐, 햄스터, 생체 외에서 연구 등 급성 감염 모델 수행할 수 있습니다. 테네시-Seq vivo에서 그리고 생체 외에서 피트 니스 결함 돌연변이 대 한 화면에 강력한 도구를 제공합니다.
Introduction
Leptospira 종 등 일부 박테리아에 대 한 독성 유전자의 유전 도구 사용할 수 있는 제한 된 수 때문에 어렵습니다. 일반적으로 사용 되는 한 가지 방법은 각 돌연변이에 삽입 사이트의 식별 및 독성 테스트 동물 모델에서 개별 transposon 돌연변이의 임의의 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 컬렉션의 창조 이다. 이 방법은 소모, 비싼, 고 동물의 많은 수를 요구 한다.
무작위 mutagenesis Leptospira interrogans병원 체에 대 한 처음으로 개발, 유전자 독성에 관련 된 동물 모델1에서 개별 돌연변이 테스트 하 여 확인 되었다. 돌연변이 신호에 그들의 잠재적인 역할 또는 운동 성 또는 그들의 예상된 외부 막 또는 표면 위치 같은 기준에 따라 선정 됐다. Leptospiral의 대부분으로 유전자 인코딩 알 수 없는 함수2의 가상 단백질, 선택 돌연변이 이러한 조건 제한에 따라 소설 leptospiral 독성 유전자를 발견 하는 능력.
더 최근에, L. interrogans transposon 돌연변이의 풀 infectivity 햄스터와 마우스 모델3에 대 한 상영 했다. 각 동물 수영장 최대 10 돌연변이에 전했다. 돌연변이의 infectivity 문화의 혈액과 신장에서 얻은 PCR에 의해 검색 된 경우 긍정적으로 득점 했다. 수영장에서 각 돌연변이 대 한 개별 PCR 반응 필요 하기 때문에 PCR 테스트 하는 것은 힘 드는. 문화에 각 돌연변이의 주파수는 계량 하지, 때문에 접근 했다 높은 감쇠 돌연변이의 id 쪽으로 치우친 다.
(테네시-Seq) 기법, 독성 유전자에 대 한 화면을 보다 효율적으로 하는 전략으로 시퀀싱 하는 transposon을 설명 합니다. 대규모 병렬 시퀀싱4,,56다음 transposon mutagenesis에 의해 돌연변이의 도서관의 창조 테네시-seq에 의하여 이루어져 있었다. 간단히, transposon 돌연변이 풀링된, 동물에 주사 고 나중 다른 장기 (출력 풀)에서 복구. 출력 풀에서 DNA 추출 및 금지 효소로 소화 또는 쥡니다에 의해 전단. 2 라운드 PCR transposon 삽입 사이트의 접속을 대상으로 수행 됩니다. 이 단계는 시퀀싱에 필요한 어댑터의 추가 수 있습니다. 결과 PCR 제품의 그들의 관계 되는 풍부, 돌연변이의 수영장의 초기 구성에 비해 함께 수영장의 각 돌연변이 transposon 삽입 사이트를 식별 하려면 높은 처리량 연속 분석 된다.
이 방법의 주요 장점은 많은 동물의 작은 수로 돌연변이 동시에 화면을 기능입니다. 테네시-Seq 새로운 Leptospira발견의 기회를 증가 하는 transposon 삽입 사이트의 사전 지식이 필요 하지 않습니다-특정 유전자 독성에 더 적은 시간 및 더 큰 효율성과 관련된. 설치류 모델에 치명적인 감염 감염 조직에 leptospiral 부담에서 상대적으로 높기 때문에 (일반적으로 104 조직의 108 박테리아/g)7,,89 또한 저수지 호스트 에서 10,11, 조직 문화, 생체 외에서 성장으로 인해 편견을 줄일 필요 없이 직접 분석 될 수 있다.
테네시-Seq 날짜를 설명 하는 대부분 세균성 병원 체 연구, insertional mutagenesis의 높은 주파수 통칭 데 모든 유전자4 내 여러 긴밀 한-간격 transposon 삽입 돌연변이 포함 하는 큰 풀과 감염을 허용 ,12,,1314. 또한 테네시-Seq는 mutagenesis 주파수는 훨씬 낮은6박테리아에 대 한 개발 되었습니다. Leptospira, 함께 transposon 돌연변이의 라이브러리 활용 설명 된 대로 Slamti 외15여 의해 transposon mobilizable 플라스 미드에 도입 하 여 생성할 수 있습니다. 그러나, L. interrogans 의 transposon mutagenesis의 주파수가 낮습니다. Transconjugant 주파수만 8.5 받는 당 10-8 x L. interrogans16 라이 긴장으로 세포와 될 것입니다 알려졌다 Himar1 transposon conjugative 플라스 미드에 도입 되었다, L. interrogans의 대부분 다른 종자와 마찬가지로 가난한 사람 여기에 설명 된 프로토콜 보렐 리아 burgdorferi는 transposon insertional mutagenesis의 주파수는 또한 낮은6에 대 한 개발에 기반 하는 부분 이다.
프로토콜17우리의 파일럿 실험에 대 한 낮은 함께 피로 transposon 삽입 돌연변이 고립 시키는에 다른 그룹의 성공 때문에 L. interrogans serovar Manilae 긴장 L495와 transposon mutagenesis 실시 LD50 (치명적인 복용량) 독성1. 우리 테네시-Seq에 의해 42 돌연변이 검사 하 고 여러 돌연변이 후보 후보 adenylate 있고 유전자에서 2 삽입을 포함 한 독성에 결함을 발견. 햄스터에 두 돌연변이의 개별 테스트 그들이 결핍 독성17에 확인.
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Protocol
주의: Leptospira 종의 병원 성 긴장 Biosafety 수준 2 (BSL-2) 견제 절차에 따라 처리 되어야 합니다. 적절 한 개인 보호 장비 (PPE)를 착용 해야 합니다. 캐비닛 클래스 II biosafety 병원 성 Leptospira 종의 모든 조작에 대 한 사용 해야 합니다.
1. 창조는 Transposon의 돌연변이 도서관15
-
활용 하 여 Leptospira spp. 에 transposon의 전송 (그림 1)
- Ellinghausen-맥-존슨-해리스 중간 (EMJH)18,19의 10 mL로 107 셀에 해당 하는 병원 성 Leptospira 종의 지 수 단계 문화의 예방 떨고 밀도 108 셀/mL x 2-8에 도달할 때까지 150 rpm으로 30 ° C에서 품 어.
참고: 병원 성 leptospires의 2 배 시간 변형에 따라 12 ~ 24 h입니다. - 5 mL Luria 국물 (파운드)의 하 0.3 m m 2, 6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µ g/mL의 보충으로 mobilizable transposon 플라스 미드 (pCjTKS2)16 을 들고 기증자 대장균 긴장 β216320 의 50 µ L를 접종 대 (Km), 그리고 spectinomycin (Spc)와 255 rpm에서 37 ° C 배양 기에서 하룻밤의 50 µ g/mL.
- DAP (EMJH + DAP)의 0.3 m m로 보완 하는 EMJH의 3 mL에 대장균 세포의 60 µ L을 접종. OD600nm≈ 0.3까지 3-4 h 255 rpm 동요에서 37 ° C에서 품 어.
- 여과 장치 (그림 1)를, 125 mL 사이드-팔 삼각 플라스 크에 기지를 배치, 초 산 셀 룰 로스 필터 위치 (기 공 크기 0.1 m m, 직경 25 mm) 베이스, 클램프 베이스에 퍼 널에. 진공 시스템에 여과 장치를 연결 합니다.
- Leptospira spp의 5 mL를 추가 합니다. 문화와 0.5 mL의 깔때기로 대장균 문화. 진공 필터를 통해 액체입니다.
- EMJH + DAPplate에 향하도록 하는 박테리아의 표면으로 필터를 전송 합니다. 품 어 30 ° C에서 하룻밤 향하도록 필터.
- EMJH 및 10에 대 한 소용돌이의 1 mL를 포함 하는 15 mL 튜브에 필터를 배치 미디어에 박테리아를 릴리스 s. 5 EMJH platescontaining 50 µ g/mL의 10-15 1 m m 메 마른 유리 구슬 또는 멸 균 일회용 분산기를 사용 하 여 Km에 서 스 펜 션의 200 µ L를 확산. Parafilm으로 접시를 포장 하 고 식민지가 표시 될 때까지 3 ~ 4 주 동안 그들을 거꾸로 30 ° C에서 품 어.
- 7 ~ 10 일 문화 ≈ 10의 밀도 도달할 때까지 교 반 150 rpm에서 30 ° C에서 50 µ g/mL Km (EMJH + 킬로미터)를 포함 하는 EMJH의 3 mL에 개별적으로 식민지를 전송8/mL.
참고:-80 ° C에 또는 액체 질소 (4% 글리세롤)과 문화를 저장할 수 있습니다.
- Ellinghausen-맥-존슨-해리스 중간 (EMJH)18,19의 10 mL로 107 셀에 해당 하는 병원 성 Leptospira 종의 지 수 단계 문화의 예방 떨고 밀도 108 셀/mL x 2-8에 도달할 때까지 150 rpm으로 30 ° C에서 품 어.
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중첩된 PCR에 의해 transposon 삽입 사이트의 식별 (그림 2)
- 15 분 동안 95 ° C에 외피에 의해 PCR 튜브에 각 transposon 돌연변이의 50 µ L를 lyse.
참고: DNA 수 수 정화 대신, DNA 추출 키트를 사용 하 여. - 표 1에 따라 Deg1와 Tnk1 뇌관 (표 3) PCR 혼합을 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 믹스의 23.7 µ L를 전송 하 고 lysed 세포의 1.3 µ L를 추가 합니다. 프로그램을 실행: 95 ° C 5 분; 40 주기: 95 ° C 15 초, 1 분, 2 분; 72 ° C에 40 ° C 10 분 동안 72 ° C입니다.
- 표 2에 따라 태그와 TnkN1 뇌관 (표 3) PCR 혼합을 확인 합니다. 각 PCR 튜브에 믹스의 24.2 µ L를 전송 하 고 PCR #1 반응의 0.8 µ L를 추가 합니다. 프로그램을 실행: 95 ° C 5 분; 35 주기: 95 ° C 15에 대 한 s, 55 ° C 30 초, 2 분; 72 ° C 10 분 동안 72 ° C입니다.
- 10-15 V/cm (그림 2B)에 1 X 트리 스-아세테이트-EDTA (태) 버퍼와 함께 1 %agarose 젤에 PCR 제품의 3 µ L를 실행 합니다.
- PCR 정화 키트를 사용 하 여 긍정적인 샘플의 PCR 제품을 정화. 복구 하는 DNA의 농도 극대화 하는 키트에서 허용 하는 최저 볼륨으로 DNA을 elute.
- 생어 시퀀싱 TnkN1 뇌관 (표 3)을 사용 하 여에 대 한 정화 PCR 제품을 보냅니다.
- BLASTN 분석 (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)에 의해 부모의 긴장의 게놈 순서와 결과 시퀀스를 비교 하거나21SpiroScope 데이터베이스 (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) 사용 하 여 삽입 사이트를 식별 합니다.
- 측면에 서 호스트 시퀀스를 단련 하는 뇌관을 사용 하 여 PCR에 의해 transposon의 삽입 사이트를 확인 합니다.
참고:는 transposon 증가 야생-타입 시퀀스의 크기 ≈ 2 kb.
- 15 분 동안 95 ° C에 외피에 의해 PCR 튜브에 각 transposon 돌연변이의 50 µ L를 lyse.
2. 동물 실험 (그림 3)
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Leptospira 돌연변이의 문화
- 107-108 leptospires/mL의 조밀도에 150 rpm 동요에서 30 ° C에서 EMJH + 킬로미터의 10 mL에 각각 개별적으로 선택한 transposon 돌연변이 성장.
- Petroff 하우서 카운터 또는 밀러23에 의해 설명된대로 다크 필드 현미경으로는 leptospires를 계산 합니다.
- 각 문화 EMJH에 동일한 밀도, 예를 들어 106 셀/mL를 희석.
- 입력된 풀 조립, 동일한 볼륨에 희석된 문화 혼합 함께.
참고: loa2217,24 등 알려진된 피트 니스 결함 돌연변이 돌연변이 ligB17,25, 같은 불변된 피트 니스와 함께 추가 하 여 입력된 풀 컨트롤 포함 각각. 돌연변이의 풀 4% 글리세롤-80 ° C에 또는 액체 질소에서로 저장할 수 있습니다.
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도전
참고: 여기서 설명 하는 방법 재향 군인 담당 큰 로스 앤젤레스 기관 동물 관리 및 사용 위원회 (프로토콜 #09018-14)에 의해 승인 되었다.- 인슐린 주사기 U-100 26G x ½"바늘 각 동물에 입력된 풀의 intraperitoneally 1 mL를 주사.
참고: 파일럿 실험 8 동물 입력된 풀, 즉, 106 박테리아 총17의 1 mL와 함께 도전 되었다. 감염 4 일전 안락사에 대 한 진행을 허용 했다. - 입력된 풀의 10 mL를 수집 하 고 3,220 x g. 20 분은 펠 렛을 방해 하지 않고 신중 하 게 제거 하는 상쾌한 대 한 스핀. -80˚C에서 셀 펠 릿 사용 (단계 3.1.3)까지 저장 합니다.
- 그들은 미리 정해진된 끝점에서 종료 됩니다 때까지 동물을 매일 모니터링 합니다. 햄스터를 매일 체중을 끝점 기준: 식욕, 걸음 걸이 또는 호흡 곤란, 의식, 뻗 치고 모피, 또는 달성 하는 최대 중량의 > 10%의 손실.
- 인슐린 주사기 U-100 26G x ½"바늘 각 동물에 입력된 풀의 intraperitoneally 1 mL를 주사.
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생체 외에서 실험
- 도전의 날 3 플라스 크의 입력된 풀의 5 mL와 EMJH + 킬로미터의 25 mL 접종. 150 rpm 동요에서 30 ° C에서 문화를 성장.
- 2.1.2 섹션의 방법 중 하나를 사용 하 여 매일은 leptospires를 계산 합니다. 밀도 ≈ 1 x 108/mL에 도달 하면, 각 정지 3,220 x g에서 20 분 동안 아래로 회전 합니다.
- 사용까지-80 ° C에서 셀 펠 릿을 저장 합니다.
-
수확 및 저장 조직
- 뒤에 양자 thoracotomy26isoflurane 흡입에 의해 동물을 안락사.
- 즉시 3 mL 주사기와 바늘 25G x 5/8"심장 펑크에 의해 혈액의 1 ~ 2 mL를 수집 합니다. EDTA를 포함 하는 튜브로 혈액을 전송 합니다. 반전에 의해 혼합 5 ~ 6 배.
- Cryotubes에 간 복 부 중간 엽의 ½를 한 신장과 ⅓를 수집 합니다.
- 조직-80 ° C에서 사용까지 저장 합니다.
3. 높은 처리량 시퀀싱 (그림 4)에 대 한 게놈 라이브러리의 건설
-
DNA 추출
- 혈액 으로부터 DNA 추출입니다.
- Microcentrifuge 튜브에 EDTA 튜브에서 혈액의 100 µ L를 전송.
- DNA 추출 키트를 사용 하 여 DNA를 정화. 제조업체의 지침을 따릅니다.
- 조직에서 DNA 추출입니다.
- Scalpels와가 위를 사용 하, 작은 조각 (1 m m x 1 m m),으로 각 장기의 50 ~ 80 밀리 그램 사이 주사위 고 나사 모자 살 균 건조 관으로 그들을 전송. 정밀 밸런스와 티슈의 무게를 측정 합니다.
- 튜브에 살 균 PBS의 500 µ L를 추가 합니다.
- 초당 5 움직임에서 1 분 동안에 방해를 사용 하 여 샘플을 균질.
- 다음 수식을 사용 하 여 조직의 25 밀리 그램에 해당 하는 볼륨을 계산:
- DNA 추출 키트로 계산된 볼륨을 전송. 제조업체의 지침에 따라 DNA 정화와 함께 진행 합니다.
- 입력된 풀 및 생체 외에서 문화에서 DNA 추출.
- 세균성 알 약 5-10 분 동안 실 온에서 녹여
- DNA 추출 키트와 함께 제공 되는 지침에 따라 진행 합니다.
- 사용까지-80 ° C에서의 저장소 DNA
- 혈액 으로부터 DNA 추출입니다.
-
DNA를 기울이기 (그림 5)
- Microcentrifuge 1.5 mL 튜브에 추출 된 DNA의 50 µ L를 전송 합니다.
- 차가운 물 (4 ° C)로 가득 sonicator 컵 경적의 랙 튜브를 놓습니다.
- 10 80% 강도로 3 분 sonicator 실행 펄스 및 5의 펄스에서 s.
주의: 귀 머프 또는 귀 플러그 청력 보호를 착용 하십시오. - 전단의 2.5 µ L을 실행 DNA의 대부분을 확인 하는 2 %agarose 젤에 DNA는 < 600 bp 크기.
-
C-꼬리의 추가
- 작은 볼륨 분 광 광도 계와 DNA 농도 측정 합니다.
- 500 해당 볼륨 계산 다음과 같은 방정식을 사용 하 여 DNA의 ng:
- 미행 반응 (표 4)을 준비 합니다. 37 ° C에서 1 시간을 품 어 20 분 동안 75 ° C에 비활성화.
참고: 14.5 µ L 보다 큰 볼륨을 조정 해야 하는 샘플에 대 한 40 µ L에 대 한 반응의 최종 볼륨을 증가 하 고 그에 따라 나머지 구성 요소를 확장. - PCR 정화 키트와 함께 샘플을 청소. 차입 버퍼의 12 µ L로 DNA elute
-
중첩된 한 PCR
- PCR #1
- 테이블 3 및 5PCR 믹스를 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 라이브러리 믹스의 22 µ L를 전송 하 고 순화 된 DNA의 3 µ L를 추가 합니다. 마찬가지로 컨트롤 믹스와 함께 진행 합니다.
참고: 뇌관 TnkN317 는 transposon 및 뇌관 olj3766 는 C-꼬리. 제어 믹스 TnkN3 뇌관, 특히 표적으로 transposon 부족 이다. - 다음 프로그램 실행: 95 ° C 2 분; 24 주기: 95 ° C 30에 대 한 s, 60 ° C 30 초, 2 분; 72 ° C 2 분 동안 72 ° C입니다.
- 테이블 3 및 5PCR 믹스를 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 라이브러리 믹스의 22 µ L를 전송 하 고 순화 된 DNA의 3 µ L를 추가 합니다. 마찬가지로 컨트롤 믹스와 함께 진행 합니다.
- PCR # 2입니다.
- 테이블 3 및 6에 따라 두 번째 PCR 믹스를 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 라이브러리 믹스의 49 µ L를 전송 하 고 PCR #1 라이브러리 반응의 1 µ L를 추가 합니다. 각 PCR 관을 제어 믹스의 24.5 µ L를 전송 하 고 PCR #1 컨트롤 반응의 0.5 µ L를 추가 합니다.
참고: 뇌관 pMargent2는 transposon, 그리고 IP 뇌관6 포함 6-기지-쌍 바코드 및 특정 시퀀스 다음-세대 시퀀싱 플랫폼에 의해 인식. - 다음 프로그램 실행: 95 ° C 2 분; 18 주기: 95 ° C 30에 대 한 s, 60 ° C 30 초, 2 분; 72 ° C 2 분 동안 72 ° C입니다.
- 테이블 3 및 6에 따라 두 번째 PCR 믹스를 준비 합니다. 각 PCR 튜브에 라이브러리 믹스의 49 µ L를 전송 하 고 PCR #1 라이브러리 반응의 1 µ L를 추가 합니다. 각 PCR 관을 제어 믹스의 24.5 µ L를 전송 하 고 PCR #1 컨트롤 반응의 0.5 µ L를 추가 합니다.
- 2 %agarose 젤에서 3 µ L를 실행 합니다. 라이브러리는 대부분 200 ~ 600 사이 신호의 얼룩 표시 해야 혈압 (그림 6)과 제어 반응에 대 한 아무 증폭.
- PCR #1
-
PCR 제품의 정화입니다.
참고: 제조업체의 지침에 따라 PCR 정화 키트를 게놈 라이브러리를 청소 합니다. 차입 버퍼의 30 µ L로 DNA elute - DNA 농도 fluorometer를 사용 하 여 측정 합니다. 평균 2 ~ 3 읽습니다.
- 각 도서관에 15 또는 20 ng 아래 수식을 사용 하 여 해당 볼륨을 계산:
-
모든 라이브러리 이전 계산에 따르면 함께 혼합. 다음 웹 사이트의 방정식으로 DNA의 어 금 니 농도를 결정 합니다.
http://www.molbiol.edu.ru/eng/scripts/01_07.html
주의: DNA 농도 및 볼륨 요구 사항을 시퀀싱 플랫폼에 따라 달라 집니다.
4. 높은 처리량 시퀀싱 및 데이터 분석
- 시퀀싱
- 사용자 지정 연속 뇌관 pMargent3 표준 상업 시퀀싱 뇌관을 사용 하 여 64 bp 일자형 읽기로 라이브러리를 시퀀스. 시퀀싱 플랫폼 모든 시퀀싱 읽기와 FastQ 파일을 제공 합니다.
- 분석은 소프트웨어와 함께
- 게놈 시퀀스 파일 다운로드
- SpiroScope 데이터베이스 홈페이지에서 (단계 1.2.7 링크 참조), 실험을 위해 사용 하는 유기 체를 선택 하 고 "게놈 브라우저에 로드"를 클릭 합니다.
- (홈페이지 상단) 도구 모음에서 선택 "검색/내보내기 > 데이터 다운로드", "시퀀스 (fasta)" 줄에서 "게놈" 시퀀스를 다운로드를 클릭 합니다.
- 메모장 (PC) 나 텍스트 편집기 (Mac) 파일을 열고 염색체 (예: "기독교")의 이름을 변경 합니다. Fasta 포맷을 유지 한다.
- 염색체 II의 순서를 다운로드 하려면 동일한 단계를 따릅니다. 복사 및 붙여넣기 하 여 단일.txt 파일로 두 염색체 시퀀스를 결합 합니다.
참고: 염색체 시퀀스 수 NCBI 웹사이트 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov)에서 다운로드할 수 있으며 단일.txt 파일에 결합.
- 서버에 파일 업로드
참고:은 오픈 소스, 데이터 집중 생물 정보학 워크플로27,,2829,30 를 관리 하기 위한 웹 기반 플랫폼 이며, https://usegalaxy.org/에 액세스할 수 있습니다.- 도구 메뉴에서 선택 "데이터 > 당신의 컴퓨터에서 파일을 업로드". 드래그 드롭 창으로 시퀀싱 플랫폼에서 생성 된.fastq 파일 다음 클릭 "시작".
- Leptospira 게놈 시퀀스.txt 파일을 업로드 하려면 동일한 단계를 따릅니다.
- 신랑이 읽습니다.
- 선택 "NGS: QC 및 조작 > FASTQ Groomer" 도구 메뉴에서.
- 신랑을 파일, 다음 단계 4.2.2에서에서 업로드 라이브러리를 선택 합니다. 입력 FASTQ 품질 점수 형식에서 적절 한 시퀀싱 시스템을 선택 합니다. 고급 옵션에 대 한 선택 숨기기 고급 사무실을 떠나.
- "실행"을 클릭 합니다.
- 제거 시퀀싱
- 선택 "NGS: QC 및 조작 > 시퀀싱 제거". 필터링 할 라이브러리 옆 4.2.3 단계에서 생성 된 단정한 파일을 선택 합니다. "실행"을 클릭 합니다.
- C-꼬리 시퀀스를 제거
참고: 모든 C-꼬리를 보장 하기 위해 한 두 번이 단계는 제거를 반복 합니다.- 선택 "NGS: QC 및 조작 > 어댑터 시퀀스 클립".
- 선택 하거나 다음을 입력 합니다.
도서관 클립: 4.2.4 단계에서 생성 된 파일을 선택 합니다.
최소 시퀀스 길이: 15
사용자 지정 시퀀스를 입력 하는 소스:
사용자 지정 클리핑 시퀀스: CCCCCCC
0이 아닌 값을 어댑터 시퀀스와 그것을 따르는 x 기지 유지 입력: 0
알 수 없는 (N) 기지와 시퀀스를 무시: 예
출력 옵션: 잘린 및 비 클립 시퀀스를 출력 - "실행"을 클릭 합니다.
- 어댑터 시퀀스를 제거
- 선택 "NGS: QC 및 조작 > 어댑터 시퀀스 클립".
- 선택 하거나 다음을 입력 합니다.
- 도서관 클립: 4.2.5 단계에서 생성 된 파일을 선택 합니다.
- 최소 시퀀스 길이: 15
- 사용자 지정 시퀀스를 입력 하는 소스:
- 사용자 지정 클리핑 시퀀스 입력: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
- 0이 아닌 값을 어댑터 시퀀스와 그것을 따르는 x 기지 유지 입력: 0
- 알 수 없는 (N) 기지와 시퀀스를 무시: 예
- 출력 옵션: 잘린 및 비 클립 시퀀스를 출력
- "실행"을 클릭 합니다.
- 그들의 품질에 따라 필터 읽기
- 선택 "NGS: QC 및 조작 > 품질 필터".
참고:이 도구는 품질 평가 점수에 따라 읽기를 선택 합니다. - 다음을 선택 합니다.
필터링 할 라이브러리: 4.2.6 단계에서 생성 된 파일을 선택 합니다.
품질 컷오프 값: 20
질 해야 하는 순서로 기지의 % 동등 하/보다 높은 커트 오프 가치: 95 - "실행"을 클릭 합니다.
참고: 이러한 설정을 사용 하 여 읽기 20 뉴클레오티드 또는 20의 품질 평가 점수와 함께 짧은 이하의 사이클의 95%는 삭제 됩니다. 적응 실험을 엄중 설정.
- 선택 "NGS: QC 및 조작 > 품질 필터".
- 읽기32 지도
- 선택 "NGS: 매핑 > Bowtie2"32.
- 주 창에서 필드에서 다음을 선택 합니다.
이 단일 또는 결합 라이브러리: 일자형
FASTQ 파일: 라이브러리 4.2.7 단계에서 품질에 대 한 필터링을 선택 합니다.
별도의 파일 (fastq 형식)에 정렬 되지 않은 읽기 쓰기: 없음
파일을 정렬된 (fastq 형식)에서 읽기 쓰기: 없음
당신의 역사에서 참조 게놈을 선택 것입니다 하거나 내장 된 인덱스를 사용 하 여?: 역사에서 게놈을 사용 하 고 인덱스 작성
선택 참조 게놈: Leptospira genome.txt 파일 업로드 단계 4.2.2에서에서 선택.
설정 그룹 정보를 읽을?: 설정 하지 마십시오
선택 분석 모드: 1: 기본만 설정
프리셋을 사용 하 시겠습니까?: 아니, 그냥 기본값 사용
역사에 bowtie2 매핑 통계를 저장: 없음
리소스 매개 변수 작업: 기본 작업 리소스 매개 변수를 사용 하 여 - 게놈에 정렬 하려면 "실행"을 클릭 합니다.
- 파일 변환
- 선택 "NGS: SAMtools > BAM 샘 샘 BAM 변환".
- 다음을 선택 합니다.
BAM 파일 변환: 선택 매핑된 단계의 4.2.8 라이브러리.
헤더 옵션: 헤더 샘 출력에 포함 (-h) - "실행"을 클릭 합니다.
- 파일 변환
- 선택 "NGS: SAMtools > 간격 샘 변환".
- 다음을 선택 합니다.
변환할 데이터 집합 선택: 4.2.9 단계에서 생성 된 샘 매핑된 라이브러리 파일을 선택.
모두 인쇄?: 네 - "실행"을 클릭 합니다.
- 정렬 읽기
- 선택 "필터 및 정렬 > 오름차순 또는 내림차순으로 데이터 정렬".
- 다음을 선택 합니다.
데이터 집합 정렬: 4.2.10 단계에서 생성 된 간격 파일 선택.
열: 2
맛: 순서
에 다: 오름차순 - "실행"을 클릭 합니다.
- 일치 하는 염색체 읽기 선택 난
- 선택 "필터 및 정렬 > 식과 일치 하는 라인을 선택".
- 다음을 선택 합니다.
라인 선택: 정렬 된 읽기 단계 4.2.11에서에서 생성 된 파일 선택.
그: 일치
패턴: 단계 4.2.1.3 (예를 들어, "기독교")에서으로 내가 결정 하는 염색체의 이름 입력. - "실행"을 클릭 합니다.
- 일치 하는 염색체 II 선택 읽기
4.2.12 단계 진행 합니다. - 그룹은 염색체에 삽입 사이트에 읽고 내가
- 선택 "조인, 빼기와 그룹 > 데이터 열으로 그룹화 하 고 다른 열에 집계 작업을 수행".
- 다음을 선택 합니다.
데이터 선택: 단계 4.2.12에서에서 결과 파일 선택.
그룹 열: 2
그룹화 하는 동안 소문자 무시?: 없음
이 문자로 시작 하는 줄을 무시: Ø
작업 > 작업 삽입 +
종류: 수
열: 2
가장 가까운 정수로 결과 라운드: 없음 - "실행"을 클릭 합니다.
- 그룹 II 염색체에 삽입 사이트에 따르면 읽습니다.
4.2.14 단계 진행 합니다. - 정렬 삽입 사이트 염색체에 나
- 선택 "필터 및 정렬 > 오름차순 또는 내림차순으로 데이터 정렬".
- 다음을 선택 합니다.
데이터 집합 정렬: 4.2.14 단계에서 파일을 선택 합니다.
열: 1
맛: 순서
에 다: 오름차순 - "실행"을 클릭 합니다.
- 염색체 2 차 정렬 삽입 사이트
4.2.16 단계 진행 합니다.
- 게놈 시퀀스 파일 다운로드
- 통계 분석
- 복사 및 붙여넣기 단계 4.2.16에서에서 두 개의 열으로 스프레드시트 파일은 데이터를 전송. 그리고 4.2.17입니다. 으로 하는 Excel 파일.
참고: 첫 번째 열은 transposon 삽입 사이트의 뉴클레오티드 좌표 하 고 두 번째 열은 각 삽입 사이트에서 읽기 수 있습니다. - 은닉 transposon 테이블에 제공 된 뉴클레오티드 좌표를 사용 하 여 유전자를 식별 합니다.
참고: 예를 들어 뉴클레오티드 #30718 염색체에 삽입 하는 transposon 나는 걸쳐 뉴클레오티드 29263 31539에 염색체, LIC10024 유전자에 있는 나. - 각 조직에와 아래 방정식에 따라 입력된 수영장에서 각 돌연변이 대 한 상대 주파수 (F)을 계산.
- 각 돌연변이 아래 수식을 사용 하 여 조직에 대 한 입력/출력 비율 (R)을 계산.
- Wilcoxon 서명 순위 테스트
- 1.0 각 동물의 각 조직에 대 한 평균 비율을 설정 하 여 모든 입력/출력 비율을 정상화. 1.0의 비율은 중립, > 1.0은 불리 한, 그리고 < 1.0은 유리한33.
- P 값으로 Wilcoxon 순위 테스트를 사용 하 여 1.0 (중립 피트 니스) 입력/출력 비율을 비교 < 0.05 통계적으로 유의 한 것으로 간주.
- 복사 및 붙여넣기 단계 4.2.16에서에서 두 개의 열으로 스프레드시트 파일은 데이터를 전송. 그리고 4.2.17입니다. 으로 하는 Excel 파일.
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Representative Results
그림 1에서 보듯이 transposon 돌연변이 L. interrogans 에 활용 하 여 도서관의 창조 여과 장치를 요구 한다. 우리는 각 짝짓기에서 100-200 transconjugants를 복구.
Transposon 삽입 사이트는 transposon의 끝을 대상으로 어느 정도 임의적인 PCR에 의해 생성 된 PCR 제품을 시퀀싱으로 각 돌연변이에 식별 되 고 인접 한 호스트 시퀀스15 (그림 2A). 어느 정도 임의적인 PCR의 결과의 예는 그림 2B에 표시 됩니다. 대부분의 경우에는 지배적인 amplicon 2 차 PCR 태그와 TnkN1의 첫 번째 라운드에 대 한 Deg1 및 Tnk1 뇌관을 사용할 때 관찰 됩니다. 그러나, (pentameric 시퀀스의 낮은 특이성 때문 N10GATAT 3'), Deg1 뇌관의 3' 끝에이 뇌관 leptospiral 게놈에 걸쳐 여러 위치에서 anneal 것입니다. 이 사이트는 transposon 끝 가까이 존재 하는 경우 다중 PCR 제품을 얻을 수 있습니다. 여러 amplicons 생성 되 면 함께 PCR 믹스에서 정화 하 고 수 있습니다 직접; 시퀀싱 그들은 모두 동일한 순서의 하류 TnkN1 뇌관 anneals 포함 됩니다 때문에 각 amplicon의 젤 정화 필요 하지 않습니다. 다른 한편으로, PCR Deg1 뇌관 대상 시퀀스의 가까운 복사는 transposon 끝에서 훌륭한 거리에 위치 하는 경우 실패할 수 있습니다. PCR 제품 검색 되 면 어느 정도 임의적인 PCR의 첫 번째 라운드 Deg1 뇌관 및 Tnk2 뇌관는 transposon의 반대쪽 끝을 대상으로 반복할 수 있습니다. 이 경우에 TnkN2 및 태그 사용 될 것입니다 제 2 차; amplicon TnkN2 뇌관 (그림 2B)와 시퀀싱 될 것 이다. 또는, PCR의 첫 라운드 할 수 있길 2 뇌관, 누구의 3' 끝 (... N10TCTT 3') 5-뉴클레오티드 순서 보다 4-대상. 뇌관의 4 가지 세트 PCR (PCR #1)의 첫 번째 라운드에 사용할 수 있습니다: Tnk1 + Deg1 Tnk1 + 있길 2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + 있길 2. 한 세트의 뇌관을 작동 하지 않을 때 또 다른 세트를 사용 합니다. 이 두 번째도 실패를 설정 하는 경우에 하나를 사용 합니다. 자연 대 저항 돌연변이 매우 드물다 고 주파수에서 발생 하는 < 10-10- 34.
게놈 라이브러리 (그림 4)의 준비, 동안 단계를 확인할 수 있습니다. 쥡니다에 의해 DNA를 기울이기 agarose 젤 (그림 5)에 약 수의 전기 이동 법에 의해 확인 되어야 한다. DNA는 올바르게 전단은, 600 bp에 200에서 배열 하는 DNA 파편 2 %agarose 젤에 얼룩을 형성 한다. 높은 처리량 시퀀싱에 대 한 라이브러리를 보내기 전에 중첩 된 PCR 반응에서 PCR 제품의 세대 agarose 젤 전기 이동 법 (그림 6) 확인 해야 합니다.
연속 읽기 다음 여기에 설명 된 프로토콜 (단원 4.2)를 처리 한 후 입력된 풀과 모든 조직 각 돌연변이의 주파수는 섹션 4.3.3에서에서 방정식을 사용 하 여 결정 됩니다. 각 조직에 각 돌연변이 대 한 입력/출력 비율 4.3.4 단원의 방정식으로 계산 됩니다. 그림 7 시퀀스 (Seq) Tn 방식으로 얻은 결과의 예가 나와 있습니다. 또는, 처리 하 고 분석 하는 시퀀싱 데이터 31마젠타 도구를 사용할 수 있습니다. 통계적으로 현저 하 게 감소 및 증가 피트 니스와 돌연변이 확인 되었다. 발생 하는 알려진된 leptospiral 독성 유전자에 있는 돌연변이 피트 니스, 테네시-Seq 접근 유효성 검사 감소.
그림 1: 활용에 사용 되는 여과 단위. 여과 장치 측면 팔 삼각 플라스 크에 필터 지원의 마 개를 삽입 하 여 조립은 베이스에 초 산 셀 룰 로스 필터 살 균 겸 자, 그리고 기지에 퍼 널을 배치 클램프와 시스템 보안 위치 . 여과 장치는 진공 시스템에 다음 연결 됩니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 2: transposon 삽입 사이트의 Id. (A) 체계 반 임의 PCR 뇌관의 어 닐 링 사이트를 보여주는. Tnk1 및 Tnk2 뇌관 anneal transposon (Tn)의 반대 끝에 가까운. Deg1 35 뉴클레오티드 뇌관 뒤에 3' 끝에 시퀀스 GATAT 10 타락 한 뉴클레오티드의 뻗 기를 포함 하는. PCR (PCR #1)의 첫 번째 라운드 Deg1와 Tnk1 또는 Deg1와 함께 진행 되며 각각 transposon 끝 및 Tnk1 및 Tnk2, 사이 anneal Tnk2 TnkN1 및 TnkN2 뇌관, PCR # 2에 대 한 사용. 태그 뇌관의 순서는 Deg1 뇌관의 5' 끝의. Agarose 젤의 (B) 예 14 transposon 돌연변이 (레인 1 ~ 14) 가진 PCR의 두번째 라운드 후 얻은. PCR의 첫 번째 라운드는 Deg1와 Tnk1; 수행 되었다 두 번째 라운드 태그와 함께 끝났다 고 TnkN1. 긍정적인 PCR로 표시 됩니다 "+"와 부정적인 PCR에 의해 "-". "KmR"대 저항 카세트를 나타냅니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 3: 출력 풀을 얻기 위한 플로우 차트. 도전 (0 일)의 날, 각 leptospiral 돌연변이 암시 야 현미경 검사 법에 의해 계산, 동일한 밀도, 희석 이며 입력된 수영장 (세부 섹션 2.1에서에서 제공)를 형성 하기 위하여 결합. 햄스터는 입력 수영장 intraperitoneally 도전입니다. 또한, 3 문화 입력된 수영장으로 시작 했다. 접종 (0 일)의 일과 문화 ≈의 밀도 도달 하는 때에 108/mL, 입력된 수영장 및 문화 원심 분리에 의해 수집 된 있으며 사용 (참조 섹션 2.3)까지-80 ° C에서 펠 릿으로 저장. 끝점 날 (하루는 동물, 예를 들면, 하루 4 도전 후 종료를 미리 선택), 동물 안락사는; 혈액, 신장, 간은 수집 저장 및-80 ° C에서까지 사용 (섹션 2.4 참조). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 4: 게놈 라이브러리 준비의 플로우 차트. (A) DNA 혈액, 조직 또는 문화 섹션 3.1에에서 설명 된 프로토콜을 다음에서 추출 됩니다. 빨간색 상자는 transposon을 (테네시)를 나타냅니다. (B)는 DNA 200, 600 bp 사이 조각으로 쥡니다에 의해 전단입니다. 자세한 내용은 섹션 3.2에에서 제공 됩니다. (C) C-꼬리 (노란색 상자)은 표 4와 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT) 섹션 3.3에에서 설명 된 대로 모든 DNA 조각에 추가 됩니다. 게놈 라이브러리 시퀀싱에 대 한 중첩 된 PCR (D-E)에 의해 준비 된다. PCR의 첫 번째 라운드는 각각는 transposon 및 C-꼬리, TnkN3 및 olj376에 해당 하는 뇌관으로 수행 됩니다. 표 3과 5를 참조 하십시오. 파편만 transposon 끝 (빨간색 상자)을 포함 하는 증폭 된다. 참고: 모든 DNA 파편 C-꼬리를가지고 있기 때문에 TnkN3 보다 3 배 이상 olj376 뇌관을 사용 합니다. PCR의 두번째 라운드는 transposon 끝 및 뇌관을 인덱싱, 모든 샘플 단일 연속 차선에서 다중화를 허용 (분홍색)에 6-기지-쌍 바코드 시퀀스가 포함 된 것에 대 한 특정 pMargent2와 함께 실시 됩니다. 표 3 및 6 참조. 두 뇌관 시퀀스 Illumina (녹색과 보라색 상자)을 시퀀싱 하는 동안 흐름 셀 바인딩에 필요한 포함 되어 있습니다. (F) 결과 PCR 제품, 청소 고 그들의 농도 3.6 절에 설명 된 대로 측정 된다. (G) 모든 게놈 라이브러리 풀링되지 함께; 각 라이브러리에 서로 다른 바코드와 (H) 풀 시퀀싱 플랫폼에 보내집니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 5: DNA의 쥡니다. DNA는 8 감염 된 햄스터 (1 ~ 8 레인), sonicated, 및에서 2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 검사의 간은에서 순화 되었다. 깎인된 DNA는 파편의 대부분의 크기는 200 그리고 600 bp. 사이 얼룩 특징 이다 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 6: 높은 처리량 시퀀싱에 대 한 게놈 라이브러리. 게놈 라이브러리 ested 8 감염 된 햄스터 (1 ~ 8 레인)의 혈액에서 DNA PCR에 의해 준비 하 고에 2 %agarose 젤 전기 이동 법에 의해 검사를 했다. 대부분의 PCR 제품의 크기는 200 사이 고 600bp. 부정적인 제어 (PCR #1 믹스에 없음 TnkN3 뇌관 표 5 참조) 더 증폭 (표시 되지 않음)를 보여줍니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
그림 7: 테네시-Seq 실험에서 돌연변이의 피트 니스. 돌연변이 햄스터의 신장에서의 수영장 휘트니스 도전 (Lourdault의 연구17에서 적응) 후 4 일. 모든 42 돌연변이의 입력/출력 비율 각 동물에 대 한 결정 했다. 각 돌연변이 유전자 (lic) 또는 intergenic 지역으로 명명 (인테르)는 transposon 삽입 또는 이름은 일반적으로 문학에서 사용. 각 비율 블랙 다이아몬드로 표시 됩니다. 비율 (레드 라인)의 중간 각 돌연변이 대 한 결정 되었고 Wilcoxon 순위 테스트를 사용 하 여 1.0에 비해. 점선은 해당 중립 피트 니스 하는 1.0의 적합성을 나타냅니다. 돌연변이 피트 니스는 크게 영향을 별표로 표시 됩니다: * P < 0.05; * * P < 0.01. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.
| 시 약 | 하나의 반응에 대 한 볼륨 |
| 마스터 믹스 2 X | 12.5 Μ L |
| 뇌관 1, 10 m m (TnK1 또는 TnK2) * | 1.2 Μ L |
| 뇌관 2, 10 m m (Deg1 또는 있길 2) * | 1.2 Μ L |
| 물 | 8.8 Μ L |
| 서식 파일 (세포 lysate 또는 DNA) | 1.3 Μ L |
| 마지막 볼륨 | 25 µ L |
| * 표 3에 뇌관 시퀀스입니다. |
표 1: 세미 임의의 PCR #1 믹스 transposon 삽입 사이트의 id.
| 시 약 | 하나의 반응에 대 한 볼륨 |
| 마스터 믹스 2 X | 12.5 Μ L |
| 뇌관 1, 100mm (TnKN1 또는 TnKN2) * | 0.2 Μ L |
| 뇌관 2, 100mm (태그) * | 0.2 Μ L |
| 물 | 10.1 Μ L |
| PCR 제품에서 PCR #1 | 0.8 Μ L |
| 마지막 볼륨 | 25 µ L |
| * 표 3에 뇌관 시퀀스입니다. |
표 2: 세미 임의의 PCR #2 믹스 transposon 삽입 사이트의 id.
| 이름 | 시퀀스 (5'-3') | 참조 | ||||
| 어느 정도 임의적인 PCR에 사용 되는 뇌관 | ||||||
| Tnk1 | CTTGTCATCGTCATCCTTG | 15 | ||||
| Tnk2 | GTGGCTTTATTGATCTTGGG | |||||
| Deg1 | GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT | |||||
| Deg2 | GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT | |||||
| TnkN1 | CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG | |||||
| TnKN2 | TGGGGATCAAGCCTGATTGGG | |||||
| 태그 | GGCCACGCGTCGACTAGTAC | |||||
| 뇌관에 Illumina의 시퀀싱에 대 한 사용 | ||||||
| TnkN3 | CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG | 17 | ||||
| olj376 | GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG | 6 | ||||
| pMargent2 | AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA | |||||
| IP 1 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | Illumina의 시퀀싱 (굵게 바코드) | ||||
| IP 2 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 3 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 4 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 5 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 6 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 7 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 8 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 9 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 10 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 11 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 12 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 13 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 14 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 15 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 16 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 17 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 18 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 19 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 20 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 21 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 22 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 23 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 24 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 25 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 26 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 27 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 28 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP 29 | CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT | |||||
| IP seq | GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC | |||||
| pMargent3 | ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA | 6 | ||||
표 3: 뇌관 시퀀스.
| 시 약 | 하나의 반응에 대 한 볼륨 |
| 깎인된 DNA | 500 ng (3.3.2에서 방정식을 참조 하십시오.) |
| 물 | 최대 14.5 µ L |
| TdT 버퍼 x 5 | 4 Μ L |
| (9.5 m m dCTP + 0.5 m m ddCTP) 믹스 * | 1 Μ L |
| TdT (30 U / µ L) | 0.5 Μ L |
| 마지막 볼륨 | 20 µ L |
| * 믹스 3 µLof 10mm ddCTP 100mm dCTP의 5.7 µ L, 물 51.3 µ L | |
표 4: 터미널 deoxynucleotidyl 전이 효소 (TdT)와 C-미행 반응.
| 시 약 | 하나의 반응에 대 한 볼륨 | |
| 라이브러리 반응 | 컨트롤 반응 | |
| 마스터 믹스 2 x | 12.5 Μ L | 12.5 Μ L |
| 뇌관 1, 30 µ M (TnkN3) * | 0.5 Μ L | - |
| 뇌관 2, 30 µ M (olj376) * | 1.5 Μ L | 1.5 |
| 물 | 7.5 Μ L | 8 Μ L |
| C 꼬리 DNA | 3 Μ L | 3 Μ L |
| 마지막 볼륨 | 25 µ L | 25 µ L |
| * 표 3에 뇌관 시퀀스입니다. | ||
표 5: 건설 게놈 라이브러리, PCR #1 믹스의.
| 시 약 | 하나의 반응에 대 한 볼륨 | |
| 라이브러리 반응 | 컨트롤 반응 | |
| 마스터 믹스 2 x | 25 Μ L | 12.5 Μ L |
| 뇌관 1, 30 µ M (pMargent2) * | 0.5 Μ L | 0.25 Μ L |
| 뇌관 2, 30 µ M (인덱싱 뇌관) * | 0.5 Μ L | 0.25 Μ L |
| 물 | 23 Μ L | 11.5 Μ L |
| PCR 제품에서 PCR #1 | 1 Μ L | 0.5 Μ L |
| 마지막 볼륨 | 50 µ L | 25 µ L |
| * 표 3에 뇌관 시퀀스입니다. | ||
표 6: 건설 게놈 라이브러리, PCR #2 혼합의.
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Discussion
Intraperitoneally 42 L. interrogans 돌연변이 함께 도전 하는 햄스터에 대 한 우리의 파일럿 실험 결과17제공 됩니다, 하지만 우리는 돌연변이의 더 큰 수영장 Tn이 의해 상영 될 수 있습니다 기대 Transconjugants의 주파수는 낮은 때문에 (100-200 transconjugants/짝짓기), 몇몇 matings 큰 Tn-Seq 실험에 대 한 돌연변이의 충분 한 번호를 생성할 필요가 있습니다. 액체 문화에서 돌연변이의 많은 수를 유지 하는 해결 되어야 물류 도전을 선물 한다. 문화 깊은 96 잘 접시에 알을 품을 수 있다. 문화 밀도 420로 설정 하는 분 광 광도 계에 신호는 광학 밀도 의해 모니터링할 수 nm. 사용 하는 동물의 수의 결정 부분에 입력된 풀의 크기에 따라 고 전력 분석에 의해 결정 되어야 합니다. 대규모 실험에 대 한 전력 분석 협의 biostatistician에서 수행 되어야 하는 것이 좋습니다.
병목 현상을 출력 풀에서 무작위 돌연변이의 복구에 영향을 줄 수 있습니다. 비록 심각한 병목 현상을 하지 우리의 파일럿 연구17 (그림 7)에 관찰 했다, 대규모 실험 돌연변이의 임의의 손실에 의해 영향을 받을 수 있습니다. 입력된 풀에서 돌연변이 당 셀의 수를 증가 하 여 도전 복용량을 증가 병목35의 가능성을 최소화 합니다. 새로 게시 된 갤럭시 도구를 마젠타 병목 현상 및 피트 니스31를 평가 하기 위해 필요한 도구를 제공 합니다.
테네시-Seq 실험 긴장, 감염, 다른 Leptospira 의 대체 경로 대 한 계획 또는 다른 설치류 모델 추가 고려 필요. 호스트 종에서 감염의 활동 알려져 있지 않거나 없는 경우 지속적으로 지 수 검사를 각 조직 내에서 감염의 과정, 조직 배양에서 보다는 조직에서 직접 DNA는 얻을 수 한다. 이 추가 단계는 죽은 나 선상 세균에서 DNA의 검출으로 인해 돌연변이 피트 니스의과 대 평가 최소화 됩니다. 출력 풀 조직 배양에서 가져온 경우 입력된 수영장 주소 효과 생체 외에 성장 경작 한다. 또한 좋습니다 파일럿 실험을 병목 현상을 우려 됩니다 여부를 확인 하 고 대규모 실험에 대 한 전력 분석을 원조 하는 돌연변이의 작은 수 있습니다.
테네시-Seq 결정 변경된 적합성의 확인은 개별 돌연변이 동물 모델에서의 테스트 필요 합니다. 현재, 각 돌연변이 테네시-Seq 관심사의 유전자에 삽입을 수행 하는 돌연변이 식별 하기 전에 개별적으로 시퀀싱 될 해야 합니다. 그러나, 병원 성 Leptospira 에 대립 유전자 교체 쉬운 경우, 개별 돌연변이의 연속 이상 필요할 것 이다. 또는 녹음 방송 활성 제 같은 이펙터 L. interrogans36에 lig 유전자 식 감소를 성공적으로 사용 되어 왔습니다. 이 기술은 다운 조절 유전자 돌연변이에 Tn이 식별 하는 변경 된 피트 니스 중단 하는 데 사용할 수 있습니다.
테네시-Seq 데이터를 해석할 때 박테리아 사이의 상호 작용 고려 해야 합니다. 그것은 이론적으로 가능한 피트 니스 감소 돌연변이 보다는 transposon 삽입의 직접적인 영향 사이의 경쟁 때문일 수 있었다. 또한, vivo에서 피트 니스 풀에서 돌연변이의 변화의 부재 돌연변이 사이 협력으로 인해 수 있습니다. 예를 들어 필수 요소를 생산 하지 못하는 돌연변이 수영장에서 다른 돌연변이 의해 요인의 생산에 의해 intercellularly 보완 될 수 있는. 우리는 이상 하지 않은 성장을 위한 필수 살 모 넬 라 enterica37같이 단백질 합성의 대사 감소의 결과 될 수 있는 여러 가지 돌연변이 대 한 적합성에 증가 관찰 했다.
이 프로토콜은 물질 대사 또는 38,39 생체 외에서 스트레스 조건에서 생존에 관련 된 유전자를 식별 하기 위해 사용할 수 있습니다. 예를 들어 높은 염화 나트륨 농도, 한정된 철, 산 성 pH 같은 서로 다른 조건에서 성장 Leptospira 유전자 산 성 생존 또는 스트레스 저항에 대 한 책임을 식별할 수 있는. 이러한 생체 외에서 실험을 수행할 수 있습니다 L. biflexa 긴장 Patoc 등 마저 긴장으로 나이 Tn-Seq 방법에 적용 될 수 있기 때문에 모든 시퀀싱 Leptospira 긴장.
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Disclosures
저자는 공개 없다.
Acknowledgments
이 작품 재향 군인 업무 공로 수상 (D.A.H.)에 의해 지원 되었다 그리고 건강의 국립 연구소는 부여 R01 AI 034431 (D.A.H.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus | Sigma-Aldrich | K4000 | |
| 2,6-diaminopimelic acid | Sigma-Aldrich | D1377 | |
| Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate | Sigma-Aldrich | S4014 | |
| Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser | Zeiss | 490950-001-000 | |
| DNeasy blood and tissue kit | Qiagen | 69504/69506 | |
| MinElute PCR Purification | Qiagen | 28004/28006 | |
| QIAquick PCR purification kit | Qiagen | 28104/28106 | |
| Model 505 Sonic Dismembrator | Fisher Scientific | FB-505 | |
| 2.5" Cup horn | Fisher Scientific | FB-4625 | |
| Bead Ruptor 24 | Omni International | 19-010 | Step 3.1.2.4 |
| Terminal deoxynucleotidyl transferase | Promega | M828C | |
| Master mix Phusion | Thermo Scientific | F531 | Preparation of genomic libraries, step 3.4. |
| DreamTaq Master Mix | Thermo Scientific | K9011/K9012 | Identification of the transposon insertion site, step 1.2. |
| dCTP | Thermo Scientific | R0151 | |
| ddCTP | Affymetrix/ USBProducts | 77112 | |
| T100 Thermal cycler | BioRad | 1861096 | |
| Qubit 2.0 fluorometer | Invitrogen | Q32866 | step 3.6. |
| Qubit dsDNA HS assay kit | Invitrogen | Q32851/Q32854 | step 3.6. |
| Qubit assay tubes | life technologies | Q32856 | step 3.6. |
| PBS pH 7.2 (1X) | Gibco | 20012-027 20012-050 | |
| Disposable scalpel No10 | Feather | 2975#10 | |
| Plastic K2 EDTA 2 ml tubes | BD vacutainer | 367841 | |
| syringe U-100 with 26G x ½” needle | BD vacutainer | 329652 | IP challenge, step 2.2.1. |
| 3 mL Luer-Lok tip syringe | BD vacutainer | 309657 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25G X 5/8” needle | BD vacutainer | 305901 | Cardiac puncture, step 2.4.2. |
| 25 mm fritted glass base with stopper | EMD Millipore | XX1002502 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 25 mm aluminum spring clamp | EMD Millipore | XX1002503 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 15 ml borosilcate glass funnel | EMD Millipore | XX1002514 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| 125 ml side-arm Erlenmeyer flask | EMD Millipore | XX1002505 | Filtration unit system, step 1.1.7. |
| Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) | EMD Millipore | VVLP02500 |
References
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