Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Immunology and Infection

متعدد الوسائط التصوير النهج استناداً إلى التصوير المقطعي الجزيئية الصغيرة-الأشعة المقطعية والأسفار لتقييم طولية لتليف الرئة الناجمة عن بليوميسين في الفئران

doi: 10.3791/56443 Published: April 13, 2018

Summary

يصف لنا النقل المتعدد الوسائط غير الغازية التصوير النهج القائم على التصوير المقطعي الجزيئية الصغيرة-الأشعة المقطعية والأسفار لتقييم طولية من طراز تليف الرئة الماوس الناجم عن تقطير إعطاء مزدوجة من بليوميسين.

Abstract

تليف رئوي مجهول السبب (IPF) هو مرض الرئة قاتلة تتميز بتدمير بنية الرئة، مما يسبب تدهورا كبيرا في وظائف الرئة والوفاة اللاحقة من فشل في الجهاز التنفسي تدريجيا ولا رجعة فيها.

وقد حملت الآلية المرضية للفريق الحكومي الدولي في نماذج حيوانية تجريبية بليوميسين الإدارة. في هذه الدراسة، ونحن التحقيق طراز ماوس مثل الفريق الحكومي الدولي الناجم عن تقطير بليوميسين إعطاء مزدوجة. تقييمات النسيجي القياسية المستخدمة لدراسة تليف الرئة إجراءات المحطة الغازية. والهدف من هذا العمل رصد تليف الرئة عن طريق موسع تقنيات التصوير مثل التصوير المقطعي الجزيئية الفلورسنت (FMT) والصغرى-قيراط يمكن أن تمثل هذه التقنيات اثنين التحقق من صحتها مع النتائج التي توصل إليها علم الأنسجة ثورية وظيفية لرصد الوقت الحقيقي غير الغازية من شدة المرض الحكومي والتقدم. الدمج بين نهج مختلفة تمثل خطوة أخرى لفهم هذا المرض الحكومي، حيث يمكن ملاحظة الأحداث الجزيئية التي تحدث في حالة مرضية مع معاهدة المواد الانشطارية، ويمكن رصد التغيرات التشريحية اللاحقة بالدقيقة-قيراط

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

تليف رئوي مجهول السبب (IPF) مرض الرئة المزمن مع الانخفاض التدريجي لوظائف الرئة التي للأسف غالباً ما تكون قاتلة في غضون أربع سنوات من تشخيص1. السمات الرئيسية لمقترحات ترسب المصفوفة خارج الخلية، وانتشار تنتجها الخلايا الليفية، ولكن الآلية المرضية غير مفهومة تماما حتى الآن. الفرضية الأكثر المعتمدة هو أن دورات متعددة لإصابات الرئة يسبب تدمير الخلايا الظهارية السنخية تؤدي إلى تغيير انتشار دورة الخلية الوسيطة، وتراكم مبالغ فيها الخلايا الليفية وميوفيبروبلاستس، و مصفوفة زيادة الإنتاج. الوسطاء المتورطين في هذه العمليات مثل مصفوفة ميتالوبروتيناسيس (يتولى) وقد تم العثور على dysregulated في التليف التنمية البشرية الحكومي أو في النماذج الحيوانية المستحثة بليوميسين. إنتاج نظام التمثيل التناسبي المختلط غير المنضبط يؤدي إلى ترسيب الكولاجين غير متوازن داخل الرئة إينتيرستيتيوم والفضاء السنخية، محاكاة الجرح غير طبيعي إصلاح1،2.

واحدة من العقبات الرئيسية لاكتشاف المخدرات والتنمية هو توافر نماذج الماوس موجوداً التي تحاكي البشرية المرضية والنمط الظاهري المرض. عوامل مختلفة قد استخدمت للحث على تليف الرئة في نماذج حيوانية: أضرار الإشعاع، وإدارة الأسبستوس ووالسليكا، الإدارة من السيتوكينات فيبرينوجينيك و3،بليوميسين4؛ لكن بليوميسين الأكثر استخداماً في الفئران، خنازير غينيا، الهامستر، الأرانب5 الجرذان، أو في الحيوانات الكبيرة (الرئيسيات غير البشرية والخيول والكلاب والحيوانات المجترة)6،7. هو مضاد حيوي أدلى به بكتيريا فيرتيسيلوس متسلسلة8 بليوميسين ويستخدم ك عامل مضاد لسرطان9. التليف الرئوي أحد آثار الجانبية شائعة للدواء ولهذا السبب، ويتم استخدامه في نماذج حيوانية تجريبية للحث على التليف الرئوي.

في نماذج تليف الرئة الناجمة عن بليوميسين، تحدث الآفات تليفية بعد الإدارة بليوميسين 14-21 يوما. في الأعمال المعروضة، استخدمنا بروتوكولا جديداً لحمل تليف الرئة في الفئران بتقطير إعطاء بليوميسين مزدوجة. الطراز الماوس بليوميسين هو وقتاً طويلاً جداً للعقاقير الجديدة بحاجة إلى تقييم على آفات تليفية الراسخة، واختبار للتمييز بين آثارها تليفية المضادة الآثار المضادة للالتهابات.

البيوكيميائية تحديد محتوى الكولاجين، مورفوميتريكال والتحليل النسيجي استندت إلى تحليل ما بعد الوفاة، يحد من إمكانية متابعة الآلية المرضية لهذا المرض في الحيوان نفسه. على الرغم من أن تعتبر هذه البارامترات معيار الذهب لتقييم التليف، أنها لم تقدم أي التوزيع المكاني أو الزماني للآفة تليفية ويحول دون وسيلة للتحقيق في عملية تطور المرض. 10

في الآونة الأخيرة، قد طبقت تقنيات التصوير غير الغازية لمراقبة إعادة عرض مجرى الهواء، والتهاب، وتقدم التليف في نماذج مورين: "التصوير بالرنين المغناطيسي" (التصوير بالرنين المغناطيسي)، والتصوير المقطعي بالكمبيوتر الصغير (الصغرى-CT)، Fluorescence الجزيئية التصوير المقطعي (FMT) وطرحه (BLI)11،،من1213،14،15،16،،من1718،19 ،،من2021. أننا نقترح نهجاً تصوير غير الغازية لرصد التقدم تليف الرئة بمعاهدة المواد الانشطارية والصغرى-CT في نقاط زمنية مختلفة بعد تحدي بليوميسين22طوليا.

مسارات عديدة تشارك في إنشاء وتطوير التليف، ولا يعرف الكثير. يمكن ترجمة فقط إلى فهم أعمق لهذه العمليات إلى المزيد من الأهداف المخدرات التي قد نقل إلى المستشفى. القدرة على رصد تفعيل نظام التمثيل التناسبي المختلط طوليا بالتصوير المقطعي الجزيئية الأسفار بالإضافة إلى الكشف عن التغييرات متني الرئة بالأشعة المقطعية الصغرى قد تستعمل في المستقبل الوصول إلى الاستجابة السريرية للمعالجة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

جميع التجارب على الحيوانات المبينة في هذا التقرير قد وافقت لجنة الرفق بالحيوان داخلية للتجارب الحيوانية فارماسيوتيسي كايسي وايراسموس مولودية تحت رقم البروتوكول: EMC 3349 (138-14-07) الامتثال "رق" 63/2010 التوجيه الأوروبي، أقر الإيطالية 26/2014 و "دليل لرعاية واستخدام لمختبر الحيوانات" المنقحة23.

ملاحظة: قبل الاستخدام، الإناث من الفئران C57Bl/6 (7-8 أسابيع من العمر) الفطرية كانت أقلمة لمدة 7 أيام على الأقل للظروف المحلية فيفاريوم (درجة حرارة الغرفة: 20-24 درجة مئوية؛ والرطوبة النسبية: 40-70%؛ ودورة الضوء الظلام 12-ح)، إمكانية الوصول مجاناً إلى تشو القوارض القياسية و خففت من ماء الصنبور.

1-إعطاء معاملة الفئران مع بليوميسين

  1. إعداد المعدات لتقطير داخل الرغامى12،،من1314.
  2. وضعت الفئران في قاعة مخدر متصلاً المبخر isoflurane المحددة في 2.5% مختلطة مع الأكسجين. التحقق من وجود عمق التخدير بسبب عدم استجابة قرصه أخمص القدمين. حدث تأثير التخدير بعد 3-5 دقائق.
  3. ضع الماوس أنيسثيتيزيد على منصة تنبيب، معلقة عليه بالقواطع وضعها على السلك.
  4. تشغيل المنظار وأخذ زوج من كليلة الملقط المنتهية واستخدام أما الملقط أو تلميح بالمنظار لفتح الفم بلطف.
  5. سحب اللسان والاحتفاظ بها إلى الجانب مع الملقط. ضع شفرة المنظار نحو الجزء الخلفي الفم حتى يتم تصور فتح القصبة الهوائية والاحتفاظ المنظار في المكان.
  6. ناحية أخرى، مع إدراج إيصال أنبوب متصل بنهاية الأنبوب PE إلى القصبة الهوائية، تناوب صمام ثلاثي. تسليم 50 ميليلتر من بليوميسين (0.020 ميكروغرام/الماوس). بعد تقطير، بسرعة إزالة الأنبوب من القصبة الهوائية لمنع الاختناق. عقد الفئران تستقيم لبضع ثوان.
    1. إدارة إينتراتراتشيلي بليوميسين في اليوم 0 وكرر في يوم 4 (الشكل 1).
  7. إزالة الماوس من منصة تنبيب ورصد الماوس لمدة 30 دقيقة (الوقت اللازم للتعافي تماما من التخدير).
  8. أداء في فيفو تصوير الرئتين الفئران بمعاهدة المواد الانشطارية والصغرى-CT بعد تقطير بليوميسين مزدوجة في اليوم 7 و 14 و 21.

2-التصوير في فيفو بواسطة "التصوير المقطعي Fluorescence الجزيئية"

ملاحظة: تعد مسبقاً، حل أسهم طازجة نمول 6/مل من MMP الحساسة الفلورسنت الركازة 680 في المحلول الملحي (كلوريد الصوديوم 0.9%)، وتخزين محمية من الضوء في 4 درجات مئوية قبل الاستخدام. أنها مستقرة لمدة تصل إلى 6 أشهر في 4 درجات مئوية. يسمح نظام التمثيل التناسبي المختلط التصوير عامل حجته إلى درجة حرارة الغرفة قبل الحقن في الحيوانات.

  1. حقن مسبار
    1. إعداد معدات الحقن الوريدي من الحل مسبار MMP. قبل حرارة المياه عند 50 درجة مئوية لتسخين ذيل الماوس.
    2. أمسك قوة القفا الماوس، اعتبر من ذيله والسماح لها بقبضة غطاء القفص. عقد الفئران عبر الكتفين الحيوان، وضع الذيل في كوب ماء دافئ، 4 كحد أقصى 8 s الضرر الحراري لمنع الإصابة الحرارية للجلد الذيل.  فحص الأوردة تورم للتصور أسهل وغرز الإبرة.
    3. أثناء إجراء الحقن، وضع الفئران في ريسترينير بلاستيكية لإبقائه المطرد وسحب الذيل من خلال فتحه خاصة في الظهر. إيجاد الأوردة والذيلية اثنين على جانبي الذيل؛ لا الشريان في الجانب السفلي الذيل.
    4. إدراج الإبرة (26 ز) من المحاقن 1 مل في هذا السياق. إذا تم وضع الإبرة بشكل صحيح، يكون سهلاً على حقن والحل المسبار سوف يتدفق إلى السفينة.
    5. حقن الحل مسبار MMP 10 مل/كجم.
    6. تجاهل الإبرة.
      ملاحظة: نقطة وقت التصوير الأمثل ح 24 بعد حقن مسبار نظام التمثيل التناسبي المختلط لأنه الوقت المطلوب بالتحقيق لتفعيلها. إذا كان يتم إجراء الدراسات الطولية، الوقت الأمثل إعادة حقن 7 أيام، الذي يسمح بإزالة كاملة للوكيل من الماوس.
  2. تصوير معاهدة المواد الانشطارية
    ملاحظة: قبل البدء، دائماً إزالة الفراء في وحول مناطق الحيوان تصويرها، في هذه الحالة الصدر، لتجنب تشتت وامتصاص في الأنسجة.
    1. لتخدير الماوس ووضعه في غرفة التخدير وتحويل الطلب isoflurane إلى 2.5 في المائة لتحريض و 2% للصيانة.
    2. تهيئة البيانات اقتناء البرمجيات وفتح دراسة جديدة في قاعدة البيانات للتجربة.
    3. قبل البدء التصوير مع معاهدة المواد الانشطارية، نقل الماوس إلى كاسيت التصوير. ضع الماوس أنيسثيتيزيد في منتصف التصوير كاسيت استخدامها على النحو الأمثل في مجال الرؤية لمعاهدة المواد الانشطارية. تبقى الفئران مسطحة وآمنة ومضغوط بلطف ضد كل من ويندوز للكاسيت التصوير. ضبط الارتفاع بالمقابض على الكاسيت ومن ثم أدخلها في محطة الإرساء.
    4. انقر فوق حول هذا الموضوع في إطار المسح الضوئي، وانقر فوق معاينة لرؤية الصورة الحية.
    5. رسم منطقة المسح كبيرة بما فيه الكفاية حتى أن يتم التقاطها الأنسجة المحيطة بالمنطقة المتوقعة للأسفار. بما في ذلك ما مجموعة 25 مسح نقاط الضمانات ستكون منطقة الرئة الممسوحة ضوئياً تماما.
    6. حالما يتم رسم العائد على الاستثمار، أولاً انقر فوق إضافة إلى قائمة انتظار إعادة الإعمار وثم انقر فوق مسح الصورة الماوس. تأكد من أن الليزر الصحيح في 680 نانومتر محدداً.
    7. عندما يتم الانتهاء من الحصول على صورة، ضع الماوس مرة أخرى في قفصة. ومن المؤكد أنه يتعافى تماما من التخدير.
    8. قياس بيكوموليس الأسفار في إطار التحليل برمجيات التحليل باستخدام أداة العائد على الاستثمار وتخفيض العائد على الاستثمار حوالي 700-800 مم3 في إشارة قادمة من منطقة الرئة. كن حذراً لاستبعاد الإشارات الكبد. نسخ دوروا على مواضيع أخرى يكون لهم مماثلة في البعد وضبط وضعها في كل صورة الحيوان.
    9. تصدير الصور كملفات jpg.

3. في فيفو التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى

تنبيه: قبل البدء، دائماً إزالة أي مجوهرات معدنية أو الأجسام المعدنية القريبة مجال التصوير، لتجنب تشتت الأشعة السينية.

ملاحظة: التليف الرئوي الناتج عن الإشعاع استنتاج مشترك خلال الإشعاع الناجم عن إصابة الرئة24. لا الصغرى-CT اشتقاق مؤشرات لا النسيجي النتائج المرتبطة بتليف الرئة كانت موجودة في الفئران مراقبة المعالجة المالحة في يوم 21 تعرض للصغرى-CT أربعة دورات التصوير، مما يشير إلى أن جرعة الأشعة السينية تسليمها للحيوانات خلال مايكرو-CT الامتحانات لم تكن كافية للتأثير على النتائج.

  1. تشغيل مايكرو-الأشعة المقطعية عن طريق الضغط على الزر الأخضر السلطة وإطلاق برامج الاحماء مصدر الأشعة السينية. استخدام تتحمل صغيرة والسرير الحيوان للفئران التصوير.
  2. إنشاء قاعدة البيانات بالنقر فوق قاعدة بيانات جديدة عن واحدة جديدة وبناء المتصفح على أساس عدد من الفئران في التجربة، أو انقر فوق الاتصال بقاعدة بيانات موجودة لحفظ البيانات إلى واحد تم إنشاؤها مسبقاً.
  3. قبل بدء تشغيل المسح الضوئي، حدد لبارامترات في إطار مراقبة البرمجيات: أنبوب الأشعة السينية من الجهد، 90 كيلو فولت؛ أنبوب "الأشعة المقطعية" الحالية، µA 160؛ يعيش أنبوب الأشعة السينية الحالية، µA 80؛ فوف، 36 مم؛ لا يوجد أسلوب النابضة؛ مسح تقنية عالية القرار 4 دقيقة.
  4. تخدير الفئران باستنشاق إيسوفلوراني 3% ووضعها على السرير إدراج تتحمل مع مخروط الآنف توفير إمدادات ثابتة من مخدر. شل الكفوف الفئران مع الشريط على السرير للسماح للصدر ليكون عرضه.
  5. حرك الباب صك وتشغيل وضع العيش لترى موضع الماوس في الوقت الحقيقي عن طريق الضغط على زر الالتقاط. نقل السرير الحيوان محاذاة الصدر مع مجال الرؤية (FOV) باستخدام الأزرار الموجودة مباشرة على الصك CT. مركز مسح على الماوس; أن لم يكن ضبط الموضع مع الأسهم الأيمن والأيسر الموجود على الصك CT.
  6. تأكيد موقف سرير الأمثل بالتناوب الهزال بتحديد 90 ° النقر فوق تعيين. تأكد من أن المنطقة بصورة كاملة داخل فوف.
  7. لا تطبق أية تقنية النابضة وبدء المسح الضوئي عن طريق النقر فوق الزر مسح CT . انقر فوق نعم إلى الرسالة التي يعلم أن مصدر الأشعة السينية سوف تكون قيد التشغيل.
    ملاحظة: بمجرد تشغيل الأشعة السينية، سوف يضيء المصباح البرتقالي على رأس هذا الصك وانزلاق الباب سيكون من المستحيل فتح الأمان للمشغل. بمجرد الانتهاء من المسح الضوئي، تظهر نافذة جديدة من البرنامج عارض 2D تظهر ترانساكسيال وكرونال، وشريحة السهمي لإعادة الإعمار.
  8. التحقق من جودة الصورة وتأكد من لا يكون عدم وضوح الصور من الحركات بسبب المستوى المنخفض للتخدير. إذا لزم الأمر، كرر المسح الضوئي.
  9. ضع الحيوانات مرة أخرى إلى القفص وتأكد من أنها التعافي تماما من التخدير.

4-للفيسيولوجيا الغسل

  1. تخدير الحيوانات مع إيسوفلوراني 3% والتضحية بالنزيف من الشريان الاورطي البطني.
  2. استخدام مقص لفضح في القفص الصدري والرقبة. ثم فضح القصبة الهوائية وجعل شق صغير للسماح بالإجراء BAL المراد تنفيذها مع أنبوب غسل 21-مقياس المرفقة بحقنه 1 مل دون الإبرة. انتبه لا إلى قطع طريق القصبة الهوائية.
  3. للقيام البال، ملء المحاقن 1 مل دون إبرة مع 0.6 مل من محلول معقم [x 10 هانك في متوازنة الحل الملح (حبس)؛ حمض الإيثيلين 100 مم (يدتا)؛ حمض 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic 1 مم (حبيس)؛ المقطر المياه].
  4. إدراج أنبوب الغسل في الشق في القصبة الهوائية وبطء حقن وسحب الحل 3 مرات، التوقف عن انسحاب ثالث للسماح لمجموعة الأمثل من بالف للتحليل اللاحق.

5-علم الأنسجة وهيستومورفوميتري

  1. كشف وإزالة الرئتين، وتضخيم لهم مع قنية من خلال القصبة الهوائية بضخ لطيف مع 0.6 مل فورمالين 10% مخزنة المحايدة وتخزين العينات في درجة حرارة الغرفة ح 24.
  2. يذوي عينات من خلال مقاطع مختلفة من التركيزات المتزايدة لحلول الكحول (الإيثانول 60% ح 1، 70% إيثانول ح 1, الإيثانول 90% ح 1, الإيثانول 95% ح 2، والايثانول 100% ح 2) باستخدام معالج أنسجة تلقائي.
  3. وضع العينات في زيلين نفط ح 2 لجعلها شفافة. في نهاية الجفاف، التسلل عينات في البارافين في 60 درجة مئوية ح 3 وتضمينها في المعالج الآلي.
  4. الحصول على 5 ميكرومتر سميكة المسلسل المقاطع استخدام مبضع دوارة.
  5. ديبارافينيزي وترطيب الشرائح في الدرجات تنازلياً من الإيثانول ووصمة عار مع Trichrome ماسون باستخدام معالج أنسجة تلقائي.
  6. التركيز على شرائح الرئة، المسح الضوئي في 20 X التكبير باستخدام ماسح ضوئي شريحة والتقاط صور رقمية لأقسام الرئة كاملة باستخدام برامج عرض مع قرار من 451 نيوتن متر/بكسل يدوياً.
  7. تقييم شكلياً إصابة الرئة تليفية بمعلمات شبه كمي وكمي على النحو التالي:
    1. تحديد نقاط أشكروفت. شبه كمي الصف التغييرات الشكلية في أقسام الرئة طبقاً لمقياس يحددها أشكروفت10 تعديل بواسطة أوبنر et al. 25 استخدام نظام 0-8 نقاط لتقييم جميع حمة في أقسام الرئة.
    2. تحديد محتوى الكولاجين. قياس درجة التليف10،25 من برمجيات تحليل صورة مجهر. حدد عشوائياً رويس ثلاثة في 10 X التكبير، لكل شريحة. بتوحيد اللون إعدادات العتبة، الكشف عن الكولاجين كمنطقة الملون الأخضر.
    3. تحديد المجال الجوي السنخية. تحديد حجم منطقة إير السنخية كمعلمة غير مباشرة من التليف10،25. عن طريق نفس البرنامج ورويس طلبا للكسر التليف, الكشف عن منطقة الهواء داخل رويس استخدام عتبة بيضاء.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

ولاحظ القرار العفوي للآفات تليف الرئة بعد الإدارة بليوميسين واحدة والتغييرات الهيكلية المعتدلين تسليط الضوء على حدود هذا النموذج ثلاثة أسابيع. يمكن أن يقوم إلا العلاج الوقائي بسبب نافذة علاجية ضيقة تمثل الممارسة السريرية17.

هنا، نحن تبين أن لدينا بروتوكول لتقطير إعطاء بليوميسين مزدوجة قادرة على تطوير طويلة الأمد تليف الرئة في الفئران18. ويبين الشكل 119،،من2021التصميم التجريبي. والهدف من هذه الدراسة إلقاء نظرة على تطور تليف الرئة في الفئران مع تقنيات التصوير موسع. كان بليوميسين إينتراتراتشيلي التي تديرها مرتين (في اليوم 0 و 4؛ 1 مغ/كغ بليوميسين في 50 ميليلتر في كل مناسبة). وكانت الفئران اثنا عشر لكل مجموعة إينتراتراتشيلي وتحدي مع نفس الحجم من السيارة فقط في نفس الوقت كمجموعة بليوميسين لاستخدامه كعنصر تحكم. لتقييم التليف، تحليل النسيجي شبه كمي تم استناداً إلى أشكروفت سجل النظام. 10

في هذا العمل، قمنا بتقييم التنمية تليف الرئة في نموذج المستحثة بليوميسين الماوس باستخدام تكنولوجيا الأشعة المقطعية الصغرى ومعاهدة المواد الانشطارية في تركيبة مع الأنسجة الكلاسيكية. طبيعة موسع للتصوير التكنولوجيات يمثل قيمة حقيقية للتقييم السريري لتطور تليف الرئة والاتفاق وجد مع علم الأنسجة خطوة ممتازة. التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى يمكن أن تلعب دوراً مهما في تحديد مقدار التغييرات متني الرئة بسبب آفات تليفية طوليا.

صور علم الأنسجة بليوميسين تعامل المجموعة أظهرت نمطاً وضوحاً التليف بدءاً من يوم 7، أساسا كالجماهير تليفية واحد، وأحرزت تقدما في يوم 14 إلى تكتلات المتلاقية الكولاجين البديلة وبقيت دون تغيير حتى اليوم 21 ( الأرقام 2 ألف-2 (ج)). العلاج بليوميسين الناجم عن التهاب الرئة (الشكل 3أ) من حيث العدد لمكافحة حرائق آبار النفط كان أعلى بكثير في بالف بليوميسين يعامل الفئران في 7 و 14 و 21 يوما مقارنة بمجموعة مركبة. من المثير للاهتمام، كما زادت الكسور اللمفاويات والوحيدات في كل وقت لأخذ العينات (الأرقام 3 باء-3 ج)؛ وفي المقابل، لوحظت زيادة كبيرة في كسر العَدلات في يوم 7 (الشكل 3د).

في هذه الدراسة، استخدمت الأشعة المقطعية الصغرى لرصد التغييرات حمة الرئة طوليا. التغييرات التشريحية التدريجي بنية الرئة عند نقاط زمنية مختلفة للمراقبة من الأساس يتم رؤيتها بوضوح في إسقاطات الأشعة المقطعية الصغرى (الأرقام 4A-4B). يمكن تحديد نصف قطر مجرى الهواء في الجزء الأعلى من شجرة الشعب الهوائية (الأرقام 5 ألف وجيم 5)19،،من2021 ونسبة تليف الرئة مجموع (5B الأرقام و 5 د) تطور التليف. كان قليلاً المبالغة تقدير نسبة التليف في مجموعة العلاج بليوميسين في يوم 7 (الشكل 5د) إذا ما قورنت بالتهديف علم الأنسجة. ويمكن تفسير ذلك بفعل مزدوج من بداية الالتهاب والتليف، مما يجعل من الصعب التمييز بين أعراض اثنين. نصف قطر مجرى الهواء والنسبة المئوية التليف اختيرت من معالجة الصور من الإسقاطات الصغرى-CT للتحديد الكمي للرئة التغييرات متني (أرقام ج 5-5 د)19،20،21 . هذه المعلمات الجزئي-CT جيدا يتفق مع استنتاجات النسيجي كما هو موضح في الأرقام 2A/2 ج.

الصغرى-الأشعة المقطعية التصوير مباشرة تنعكس التغييرات باثولوجي والعلاجية في حمة الرئة وتكنولوجيا إنتاج المواد الانشطارية وقدمت معلومات كمية أكثر ارتباطاً بتعبير البروتين يحب للفريق الحكومي الدولي. لهذه الدراسة، اخترنا تحقيقا MMP استناداً إلى أهميتها للفريق الحكومي الدولي ووجدنا محددة يتولى التنشيط في بليوميسين يعامل الفئران (الشكل 6)18. دور يتولى تم التحقيق عن طريق حقن المركبات أو بليوميسين يعامل الفئران مع تحقيقات الفلورسنت أكتيفابل نظام التمثيل التناسبي المختلط عند نقطة زمنية محددة. أربع وعشرين ساعة بعد الحقن، الفئران تم تصويرها بمعاهدة المواد الانشطارية تكشف عن أن الفئران تليفية يمكن تنشيط محددة MMP مسبار الفلورسنت في فيفو (الأرقام 6A-6 د)18 و السابقين فيفو (الشكل 6ه)18 .

Figure 1
الشكل 1 : إعداد تجريبية لتليف الرئة الماوس التي يسببها بليوميسين- كان الفئران الإناث C57BL/6 أما المحلول الملحي أو بليوميسين غرست إينتراتراتشيلي في اثنين من مناسبات، اليوم 0 و 4. تم تصويرها الفئران بماسح ضوئي الأشعة المقطعية الصغرى عند خط الأساس (يوم 0)، 7 و 14 و 21 يوما. مجموعات من الفئران 12 تم التضحية بها في 7 و 14 و 21 يوما وقيمت على الرئتين لترسيب الكولاجين للربط بين نتائج النسيجي مع الصور التي حصلت عليها µCT. وقد تم تعديل هذا الرقم من مقالة منشورة21. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 2
الشكل 2: التحليل النسيجي أثناء وقت بليوميسين الناجم عن تليف الرئة في الفئران. 
(أ) التحديد الكمي لتليف الرئة أشكروفت نقاط أما مركبة أو بليوميسين يعامل الفئران في نقاط زمنية مختلفة. وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات وكل نقطة تمثل ± يعني SEM من الحيوانات 12. وقد أجريت التحليل الإحصائي من ANOVA متبوعاً باختبار توكي ل. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01.
(ب) أشكروفت توزيع الترددات درجة تخصص في الفئات الفرعية خفيفة ومتوسطة وشديدة.
(ج) علم الأنسجة التمثيلية من Trichome ماسون في الملون بليوميسين باب إينتراتراتشيلي مزدوجة تغرس الرئة الماوس أو المالحة الفئران المعالجة في 7 و 14 و 21 يوما بعد العلاج (10 X التكبير، مقياس بار 200 ميكرومتر). الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 3
الشكل 3: دورة الوقت تسلل الخلوية في بالف بليوميسين الناجم عن تليف الرئة في الفئران. 
(أ) عدد مكافحة حرائق آبار النفط ووحيدات (ب) ، (ج) الخلايا الليمفاوية والعدلات (د) . وأعرب عن الخلايا الموجودة في بالف كعدد الخلايا * 103/µL. وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات وكل نقطة تمثل ± يعني SEM الحيوانات 9. وقد أجريت التحليل الإحصائي التي تليها الاختبار دونيت ANOVA. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 4
الشكل 4 : إسقاطات التصوير الطولي الجزئي-CT تليف الرئة الناجمة عن بليوميسين ومركبة يعامل الفئران. (أ) الصغرى-CT، بليوميسين تعامل الماوس والماوس (ب) المعالجة الدقيقة-CT، المالحة الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 5
الشكل 5 : شركة الخطوط الجوية وتليف الرئة الفصوص الكمي وتجزئة استناداً إلى التصوير بالأشعة المقطعية الصغرى المتكررة.
(أ) الخطوط الجوية قسمت إلى جزء مركزي والبعيدة. (ب) الجزء الأعلى للخطوط الجوية هي المسالك الخزعات التي تستخدم لتحديد وتقسيم الفصوص الرئة ك: حق الفص الجمجمة (ركرل) وحق الفص الأوسط (رمدل) وحق الفص والذيلية (ركدل)، والحق التبعي الفص (راكل) والرئة اليسرى (ليرة لبنانية). (ج) نصف قطر مجرى الهواء و (د) مجموع القياس الكمي تليف الرئة أما مركبة أو بليوميسين يعامل الفئران في نقاط زمنية مختلفة. وتمثل كل نقطة يعني ± SEM الحيوانات 5، لما مجموعة 30 الفئران. وقد أجريت التحليل الإحصائي التي تليها الاختبار دونيت ANOVA. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من مقالة منشورة21الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Figure 6
الرقم . 6-الوقت بالطبع إشارة الأسفار التي تقاس إينبليوميسين معاهدة المواد الانشطارية الناجمة عن الفئران تليف الرئة. في فيفو (A و B) و السابقين فيفو FMT (C و D) الممثل الصور من الفئران حقن بمسبار MMP تعامل مع السيارة أو مع بليوميسين. (ه) حسبت المبلغ الإجمالي للرئة fluorescence إشارة تلقائياً ببرنامج صورة معاهدة المواد الانشطارية. وتكررت هذه التجربة ثلاث مرات وكل نقطة تمثل المتوسط ± الانحراف المعياري للحيوانات 9. وقد أجريت التحليل الإحصائي التي تليها الاختبار دونيت ANOVA. * ف < 0.05؛ * * ف < 0.01. وقد تم تعديل هذا الرقم من مقالة منشورة18. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

وعلى الرغم من العديد من المجموعات البحثية مع التركيز على تطوير أدوية جديدة لعلاج الحكومي، في هذه اللحظة اثنين فقط المتاحة للمرضى. هناك حاجة طبية عاجلة لإيجاد علاجات أكثر فعالية7 نظراً لأن فقط الرئة ترانسبلانتاتيونيس قادرة على إطالة البقاء على قيد الحياة من 4-5 سنوات26. هو الشرط الأساسي للطب متعدية الجنسيات واستحداث أدوية جديدة توفر نموذج الحيوان الذي يحاكي الميزات للفريق الحكومي الدولي، وفي الدراسات التدخلية التي هي تنبؤية للنجاح في العيادة. ومع ذلك، هو فائدة النماذج الحيوانية الموجودة في التليف الرئوي المثيرة للجدل لا يزال27. علينا تطوير نموذج ماوس جديدة لتليف الرئة، الذي يتطلب من تقطير مزدوجة من بليوميسين كما هو موضح في الشكل 118. تقنيات التصوير أدوات قوية وضع تصور لتطور المرض، والدوائية واستجابة للعلاج. لخص هذا النموذج الحيواني أفضل السمات البشرية للفريق الحكومي الدولي وتكنولوجيات موسع يمكن إنشاء جسر بين إعدادات الإكلينيكية والممارسة السريرية27.

ومع ذلك، للحصول على بيانات قوية واستنساخه، بعض الخطوات ضرورية. يجب أن يتم تقطير إعطاء عند الفئران تماما تخديره، باستخدام إجراءات موحدة. اكتساب الصغير-CT يتطلب مراقبة دقيقة للغاية للتخدير، لأنه يتم عن طريق بوابة الإسقاطات CT من وتيرة التنفس. قبل التصوير، والتحقق من أن الفئران لها نفس العمق من التخدير. خطوة هامة جداً للتصوير الضوئي بواسطة معاهدة المواد الانشطارية هو إزالة الشعر. قبل البدء، دائماً إزالة الفراء وحول الصدر، لتجنب تشتت وامتصاص في الأنسجة. حقن التحقيق يحتاج إلى تصحيح بوزن جسم الحيوان.

إمكانية التحقيق والتحديد الكمي قراءة جزيئية محددة مع التغيرات التشريحية في الفئران نفسها عند نقاط زمنية مختلفة تمثل خطوة كبيرة في فهم التليف التنمية، تقدما واضحا الوظيفية، فضلا عن الدوائية الدراسات.

المتعدد الوسائط هذا التصوير النهج أداة ذكية لتقييم فعالية المخدرات، توفير معلومات أكثر بكثير مقارنة بتقييم المحطة الطرفية، وترجمة في عملية اكتشاف المخدرات أكثر كفاءة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب يعلن أن لديهم لا تضارب في المصالح.

Acknowledgments

الكتاب يود أن يشكر الدكتور دانييلا بومبيليو وروبرتا سيكسيمارا للحصول على مساعدة تقنية.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208, (7), 1339-1350 (2011).
  2. Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18, (7), 1028-1040 (2012).
  3. Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49, (2), 167-179 (2013).
  4. Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. (2017).
  5. Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294, (2), 152-160 (2008).
  6. Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41, (3), 115-134 (2015).
  7. Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
  8. Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65, (3), 422-431 (2002).
  9. Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16, (6), 509-521 (2016).
  10. Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41, (4), 467-470 (1988).
  11. Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
  12. Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14, (1), 226 (2016).
  13. Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7, (6), 39716 (2012).
  14. Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
  15. Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11, (5), 396-404 (2016).
  16. Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21, (1), 15009 (2016).
  17. Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9, (1), 91-98 (2016).
  18. Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
  19. Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7, (1), 340 (2017).
  20. Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53, (1), 8-13 (2015).
  21. Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
  22. Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
  23. Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. National Research Council. Washington DC. (2011).
  24. Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. (2016).
  25. Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44, (4), 507-514 (2008).
  26. King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378, (9807), 1949-1961 (2011).
  27. De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7, (8), 43123 (2012).
متعدد الوسائط التصوير النهج استناداً إلى التصوير المقطعي الجزيئية الصغيرة-الأشعة المقطعية والأسفار لتقييم طولية لتليف الرئة الناجمة عن بليوميسين في الفئران
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).More

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter