Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Immunology and Infection
Click here for the English version

Immunology and Infection

Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness Leptospira interrogans Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için

Published: December 18, 2017 doi: 10.3791/56442
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2,3,4
1Veterans Affairs Greater Los Angeles Healthcare System, 2Departments of Medicine, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 3Departments of Urology, David Geffen School of Medicine at University of California Los Angeles, 4Departments of Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California Los Angeles

Summary

Biz burada transposon mutagenesis tanımlamak ve transposon leptospiral mutantlar dokularda hamster bir meydan okuma sonra ölçmek için yüksek üretilen iş sıralama ile birleştirir bir tekniğini tanımlamak. Bu iletişim kuralı için hayatta kalma ve hayvanlar yayılmasında ekran mutantlar için kullanılabilir ve vitro çalışmalar için de uygulanabilir.

Abstract

Bu makale, bir transposon (Tn-Seq) tekniği tanımlamak ve fitness konusunda altın Suriye hamster enfeksiyon sırasında değiştirilmiş Leptospira interrogans mutantlar ölçmek için sıralama açıklar. TN-Seq rasgele transposon mutagenesis yüksek üretilen iş sıralama teknoloji gücü ile birleştirir. Hayvanlar transposon mutant (giriş havuzu), havuzlu kan ve dokularda birkaç gün sonra tanımlamak ve mutantlar her organ (çıkış havuzları) sayısını ölçmek için hasat tarafından takip zorlanmaktadır. Çıkış havuzları her mutant vivo içinde fitness değerlendirmek için giriş havuza karşılaştırılır. Bu yaklaşım mutant hayvanlar sınırlı sayıda büyük bir havuzu tarama sağlar. Küçük değişiklikler ile bu iletişim kuralı leptospirosis hayvan herhangi bir model, sıçan gibi rezervuar ana bilgisayar modelleri ve vitro çalışmalar yanı sıra, hamster gibi akut enfeksiyon modelleri ile gerçekleştirilebilir. TN-Seq in vivo ve in vitro fitness kusurları mutantlarla için ekran için güçlü bir araç sağlar.

Introduction

Leptospira spp. gibi bazı bakteriler için virülans gen tanımlaması genetik araçlar mevcut sınırlı sayıda nedeniyle zordur. Bir sık kullanılan yaklaşım ardından her mutant ekleme sitedeki tanımlaması ve bireysel transposon mutant bir hayvan modeli virülans test rastgele transposon mutagenesis gitmesini... mutantlardan topluluğu oluşturulmasıdır. Bu yaklaşım zaman alan, pahalı ve çok sayıda hayvan gerektirir.

Rastgele mutagenesis patojen Leptospira interrogansiçin ilk geliştirildiğinde, genler virülans içinde yer alan bir hayvan modeli1' bireysel mutant test ederek tespit edilmiştir. Mutantlar sinyal onların potansiyel rolleri veya hareketliliği veya tahmin edilen dış membran veya yüzey konum gibi ölçütlere göre seçildi. Leptospiral çoğunluğu olarak genler kodlamak bilinmeyen fonksiyon2varsayımsal proteinler, seçme mutantlar dayalı bu kriterleri sınırlamalar roman leptospiral virülans genler keşfetmek yeteneği.

Daha yakın zamanlarda, L. interrogans transposon mutantlar takımlık infektivite hamster ve fare modelleri3için gösterildi. Her hayvan en çok 10 mutantlar bir havuz ile karşılaşıyordu. Bir mutant infektivite PCR kan ve böbrek elde kültürler tarafından algılandıysa olumlu olarak atan oldu. Çünkü her mutant havuzu için bireysel bir PCR reaksiyon gerekli PCR testi zahmetli. Her mutant kültürlerde sıklığını sayısal değil çünkü yaklaşım son derece zayıflatılmış mutantlar tanımlaması doğru önyargılı.

Biz bir transposon (Tn-Seq) tekniği, daha verimli bir şekilde ekrana virülans genler için bir strateji olarak sıralama tanımlamak. TN-seq mutantlar Kütüphanesi oluşturulması büyük paralel sıralama4,5,6tarafından takip transposon mutagenesis tarafından oluşur. Kısaca, transposon mutantlar havuza alınmış, hayvana aşı ve daha sonra farklı organ (çıkış havuzları) kurtarıldı. DNA çıktı havuzlarından çıkarılan ve enzimleri ile sindirilmiş veya sonication tarafından sheared. Transposon ekleme siteleri kavşak hedefleyen PCR iki tur gerçekleştirilir. Bu adım nasıl yapılacağını için gerekli adaptörleri ilavesi etkinleştirir. Elde edilen PCR ürünleri her mutant havuzun mutant havuzu ilk kompozisyon karşılaştırıldığında onların göreceli bereket ile birlikte transposon ekleme site tanımlamak için yüksek üretilen iş sıralama tarafından incelenir.

Bu yaklaşımın birincil avantajı aynı anda çok sayıda hayvan az sayıda mutantlarla ekran için yeteneğidir. TN-Seq transposon ekleme siteleri ile yeni Leptospirakeşfetme şansı artar ön bilgi gerektirmez-belirli genler virülans içinde daha az zaman ve daha fazla verimlilik ile ilgili. Leptospiral yük dokularda nispeten yüksek olduğundan kemirgen öldürücü duyarlı enfeksiyon modelleri (genellikle 104 ' e 108 bakteri/g doku)7,8,9 de rezervuar ana olduğu gibi 10,11, dokuları doğrudan kültür, önyargıları vitro büyüme nedeniyle azaltmak için gerek kalmadan analiz.

TN-Seq çalışmalar çoğu bakteriyel patojenler açıklandığı tarihe, insertional mutagenesis yüksek frekans enfeksiyon topluca her gen4 içinde birden çok yakından aralıklı transposon eklemeler olan mutantlar içeren büyük havuzlu izin ,12,13,14. TN-Seq da mutagenesis sıklığı çok düşük6olduğu bir bakteri için geliştirilmiştir. Leptospiraile Slamti ve ark15tarafından açıklandığı gibi konjugasyon tarafından transposon mobilizable plazmid olarak tanıtarak bir kütüphane transposon mutant oluşturulabilir. Ancak, transposon mutagenesis, L. interrogans sıklığı düşüktür. Himar1 transposon üzerinde Konjügatif bir plazmid tanıttığında, transconjugant frekans sadece 8,5 x 10-8 alıcı başına L. interrogans16 Lai gerilme ile hücre ve olması muhtemeldir olduğu bildirildi L. interrogansçoğu suşları ile benzer şekilde zavallı. Burada açıklanan transposon insertional mutagenesis sıklığı da düşük6olduğu Borrelia burgdorferiiçin geliştirilen temel bölümünde iletişim kuralıdır.

Bizim pilot için protokol17ile biz transposon mutagenesis L. interrogans serotip Manilae gerilme L495 ile transposon ekleme mutant suşu ile birlikte onun düşük içinde izole başarısı, diğer grupların nedeniyle deney LD50 (öldürücü doz) virülans1. Tn-Seq 42 mutantlar ekranlı ve birkaç mutant aday virülans iki eklemeler ile bir aday adenilat cyclase gene de dahil olmak üzere, kusurlu teşhis etti. Hamster iki mutantların bireysel test onların virülans17' eksik olduğunu doğruladı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dikkat: Patojen Leptospira spp. suşlarının seviye 2 (BSL-2) koruma prosedürleri altında ele alınması gerekir. Uygun kişisel koruyucu ekipman (PPE) takılmalıdır. Sınıf II Biyogüvenlik kabini patojenik Leptospira spp. tüm manipülasyonlar için kullanılmalıdır

1. Transposon Yaratılış Mutant Kütüphane15

  1. Transposon transfer Leptospira spp. konjugasyon tarafından içine (Resim 1)
    1. Bir birim 10 mL Ellinghausen-McCullough-Johnson-Harris orta (EMJH)18,19107 hücrelere karşılık gelen patojenik Leptospira spp. kültürünün üssel faz aşılamak. 150 yoğunluğu 2-8 x 108 hücre/mL ulaşıncaya kadar sallayarak rpm ile 30 ° C'de kuluçkaya.
      Not: Katlama, patojen leptospires zorlanma bağlı olarak 12-24 h zamanı.
    2. 5 mL, Luria suyu (2,6-diaminopimelicacid (DAP), 50 µg/mL 0.3 mM ile desteklenmiş LB) içine mobilizable transposon plazmid (pCjTKS2)16 taşıyan donör Escherichia coli zorlanma β216320 50 µL aşılamak sefaloridin (Km) ve 50 µg/mL Spektinomisin (Spc) ve 37 ° C kuluçka 255 devirde gecede yerde.
    3. DAP (EMJH + DAP) 0.3 mM ile desteklenmiş EMJH 3 mL içine E. coli hücre 60 µL aşılamak. 3-4 h OD600nm≈ 0,3 ilâ 255 rpm ajitasyon, 37 ° C'de kuluçkaya.
    4. Filtrasyon ünitesi (şekil 1) bir araya getirmek için bir 125 mL yan-kol üzerinde Erlenmeyer flask Bankası yerleştirin, bir asetat-selüloz filtre pozisyonu (gözenek boyutu 0.1 mm; çapı 25 mm) Bankası ve kelepçe kaidenin üzerine huni. Filtrasyon ünitesi vakum bir sisteme bağlayın.
    5. Leptospira spp5 mL ekleyin. Kültür ve E. coli kültür huni içine 0.5 mL. Sıvı filtreden vakum.
    6. Yukarı dönük olacak şekilde bir EMJH + DAPplate bakteri yüzey filtresiyle aktarın. 30 ° C'de gecede yukarı dönük olacak şekilde filtre ile kuluçkaya.
    7. EMJH ve girdap 10 için 1 mL içeren bir 15 mL tüp içine süzgeç koyun s bakteri medya serbest bırakmak için. Süspansiyon üzerine 5 EMJH platescontaining 50 µg/mL de 10-15 1 mm steril cam boncuk veya steril bir tek kullanımlık dağıtıcısı kullanarak Km 200 µL yayıldı. Plakayı parafilm ile sarın ve onları baş aşağı 30 ° C'de 3-4 kolonileri görünür hale gelene kadar hafta kuluçkaya.
    8. Koloniler 150 rpm ajitasyon 7 ila 10 gün kültür ≈ 10 bir yoğunluğuna ulaşır kadar altında 30 ° C'de EMJH Km (EMJH + Km) 50 µg/mL içeren ayrı ayrı 3 mL aktarmak8/mL.
      Not: Kültürler-80 ° C'de veya sıvı azot (ile % 4 gliserol) depolanabilir.
  2. Transposon ekleme sitesi tarafından iç içe PCR tanımlaması (Şekil 2)
    1. Kuluçka 15dk için 95 ° C'de tarafından 50 µL PCR tüpleri her transposon mutant parçalayıcı.
      Not: DNA bunun yerine, bir DNA ekstraksiyon kiti kullanarak saf.
    2. PCR karışımı ile Deg1 ve Tnk1 astar (Tablo 3) Tablo 1göre hazırlayın. Mix 23,7 µL her PCR tüp aktarmak ve lysed hücrelerinin 1.3 µL ekleyin. Programı çalıştırın: 95° C 5 dakika; 40 devir: 15 95 ° C s, 40 ° C için 1 dakika, 72 ° C için 2 dk; 10 dk 72 ° C.
    3. PCR karışımı etiket ve TnkN1 astar (Tablo 3) göre Tablo 2ile olun. Mix 24.2 µL her PCR tüp aktarmak ve 0.8 µL PCR 1 tepki ekleyin. Programı çalıştırın: 95 ° C 5 dakika; 35 devir: 15 95 ° C s, 30 55 ° C s, 72 ° C için 2 dk; 10 dk 72 ° C.
    4. 3 µL PCR ürünlerinin % 1'özel jel 10-15 V/cm (şekil 2B), 1 X Tris-asetat-EDTA (TAE) arabelleği ile çalıştırın.
    5. PCR ürünlerinin bir PCR arıtma kit kullanarak olumlu örnekleri arındırmak. DNA paketi tarafından kurtarılan DNA konsantrasyonu en üst düzeye çıkarmak için izin verilen en düşük güç ile elute.
    6. Arıtılmış PCR ürünleri TnkN1 astar (Tablo 3) kullanarak sıralama Sanger için gönderin.
    7. Ekleme siteleri ebeveyn zorlanma 's genom dizisi ile elde edilen sıra BLASTN analizi (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/) ile karşılaştırarak veya SpiroScope veritabanı (http://www.genoscope.cns.fr/agc/mage)21kullanarak tanımlayın.
    8. Transposon kanat ana bilgisayar sıraları tavlama primerler kullanılarak PCR tarafından ekleme sitesi onaylayın.
      Not: Transposon vahşi-tipi kol boyutunu artırır tarafından ≈ 2 kb.

2. hayvan deneyi (şekil 3)

  1. Leptospira mutantların kültür
    1. Tek tek her seçili transposon mutant EMJH + Km 10 ml 107-108 leptospires/mL bir yoğunluk için 150 rpm ajitasyon, 30 ° C'de büyümek.
    2. Karanlık-alan mikroskobu ile Petroff-Hausser sayaç veya Miller23tarafından tanımlandığı gibi tarafından leptospires saymak.
    3. EMJH her kültürde aynı yoğunluğu, örneğin 106 hücre/mL için sulandırmak.
    4. Giriş havuzu bir araya getirmek için eşit birimleri seyreltilmiş kültürlerde karıştırın.
      Not: bilinen fitness kusurları gibi loa2217,24 mutantlarla ve ligB17,25gibi değişmeden fitness mutantlarla ekleyerek giriş havuzda denetimleri dahil, anılan sıraya göre. Mutantlar takımlık %4 gliserol-80 ° C'de veya sıvı azot ile saklanır.
  2. Meydan okuma
    Not: Burada açıklanan yöntemleri gazileri işleri büyük Los Angeles kurumsal hayvan bakım ve kullanım Komitesi (iletişim kuralı #09018-14) tarafından kabul edildi.
    1. Her hayvan giriş havuza intraperitoneally 1 mL 26G x ½" iğne ile bir insülin şırınga U-100 enjekte et.
      Not: pilot denemede giriş Havuzu, yani, 106 bakteri toplam171 mL ile 8 hayvanlar meydan. Enfeksiyon 4 gün önce ötenazi için devam etmek için izin verildi.
    2. Giriş havuzun 10 mL toplamak ve 20 dk 3,220 x g., dikkatli bir şekilde çıkarın için süpernatant Pelet bozmadan spin. Hücre Pelet, - 80˚C kadar kullanmak (Adım 3.1.3) depolar.
    3. Onlar önceden belirlenmiş uç noktada durduruluncaya kadar hayvanlar her gün izlemek. Hamster günlük tartmak ve bitiş noktası ölçütlerini bak: kaybetme-in iştah, yürüyüş veya nefes zorluk, secde, fırfır yakalı kürk veya > %10 elde en fazla kilo kaybı.
  3. Vitro deney
    1. Challenge günü, EMJH + Km 25 ml 5 mL de giriş havuzu ile 3 şişe aşılamak. Kültürler 150 rpm ajitasyon altında 30 ° C'de büyümek.
    2. Leptospires her gün Bölüm 2.1.2 yöntemlerden birini kullanarak sayma. Spin yoğunluğu ≈ 1 x 108/mL ulaştığında, her süspansiyon 3,220 x g de 20 dakika aşağı.
    3. -80 ° C'de hücre topakları kullanmak kadar saklamak.
  4. Hasat ve depolama dokularin
    1. İkili Torakotomi26tarafından takip isoflurane Solunduğunda hayvanlara ötenazi.
    2. Hemen 1-2 mL kan tarafından kalp ponksiyon 3 mL şırınga ve iğne 25G x 5/8" ile toplamak. Kan EDTA içeren tüp içine aktarın. INVERSION tarafından 5-6 kez karıştırın.
    3. Bir böbrek ve ⅓ ventral medyan LOB karaciğer ½ simgesiyle cryotubes toplamak.
    4. -80 ° C'de dokuları kullanmak kadar saklamak.

3. inşaat yüksek üretilen iş sıralama (şekil 4) için genomik kütüphanelerin

  1. DNA ekstraksiyon
    1. Kandan DNA ekstraksiyon.
      1. 100 µL kan EDTA tüp sizden bir microcentrifuge tüp aktarın.
      2. Bir DNA ekstraksiyon kiti kullanılarak DNA arındırmak. Üreticinin yönergeleri izleyin.
    2. DNA dokuları çıkarma.
      1. Neşter ve makas kullanarak, 50-80 mg (1 mm x 1 mm) küçük parçalara her organ arasında zar ve steril vida-kap kuru tüpe aktarmak. Doku ağırlığı ile hassas denge ölçmek.
      2. Steril PBS 500 µL tüpün içine ekleyin.
      3. Örnekleri saniyede 5 hareketleri, 1 dk. için topu kullanarak lunaparkçı.
      4. Aşağıdaki denklemi kullanarak doku 25 mg için karşılık gelen birim Hesapla:
        Equation 1
      5. Hesaplanan birim DNA ekstraksiyon kiti aktarın. DNA arıtma üreticinin yönergeleri izleyerek devam edin.
    3. Giriş havuzu ve vitro kültürlerden DNA ekstraksiyon.
      1. Bakteriyel granül, oda sıcaklığında 5-10 dk çözülme.
      2. DNA ekstraksiyon kiti eşlik eden yönergeleri izleyerek devam edin.
    4. Mağaza DNA-80 ° c kadar kullan.
  2. DNA kesme (şekil 5)
    1. 50 µL ayıklanan DNA 1.5 mL microcentrifuge tüp üzerine aktarın.
    2. Tüpler (4 ° C) soğuk su ile dolu sonicator Kupası boynuz rafa yerleştirin.
    3. %80 yoğunluğu ile 10 sonicator 3 dk için çalıştırılacak s darbe ve 5 s darbe kapalı.
      Dikkat: kulak muffs veya işitme korumak için kulak tıkacı giymek.
    4. 2.5 µL yamultulmuş, DNA'ın çoğu onaylamak için % 2 özel jel DNA çalıştırıldığında < 600 bp boyutunda.
  3. Ek C-kuyruk
    1. DNA toplama küçük hacimli Spektrofotometre ile ölçmek.
    2. 500'e karşılık gelen birim hesaplamak ng DNA'ın aşağıdaki denklemi kullanarak:
      Equation 2
    3. Takip reaksiyon (Tablo 4) hazırlayın. 1 h 37 ° C'de kuluçkaya; 75 ° c 20 dk için devre dışı bırakabilirsiniz.
      Not: 14,5 µL büyük bir birime ayarlama gerektiren örnekleri için 40 µL tepki son hacim artırmak ve kalan bileşenleri kadar buna göre ölçek.
    4. PCR arıtma kiti ile örnekleri temiz. DNA 12 µL elüsyon arabelleği ile elute.
  4. İç içe geçmiş PCR
    1. PCR #1
      1. PCR karışımları Tablo 3 ve 5göre hazırlayın. Kütüphane Mix 22 µL her PCR tüp aktarmak ve saf DNA'ın 3 µL ekleyin. Benzer şekilde denetim karışımı ile devam edin.
        Not: Primer TnkN317 transposon için özeldir ve astar olj3766 C kuyruğuna özgüdür. Denetim mix özellikle transposon hedefleyen TnkN3 astar bulunmuyor.
      2. Aşağıdaki programı çalıştır: 95 ° C için 2 dk; 24 devir: 30 95 ° C s, 30 60 ° C s, 72 ° C için 2 dk; 2 dk 72 ° C.
    2. PCR #2.
      1. Tablo 3 ve 6göre ikinci PCR karışımları hazırlayın. 49 µL Kütüphane karışımı her PCR tüp aktarmak ve 1 µL PCR 1 Kütüphane tepki ekleyin. Denetim Mix 24.5 µL her PCR tüp aktarmak ve 0.5 µL PCR 1 Denetim tepki ekleyin.
        Not: Primer pMargent2 transposon için özeldir ve IP astar6 altı-temel-çift barkod ve yeni nesil sıralama platformu tarafından tanınan belirli dizileri içerir.
      2. Aşağıdaki programı çalıştır: 95 ° C için 2 dk; 18 devir: 30 95 ° C s, 30 60 ° C s, 72 ° C için 2 dk; 2 dk 72 ° C.
    3. 3 µL % 2 özel jel üzerinde çalıştırın. Kütüphanede bir smear 200-600 arası sinyal çoğunluğu ile göstermelidir bp (şekil 6) ve hiçbir amplifikasyon kontrolü reaksiyon için.
  5. PCR ürünleri arıtma.
    Not: genomik kitaplıkları için üreticinin yönergelerini izleyerek bir PCR arıtma kiti ile temizleyin. DNA 30 µL elüsyon arabelleği ile elute.
  6. Bir yer kullanarak DNA toplama ölçmek. Ortalama 2-3 defa okundu.
  7. Her kitaplık için 15 veya 20 ng aşağıdaki denklemi kullanarak eşdeğer hacmi hesaplamak:
    Equation 3
  8. Birlikte önceki hesaplamalara göre tüm kitaplıkları mix. Aşağıdaki Web sitesinin denklem ile DNA'ın molar konsantrasyonu belirlemek:
    http://www.molbiol.edu.ru/ENG/Scripts/01_07.html
    Dikkat: Sıralama platformda DNA toplama ve hacim gereksinimleri bağlıdır.

4. yüksek üretilen iş sıralama ve veri analizi

  1. Sıralama
    1. Kitaplıkları özel sıralama astar pMargent3 ve standart ticari sıralama astar kullanarak 64 bp tek taraflı kenar okuma sıra. Sıralama platformu FastQ dosyaları tüm sıralama okuma ile sağlayacaktır.
  2. Galaxy yazılım ile analiz
    1. Genom dizisi dosya indirmek
      1. SpiroScope veritabanı ana içinde (bkz. Adım 1.2.7 bağlantı için), deneme için kullanılan organizma seçin ve "Yük içine GENOM BROWSER"'ı tıklatın.
      2. (Ana sayfasının üst) yakın araç içinde "arama/ihracat > Download veri", "genom dizisi indirmek için" "Sequence (fasta)" satırını tıklatın.
      3. Not defteri (PC) veya TextEdit (Mac) ile dosyayı açın ve kromozom (örneğin "bedeni") yeniden adlandırın. Fasta biçimini koruyun.
      4. Kromozom II dizisini indirmek için aynı adımları izleyin. Her iki kromozom dizileri bir tek .txt dosyasına kopyalayıp yapıştırarak birleştirin.
        Not: Kromozom dizileri de (https://www.ncbi.nlm.nih.gov) NCBI Web sitesinden indirilebilir ve kombine içine bir tek .txt eğe.
    2. Dosyalar gökada sunucuya upload
      Not: Galaxy açık kaynak kodlu veri yoğun Biyoinformatik iş akışları27,28,29,30 yönetmek için web tabanlı platformu ve https://usegalaxy.org/-ebilmek var olmak giriş.
      1. Araçlar menüsünden seçin "veri > Upload eğe--dan senin bilgisayar". Sürükleyin ve bırakın penceresinin içine sıralama platformu tarafından oluşturulan dosya/dosyalar .fastq sonra "Başlat".
      2. Leptospira genom dizisi .txt dosya yüklemek için aynı adımları izleyin.
    3. Damat okur
      1. Seçin "NGS: QC ve manipülasyon > FASTQ damat" Araçlar menüsünden.
      2. Damat için dosya yanında adım 4.2.2 yükledi kitaplıkları seçin. Giriş FASTQ Kalite Puanları türü uygun sıralama sistemi seçin. Gelişmiş seçenekler için gelişmiş ofis gizle seçili bırakın.
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    4. Sıralama eserler kaldırmak
      1. Seçin "NGS: QC ve manipülasyon > kaldırmak sıralama eserler". Filtre uygulamak için kütüphane yanındaki 4.2.3 adımda oluşturulan bakımlı dosyaları seçin. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    5. C-kuyruk dizileri kaldırmak
      Not: are çıkarmak bir veya iki kez tüm C-kuyrukları emin olmak için aşağıdaki adımları yineleyin.
      1. Seçin "NGS: QC ve manipülasyon > klip bağdaştırıcısı dizileri".
      2. Seçin veya aşağıdakileri girin:
        Küçük resim kitaplığına: 4.2.4 adımda oluşturulan dosyaları seçin.
        En az sıra uzunluğu: 15
        Kaynak: özel sırasını girin
        Özel kırpma sırasını girin: CCCCCCC
        Bağdaştırıcı dizileri ve onu takip x üsleri tutmak için sıfır olmayan değer girin: 0
        Bilinmeyen (N) üsleri sıralarıyla atmak: Evet
        Çıktı seçenekleri: çıkış kısaltıldı ve sigara kırpılmış dizileri
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    6. Adaptör dizileri kaldırmak
      1. Seçin "NGS: QC ve manipülasyon > klip bağdaştırıcısı dizileri".
      2. Seçin veya aşağıdakileri girin:
      3. Küçük resim kitaplığına: 4.2.5 adımda oluşturulan dosyaları seçin.
      4. En az sıra uzunluğu: 15
      5. Kaynak: özel sırasını girin
      6. Özel kırpma sırasını girin: CGTATGCCGTCTTCTGCTTG
      7. Bağdaştırıcı dizileri ve onu takip x üsleri tutmak için sıfır olmayan değer girin: 0
      8. Bilinmeyen (N) üsleri sıralarıyla atmak: Evet
      9. Çıktı seçenekleri: çıkış kısaltıldı ve sigara kırpılmış dizileri
      10. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    7. Onların kalitesinebakarak filtre defa okundu
      1. Seçin "NGS: QC ve manipülasyon > Kalite göre filtrele".
        Not: Bu araç Kalite Puanları üzerinde temel okuma seçer.
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        Kütüphane filtre uygulamak için: 4.2.6 adımda oluşturulan dosyaları seçin.
        Kalite cut-off değeri: 20
        Kaliteli olması gerekir sıra üsleri yüzde eşit için/gösterilenden daha yüksek kesme: 95
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
        Not: Bu ayarlar ile okunma 20 nükleotit veya 20 Kalite Puanı daha kısa veya daha az devir % 95'i için atılır. Sıkılık ayarları denemeniz için uyum.
    8. Harita32 okur
      1. Seçin "NGS: eşleme > Bowtie2"32.
      2. Aşağıdaki ana penceresindeki alanları seçin:
        Bu tek veya eşleştirilmiş Kütüphane: tek taraflı kenar
        FASTQ dosya: adım 4.2.7 kalitesi için filtre kitaplığı seçin.
        Dosyaları ayırmak için hizalanmamış (fastq biçiminde) okuma yazma: yok
        Dosyaları ayırmak için (fastq biçiminde) hizalanmış okuma yazma: yok
        Başvuru genom geçmişinizden seçin veya yerleşik bir dizin kullanın?: genom Tarih kullanın ve dizini oluşturun
        Başvuru genom seçin: Leptospira genome.txt dosya karşıya adım 4.2.2 seçin.
        Küme grupları bilgi okumak?: ayarlı değil
        SELECT analysis modu: 1: yalnızca varsayılanı ayarlama
        Hazır ayarları kullanmak istiyor musunuz?: Hayır, sadece varsayılan değerlerini kullan
        Bowtie2 eşleme istatistikleri kurtarmak için Tarih: Hayır
        İş kaynak parametreleri: varsayılan iş kaynak parametrelerini kullanmak
      3. "Çalıştır" genom okuyan hizalamak için'ı tıklatın.
    9. Dosyalarını dönüştürme
      1. Seçin "NGS: SAMtools > BAM SAM SAM için BAM dönüştürmek".
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        BAM dosya dönüştürmek için: Select eşlenen adım 4.2.8 kitaplığından.
        Başlık seçenekleri: başlık SAM çıktıda (-h)
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    10. Dosyalarını dönüştürme
      1. Seçin "NGS: SAMtools > SAM aralığına dönüştürmek".
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        Dönüştürmek için veri kümesini seçin: 4.2.9 adımda oluşturulan SAM eşlenen kitaplık dosyasını seçin.
        Tümünü yazdırmak?: Evet
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    11. Sıralama defa okundu
      1. Seçin "Filtre Uygula ve Sırala > verileri artan veya azalan düzende sıralama".
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        Sıralama veri kümesi: 4.2.10 adımda oluşturulan aralığı dosyası seçin.
        sütun: 2
        lezzet ile: numara sırasına
        Her şey: artan
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    12. Kromozom eşleşen okuma seçin ben
      1. Seçin "Filtre Uygula ve Sırala > seçin bir ifade ile eşleşen satırlarını".
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        Satırlarından seçin: 4.2.11 adımda oluşturulan sıralı okuma ile seçme eğe.
        Bu: eşleştirme
        desen: Ben olarak belirlenen kromozom adım 4.2.1.3 (örneğin, "İsa") girin.
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    13. Kromozom II eşleşen okuma seçin
      Adım 4.2.12 devam edin.
    14. Grup okur kromozom eklemeleri sitelere göre
      1. Seçin "birleştirme, çıkarma ve grup > bir sütuna göre gruplamak veri ve diğer sütunlar üzerinde toplama işlemi".
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        Veri seçin:--dan adım 4.2.12 elde edilen dosyayı seçin.
        Sütuna göre grupla: 2
        Dava sırasında gruplandırma görmezden?: Hayır
        Bu karakterlerle başlayan satırları yoksay: Ø
        İşlem > + işlemi Ekle
        Türü: sayısı
        Sütun: 2
        Yuvarlak yakın tamsayı Sonuç: Hayır
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    15. Kromozom II ekleme sitelere göre grup okur
      4.2.14 adım devam edin.
    16. Kromozom üzerinde sıralama ekleme siteleri
      1. Seçin "Filtre Uygula ve Sırala > verileri artan veya azalan düzende sıralama".
      2. Aşağıdakilerden birini seçin:
        Sıralama veri kümesi: Seçme eğe--dan adım 4.2.14.
        sütun: 1
        lezzet ile: numara sırasına
        Her şey: artan
      3. "Çalıştır" seçeneğini tıklatın.
    17. Sıralama ekleme sitelerinde kromozom II
      Adım 4.2.16 devam edin.
  3. İstatistiksel analiz
    1. Galaxy veri kopyalayıp yapıştırarak adımları 4.2.16 iki sütunlarından elektronik tablo dosyaları aktarın. ve 4.2.17. bir Excel dosyasına.
      Not: İlk sütun transposon ekleme sitesi nükleotit koordinatı ve okuma sayısı, her ekleme sitede ikinci sütundur.
    2. Tabloda sağlanan nükleotit koordinat kullanarak transposon yataklık gen tanımlayın.
      Not: Örneğin, kromozom nükleotit #30718 eklenen bir transposon ben bu I nükleotit 29263-31539 içinde kromozom yayılan LIC10024 gen içinde bulunan.
    3. Her mutant her doku ve aşağıdaki denklemi aşağıdaki giriş havuzun için göreli frekans (F) hesaplamak:
      Equation 4
    4. Çıkış/giriş oranları (R) her mutant ve aşağıdaki denklemi kullanarak doku için Hesapla:
      Equation 5
    5. Wilcoxon imzaladı-rank testi
      1. Tüm çıkış/giriş oranları her hayvan 1.0 her doku için medyan oranını ayarlayarak normalleştirmek. 1.0 oranında tarafsızdır > 1.0 dezavantajlı, ve < 1.0 avantajlı33olduğunu.
      2. Çıkış/giriş oranları 1.0 (nötr fitness) P değerleri ile Wilcoxon rank testi kullanarak karşılaştırmak < 0,05 istatistiksel olarak anlamlı kabul.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

L. interrogans içinde transposon mutantlardan konjugasyon Kütüphanesi oluşturulması filtrasyon ünitesi, şekil 1' de gösterildiği gibi gerektirir. Biz 100-200 transconjugants her çiftleşme kurtarıldı.

Transposon ekleme site her mutant transposon sonu hedefleyen yarı rastgele PCR tarafından oluşturulan PCR ürünü sıralama tarafından tanımlanır ve bitişik ev sahibi15 (şekil 2A) serileri. Yarı rastgele PCR sonuçlarını örneği şekil 2Biçinde gösterilir. Çoğu durumda bir baskın amplicon Deg1 ve Tnk1 astar PCR ve etiketi ve TnkN1 ilk turu için ikinci tur için kullanıldığında gözlenir. Ancak, pentameric sıra (... düşük özgüllük nedeniyle N10GATAT-3') Deg1 astar 3' sonunda leptospiral genom boyunca birden çok yerlerde bu ilk tavlamak. Bu siteler transposon sonuna yakın varsa, birden çok PCR ürünü temin edilebilir. Birden çok amplicons oluşturulduğunda, birlikte PCR karışımından saflaştırılmış ve doğrudan sıralı; aynı sıra aşağı nerede TnkN1 astar anneals, tüm içerdikleri için her amplicon jel arıtma gerekli değildir. Öte yandan, transposon sonunda büyük bir mesafeden Deg1 astar tarafından hedef sırasının en yakın kopya almaktadır PCR başarısız olabilir. PCR ürün algıladıysa, yarı rastgele PCR ilk turunda Deg1 astar ve transposon karşı tarafındaki diğer ucuna hedefleyen Tnk2 astar ile tekrar edilebilir. Bu durumda TnkN2 ile etiket ikinci tur için kullanılacaktır; amplicon TnkN2 astar (şekil 2B) ile sıralı. Alternatif olarak, PCR ilk turunda 2 astar ile olan 3' ucu (... yapılabilir N10TCTT-3') bir dört - yerine beş-nükleotid dizisi hedefler. Astar dört farklı kümesini PCR (PCR #1) ilk turu için kullanılabilir: Tnk1 + Deg1, Tnk1 + 2, Tnk2 + Deg1, Tnk2 + 2. Astar bir dizi işe yaramazsa, başka bir set kullanın. Şu anda da başarısız ayarlarsanız, bir tane ve benzeri kullanın. Spontan sefaloridin dayanıklı mutant çok nadirdir ve bir frekansta ortaya < 10-10 34.

Genomik kitaplıkları (şekil 4) hazırlanması sırasında birkaç adım doğrulanabilir. DNA sonication tarafından kesme Elektroforez, bir aliquot içinde bir özel jel (şekil 5) tarafından onaylanması. DNA'ın doğru yaşadığı zaman, 200 ile 600 bp yerine getirecek kadar DNA parçalarının bir % 2 özel jel bir smear oluşturur. Kütüphaneleri yüksek üretilen iş sıralama için göndermeden önce iç içe geçmiş PCR reaksiyonları tarafından PCR ürünlerinin üretimi özel Jel Elektroforez (şekil 6) tarafından onaylanması gerekiyor.

Burada açıklanan protokol sonrası sıralama okuma (Bölüm 4.2.) işledikten sonra her mutant giriş havuzu ve tüm dokularda sıklığını ve bölümü 4.3.3 denklemi kullanılarak belirlenir. Her mutant her bir doku için çıkış/giriş oranı bölümünde 4.3.4 denklem ile hesaplanır. Şekil 7 Tn-Seq yaklaşımı ile elde edilen sonuçlar bir örneği gösterilir. Alternatif olarak, macenta aracı işlemek ve sıralama veri 31analiz etmek için kullanılabilir. Mutantlar istatistiksel olarak önemli ölçüde azaltılmış ve artan fitness ile tespit edilmiştir. Neden olduğu bilinen leptospiral virülans genlerdeki mutasyonlar fitness, Tn-Seq yaklaşım doğrulama azaltılmış.

Figure 1
Şekil 1: fiil için kullanılan filtrasyon ünitesi. Filtrasyon ünitesi bir yan kol Erlenmeyer flask, filtre destek tıpa ekleyerek steril forseps, o zaman huni kaidenin üzerine yerleştirerek ve bir mengene ile sistem güvenliğini sağlama ile selüloz asetat filtre kaidenin üzerine konumlandırma toplandı . Filtrasyon ünitesi sonra vakum sisteme bağlı. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 2
Resim 2: transposon ekleme siteleri tanımlaması. Yarı rastgele PCR astar tavlama siteleri gösterilen(a)şeması. Tnk1 ve Tnk2 astar ters transposon (Tn) sonuna yakın tavlamak. Deg1 vasıl belgili tanımlık son 3' GATAT sıra ardından 10 dejenere nükleotit bir streç içeren 35-nükleotit ilk okuma kitabıdır. PCR (PCR #1) ilk turunda Deg1 ve Tnk1 ile veya Deg1 ile yönetilir ve PCR #2 için de kullandığınız Tnk2. TnkN1 ve TnkN2 astar transposon biter ve Tnk1 ve Tnk2, arasında sırasıyla tavlamak. Etiket astar 5' uç Deg1 astar için özdeş dizisidir. (B) örnek özel jel elde edilen PCR ikinci tur 14 transposon mutantlar (şerit 1-14) ile sonra. PCR ilk turunda Deg1 ve Tnk1 ile gerçekleştirildi; TnkN1. pozitif PCR tarafından temsil edilir ve ikinci tur etiketi ile yapıldığı "+" ve bir negatif PCR tarafından "-". "KmR"sefaloridin direnç kaset temsil eder. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 3
Şekil 3: çıkış havuzu elde etmek için akış şeması. Meydan okuma (0 gün) günü, her leptospiral mutant darkfield mikroskobu tarafından sayılır, aynı yoğunlukta seyreltilmiş ve giriş Havuzu (2.1 sağlanan ayrıntıları) oluşturmak için bir araya. Hamster intraperitoneally giriş havuzuyla zorlanmaktadır. Buna ek olarak, üç kültürleri ile giriş havuzu başlanmıştır. Aşılama (0 gün) gün ve kültürler ≈ yoğunluğu ulaştığınız zaman 108/mL, giriş havuzu ve kültürler Santrifüjü tarafından toplanan ve granül-80 ° c olarak kadar kullanmak (bakınız Bölüm 2.3) depolanır. Bitiş noktası gün (hayvanlar, örneğin, meydan okuma sonra 4 gün sonlandırmak için önceden gün), hayvan are euthanized; Kan, böbrek ve karaciğer toplanan ve-80 ° C'de kadar kullanmak (bakınız Bölüm 2.4) depolanır. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 4
Şekil 4: akış şeması genomik Kütüphanesi hazırlık. (A)DNA kan, doku veya 3.1 bölümünde açıklanan protokol sonrası kültürler ayıklanır. Kırmızı bir kutu transposon (Tn) temsil eder. (B) DNA sonication 200 ile 600 bp arasında parçalara tarafından sheared. Daha fazla bilgi Bölüm 3.2 sağlanır. (C) C-kuyrukları (sarı kutuları) tüm DNA parçalarının terminal deoksinükleotidil transferaz (3.3 bölümünde açıklandığı gibi TdT) ve Tablo 4 ile eklenir. Genomik Kütüphanesi sıralama için iç içe geçmiş PCR (D-E) tarafından hazırlanır. PCR ilk turunda transposon ve C-kuyruk, özel TnkN3 ve olj376 astar ile sırasıyla gerçekleştirilir. Bkz. Tablo 3 ve 5. Tek parça transposon biter (kırmızı kutu) içeren güçlendirilmiş. Not: tüm DNA parçalarının C-kuyrukları yok çünkü TnkN3 daha 3 kat daha fazla olj376 astar kullanın. PCR ikinci turunda pMargent2, transposon son ve astar dizin oluşturma, bir tek sıralama şeritte multiplexed tüm örnekler sağlayan bir altı-temel-çift barkod sırayla (pembe) içeren bir için belirli ile yapılır. Bkz. Tablo 3 ve 6. Her iki astar sıraları (yeşil ve mor kutusu) sıralama Illumina sırasında akış hücreli bağlama için gerekli içerir. (F) elde edilen PCR ürünleri temizlenir ve onların konsantrasyon 3.6 bölümünde açıklandığı gibi sonra ölçülür. (G) tüm genomik kitaplıkları havuza birlikte; Her kitaplık farklı bir barkod vardır ve (H) havuz sıralama platforma gönderilir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 5
Şekil 5: DNA Sonication. DNA üzerinden sonicated ve % 2 özel Jel Elektroforez tarafından muayene sekiz virüslü hamster (yolları 1-8), karaciğer saflaştırıldı. Yamultulmuş DNA parçaları çoğunu boyutu 200 ile 600 bp. arasında olduğu bir smear karakterize Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 6
Şekil 6: yüksek işlem hacmi sıralama için genomik kitaplıkları. Genomik kitaplıkları Ibisevic'in PCR ile DNA kandan sekiz virüslü hamster (şerit 1-8) tarafından hazırlanan ve % 2 özel Jel Elektroforez tarafından muayene etti. PCR ürünlerin çoğu 200 arasında büyüklüğünde ve hiçbir amplifikasyon (gösterilmez) (PCR 1 karışımında yok TnkN3 astar bkz: Tablo 5) 600bp. negatif bir denetimi gösterir. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Figure 7
Şekil 7: Fitness Tn-Seq deneme mutantların. Hamster'ın böbrek mutantların havuzundan Fitness 4 gün sonra (Lourdault'ın çalışma17uyarlanmıştır) meydan okuma. Tüm 42 mutantlar çıkış/giriş oranı her hayvan için tespit edilmiştir. Her mutant gen (LIC) veya intergenic bölgeye göre adlandırılır (Inter) transposon eklenen veya literatürde yaygın olarak kullanılan adı. Her oranı siyah elmas tarafından temsil edilir. Oranları (kırmızı çizgi) sayılarının her mutant için belirlenen ve Wilcoxon rank testi kullanma 1.0 için karşılaştırılır. Noktalı çizgi fitness 1.0, tarafsız, fitness karşılık gelen gösterir. Kimin fitness önemli ölçüde etkilenen mutantlar yıldız tarafından işaretlenir: * P < 0,05; ** P < 0,01. Bu rakam daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için buraya tıklayınız.

Reaktifler Bir tepki için birim
Ana mix 2 X 12.5 ΜL
Astar 1, 10 mM (TnK1 veya TnK2) * 1.2 ΜL
Astar 2, 10 mM (Deg1 veya 2) * 1.2 ΜL
Su 8,8 ΜL
Şablon (hücreleri lysate ya da DNA) 1.3 ΜL
Son hacim 25 µL
* Astar serilerini Tablo 3.

Tablo 1: Transposon ekleme sitesi, yarı PCR 1 karışımlarda tanımlaması.

Reaktifler Bir tepki için birim
Ana mix 2 X 12.5 ΜL
Astar 1, 100 mM (TnKN1 veya TnKN2) * 0.2 ΜL
Astar 2, 100 mM (Tag) * 0.2 ΜL
Su 10,1 ΜL
PCR ürünleri PCR # 1 0.8 ΜL
Son hacim 25 µL
* Astar serilerini Tablo 3.

Tablo 2: Transposon ekleme sitesi, yarı PCR #2 karışımlarda tanımlaması.

Adı Sıra (5' - 3') Başvuru
Yarı rastgele PCR için kullanılan astar
Tnk1 CTTGTCATCGTCATCCTTG 15
Tnk2 GTGGCTTTATTGATCTTGGG
Deg1 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNGATAT
2 GGCCACGCGTCGACTAGTACNNNNNNNNNNTCTT
TnkN1 CGTCATGGTCTTTGTAGTCTATGG
TnKN2 TGGGGATCAAGCCTGATTGGG
Etiket GGCCACGCGTCGACTAGTAC
Illumina sıralama için kullanılan astar
TnkN3 CGGGGAAGAACAGTATGTCGAGCTATTTTTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTGATTGGG 17
olj376 GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGGGGGGGGGGGGGGGG 6
pMargent2 AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA
IP 1 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTGATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT Illumina sıralama (Barkodlarda kalın)
IP 2 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATACATCGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 3 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCCTAAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 4 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGGTCAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 5 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCACTGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 6 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATTGGCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 7 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGATCTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 8 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTCAAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 9 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTGATCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 10 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAAGCTAGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 11 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGTAGCCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 12 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTACAAGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 13 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTGACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 14 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGAACTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 15 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTGACATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 16 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGACGGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 17 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTCTACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 18 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCGGACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 19 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTTTCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 20 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGGCCACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 21 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGAAACGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 22 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCGTACGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 23 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCCACTCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 24 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTACCGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 25 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATATCAGTGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 26 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATGCTCATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 27 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATAGGAATGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 28 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATCTTTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP 29 CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATTAGTTGGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT
IP seq GATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
pMargent3 ACACTCTTTCCGGGGACTTATCAGCCAACCTGTTA 6

Tablo 3: Astar dizileri.

Reaktifler Bir tepki için birim
Yamultulmuş DNA 500 ng (3.3.2 denklemde bkz.)
Su Kadar 14,5 µL
5 x TdT arabellek 4 ΜL
(9,5 mM dCTP + 0,5 mM ddCTP) mix * 1 ΜL
TdT (30 U/µL) 0.5 ΜL
Son hacim 20 µL
* Mix 3 µLof 10 mM ddCTP, 100 mM dCTP 5.7 µL ve su 51.3 µL

Tablo 4: C-takip tepki ile terminal deoksinükleotidil transferaz (TdT).

Reaktifler Bir tepki için birim
Kütüphane tepki Denetim tepki
Master mix 2 x 12.5 ΜL 12.5 ΜL
Astar 1, 30 µM (TnkN3) * 0.5 ΜL -
Astar 2, 30 µM (olj376) * 1,5 ΜL 1.5
Su 7.5 ΜL 8 ΜL
C kuyruklu DNA 3 ΜL 3 ΜL
Son hacim 25 µL 25 µL
* Astar serilerini Tablo 3.

Tablo 5: İnşaat genomik Kütüphanesi, PCR 1 mix.

Reaktifler Bir tepki için birim
Kütüphane tepki Denetim tepki
Master mix 2 x 25 ΜL 12.5 ΜL
Astar 1, 30 µM (pMargent2) * 0.5 ΜL 0,25 ΜL
Astar 2, 30 µM (dizin oluşturma astar) * 0.5 ΜL 0,25 ΜL
Su 23 ΜL 11,5 ΜL
PCR ürünleri PCR # 1 1 ΜL 0.5 ΜL
Son hacim 50 µL 25 µL
* Astar serilerini Tablo 3.

Tablo 6: İnşaat genomik Kütüphanesi, PCR #2 karışımı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Her ne kadar intraperitoneally 42 L. interrogans mutantlarla meydan hamster için bizim pilot deney sonuçlarından17sunulmaktadır, beklediğimiz mutantların büyük havuzları Tn-Seq. tarafından taranması Çünkü transconjugants sıklığı düşüktür (100-200 transconjugants/çiftleşme), birkaç matings mutantlar büyük Tn-Seq deneyler için yeterli sayıda oluşturmak gereklidir. Mutantlar sıvı kültürlerde çok sayıda Bakımı ele alınması gereken lojistik sorunlar sunar. Kültürler derin 96-şey levha inkübe. Kültür yoğunlukları 420 için ayarla Spektrofotometre optik yoğunluk okumalar tarafından izlenen nm. Kullanmak için hayvan sayısı tayini kısmen giriş havuzu boyutuna bağlıdır ve güç analizi tarafından belirlenmelidir. Büyük ölçekli deneyler için güç analizi bir biostatistician danışarak yapılması önerilir.

Performans sorunlarını rasgele mutantlar kurtarma çıkış havuzundan etkileyebilir. Her ne kadar ciddi performans sorunlarını bizim pilot çalışma17 ' (Şekil 7) gözlenen değil, büyük ölçekli deneyler mutantlar rasgele kaybı tarafından etkilenebilir. Mutant giriş havuz başına hücre sayısını artırarak meydan dozu artan performans sorunlarını35olasılığını en aza indirmek olacaktır. Yeni yayımlanan Galaxy aracı MAGenTA darboğazları ve fitness31değerlendirmek için gerekli araç sağlar.

TN-Seq deneyler enfeksiyon, diğer Leptospira için bir alternatif rota suşları planlanmış veya diğer kemirgen modelleri ek hususlar gerektirir. Enfeksiyon ana bilgisayar türlerinde Kinetik bilinmiyor veya enfeksiyon incelenmesine her doku içinde süresince sürekli üstel değil, DNA doku kültürü yerine doğrudan doğruya--dan belgili tanımlık doku alınmalıdır. Bu ek adım overestimates mutant Fitness ölü spirochetes DNA'ın algılama nedeniyle en aza indirmek olacaktır. Çıkış havuzu doku kültürü aldıysanız, giriş havuzu vitro büyüme adresi etkileri kültürlü. Ayrıca mutantlar performans sorunlarını bir endişe olacak olup olmadığını belirlemek için ve büyük ölçekli deneyler için güç analizi yardım etmek için küçük bir dizi ile bir pilot deney öneririz.

Tn-Seq tarafından belirlenen değişmiş uygunluk onayı hayvan modelinde bireysel mutant test gerektirir. Şu anda, her mutantı tek tek ekleme faiz geni taşıyan mutant tanımlamak için Tn-Seq önce sıralı gerekir. Patojenik Leptospira alleli yedek kolay haline gelir, ancak, sıralama bireysel mutant artık gerekli olacaktır. Alternatif olarak, transkripsiyon harekete geçirmek gibi effectors lig genlerin ifadesinde L. interrogans36azaltmak için başarılı bir şekilde kullanılmıştır. Bu teknik aşağı düzenleyen-genleri değiştirilmiş fitness Tn-Seq. tarafından tanımlanan ile mutantlar kesintiye için kullanılabilir

Tn-Seq verileri yorumlarken, bakteri arasındaki etkileşimler dikkate alınması gerekir. Fitness bir düşüş doğrudan etkisi transposon ekleme yerine mutantlar arasındaki rekabet nedeniyle olabilir teorik olarak mümkündür. Ayrıca, bir mutant bir havuzda vivo içinde fitness değişiklik olmayışı mutantlar arasında işbirliği nedeniyle olabilir. Örneğin, bir temel faktör üretmek için başarısız bir mutant intercellularly üretim faktörünün havuzdaki diğer mutantlar tarafından tarafından tamamlanmaktadır. Artık Salmonella enterica37için gösterildiği gibi büyümesi için gerekli olan proteinler sentezleme düşük metabolik yükünü bir sonucu olabilir birkaç mutantlar için fitness bir artış görülmektedir.

Bu iletişim kuralı genlerin metabolizma veya yaşam stresli koşullar vitro 38,39altında yer alan tanımlamak için kullanılabilir. Örneğin, yüksek Sodyum Klorür konsantrasyon, sınırlı demir ve asidik pH gibi farklı koşullarda büyüyen Leptospira genler asidik hayatta kalma ya da stres direnci için sorumlu teşhis edebilir. Bu vitro deneyler da gerçekleştirilir çünkü bu Tn-Seq yöntemi için uygulanabilir L. biflexa gerilme Patoc gibi Saprofit suşları ile ben tüm Leptospira suşları sıralı.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarlar ifşa gerek yok.

Acknowledgments

Bu eser bir gazileri işleri Başarı Ödülü (için D.A.H.) tarafından desteklenen ve bir Ulusal Sağlık Enstitüsü (D.A.H.) R01 AI 034431 verin.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Kanamycin sulfate from Streptomyces kanamyceticus Sigma-Aldrich K4000
2,6-diaminopimelic acid Sigma-Aldrich D1377
Spectinomycin dihydrochloride pentahydrate Sigma-Aldrich S4014
Axio Lab A1 microscope with a darkfieldcondenser Zeiss 490950-001-000
DNeasy blood and tissue kit Qiagen 69504/69506
MinElute PCR Purification Qiagen 28004/28006
QIAquick PCR purification kit Qiagen 28104/28106
Model 505 Sonic Dismembrator Fisher Scientific FB-505
2.5" Cup horn Fisher Scientific FB-4625
Bead Ruptor 24 Omni International 19-010 Step 3.1.2.4
Terminal deoxynucleotidyl transferase Promega M828C
Master mix Phusion Thermo Scientific F531 Preparation of genomic libraries, step 3.4.
DreamTaq Master Mix Thermo Scientific K9011/K9012 Identification of the transposon insertion site, step 1.2.
dCTP Thermo Scientific R0151
ddCTP Affymetrix/ USBProducts 77112
T100 Thermal cycler BioRad 1861096
Qubit 2.0 fluorometer Invitrogen Q32866 step 3.6.
Qubit dsDNA HS assay kit Invitrogen Q32851/Q32854 step 3.6.
Qubit assay tubes life technologies Q32856 step 3.6.
PBS pH 7.2 (1X) Gibco 20012-027 20012-050
Disposable scalpel No10 Feather 2975#10
Plastic K2 EDTA 2 ml tubes BD vacutainer 367841
syringe U-100 with 26G x ½” needle BD vacutainer 329652 IP challenge, step 2.2.1.
3 mL Luer-Lok tip syringe BD vacutainer 309657 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25G X 5/8” needle BD vacutainer 305901 Cardiac puncture, step 2.4.2.
25 mm fritted glass base with stopper EMD Millipore XX1002502 Filtration unit system, step 1.1.7.
25 mm aluminum spring clamp EMD Millipore XX1002503 Filtration unit system, step 1.1.7.
15 ml borosilcate glass funnel EMD Millipore XX1002514 Filtration unit system, step 1.1.7.
125 ml side-arm Erlenmeyer flask EMD Millipore XX1002505 Filtration unit system, step 1.1.7.
Acetate-cellulose filter VVPP (pore size 0.1 mm; diameter 25 mm) EMD Millipore VVLP02500

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Murray, G. L., et al. Genome-wide transposon mutagenesis in pathogenic Leptospira species. Infect Immun. 77 (2), 810-816 (2009).
  2. Adler, B., Lo, M., Seemann, T., Murray, G. L. Pathogenesis of leptospirosis: the influence of genomics. Vet Microbiol. 153 (1-2), 73-81 (2011).
  3. Marcsisin, R. A., et al. Use of a high-throughput screen to identify Leptospira mutants unable to colonize the carrier host or cause disease in the acute model of infection. J Med Microbiol. 62, 1601-1608 (2013).
  4. van Opijnen, T., Bodi, K. L., Camilli, A. Tn-seq: high-throughput parallel sequencing for fitness and genetic interaction studies in microorganisms. Nat Methods. 6 (10), 767-772 (2009).
  5. van Opijnen, T., Lazinski, D. W., Camilli, A. Genome-wide fitness and genetic interactions determined by Tn-seq, a high-throughput massively parallel sequencing method for microorganisms. Curr Protoc Microbiol. 36, 1E.3.1-1E.3.24 (2015).
  6. Troy, E. B., et al. Understanding barriers to Borrelia burgdorferi dissemination during infection using massively parallel sequencing. Infect Immun. 81 (7), 2347-2357 (2013).
  7. Wunder, E. A. Jr, et al. Real-time PCR reveals rapid dissemination of Leptospira interrogans after intraperitoneal and conjunctival inoculation of hamsters. Infect Immun. 84 (7), 2105-2115 (2016).
  8. Lourdault, K., Aviat, F., Picardeau, M. Use of quantitative real-time PCR for studying the dissemination of Leptospira interrogans in the guinea pig infection model of leptospirosis. J Med Microbiol. 58, 648-655 (2009).
  9. Coutinho, M. L., et al. Kinetics of Leptospira interrogans infection in hamsters after intradermal and subcutaneous challenge. PLoS Negl Trop Dis. 8 (11), e3307 (2014).
  10. Athanazio, D. A., et al. Rattus norvegicus as a model for persistent renal colonization by pathogenic Leptospira interrogans. Acta Trop. 105 (2), 176-180 (2008).
  11. Ratet, G., et al. Live imaging of bioluminescent Leptospira interrogans in mice reveals renal colonization as a stealth escape from the blood defenses and antibiotics. PLoS Negl Trop Dis. 8 (12), e3359 (2014).
  12. Gutierrez, M. G., Yoder-Himes, D. R., Warawa, J. M. Comprehensive identification of virulence factors required for respiratory melioidosis using Tn-seq mutagenesis. Front Cell Infect Microbiol. 5 (78), (2015).
  13. Gawronski, J. D., Wong, S. M., Giannoukos, G., Ward, D. V., Akerley, B. J. Tracking insertion mutants within libraries by deep sequencing and a genome-wide screen for Haemophilus genes required in the lung. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (38), 16422-16427 (2009).
  14. Gallagher, L. A., Shendure, J., Manoil, C. Genome-scale identification of resistance functions in Pseudomonas aeruginosa using Tn-seq. MBio. 2 (1), (2011).
  15. Slamti, L., Picardeau, M. Construction of a library of random mutants in the spirochete Leptospira biflexa using a mariner transposon. Methods Mol Biol. 859, (2012).
  16. Picardeau, M. Conjugative transfer between Escherichia coli and Leptospira spp. as a new genetic tool. Appl Environ Microbiol. 74 (1), 319-322 (2008).
  17. Lourdault, K., Matsunaga, J., Haake, D. A. High-throughput parallel sequencing to measure fitness of Leptospira interrogans transposon insertion mutants during acute infection. PLoS Negl Trop Dis. 10 (11), e0005117 (2016).
  18. Ellinghausen, H. C., McCullough, W. G. Nutrition of Leptospirapomona and growth of 13 other serotypes: Fractionation of oleic albumin complex and a medium of bovine albumin and polysorbate 80. Am J Vet Res. 26, 45-51 (1965).
  19. Johnson, R. C., Harris, V. G. Differentiation of pathogenic and saprophytic letospires. I. Growth at low temperatures. J Bacteriol. 94 (1), 27-31 (1967).
  20. Demarre, G., et al. A new family of mobilizable suicide plasmids based on broad host range R388 plasmid (IncW) and RP4 plasmid (IncPa) conjugative machineries and their cognate Escherichia coli host strains. Res Microbiol. 156 (2), 245-255 (2005).
  21. Vallenet, D., et al. MicroScope: a platform for microbial genome annotation and comparative genomics. Database (Oxford). , bap021 (2009).
  22. Goodman, A. L., Wu, M., Gordon, J. I. Identifying microbial fitness determinants by insertion sequencing using genome-wide transposon mutant libraries. Nat. Protocols. 6 (12), 1969-1980 (2011).
  23. Miller, J. Spirochetes in body fluids and tissues manual of investigative methods. , 22-23 (1971).
  24. Ristow, P., et al. The OmpA-like protein Loa22 is essential for leptospiral virulence. PLoS Pathog. 3 (7), (2007).
  25. Croda, J., et al. Targeted mutagenesis in pathogenic Leptospira species: disruption of the LigB gene does not affect virulence in animal models of leptospirosis. Infect Immun. 76 (12), 5826-5833 (2008).
  26. Haake, D. A. Hamster model of leptospirosis. Curr Protoc Microbiol. 12, 2 (2006).
  27. Giardine, B., et al. Galaxy: a platform for interactive large-scale genome analysis. Genome Res. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  28. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biol. 11 (8), R86 (2010).
  29. Blankenberg, D., et al. Galaxy: a web-based genome analysis tool for experimentalists. Curr Protoc Mol Biol. (Chapter 19), 11-21 (2010).
  30. Afgan, E., et al. The Galaxy platform for accessible, reproducible and collaborative biomedical analyses: 2016 update. Nucleic Acids Res. 8 (44), (2016).
  31. McCoy, K. M., Antonio, M. L., van Opijnen, T. MAGenTA; a Galaxy implemented tool for complete Tn-Seq analysis and data visualization. Bioinformatics. , 1367 (2017).
  32. Langmead, B., Trapnell, C., Pop, M., Salzberg, S. L. Ultrafast and memory-efficient alignment of short DNA sequences to the human genome. Genome Biol. 10 (3), R25 (2009).
  33. Kamp, H. D., Patimalla-Dipali, B., Lazinski, D. W., Wallace-Gadsden, F., Camilli, A. Gene fitness landscapes of Vibrio cholerae at important stages of its life cycle. PLoS Pathog. 9 (12), e1003800 (2013).
  34. Poggi, D., Oliveira de Giuseppe, P., Picardeau, M. Antibiotic resistance markers for genetic manipulations of Leptospira spp. Appl Environ Microbiol. 76 (14), 4882-4885 (2010).
  35. van Opijnen, T., Camilli, A. Transposon insertion sequencing: a new tool for systems-level analysis of microorganisms. Nat Rev Microbiol. 11 (7), 435-442 (2013).
  36. Pappas, C. J., Picardeau, M. Control of gene expression in Leptospira spp. by Transcription activator-like effectors demonstrates a potential role for LigA and LigB in Leptospira interrogans virulence. Appl Environ Microbiol. 81 (22), 7888-7892 (2015).
  37. Koskiniemi, S., Sun, S., Berg, O. G., Andersson, D. I. Selection-driven gene loss in bacteria. PLoS Genet. 8 (6), e1002787 (2012).
  38. Troy, E. B., et al. Global Tn-seq analysis of carbohydrate utilization and vertebrate infectivity of Borrelia burgdorferi. Mol Microbiol. 101 (6), 1003-1023 (2016).
  39. Ramsey, M. E., et al. A high-throughput genetic screen identifies previously uncharacterized Borrelia burgdorferi genes important for resistance against reactive oxygen and nitrogen species. PLoS Negl Trop Dis. 13 (2), e1006225 (2017).

Tags

İmmünoloji sayı: 130 yüksek-verimi sıralama rastgele mutagenesis iç içe geçmiş PCR konjugasyon Leptospira fitness mutantlar Kütüphane
Yüksek üretilen iş paralel sıralama ölçü Fitness <em>Leptospira interrogans</em> Transposon ekleme mutantlar sırasında altın Suriye Hamster enfeksiyon için
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lourdault, K., Matsunaga, J.,… More

Lourdault, K., Matsunaga, J., Evangelista, K. V., Haake, D. A. High-throughput Parallel Sequencing to Measure Fitness of Leptospira interrogans Transposon Insertion Mutants During Golden Syrian Hamster Infection. J. Vis. Exp. (130), e56442, doi:10.3791/56442 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter