Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Immunology and Infection

Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de Leptospira interrogans Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442

Summary

Aquí describimos una técnica que combina la mutagénesis de transposon con secuenciación de alto rendimiento para identificar y cuantificar a mutantes de transposon leptoespiral en tejidos después de un desafío de hámsters. Este protocolo puede utilizarse para mutantes de pantalla para la supervivencia y difusión en los animales y también se puede aplicar a estudios en vitro .

Abstract

En este manuscrito, describimos un transposón (Tn-Seq) técnica para identificar y cuantificar a Leptospira interrogans mutantes alterados en gimnasio durante la infección de hámsters sirios dorados de secuenciación. TN-Seq combina mutagénesis de transposon al azar con el poder de la tecnología de secuenciación de alto rendimiento. Los animales se enfrentan con un grupo de mutantes de transposon (entrada piscina), seguido por la recolección de la sangre y los tejidos unos días más tarde para identificar y cuantificar el número de mutantes en cada órgano (piscinas de salida). Las piscinas de salida se comparan con la piscina entrada para evaluar la aptitud en vivo de cada mutante. Este enfoque permite la proyección de un gran número de mutantes en un número limitado de animales. Con pequeñas modificaciones, este protocolo se puede realizar con cualquier modelo animal de la leptospirosis, embalse host modelos como las ratas y la infección aguda como hámsters, así como estudios en vitro . TN-Seq proporciona una poderosa herramienta para pantalla para mutantes con defectos de fitness en vivo y en vitro .

Introduction

Identificación de genes de virulencia de algunas bacterias como Leptospira spp., es difícil debido al número limitado de herramientas genéticas disponibles. Un método comúnmente utilizado es la creación de una colección de mutantes por mutagénesis de transposon al azar seguido de la identificación del sitio de inserción en cada mutante y virulencia pruebas de mutantes de transposon individual en un modelo animal. Este enfoque es lento, costoso y requiere un gran número de animales.

Cuando mutagénesis al azar primero fue desarrollada para el patógeno Leptospira interrogans, genes implicados en virulencia fueron identificados por pruebas individuales mutantes en un modelo animal1. Mutantes se seleccionaron con base en criterios tales como su papel potencial en la señalización o motilidad o su membrana externa prevista o ubicación superficial. Como la mayoría de leptoespiral genes codifican proteínas hipotéticas de función desconocida2, selección de mutantes basan en estos límites de criterio la capacidad para descubrir genes de virulencia leptoespiral novela.

Más recientemente, revisaron las piscinas de mutantes de L. interrogans transposon de infectividad en los modelos de ratón y hámster3. Cada animal fue desafiada con una piscina de hasta 10 mutantes. Infectividad de un mutante lo marcó como positivo si fue detectado por PCR de cultivos obtenidos de sangre y los riñones. Pruebas de PCR fue laborioso, porque requiere una reacción de PCR individual para cada mutante en la piscina. Porque no se cuantificó la frecuencia de cada mutante en las culturas, el enfoque fue parcial hacia la identificación de mutantes altamente atenuadas.

Describimos un transposon secuencia técnica (Tn-Seq), como una estrategia para más eficientemente detectar genes de virulencia. TN-seq consiste en la creación de una biblioteca de mutantes por mutagénesis de transposon seguida de secuenciación masiva en paralelo4,5,6. Brevemente, mutantes de transposon se agruparon inoculados en animales y más tarde recuperados de diferentes órganos (piscinas de salida). El ADN de las piscinas de salida es extraído y digerido con enzimas de restricción o esquilado por sonicación. Se realizan dos rondas de PCR a las uniones de los sitios de inserción de transposones. Este paso permite la adición de los adaptadores necesarios para la secuenciación. Los productos PCR obtenidos son analizados por secuenciación de alto rendimiento para identificar el sitio de inserción del transposón de cada mutante de la piscina junto con su abundancia relativa, que es comparado con la composición inicial de la piscina del mutante.

La principal ventaja de este enfoque es la capacidad de la pantalla al mismo tiempo un gran número de mutantes con un pequeño número de animales. TN-Seq no requiere el conocimiento previo de los sitios de inserción de transposones que aumenta las posibilidades de descubrir nuevas Leptospira-genes específicos implicados en virulencia con menos tiempo y mayor eficiencia. Porque carga leptoespiral en tejidos es relativamente alta en roedores modelos susceptibles a la letal infección (normalmente 104 108 bacterias/g de tejido)7,8,9 , así como anfitriones del depósito 10,11, los tejidos pueden ser analizados directamente sin necesidad de cultivo, reduciendo sesgos debido al crecimiento en vitro .

En los estudios de Tn-Seq con mayoría patógenos bacterianos descritos hasta la fecha, la alta frecuencia de mutagénesis de insertional permite la infección con grandes piscinas que contengan a mutantes colectivamente con inserciones de transposones espaciamiento múltiples dentro de cada gen4 ,12,13,14. TN-Seq también ha sido desarrollado para una bacteria para que la frecuencia de mutagénesis es mucho inferior6. Con Leptospira, una biblioteca de mutantes de transposon puede generarse introduciendo el transposon en un plásmido movilizable por la conjugación de Slamti et al15. Sin embargo, la frecuencia de mutagénesis de transposon de L. interrogans es baja. Cuando el transposon Himar1 fue introducido en un plásmido conjugativos, la frecuencia de transconjugant se informó que solamente 8.5 x 10-8 por receptor de la célula con la cepa Lai de L. interrogans16 y es probable que del mismo modo pobre con más otras cepas de L. interrogans. El protocolo descrito aquí está en parte basado en que se convirtió para Borrelia burgdorferi, en el que la frecuencia de mutagénesis de insertional transposón es también baja6.

Para nuestro experimento piloto con el protocolo17, se realizó mutagénesis de transposon con L. interrogans serovar cepa Manilae L495 debido al éxito de otros grupos en el aislamiento de mutantes de inserción de transposones en la cepa junto con su bajo LD50 (dosis letal) de virulencia1. Se había defendido a 42 mutantes por Tn-Seq y se identificaron a varios candidatos mutantes defectuosos en virulencia, dos de ellos con inserciones en un gen de la adenilato ciclasa de candidato. Prueba individual de los dos mutantes en hámsteres confirmó que eran deficientes en virulencia17.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

PRECAUCIÓN: Las cepas patógenas de Leptospira spp deben manipularse bajo procedimientos de contención de bioseguridad nivel 2 (BSL-2). Debe llevarse equipo de protección personal (EPP). Un gabinete de bioseguridad clase II debe ser utilizado para todas las manipulaciones de patógena Leptospira spp.

1. creación de los transposones mutante biblioteca15

  1. Transferencia de los transposones en Leptospira spp. por conjugación (figura 1)
    1. Inocular un volumen de la fase exponencial cultura de spp de Leptospira patógena correspondiente a 107 células en 10 mL de Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris (EMJH) medio18,19. Incubar a 30 ° C con 150 rpm agitación hasta que la densidad llega a 2-8 x 108 células/mL.
      Nota: El tiempo de duplicación de leptospiras patógenas es 12 a 24 h, dependiendo de la cepa.
    2. Inoculan 50 μl del donante Escherichia coli cepa β216320 llevar el transposon movilizable plasmid (pCjTKS2)16 en 5 mL de caldo Luria (LB) suplementado con 0.3 mM de 2, 6-diaminopimelicacid (DAP), 50 μg/mL de kanamicina (Km) y 50 μg/mL de espectinomicina (Spc) y lugar durante la noche en una incubadora de 37 ° C a 255 rpm.
    3. Inocular 60 μL de células de e. coli en 3 mL de EMJH suplementado con 0.3m m de DAP (EMJH + DAP). Incubar a 37 ° C en agitación 255 rpm durante 3-4 h hasta un OD600 nm≈ 0.3.
    4. Para montar la unidad de filtración (figura 1), coloque la base en un brazo-lateral 125 mL matraz Erlenmeyer, colocar un filtro de acetato-celulosa (tamaño de poro 0,1 mm, diámetro 25 mm) en la base y el embudo en la base. Conecte la unidad de filtración a un sistema de vacío.
    5. Añadir 5 mL de Leptospira spp. cultura y 0,5 mL de cultivo de e. coli en el embudo. Aspire el líquido a través del filtro.
    6. Transferir el filtro con la superficie de las bacterias hacia arriba en un EMJH + DAPplate. Incubar a 30 ° C durante la noche con el filtro hacia arriba.
    7. Coloque el filtro en un tubo de 15 mL que contiene 1 mL de EMJH y de vortex por 10 s para liberar las bacterias en los medios de comunicación. Extensión 200 μL de la suspensión en 5 EMJH platescontaining 50 μg/mL de Km con 10-15 perlas de vidrio estéril de 1 mm o un separador desechable estéril. Envuelva las placas con parafilm e incúbelos invertida a 30 ° C durante 3 a 4 semanas hasta que las colonias sean visibles.
    8. Transferencia de colonias individualmente en 3 mL de EMJH 50 μg/ml de Km (EMJH + Km) a 30° C bajo agitación de 150 rpm durante 7 a 10 días hasta que la cultura alcance una densidad de ≈ 108/ml.
      Nota: Las culturas pueden almacenarse a-80 ° C o en nitrógeno líquido (con 4% de glicerol).
  2. Identificación del sitio de inserción de transposones por PCR anidada (figura 2)
    1. Lisan 50 μl de cada mutante de transposon en tubos de PCR por la incubación a 95 ° C durante 15 minutos.
      Nota: ADN puede purificarse en su lugar, utilizando un kit de extracción de ADN.
    2. Preparar la mezcla PCR con iniciadores Deg1 y Tnk1 (tabla 3) según tabla 1. Transferencia de 23,7 μl de la mezcla a cada tubo PCR y agregar 1,3 μl de células sometidas a lisis. Ejecute el programa: 95° C por 5 min; 40 ciclos: 95 ° C por 15 s, 40 ° C por 1 min, 72 ° C por 2 min; 72 ° C durante 10 minutos.
    3. Hacer la mezcla PCR con iniciadores de etiqueta y TnkN1 (tabla 3) según tabla 2. Transferencia 24.2 μl de la mezcla a cada tubo PCR y añadir 0,8 μl de reacción de PCR #1. Ejecute el programa: 95 ° C por 5 min; 35 ciclos de: 95 ° C por 15 s, 55 ° C por 30 s, 72 ° C por 2 min; 72 ° C durante 10 minutos.
    4. Ejecutar 3 μl de los productos PCR en un gel de agarosa 1% con 1 Tampón X Tris-acetato-EDTA (TAE) en 10-15 V/cm (figura 2B).
    5. Purificar productos PCR de muestras positivas con el equipo de purificación PCR. Eluir el ADN con el volumen más bajo permitido por el kit para maximizar la concentración de ADN recuperado.
    6. Envíe productos PCR purificados para Sanger secuenciación utilizando la cartilla de TnkN1 (tabla 3).
    7. Identificar los sitios de inserción comparando la secuencia resultante con la secuencia del genoma de la cepa parental por análisis BLASTN (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) o usando la base de datos (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage) SpiroScope del21.
    8. Confirmar el sitio de inserción del transposón por PCR usando las cartillas recocido a las secuencias que flanquean de host.
      Nota: El transposón aumenta el tamaño de la secuencia wild type ≈ 2 kb.

2. animal experimento (figura 3)

  1. Cultivo de Leptospira mutantes
    1. Crecer a individualmente cada mutante del transposon seleccionada en 10 mL de EMJH + Km a 30 ° C en agitación de 150 rpm a una densidad de7-10 108 leptospiras/mL.
    2. Cuenta las leptospiras por microscopia de campo oscuro con un contador de Petroff-Hausser o descrito por Miller23.
    3. Diluir cada cultura en EMJH para la misma densidad, por ejemplo 106 células/mL.
    4. Para montar la piscina entrada, mezclar las culturas diluidas en volúmenes iguales.
      Nota: Incluir controles en la entrada piscina añadiendo mutantes con defectos de aptitud conocida como loa2217,24 y mutantes con aptitud inalterado como ligB17,25, respectivamente. Piscinas de mutantes pueden almacenarse con 4% de glicerol a-80 ° C o en nitrógeno líquido.
  2. Desafío
    Nota: Los métodos descritos aquí fueron aprobados por los veteranos asuntos mayor Los Ángeles institucional Animal cuidado y uso (protocolo #09018-14).
    1. Inyectar por vía intraperitoneal de 1 mL de la piscina entrada a cada animal con una jeringa de insulina U-100 con aguja 26 x ½".
      Nota: En el experimento piloto, 8 animales fueron desafiados con 1 mL de la piscina de entrada, es decir, 106 bacterias total17. La infección fue permitida proceder durante 4 días antes de la eutanasia.
    2. Recoger 10 mL de la piscina entrada y vuelta por 20 min a x 3.220 g. eliminar cuidadosamente el sobrenadante sin perturbar el pellet. Guarde el precipitado de células en - 80˚C hasta su uso (paso 3.1.3).
    3. Supervisar diariamente los animales hasta que se terminan en el punto final determinado. Pesan los hámsteres diariamente y buscar criterios de punto final: pérdida de apetito, andar o respirar dificultad, postración, con volantes de piel, o la pérdida de > 10% del peso máximo alcanzado.
  3. Experimento in vitro
    1. En el día del desafío, inocular 3 matraces de 25 mL de EMJH + Km con 5 mL de la piscina entrada. Crecen cultivos a 30 ° C bajo agitación de 150 rpm.
    2. Cuenta las leptospiras diariamente mediante el uso de uno de los métodos de la sección 2.1.2. Cuando la densidad alcanza ≈ 1 x 108/ml, girar por cada suspensión por 20 min a 3.220 x g.
    3. Almacenar los pellets de células a-80 ° C hasta su uso.
  4. Cosecha y almacenamiento de los tejidos
    1. Eutanasia a los animales por inhalación isoflurano seguida de toracotomía bilateral26.
    2. Recoja inmediatamente 1-2 mL de sangre por punción cardiaca con una jeringa de 3 mL y una aguja de 25 x 5/8". Transferencia de la sangre en tubo con EDTA. Mezclar por inversión, 5 o 6 veces.
    3. Recoger un riñón y ⅓ a 1/2 del lóbulo medio ventral del hígado en criotubos.
    4. Almacenar los tejidos a-80 ° C hasta su uso.

3. construcción de librerías genómicas de secuenciación de alto rendimiento (figura 4)

  1. Extracción de ADN
    1. Extracción de ADN de la sangre.
      1. Transferir 100 μl de sangre desde el tubo de EDTA para un tubo de microcentrífuga.
      2. Purificar el ADN utilizando un kit de extracción de ADN. Siga las instrucciones del fabricante.
    2. Extracción de ADN de los tejidos.
      1. Utilizando bisturís y tijeras, dados entre 50 a 80 mg de cada órgano en trozos pequeños (1 mm x 1 mm) y transferir a un tubo seco estéril de tapón de rosca. Medir el peso del tejido con una balanza de precisión.
      2. Añadir 500 μl de PBS estéril en el tubo.
      3. Homogeneizar las muestras utilizando el disruptor durante 1 min a 5 movimientos por segundo.
      4. Calcular el volumen correspondiente a 25 mg de tejido utilizando la siguiente ecuación:
        Equation 1
      5. Transferir el volumen calculado en el kit de extracción de ADN. Proceder a la purificación de ADN siguiendo las instrucciones del fabricante.
    3. Extracción de ADN de culturas entradas piscina y en vitro .
      1. Descongele la pelotillas bacteriano a temperatura ambiente durante 5-10 minutos.
      2. Proceder a la extracción de ADN siguiendo las instrucciones que acompañan el kit.
    4. ADN tienda a-80 ° C hasta su uso.
  2. Corte del ADN (figura 5)
    1. Transferir 50 μl del ADN extraído en un tubo de microcentrífuga de 1,5 mL.
    2. Colocar los tubos en el rack del sonicador Copa cuerno llenado de agua fría (4 ° C).
    3. Hacer funcionar el sonicador durante 3 minutos en el 80% de intensidad con 10 s de 5 y pulso s de pulso.
      PRECAUCIÓN: Usar orejeras o tapones para los oídos para proteger la audición.
    4. 2.5 μl de la esquilada DNA en gel de agarosa al 2% para confirmar que la mayoría de la DNA es < 600 bp en tamaño.
  3. Además de la C de cola
    1. Medir la concentración de ADN con un espectrofotómetro de pequeño volumen.
    2. Calcular el volumen correspondiente a 500 ng de ADN utilizando la siguiente ecuación:
      Equation 2
    3. Preparar la reacción de seguimiento (tabla 4). Incubar 1 h a 37 ° C; inactivar a 75 ° C por 20 min.
      Nota: Para las muestras que requieren ajuste a un volumen superior a 14,5 μl, aumentar el volumen final de reacción a 40 μl y ampliar en consecuencia los componentes restantes.
    4. Limpiar las muestras con un kit de potabilización de la polimerización en cadena. Eluir el ADN con 12 μl de tampón de elución.
  4. PCR anidada
    1. POLIMERIZACIÓN EN CADENA #1
      1. Preparar mezclas PCR según las tablas 3 y 5. Transferencia 22 μL de la mezcla de la biblioteca a cada tubo PCR y agregar 3 μl de DNA purificado. Proceder igualmente con la mezcla de control.
        Nota: Primer TnkN317 es específico para el transposón y primer olj3766 es específico a la C de cola. La mezcla de control carece de la cartilla de la TnkN3, que dirige específicamente el transposon.
      2. Ejecutar el siguiente programa: 95 ° C por 2 min; 24 ciclos de: 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 2 min.
    2. POLIMERIZACIÓN EN CADENA #2.
      1. Preparar las mezclas PCR segundo según las tablas 3 y 6. Transferencia 49 μl de la mezcla de la biblioteca a cada tubo PCR y añadir 1 μl de reacción de PCR #1 biblioteca. 24.5 μl de la mezcla de control la transferencia a cada tubo PCR y añadir 0,5 μl de reacción de PCR #1 control.
        Nota: Primer pMargent2 es específico para el transposón y el IP cartillas6 contienen base-pares seis barras y secuencias específicas, reconocidas por la plataforma de secuenciación de próxima generación.
      2. Ejecutar el siguiente programa: 95 ° C por 2 min; 18 ciclos de: 95 ° C por 30 s, 60 ° C durante 30 s, 72 ° C por 2 min; 72 ° C por 2 min.
    3. Ejecutar 3 μL en un gel de agarosa al 2%. La biblioteca debe mostrar un frotis con la mayoría de la señal entre 200 a 600 bp (figura 6) y la no amplificación por la reacción de control.
  5. Purificación de productos PCR.
    Nota: Limpie las bibliotecas genómicas con un kit de purificación PCR siguiendo las instrucciones del fabricante. Eluir el ADN con 30 μl de tampón de elución.
  6. Medir la concentración de ADN con un fluorómetro. Promedio de 2 a 3 lecturas.
  7. Calcular el volumen de cada biblioteca equivalente a 15 o 20 ng utilizando la siguiente ecuación:
    Equation 3
  8. Mezclar todas las bibliotecas juntos según los anteriores cálculos. Determinar la concentración molar de la DNA con la ecuación de la siguiente página de Web:
    http://www.molbiol.edu.ru/ENG/scripts/01_07.html
    Atención: Requisitos de concentración y el volumen de ADN dependen de la plataforma de secuenciación.

4. alto rendimiento secuenciación y análisis de datos

  1. Secuencia
    1. Bibliotecas de secuencia como 64 Lee solo-fin de bp mediante la secuenciación personalizada cartilla pMargent3 y la cartilla de la secuencia comercial estándar. La plataforma de secuenciación le proporcionará FastQ archivos con todas las lecturas de secuenciación.
  2. Análisis con software Galaxy
    1. Descargar el archivo de secuencia de genoma
      1. En la página de base de datos de SpiroScope (ver paso 1.2.7 enlace), seleccione el organismo utilizado para el experimento y haga clic en la opción de "Carga en BROWSER del genoma".
      2. En la barra de herramientas (en la parte superior de la Página principal), seleccione "búsqueda y exportación > descargar datos", en la línea de "Secuencia (fasta)", haga clic en "Genoma" para descargar la secuencia.
      3. Abra el archivo con bloc de notas (PC) o TextEdit (Mac) y cambiar el nombre de cromosoma (por ejemplo "mente"). Mantener el formato de fasta.
      4. Siga los mismos pasos para descargar la secuencia del cromosoma II. Combinar ambas secuencias del cromosoma en un archivo .txt solo copiar y pegar.
        Nota: Secuencias del cromosoma pueden ser descargadas desde el sitio web NCBI (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) y combinar en un archivo .txt solo.
    2. Subir archivos en el servidor de la galaxia
      Nota: El Galaxy es de código abierto, plataforma web para la gestión de datos bioinformática intensos flujos de trabajo27,28,29,30 y puede consultarse en https://usegalaxy.org/.
      1. En el menú herramientas, seleccione "obtener datos > subir archivo desde su computadora". Arrastrar y soltar los archivos de .fastq generados por la plataforma de secuenciación en la ventana y haga clic en "Inicio".
      2. Siga los mismos pasos para cargar el archivo de .txt de secuencia de genoma de Leptospira .
    3. Novio Lee
      1. Seleccione "NGS: manipulación y control de calidad > FASTQ Groomer" en el menú herramientas.
      2. Junto al archivo para novio, seleccione las bibliotecas cargado en el paso 4.2.2. En entrada FASTQ calidad partituras tipo, seleccione el sistema apropiado de la secuencia. Para opciones avanzadas, deje ocultar avanzada oficina seleccionadas.
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    4. Eliminar artefactos de secuenciación
      1. Seleccione "NGS: manipulación y control de calidad > eliminar artefactos de la secuencia". Junto a la biblioteca para filtrar, seleccione los archivos arreglados generados en el paso 4.2.3. Haga clic en "Ejecutar".
    5. Quitar secuencias C-tail
      Nota: Repita estos pasos una vez o dos veces para todos C-colas se quitan.
      1. Seleccione "NGS: manipulación y control de calidad > Clip secuencias de adaptador".
      2. Seleccione o escriba lo siguiente:
        Clip de la biblioteca: seleccione los archivos generados en el paso 4.2.4.
        Longitud mínima de la secuencia: 15
        Fuente: introducir secuencia personalizada
        Introduzca la secuencia de recorte personalizado: CCCCCCC
        Introduzca valor distinto de cero para mantener el adaptador secuencias y bases x que le siguen: 0
        Deseche las secuencias con desconocido (N) bases: sí
        Opciones de salida: salida de secuencias recortadas y sin recortar
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    6. Quitar secuencias de adaptador
      1. Seleccione "NGS: manipulación y control de calidad > Clip secuencias de adaptador".
      2. Seleccione o escriba lo siguiente:
      3. Clip de la biblioteca: seleccione los archivos generados en el paso 4.2.5.
      4. Longitud mínima de la secuencia: 15
      5. Fuente: introducir secuencia personalizada
      6. Introduzca la secuencia de recorte personalizado: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Introduzca valor distinto de cero para mantener el adaptador secuencias y bases x que le siguen: 0
      8. Deseche las secuencias con desconocido (N) bases: sí
      9. Opciones de salida: salida de secuencias recortadas y sin recortar
      10. Haga clic en "Ejecutar".
    7. Filtro lee en base a su calidad
      1. Seleccione "NGS: manipulación y control de calidad > filtro de calidad".
        Nota: Esta herramienta selecciona lecturas basadas en los resultados de calidad.
      2. Seleccione los siguientes:
        Biblioteca de filtro: seleccione los archivos generados en el paso 4.2.6.
        Valor de corte de calidad: 20
        Por ciento de las bases en la secuencia que debe tener calidad igual a o más alta que el valor de corte: 95
      3. Haga clic en "Ejecutar".
        Nota: Con estas opciones, se descartan lecturas más cortas de 20 nucleótidos o con una puntuación de calidad de 20 o menos para el 95% de los ciclos. Adaptar los ajustes de rigor para su experimento.
    8. Mapa Lee32
      1. Seleccione "NGS: cartografía > Bowtie2"32.
      2. Seleccione lo siguiente en los campos en la ventana principal:
        Es esta biblioteca unitarios o emparejada: solo-fin
        Fichero FASTQ: seleccione la biblioteca de filtrado para la calidad del paso 4.2.7.
        Escribir no alineados (en formato fastq) lecturas para separar archivos: no
        Escribir alineadas (en formato fastq) lecturas para separar archivos: no
        ¿Seleccione un genoma de referencia de su historia o utilizar un índice incorporado?: utilizar un genoma de la historia y construir el índice
        Seleccione el genoma de referencia: seleccione el archivo de genome.txt de Leptospira cargado en el paso 4.2.2.
        Conjunto de Lee la información de los grupos?: no
        Modo de análisis Select: 1: por defecto configuración sólo
        ¿Desea usar presets?: No, sólo tiene que utilizar por defecto
        Guardar las estadísticas de asignación de bowtie2 en la historia: No
        Parámetros de recursos de empleo: utilizar parámetros de recursos de trabajo por defecto
      3. Haga clic en "Ejecutar" para alinear Lee al genoma.
    9. Convertir archivos
      1. Seleccione "NGS: SAMtools > BAM a SAM convertir BAM a SAM".
      2. Seleccione los siguientes:
        Archivo de BAM para convertir: seleccione asignado biblioteca de paso 4.2.8.
        Opciones de encabezado: incluir encabezado en salida de SAM (-h)
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    10. Convertir archivos
      1. Seleccione "NGS: SAMtools > convertir SAM intervalo".
      2. Seleccione los siguientes:
        Seleccione conjunto de datos a convertir: seleccione el archivo de biblioteca asignadas SAM generado en el paso 4.2.9.
        Imprimir todo?: sí
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    11. Suerte Lee
      1. Seleccione "filtrar y ordenar > ordenar los datos en orden ascendente o descendente".
      2. Seleccione los siguientes:
        Conjunto de datos de tipo: seleccione el archivo de intervalo generado en el paso 4.2.10.
        en la columna: 2
        con sabor: orden numérico
        todo en: orden ascendente
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    12. Seleccione lecturas que cromosoma
      1. Seleccione "filtrar y ordenar > seleccionar las líneas que coincidan con una expresión".
      2. Seleccione los siguientes:
        Seleccionar líneas de: seleccione Archivo clasificado lecturas generada en el paso 4.2.11.
        que: coincidencia
        el patrón: Introduzca el nombre de cromosoma determinado en el paso 4.2.1.3 (p. ej., "mente").
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    13. Seleccione Lee correspondiente cromosoma II
      Proceder siguiendo paso 4.2.12.
    14. Grupo Lee según los sitios de inserción en el cromosoma I
      1. Seleccionar "unir, sustraer y grupo > agrupar datos por una columna y realizar operación agregada en otras columnas".
      2. Seleccione los siguientes:
        Seleccionar datos: seleccionar archivo resultante del paso 4.2.12.
        Grupo de columnas: 2
        Ignorar el caso mientras la agrupación?: No
        Ignorar las líneas a partir de estos personajes: Ø
        Operación > + Insertar operación
        Tipo: cuenta
        En la columna: 2
        Ronda el resultado al entero más cercano: NO
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    15. Grupo Lee según los sitios de inserción en el cromosoma II
      Proceder siguiendo paso 4.2.14.
    16. Sitios de inserción de tipo en el cromosoma I
      1. Seleccione "filtrar y ordenar > ordenar los datos en orden ascendente o descendente".
      2. Seleccione los siguientes:
        Conjunto de datos de tipo: Seleccione el archivo del paso 4.2.14.
        en la columna: 1
        con sabor: orden numérico
        todo en: orden ascendente
      3. Haga clic en "Ejecutar".
    17. Ordenar los sitios de inserción en el cromosoma II
      Proceder siguiendo paso 4.2.16.
  3. Análisis estadístico
    1. Transferir los datos de la galaxia a archivos de hoja de cálculo por copiar y pegar las dos columnas de pasos 4.2.16. y 4.2.17. en un archivo de Excel.
      Nota: La primera columna es la coordenada del nucleótido del sitio de inserción de transposones, y la segunda columna es el número de lecturas en cada sitio de inserción.
    2. Identifican el gen que el transposon usando la coordenada de nucleótido en la tabla.
      Nota: por ejemplo, un transposón insertado en el nucleótido #30718 del cromosoma es situado en el gen LIC10024 , que se extiende por nucleótidos cromosoma en 29263-31539.
    3. Calcular frecuencias relativas (F) para cada mutante en cada tejido y en la piscina entrada siguiendo la siguiente ecuación:
      Equation 4
    4. Calcular relaciones de entrada y salida (R) para cada mutante y tejido usando la siguiente ecuación:
      Equation 5
    5. Wilcoxon firmar-alinea la prueba
      1. Normalizar todos relaciones de entrada y salida mediante el establecimiento de la relación media de cada tejido en cada animal a 1.0. Una proporción de 1.0 es neutral, > 1.0 es desventajosa, y < 1.0 es ventajoso33.
      2. Comparar relaciones de entrada y salida a 1.0 (aptitud neutral) usando la prueba de Wilcoxon rank con valores de P < 0,05 considerado como estadísticamente significativo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Creación de una biblioteca de mutantes de transposon en L. interrogans por verbal requiere una unidad de filtración, como se muestra en la figura 1. Hemos recuperado 100-200 transconjugants de cada apareamiento.

El sitio de inserción del transposón se identifica en cada mutante por secuenciación del producto PCR generado por PCR semi-random que se dirige al final de los transposones y secuencias de host adyacente15 (figura 2A). En la figura 2Bse muestra un ejemplo de los resultados de la PCR semi-random. En la mayoría de los casos se observará un amplicon dominante cuando los iniciadores Deg1 y Tnk1 se utilizan para la primera ronda de PCR, etiqueta y TnkN1 para la segunda ronda. Sin embargo, debido a la baja especificidad de la secuencia pentamérica (...) N10GATAT-3') en el extremo 3' del primer Deg1, esta cartilla se recuece en múltiples ubicaciones por todo el genoma leptoespiral. Si estos sitios están presentes cerca del extremo del transposón, se pueden obtener varios productos de PCR. Cuando se generan múltiples amplicones, puede ser purificados juntos de la mezcla PCR y secuenciados directamente; purificación del gel de cada amplicón no es necesario ya que todos contienen la misma secuencia corriente abajo de donde se recuece TnkN1 cartilla. Por otra parte, la PCR puede fallar si la copia más cercana de la secuencia blanco de la imprimación Deg1 se encuentra a gran distancia desde el extremo del transposón. Si no productos PCR se detectaron, puede repetirse la primera ronda de PCR semi-random y la cartilla Deg1 Tnk2 cartilla, que dirige el extremo opuesto de los transposones. En este caso se utilizaría TnkN2 y etiqueta para la segunda ronda; el amplicon secuenciado con la cartilla de TnkN2 (figura 2B). Por otra parte, la primera ronda de PCR puede hacerse con la cartilla Deg2, cuyo extremo 3' (...) N10TCTT-3') dirige una cuatro - en lugar de una secuencia de cinco nucleótidos. Cuatro juegos diferentes de primers se pueden utilizar para la primera ronda de PCR (PCR #1): Tnk1 + Deg1, Tnk1 + Deg2, Tnk2 + Deg1 Tnk2 + Deg2. Cuando un conjunto de cartillas no funciona, use otro sistema. Si esta segunda establece también falla, use otro y así sucesivamente. Mutantes resistentes a kanamicina espontáneas son muy raros y ocurren con una frecuencia de < 10-10 34.

Durante la preparación de bibliotecas genómicas (figura 4), se puede verificar un par de pasos. Corte del ADN por sonicación debe confirmarse mediante electroforesis de una alícuota en un gel de agarosa (figura 5). Cuando el ADN es cortado correctamente, fragmentos de ADN que van desde 200 hasta 600 bp voluntad forman un frotis en un gel de agarosa al 2%. Antes de enviar a las bibliotecas para la secuenciación de alto rendimiento, la generación de productos PCR por reacciones de PCR anidadas debe ser confirmada por electroforesis en gel de agarosa (figura 6).

Después de procesar la Lee de la secuencia siguiendo el protocolo descrito aquí (sección 4.2.), la frecuencia de cada mutante en la piscina de entrada y en todos los tejidos se determina mediante la ecuación en la sección 4.3.3. La relación de entrada y salida para cada mutante en cada tejido se calcula con la ecuación en la sección 4.3.4. La figura 7 muestra un ejemplo de los resultados obtenidos con el método Tn-Seq. Alternativamente, puede utilizarse la herramienta MAGenTA para procesar y analizar la secuencia de datos 31. Se identificaron mutantes con aptitud estadísticamente significativamente menor y mayor. Mutaciones en genes de virulencia conocidos leptospirósica causadas reducen aptitud, validando el método Tn-Seq.

Figure 1
Figura 1: unidad de filtración utilizado para conjugación. La unidad de filtración se ensambla insertando el tapón del soporte del filtro en un matraz Erlenmeyer, de brazo lateral coloca el filtro de acetato de celulosa en la base con pinzas estériles, colocar el embudo en la base y asegurar el sistema con una abrazadera de . La unidad de filtración se conecta al sistema de vacío. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 2
Figura 2: identificación de los sitios de inserción del transposón. (A) esquema que muestra sitios de recocido de los semi-random primers PCR. Tnk1 y Tnk2 cebadores hibridan cerca de los extremos opuestos del transposón (Tn). Deg1 es un imprimador de 35 nucleótidos que contiene un tramo de 10 nucleótidos degenerados, seguido por la secuencia GATAT en el extremo 3'. La primera ronda de PCR (PCR #1) se lleva a cabo con Deg1 y Tnk1 o con Deg1 y cartillas Tnk2. TnkN1 y TnkN2, utilizados para la polimerización en cadena #2, templar entre los extremos de transposon y Tnk1 y Tnk2, respectivamente. La secuencia de la cartilla de la etiqueta es idéntica a la del 5' final de la cartilla Deg1. (B) ejemplo de gel de agarosa obtenido después de la segunda ronda de PCR con 14 mutantes de transposon (carriles 1 a 14). La primera ronda de PCR fue realizada con Deg1 y Tnk1; la segunda ronda se hizo con la etiqueta y TnkN1. PCR positiva está representada por "+" y un PCR negativo por "-". "KmR"representa el cassette de resistencia a kanamicina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 3
Figura 3: Diagrama de flujo para la obtención de la piscina de la salida. En el día del reto (día 0), cada mutante leptoespiral es contado por microscopia de campo oscuro, diluido a la misma densidad y combinan para formar la entrada piscina (datos proporcionados en la sección 2.1). Hámsters son desafiados por vía intraperitoneal con la piscina entrada. Además, las tres culturas se iniciaron con la entrada piscina. En el día de la inoculación (día 0) y cuando los cultivos alcanzan una densidad de ≈ 108/ml, la entrada de la piscina y culturas son recogidas por centrifugación y almacenadas como pelotillas a-80 ° C hasta su uso (ver sección 2.3). En el extremo/día pre-seleccion para terminar los animales, por ejemplo, día 4 después del desafío, los animales son sacrificados; sangre, riñón y hígado son recogidos y almacenados a-80 ° C hasta su uso (ver sección 2.4). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 4
Figura 4: Diagrama de flujo de la preparación de la biblioteca genómica. (A) ADN se extrae de la sangre, tejidos o cultivos siguiendo el protocolo descrito en la sección 3.1. El cuadro rojo representa el transposón (Tn). (B) el ADN es cortado por sonicación en fragmentos entre 200 y 600 pb. Otros datos se proporcionan en la sección 3.2. (C) C-colas (cajas amarillas) se agregan a todos los fragmentos de ADN con la transferasa terminal del deoxynucleotidyl (TdT) como se describe en la sección 3.3 y la tabla 4. La biblioteca genómica está preparada para la secuencia por PCR anidada (D-E). Se realiza la primera ronda de PCR con cebadores TnkN3 y olj376 específicos a los transposones y la C de cola, respectivamente. Ver tabla 3 y 5. Se amplifican sólo fragmentos que contienen los extremos del transposon (caja roja). Nota: Use 3 veces más olj376 primer que TnkN3 porque todos los fragmentos del ADN tienen C-colas. La segunda ronda de PCR se lleva a cabo con pMargent2, específico para el final del transposon y una indexación de cartilla, que contiene una secuencia de código de barras de seis-base-pair (en rosa) permitiendo que todas las muestras para ser multiplexados en un carril de secuencia única. Ver tabla 3 y 6. Ambos primers contienen secuencias necesarias para atar a la célula de flujo durante Illumina secuenciación (caja verde y morada). (F) la PCR que los productos se limpian, y entonces su concentración se mide como se describe en la sección 3.6. (G) se agruparon todas las bibliotecas genómicas; cada biblioteca tiene un código de barras diferentes y (H) la piscina es enviado a la plataforma de secuenciación. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 5
Figura 5: sonicación de la DNA. Se purificó ADN de hígados de hámster infectado ocho (carriles 1 y 8), sonicados y examinado por electroforesis en un gel de agarosa al 2%. Esquilada ADN se caracteriza por un borrón de transferencia en la que el tamaño de la mayoría de los fragmentos es entre 200 y 600 BP haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 6
Figura 6: bibliotecas genómicas de alto rendimiento de secuenciación. Bibliotecas genómicas fueron preparadas por la prueba PCR con ADN de la sangre de ocho hámsters infectados (carriles 1 y 8) y examinadas por electroforesis en un gel de agarosa al 2%. El tamaño de la mayoría de los productos PCR es entre 200 y 600bp. control negativo (cartilla de TnkN3 en la mezcla de PCR #1, no ver tabla 5) no muestra amplificación (no mostrada). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figure 7
Figura 7: adecuación de mutantes de Tn-Seq experimento. Aptitud de un grupo de mutantes en riñón de hámster 4 días después del desafío (adaptado de estudio17 de Lourdault). La relación de entrada y salida de todos los 42 mutantes se determinó para cada animal. Cada mutante es nombrado por el gen (lic) o la región intergénica (inter) se inserta el transposón o el nombre utilizado comúnmente en la literatura. Cada relación está representado por un diamante negro. La mediana de los ratios (línea roja) fue determinada para cada mutante y comparada con el 1.0, utilizando la prueba de rango de Wilcoxon. La línea punteada representa la aptitud de 1.0, que corresponde a la aptitud neutral. Mutantes cuya aptitud es significativamente afectada están marcados con asteriscos: * P < 0.05; ** P < 0.01. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Reactivos Volumen para una reacción
Master mix 2 X 12.5 ΜL
Cartilla 1, 10 m m (TnK1 o TnK2) * 1.2 ΜL
Cartilla 2, 10 m m (Deg1 o Deg2) * 1.2 ΜL
Agua 8,8 ΜL
Plantilla (lisado de células o ADN) 1.3 ΜL
Volumen final 25 μl
* Secuencias primer en la tabla 3.

Tabla 1: Identificación de la zona de inserción de transposones, semi aleatoria mezcla de PCR #1.

Reactivos Volumen para una reacción
Master mix 2 X 12.5 ΜL
Cartilla 1, 100 m m (TnKN1 o TnKN2) * 0.2 ΜL
Cartilla 2, 100 mM (etiqueta) * 0.2 ΜL
Agua ΜL DE 10.1
Productos de la polimerización en cadena de la polimerización en cadena #1 0,8 ΜL
Volumen final 25 μl
* Secuencias primer en la tabla 3.

Tabla 2: Identificación de la zona de inserción de transposones, semi aleatoria mezcla de PCR #2.

Nombre Secuencia (5' - 3') Referencia
Cebadores usados para PCR semi aleatorio
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
Deg2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Etiqueta GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Cebadores utilizados para la secuencia de Illumina
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Secuenciación de Illumina (códigos de barras en negrita)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tabla 3: Secuencias de la cartilla.

Reactivos Volumen para una reacción
Esquilado ADN 500 ng (véase ecuación en 3.3.2).
Agua Hasta 14,5 μl
5 x buffer de la TdT 4 ΜL
(dCTP 9.5 mM + 0,5 mM ddCTP) mix * 1 ΜL
TdT (30 U/μL) 0.5 ΜL
Volumen final 20 μl
* Mezcla 3 μl 10 mM ddCTP, 5.7 μl de 100 mM dCTP y 51,3 μl de agua

Tabla 4: C-tailing reacción con la transferasa terminal del deoxynucleotidyl (TdT).

Reactivos Volumen para una reacción
Reacción de biblioteca Reacción de control
Master mix 2 x 12.5 ΜL 12.5 ΜL
Cartilla 1, 30 μm (TnkN3) * 0.5 ΜL -
Cartilla 2, 30 μm (olj376) * 1.5 ΜL 1.5
Agua ΜL DE 7.5 8 ΜL
Cola de C DNA 3 ΜL 3 ΜL
Volumen final 25 μl 25 μl
* Secuencias primer en la tabla 3.

Tabla 5: Construcción de la biblioteca genómica, mezcla de PCR #1.

Reactivos Volumen para una reacción
Reacción de biblioteca Reacción de control
Master mix 2 x 25 ΜL 12.5 ΜL
Cartilla 1, 30 μm (pMargent2) * 0.5 ΜL 0.25 ΜL
Cartilla 2, 30 μm (primer índice) * 0.5 ΜL 0.25 ΜL
Agua 23 ΜL 11.5 ΜL
Productos de la polimerización en cadena de la polimerización en cadena #1 1 ΜL 0.5 ΜL
Volumen final 50 μl 25 μl
* Secuencias primer en la tabla 3.

Tabla 6: Construcción de la biblioteca genómica, mezcla de PCR #2.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Aunque se presentan los resultados de nuestro experimento piloto para hámster desafiado por vía intraperitoneal con mutantes de L. interrogans 4217, esperamos que piscinas más grandes de mutantes pueden ser defendidos por Tn-SS. Porque la frecuencia de transconjugants es baja (100-200 transconjugants/apareamiento), varios apareamientos son necesarias para generar un número suficiente de mutantes para los grandes experimentos de Tn-Seq. Mantener un gran número de mutantes en cultivos líquidos presenta desafíos logísticos que deben ser abordados. Las culturas pueden ser incubadas en placas de 96 pocillos profundos. Densidades de cultivo pueden ser monitoreadas por las lecturas de densidad óptica en un espectrofotómetro a 420 nm. La determinación del número de animales a utilizar depende en parte del tamaño de la piscina entrada y debe ser determinada por análisis de energía. Para los experimentos a gran escala, se recomienda que el análisis sea realizado en consulta con un bioestadístico.

Los cuellos de botella pueden afectar la recuperación de los mutantes al azar de la piscina de salida. Aunque no se observaron graves cuellos de botella en nuestro estudio piloto17 (figura 7), experimentos a gran escala pueden verse afectados por la pérdida al azar de mutantes. Aumentar la dosis de desafío aumentando el número de células por mutante en la piscina entrada minimizará la probabilidad de que los cuellos de botella35. La herramienta de galaxia recién publicada MAGenTA proporciona las herramientas necesarias para determinar los cuellos de botella y fitness31.

TN-Seq experimentos habían previsto para una ruta alternativa de la infección, otros Leptospira cepas, u otros modelos de roedores requieren consideraciones adicionales. Si la cinética de la infección en la especie no se conoce o no es exponencial continuamente durante el curso de la infección dentro de cada tejido para ser examinado, debe obtenerse ADN de cultivo de los tejidos y no directamente de los tejidos. Este paso adicional reducirá sobreestimaciones de aptitud mutante debido a la detección de ADN de las espiroquetas muertas. Si la piscina de salida se obtiene del cultivo de los tejidos, se debe cultivar la piscina entrada a efectos de la dirección de crecimiento en vitro . También recomendamos un experimento piloto con un pequeño número de mutantes para determinar si los cuellos de botella serán una preocupación y para facilitar el análisis de poder para los experimentos a gran escala.

Confirmación de alterado aptitud determinada por Tn-Seq requerirá pruebas de las mutantes individuales en el modelo animal. Actualmente, cada mutante debe ser secuenciado individualmente antes de Tn-Seq para identificar a los mutantes con la inserción en el gen de interés. Sin embargo, si reemplazo de alelo en patógena Leptospira se convierte en fácil, la secuencia de los mutantes ya no será necesaria. Por otra parte, efectores como activador de transcripción se han utilizado con éxito para disminuir la expresión de genes lig en L. interrogans36. Esta técnica podría utilizarse para abajo-regulan genes interrumpidos en mutantes alterados fitness identificado por Tn-SS.

Al interpretar los datos de Tn-Seq, interacciones entre bacterias deben tenerse en cuenta. Es teóricamente posible que una disminución en el fitness podría ser debido a la competencia entre mutantes más que un efecto directo de la inserción del transposón. Además, una ausencia de cambio de aptitud en vivo de un mutante en una piscina podría ser debido a la cooperación entre mutantes. Por ejemplo, un mutante que no produce un factor esencial podría complementarse intracelular producción del factor de otros mutantes en la piscina. Observamos un aumento en la aptitud para varios mutantes, que puede ser una consecuencia de la carga metabólica reducida de no sintetizar proteínas que no son esenciales para el crecimiento, como se muestra para Salmonella enterica37.

Este protocolo puede utilizarse para identificar genes implicados en el metabolismo o la supervivencia bajo condiciones estresantes en vitro 38,39. Por ejemplo, crecimiento de Leptospira en diferentes condiciones de concentración de cloruro de sodio alto, hierro limitada y pH ácido podría identificar genes responsables de resistencia ácida de supervivencia o el estrés. También se pueden realizar estos experimentos en vitro con cepas saprofitas como L. biflexa cepa Patoc porque este método Tn-Seq puede aplicarse a todo secuenciado cepas de Leptospira .

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por un premio de mérito de asuntos de veteranos (para D.A.H.) y un Instituto Nacional de salud concede R01 AI 034431 (a D.A.H.).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

Inmunología número 130 alto rendimiento de secuenciación verbal de mutagénesis al azar PCR anidada Leptospira fitness mutantes biblioteca
Alto rendimiento de secuenciación paralelo a la idoneidad de la medida de <em>Leptospira interrogans</em> Transposon inserción mutantes durante oro sirios Hamster infección
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter