Summary
אנו מתארים הדמיה גישה המבוססת על מיקרו-CT וקרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית להערכת האורך של המודל פיברוזיס הריאות העכבר המושרה על ידי החדרה intratracheal כפול של bleomycin יחידנית או פולשני משולבת.
Abstract
Idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) היא מחלת ריאות קטלנית המאופיינת על ידי הרס הריאה אדריכלות, אשר גורם משמעותי להידרדרות תפקודי ריאה ומוות עוקבות של כשל נשימתי הדרגתיים ובלתי הפיכים.
בפתוגנזה של IPF במודלים חייתיים ניסיוני יש נגרמו bleomycin המינהל. במחקר זה, אנו לחקור מודל עכבר דמוי-IPF המושרה על ידי החדרה bleomycin intratracheal זוגי. הערכות היסטולוגית סטנדרטי עבור פיברוזיס של הריאה הם הליכים פולשניים מסוף. מטרת עבודה זו היא לעקוב אחר פיברוזיס של הריאה באמצעות טכניקות הדמיה לא פולשנית כגון טומוגרפיה מולקולרית פלורסנט (FMT), מיקרו-טי אלה שתי טכנולוגיות חוקיותו עם היסטולוגיה ממצאים יכול לייצג מהפכנית פונקציונלי ניטור בזמן אמת לא פולשנית של חומרת המחלה IPF והתקדמות. היתוך גרעיני של גישות שונות מייצג צעד נוסף להבנת המחלה משקפות את עמדות, שבו ניתן לראות את האירועים המולקולריים המתרחשים במצב פתולוגי עם FMT ו ניתן לנטר שינויים אנטומיים הבאים על ידי מיקרו-טי
Introduction
Idiopathic פיברוזיס ריאתי (IPF) היא מחלת ריאות כרונית עם ירידה הדרגתית של פונקציות ריאות כי היא למרבה הצער לעיתים קרובות קטלנית תוך 4 שנים מיום אבחון1. התכונות הגדולות של IPF מטריצה חוץ-תאית התצהיר והתפשטות פיברובלסט, אך בפתוגנזה אינה כבר מובנת במלואה. ההיפותזה נתמכת ביותר הוא כי מספר מחזורים של פציעות בריאות לגרום להרס של תאים אפיתל מכתשי שמוביל שינוי של התפשטות mesenchymal מחזור התא, הצטברות מוגזמת של fibroblasts, myofibroblasts, ו ייצור מוגבר מטריקס. מתווכים המעורבים בתהליכים אלה כגון מטריקס metalloproteinases (MMPs) התגלו dysregulated בפיתוח פיברוזיס IPF אנושי או במודלים חייתיים bleomycin-induced. ההפקה MMP לא מבוקרת מוביל התצהיר קולגן לא מאוזנת בתוך הריאות interstitium ואת שטח מכתשי, מחקה את הפצע חריג תיקון1,2.
אחד המכשולים העיקריים גילוי תרופות ופיתוח הוא הזמינות של מודלים העכבר נגיש המחקים הפתוגנזה אנושי ו פנוטיפ של המחלה. סוכנים שונים שימשו לזירוז פיברוזיס של הריאה במודלים של בעלי חיים: הקרנה נזק, הניהול של אסבסט, סיליקה, מנהלה של ציטוקינים fibrinogenic ו-3,bleomycin4; אולם bleomycin ביותר בשימוש עכברים, עכברושים, שרקנים, אוגרים, ארנבות5 או6,חיות גדולות (פרימטים לא אנושי, סוסים, כלבים ומעלי גירה)7. Bleomycin היא אנטיביוטיקה שנעשו על ידי החיידק Streptomyces verticillus8 ומשמש בתור סוכן אנטי סרטניים9. פיברוזיס ריאתי היא תופעת לוואי נפוצה של הסם ומסיבה זו, הוא משמש במודלים חייתיים ניסיוני לזירוז לייפת.
במודלים פיברוזיס ריאות הנגרמת bleomycin, נגעים שהותירה להתרחש 14-21 יום לאחר bleomycin המינהל. עבודה שהוצגו, השתמשנו פרוטוקול חדש לזירוז פיברוזיס של הריאה בעכברים על ידי החדרה intratracheal bleomycin כפול. המודל העכבר bleomycin הוא מאוד זמן רב כי תרופות חדשות צורך להעריך על נגעים שהותירה הוקמה, ונבדק לבידול והשפעותיהם anti-fibrotic השפעות אנטי דלקתיות.
נחישות הביוכימי של קולגן תוכן, morphometrical וניתוח היסטולוגית התבססו על ניתוח פוסט מורטם, הגבלת האפשרות לעקוב בפתוגנזה של המחלה אותה חיה. אף על פי הפרמטרים הללו נחשבו תקן הזהב להערכה פיברוזיס, הם לא לספק כל הפצה הזמנית או המרחבי של הנגע שהותירה וגם למנוע דרך לחקור את התהליך של התקדמות המחלה. 10
לאחרונה, טכנולוגיות הדמיה לא פולשנית הוחלו על צג שיפוץ דרכי הנשימה, דלקת, פיברוזיס התקדמות במודלים מאתר: דימות תהודה מגנטית (MRI), מיקרו מחשב טומוגרפיה (מיקרו-CT), קרינה פלואורסצנטית מולקולרית טומוגרפיה (FMT) וזוהרים (רבנות בלי)11,12,13,14,15,16,17,18,19 20, ,21. אנו מציעים גישה הדמיה לא פולשנית לנטר longitudinally ריאות פיברוזיס על ידי התקדמות FMT ו- Micro-CT בנקודות שונות בזמן-לאחר bleomycin אתגר22.
משעולים רבים מעורבים הקמה ופיתוח של פיברוזיס, לא הרבה ידוע. רק הבנה מעמיקה יותר של תהליכים אלה יכול לתרגם עוד סמים מטרות זה רשאי להעביר לתוך המרפאה. היכולת לנטר MMP ההפעלה longitudinally על-ידי קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית מצמידים זיהוי שינויים parenchymal הריאה על ידי מיקרו-CT עשויה לשמש בעתיד כדי לגשת התגובה הקלינית לטיפול.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
כל הניסויים המתוארים בזאת אושרו על ידי ועדת רווחת בעלי החיים מגזר עבור ניסויים בבעלי חיים של Chiesi Farmaceutici, ארסמוס MC תחת פרוטוקול מספר: 3349 EMC (138-14-07) הציות מורה הוראה 2010/63 האירופית, איטלקי D.Lgs 26/2014, מתוקנת "מדריך עבור טיפול, שימוש של מעבדה החיות"23.
הערה: לפני השימוש, עכברים C57Bl/6 (בן 7-8 שבועות) המפגרים הנשי היו התאקלם לפחות 7 ימים לתנאים המקומיים ביבר (בטמפרטורת החדר: 20-24 מעלות צלזיוס; לחות יחסית: 40-70%; מחזור בהירה-כהה 12-h), בעל גישה חופשית תקן האוכל מכרסמים, מי ברז מרוככת.
1. Intratracheal טיפול של עכברים עם Bleomycin
- הכינו ציוד החדרה אינטרה-הנשימה12,13,14.
- לשים העכברים בבית הבליעה הרדמה מחובר מאדה איזופלוריין שוכן בגובה 2.5% מעורבב עם חמצן. לבדוק לעומק של הרדמה לתחושה של חוסר תגובה הבוהן-קורט. השפעת ההרדמה אירעה לאחר 3-5 דקות.
- מיקום העכבר anesthetized על פלטפורמת צנרור, לתלות אותה על ידי החותכות שלה מניחים על החוט.
- להפעיל את laryngoscope, קח זוג מלקחיים שהסתיימה בוטה ולהשתמש המלקחיים או העצה של laryngoscope בעדינות לפתוח את הפה.
- . תוציא את הלשון והחזק אותו לצד עם מלקחיים. מקם את הלהב laryngoscope לכיוון החלק האחורי של הפה עד הפתח של קנה הנשימה הוא מדמיין ולשמור את laryngoscope במקום.
- עם היד השנייה, הכנס את הצינור משלוח מחובר בסוף צינורות PE לתוך קנה הנשימה, לסובב את הברז-כיוונית. לספק 50 µL של bleomycin (µg 0.020/עכבר). לאחר החדרה, להסיר במהירות את הצינור קנה הנשימה כדי למנוע חנק. החזק את העכברים זקוף במשך כמה שניות.
- לנהל bleomycin intratracheally ביום 0 וחזור ביום 4 (איור 1).
- הסר את העכבר של פלטפורמת צנרור ונטר את העכבר במשך 30 דקות (הזמן הדרוש להחלים לחלוטין מן ההרדמה).
- לבצע ויוו הדמיה של הריאות עכברים מאת FMT ו- Micro-CT לאחר החדרה bleomycin זוגי ביום 7, 14, ו- 21.
2. הדמיה in vivo על-ידי קרינה פלואורסצנטית טומוגרפיה מולקולרית
הערה: להכין מראש, פתרון מניות טריים של 6 nmol/mL של MMP רגיש פלורסנט מצע 680 תמיסת מלח (0.9% נתרן כלורי), וכן חנות מוגנת מפני האור ב 4 ° C לפני השימוש. זה יציב עד 6 חודשים ב 4 º C. לאפשר MMP הדמיה לסוכן equilibrate לטמפרטורת החדר לפני הזרקת לתוך חיות.
-
בדיקה הזרקה
- הכינו ציוד ורידיות הפתרון בדיקה MMP. לחמם מים ב 50 מעלות צלזיוס לחמם זנב העכבר.
- לאחוז בחוזקה את עורפה העכבר, קח את זה בזנבו ולאפשר לו לאחוז את המכסה את הכלוב. החזקת העכברים לרוחב הכתפיים של החיה, לשים את הזנב בתוך מים חמים, עבור 4 לפגיעה מקסימום 8 s תרמית כדי למנוע פציעה של העור הזנב תרמי. בדוק הורידים נפיחות ויזואליזציה קל והוספה המחט.
- במהלך ההליך הזרקה, מכניסים את העכברים restrainer פלסטיק שמור על יציבות ולשלוף את הזנב דרך חור מיוחד בגב. למצוא את שני הוורידים סימטרית משני צדי הזנב; לא את העורק בצד התחתון של הזנב.
- הכנס את המחט (26 גרם) של המזרק 1 מ"ל לווריד. אם המחט ממוקם כראוי, הזרקת יהיה קל, הפתרון בדיקה יזרום לתוך הכלי.
- להזריק את הפתרון בדיקה MMP-10 מ"ל/ק"ג.
- למחוק את המחט.
הערה: נקודת הזמן דימות אופטימלית הוא 24 שעות אחרי הזריקה בדיקה MMP כי זה הזמן הנדרש על-ידי המכשיר להיות מופעל. אם האורך מחקרים מתבצעים, הזמן האופטימלי הזרקת מחדש הוא 7 ימים, אשר מאפשר להשלמת אישור של הסוכן מן העכבר.
-
FMT הדמיה
הערה: לפני הפעלת, תמיד להסיר את הפרווה סביב האזורים של החיה כי הם לדימות, במקרה זה החזה, כדי למנוע פיזור ספיגת ברקמות.- עזים ומתנגד העכבר, לשים אותו בתא הרדמה ולהפוך את החוגה איזופלוריין 2.5% עבור אינדוקציה, 2% לצורך תחזוקה.
- לאתחל את נתוני רכישת התוכנה ולפתוח מחקר חדש במסד הנתונים לניסוי.
- לפני שמתחילים ההדמיה עם FMT, להעביר את העכבר בקלטת הדמיה. הנח את העכבר anesthetized באמצע הדמיה קלטת לשימוש בצורה אופטימלית את שדה הראייה של FMT. שמור העכברים שטוח, מאובטח ודחוס בעדינות כנגד שני החלונות של קלטת הדמיה. להתאים את הגובה ידיות בקלטת ולאחר מכן החלק את זה לתוך תחנת העגינה.
- לחץ על נושא בחלון הסריקה, לחץ על תצוגה מקדימה כדי לראות את התמונה בשידור חי.
- לצייר את אזור הסריקה גדול מספיק כך רקמות המקיפים את האזור הצפויה של קרינה פלואורסצנטית נלכד. כולל סך של סריקת 25 נקודות ערבויות האזור ריאות יהיה לגמרי שנסרקו.
- ברגע רועי נמשך, לחץ תחילה להוסיף לתור שחזור ולאחר מכן לחץ על סרוק תמונה העכבר. ודא כי הלייזר הנכון-680 nm נבחרה.
- השלמת רכישת התמונה, מקם את העכבר בחזרה לכלוב שלו. להיות בטוח שזה מלא מתאושש מן ההרדמה.
- לכמת את picomoles של קרינה פלואורסצנטית בחלון ניתוח של תוכנת ניתוח ROI כלי ולהפחית את רועי סביב 700-800 מ"מ3 על האות מגיע מאזור ריאות. להיות זהירים כדי לא לכלול את האות בכבד. העתק את רועי על הנושאים אותם דומה בממד ולהתאמת המיקום של כל תמונה חיה.
- ייצוא תמונות כמו קבצי jpg.
3. הדמיה in Vivo על ידי מיקרו-CT
התראה: לפני שתתחיל, תמיד להסיר כל תכשיטי מתכת או חפצי מתכת ליד אזור ההדמיה, כדי למנוע פיזור קרני רנטגן.
הערה: פיברוזיס ריאות הנגרמת קרינה היא שממצא נפוץ במהלך קרינה המושרה ריאות פציעה24. מיקרו-CT נגזר מדדים וגם היסטולוגית ממצאים המשויכים פיברוזיס של הריאה נכחו בעכברים מלוחים שליטה שטופלו ביום 21 נתון מיקרו ארבעה-CT הדמיה הפעלות, המציין כי המינון הרנטגן יועברו החיות במהלך מיקרו-CT בדיקות לא היה מספיק כדי להשפיע על הממצאים.
- הפעלת ה-Micro-CT על-ידי לחיצה על כפתור ירוק כוח ולהפעיל את התוכנה כדי לחמם את מקור רנטגן. השתמש נשא קטן והמיטה בבעלי חיים עבור עכברים הדמיה.
- יצירת מסד הנתונים על-ידי לחיצה על מסד נתונים חדש אחד חדש, לבנות הדפדפן מבוסס על מספר עכברים בניסוי, או לחץ על חיבור למסד נתונים קיים כדי לשמור את הנתונים אחד שנוצרה בעבר.
- לפני תחילת הסריקה, בחר את הפרמטרים רכישה בחלון בקרת התוכנה: שפופרת רנטגן מתח, 90 kV; זרם שפופרת רנטגן CT, 160 µA; חיים שפופרת רנטגן עדכני, 80 µA; FOV, 36 מ מ; אין טכניקה המגביל; סרוק טכניקה, רזולוציה גבוהה 4 דקות.
- עזים ומתנגד העכברים על ידי שאיפה של 3% איזופלוריין ולמקם אותם על המיטה מוכנס לתוך נשא עם קונוס האף מתן אספקה קבועה של הרדמה. לשתק את כפות רגליו של העכברים עם הקלטת על המיטה כדי לאפשר בחזה חשוף.
- להחליק את הדלת כלי והפעל את מצב לחיות כדי לראות את מיקום העכבר בזמן אמת על ידי לחיצה על לחצן הלכידה. להזיז את המיטה בעלי חיים כדי ליישר את החזה עם שדה הראייה (FOV) באמצעות הלחצנים הממוקמים ישירות על המכשיר CT. מרכז הסריקה על העכבר; אם לא להתאים את המיקום עם החיצים ימינה ושמאלה הנמצאים על המכשיר CT.
- לאשר את מיקום המיטה אופטימלית על ידי לסובב gantry על-ידי בחירה ב- 90 ° ולאחר לחיצה על הגדר. ודא אזור התמונה במלואה בתוך FOV.
- לא להחיל בכל טכניקה המגביל ולהתחיל את הסריקה באמצעות לחיצה על לחצן בדיקת Ct . לחץ על כן כדי המסר מיידע מקור רנטגן תופעל.
הערה: לאחר צילומי הרנטגן מופעלים, המנורה כתום על גבי המכשיר תהיה מוארת, לדלת הזזה יהיה בלתי אפשרי לפתוח לשלומם של המפעיל. לאחר הסריקה הסתיימה, מופיע חלון חדש של התוכנה Viewer 2D מציג את transaxial הפרונטליים, פרוסה הווריד של השחזור. - בדוק את איכות התמונה ולהיות בטוח שלא לקבל מטושטשים תמונות מתנועות בשל הרמה הנמוכה של הרדמה. אם יש צורך, חזור על הסריקה.
- מקום החיות בחזרה לתוך הכלוב ולהיות בטוח שהם יתאושש לגמרי מן ההרדמה.
4. Bronchoalveolar שטיפה
- עזים ומתנגד חיות עם 3% איזופלוריין והקרבה מדממים של העורק.
- להשתמש במספריים כדי לחשוף את כלוב בית החזה והצוואר. לאחר מכן לחשוף את קנה הנשימה, עושים חתך קטן כדי לאפשר את ההליך BAL שיש לבצע עם צינור שטיפה 21-מד המצורפת מזרק 1 מ"ל ללא המחט. שים לב שלא לחתוך קנה הנשימה.
- כדי לבצע את הכדור, למלא את המזרק 1 מ"ל בלי מחט עם 0.6 מ"ל של פתרון סטרילי [של האנק x 10 מאוזן תמיסת מלח (HBSS); 100 מ מ ethylenediaminetetraacetic חומצה (EDTA); 1 מ"מ חומצה 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic (HEPES); מזוקקים מים].
- הכנס צינור שטיפה לתוך החתך לקנה, לאט לאט להחדיר ולסגת הפתרון 3 פעמים, השהיה על הנסיגה השלישית כדי לאפשר אופטימלי מאוסף BALF לצורך ניתוח מאוחר יותר.
5. היסטולוגיה ו Histomorphometry
- לחשוף, להסיר את הריאות, ניפוח אותם עם בצינורית דרך קנה הנשימה על ידי אינפוזיה עדין עם 0.6 מ"ל של 10% באגירה נייטרלי פורמלין ולאחסן את הדגימות בטמפרטורת החדר במשך 24 שעות ביממה.
- מייבשים דגימות דרך מעברים שונים להגדיל את ריכוז של אלכוהול פתרונות (60% אתנול עבור 1 h, 70% אתנול 1 h, 90% אתנול עבור 1 h, אתנול 95% עבור 2 h ו- 100% אתנול כבר שעתיים) באמצעות מעבד רקמות אוטומטית.
- מקום דגימות קסילן כבר שעתיים להפוך אותם לשקופים. בקצה של התייבשות, לחדור דוגמאות פרפין ב 60 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות, להטביע אותם במעבד אוטומטית.
- להשיג 5 מיקרומטר עבה טורי מקטעים באמצעות מיקרוטום של רוטרי.
- Deparaffinize נוזלים שקופיות בכיתות יורד של אתנול, כתם עם Trichrome של מאסון באמצעות מעבד רקמות אוטומטית.
- באופן ידני להתמקד בפרוסות ריאות, סריקה ברזולוציה 20 X הגדלה באמצעות סורק שקופיות, לכידת תמונות דיגיטליות סעיפים הריאה כולה באמצעות התוכנה צופה עם רזולוציה של nm 451/פיקסל.
- מורפולוגית להעריך פציעה שהותירה הריאה על ידי פרמטרים כמותיים למחצה, תפוקה כדלקמן:
- לקבוע את הציון אשקרופט. באופן כמותי חצי כיתה שינויים מורפולוגיים בסעיפים ריאות לקנה שהוגדרו על-ידי אשקרופט10 שונה על-ידי המלון. et al. 25 שימוש במערכת של 0-8 ניקוד להערכת כל parenchyma הריאה המקטעים.
- לקבוע את התוכן של קולגן. לכמת את מידת10,פיברוזיס25 על ידי תוכנת ניתוח תמונת מיקרוסקופ. לבחור באקראי שלוש ROIs בהגדלה X 10, עבור כל שקופית. על ידי סטנדרטיזציה של הגדרות הסף צבע, לזהות הקולגן כאזור שהוכתמו ירוק.
- קובעים את האזור מכתשי אוויר. לכמת את האזור אוויר מכתשי בתור פרמטר עקיף של פיברוזיס10,25. באמצעות תוכנה ו ROIs הוחל על השבר פיברוזיס אותו, לאתר את שטחה של אוויר ROIs באמצעות סף לבן.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
רזולוציה ספונטנית של נגעים פיברוזיס הריאה ציין שלושה שבועות. לאחר bleomycin יחיד המינהל ושינויים מבניים מתונה לסמן את הגבולות של מודל זה. רק ובמרפאה יכול להתבצע בשל חלון טיפולי צר שאינו מייצג הקלינית17.
. הנה, נדגים כי הפרוטוקול שלנו של החדרה intratracheal bleomycin זוגי הוא מסוגל לפתח פיברוזיס בריאה לאורך זמן עכברים18. הנבחנים מוצג באיור 119,20,21. מטרתו של מחקר זה היא לבחון את התקדמות פיברוזיס של הריאה בעכברים עם טכנולוגיות הדמיה לא פולשנית. Bleomycin היה intratracheally מנוהל פעמיים (יום 0 ו- 4; 1 מ"ג/ק"ג של bleomycin ב- 50 µL בכל אחד מהם). עכברים 12 עבור כל קבוצה היו intratracheally אתגר באותו אמצעי אחסון של הרכב רק במקביל לאלה של קבוצת bleomycin לשימוש בפקד. להערכה של פיברוזיס, ניתוח כמותי למחצה היסטולוגית נעשתה בהתבסס על אשקרופט שיטת הניקוד. 10
בשנת העבודה הנוכחית, אנו העריכו ריאות פיתוח פיברוזיס במודל עכבר bleomycin-induced באמצעות טכנולוגיות מיקרו-CT ו- FMT בשילוב עם היסטולוגיה קלאסית. הטבע לא פולשנית של הדמיה טכנולוגיות מייצג ערך אמיתי להערכה פרה של התקדמות פיברוזיס של הריאה, ההסכם עם היסטולוגיה היא צעד מעולה. מיקרו-CT הדמיה יכול לשחק תפקיד חשוב כימות של שינויים parenchymal ריאות עקב שהותירה נגעים longitudinally.
היסטולוגיה תמונות של bleomycin יחס הקבוצה הראתה תבנית בולטת של פיברוזיס החל מיום 7, בעיקר כגושים בודדת שהותירה, ואת התקדמה ביום 14 כדי וקונצרנים confluent של קולגן substitutive נותרה שהודעה עד ליום 21 ( דמויות 2A - 2 C). טיפול bleomycin המושרה דלקת ריאות (איור 3א), איפה המספר של WBC היה גבוה באופן משמעותי ב- BALF של עכברים bleomycin שטופלו ב- 7, 14, ו- 21 ימים השוואה לקבוצת הרכב. מעניין, שברים לימפוציט, מונוציט היו גם גדל כל הזמן של דגימה (דמויות 3B-3 C); לעומת זאת, נצפתה עלייה משמעותית של השבר נויטרופילים ב יום 7 (איור 3ד').
במחקר זה, מיקרו-CT נעשה שימוש לעקוב אחר שינויים parenchyma הריאה longitudinally. שינויים אנטומיים פרוגרסיבי של האדריכלות ריאות בנקודות זמן שונות של התבוננות מקו נראים בבירור מיקרו-CT תחזיות (דמויות 4A-4B). רדיוס דרכי הנשימה בחלק הדיסטלי של עץ הסמפונות (דמויות 5 א וג 5)19,20,21 , אחוז פיברוזיס בריאות הכולל (דמויות 5B ו 5 D) יכול לכמת פיברוזיס התקדמות. כימות אחוזי פיברוזיס בקבוצת הטיפול bleomycin ביום 7 (איור 5D) היה הפרזתי מעט אם בהשוואה היסטולוגיה הניקוד. זו יכולה להיות מוסברת על ידי תגובת כפול של תחילת דלקת, פיברוזיס, כך שקשה להבדיל בין שני התסמינים. רדיוס דרכי הנשימה ואת אחוז פיברוזיס נבחרו מתוך עיבוד תמונה של ההקרנות מיקרו-CT על כימות של הריאה parenchymal שינויים (דמויות 5 C-5 D)19,20,21 . פרמטרים אלה מיקרו-CT הם מאוד מסכים עם ממצאים היסטולוגית כפי שמוצג דמויות 2A/2 C.
מיקרו-CT הדמיה ישירות שיקף את השינויים פיפטות וטיפוליים של parenchyma הריאה וסיפק FMT טכנולוגיית מידע כמותי יותר קשור ביטוי חלבון אהב IPF. במחקר זה, בחרנו של בדיקה MMP בהתבסס על להתאמתו לצורכי IPF ומצאנו הפעלה MMPs ספציפי bleomycin מטופלים עכברים (איור 6)18. התפקיד של MMPs נחקר על ידי הזרקת הרכב או bleomycin מטופלים עכברים עם הגששים פלורסנט activable MMP בנקודות זמן נבחר. עשרים וארבע שעות לאחר ההזרקה, העכברים היו תמונה מאת FMT חושף כי עכברים שהותירה יכול להפעיל את ספציפי MMP בדיקה פלורסנט ויוו (דמויות 6A-6 D)18 ו- ex-vivo (איור 6E)18 .
איור 1 : ניסיוני להגדיר עבור העכבר bleomycin-induced ריאות פיברוזיס. C57BL/6 נקבות עכברים היו גם מי מלח או bleomycin החדירו intratracheally על שני מקרים, יום 0 ו- 4. עכברים היו עם תמונה על ידי סורק מיקרו-CT בנקודת ההתחלה (יום 0), 7, 14, 21 ימים. קבוצות של עכברים 12 הוקרבו ימים 7, 14, 21, הריאות שלהם היו שקובעת קולגן התצהיר לתאם תוצאות היסטולוגית עם תמונות מתקבל על ידי µCT. דמות זו שונתה על מאמר שפורסם21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 2: כמובן זמן ניתוח היסטולוגית של bleomycin המושרה פיברוזיס של הריאה בעכברים.
(א) כימות של פיברוזיס של הריאה על ידי אשקרופט ניקוד הרכב או bleomycin מטופלים עכברים בנקודות זמן שונות. הניסוי היה חוזר על עצמו שלוש פעמים ומייצג בכל נקודה זאת אומרת ± SEM של חיות 12. ניתוח סטטיסטי בוצעה על ידי ANOVA ואחריו המבחן של Tukey. * p < 0.05; * * p < 0.01.
(B) אשקרופט הציון התפלגות השכיחויות שהוקצה ב קטגוריות משנה קלה, בינונית וקשה.
(ג) נציג היסטולוגיה של יונקת מאסון מוכתם העכבר ריאות מקטעים עבור intratracheally זוגי החדירו bleomycin או עכברים התייחס מלוחים-7, 14, ו-21 ימים לאחר הטיפול (הגדלה 10 X, סולם בר 200 מיקרומטר). אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 3: חדירה תאית מסלול הזמן לתוך BALF של bleomycin המושרה פיברוזיס של הריאה בעכברים.
(א) מספר WBC, ומונוציטים (B) , לימפוציטים (ג) ו- (ד) נויטרופילים. תאים הנמצאים ב- BALF באו לידי ביטוי במספר תאים * 103/µL. הניסוי היה חוזר על עצמו שלוש פעמים ומייצג בכל נקודה זאת אומרת ± SEM של חיות 9. ניתוח סטטיסטי בוצעה על ידי ANOVA ואחריו המבחן של Dunnett. * p < 0.05; * * p < 0.01. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 4 : תחזיות האורך מיקרו-CT הדמיה של פיברוזיס ריאות הנגרמת bleomycin, הרכב מטופלים עכברים. (א) מיקרו-CT, bleomycin מטופלים עכבר ועכבר (B) מיקרו-CT, מליחים מטוהרים אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור 5 : איירווייז, כימות אונות הריאה פיברוזיס, פילוח בהתאם חוזרות מיקרו-CT הדמיה-
(א) דרכי הנשימה היו מחולקים חלק מרכזי ו דיסטלי. (B) החלק הדיסטלי של דרכי הנשימה היא מערכת intrapulmonary המשמש לזיהוי לפצל אונות ריאה כמו: האונה הימנית גולגולתי (RCrL) הימנית האונה האמצעית (RMdL), האונה הימנית סימטרית (RCdL), האונה הימנית אביזר (RAcL), שמאלה ריאות (LL). (ג) דרכי הנשימה radius ו- (ד) סה כ כימות פיברוזיס של הריאה או רכב או bleomycin מטופלים עכברים בנקודות זמן שונות. כל נקודה מייצגת את זאת אומרת ± SEM של בעלי חיים 5, עבור סכום כולל של 30 עכברים. ניתוח סטטיסטי בוצעה על ידי ANOVA ואחריו המבחן של Dunnett. * p < 0.05; * * p < 0.01. דמות זו שונתה על מאמר שפורסם21. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
איור . 6. זמן הקורס של קרינה פלואורסצנטית אות נמדדת FMT inbleomycin המושרה עכברים פיברוזיס של הריאה. In vivo (A ו- B) תמונות ו- ex-vivo FMT (C ו- D) נציג של עכברים הזריק MMP בדיקה מטופלים עם הרכב או עם bleomycin. (ה) הסכום הכולל של הריאה פלורסצנטיות אות באופן אוטומטי מחושב על ידי FMT תמונה תוכנה. הניסוי היה חוזר על עצמו שלוש פעמים ומייצג בכל נקודה זאת אומרת ± סטיית התקן של חיות 9. ניתוח סטטיסטי בוצעה על ידי ANOVA ואחריו המבחן של Dunnett. * p < 0.05; * * p < 0.01. איור זה השתנה מ- מאמר שפורסם18. אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
למרות הרבה קבוצות מחקר המתמקד בפיתוח תרופות חדשות לטיפול IPF, כרגע רק שניים זמינים עבור חולים. יש צורך רפואי דחוף למצוא טיפולים יעילים יותר7 כי עד כדי כך הישרדות של 4-5 שנים26רק ריאות transplantationis. תנאי מוקדם חיוני translational רפואה ופיתוח של תרופות חדשות היא הזמינות של מודל חיה המחקה את התכונות IPF וכן מחקרים התערבותית אשר הם ניבוי ההצלחה במרפאה. אולם, התועלת של הדגמים הקיימים של בעלי חיים פיברוזיס ריאתי הוא עדיין במחלוקת27. אנו מפתחים מודל עכבר חדש של פיברוזיס ריאות המצריכה של החדרה כפולה של bleomycin כמתואר באיור 118. טכנולוגיות הדמיה הינם כלים רבי-עוצמה כדי להמחיש את התקדמות המחלה, בתגובה לטיפול תרופתי. מודל זה בעל חיים טוב יותר recapitulated את תכונות אנושיות של משקפות את עמדות, לא פולשנית טכנולוגיות ליצור גשר בין הגדרות פרה הקלינית27.
עם זאת, כדי לקבל נתונים חזקים לשחזור, כמה צעדים מכריעים החדרה intratracheal חייב להתבצע כאשר העכברים הם מורדם לחלוטין, באמצעות הליך סטנדרטית. מיקרו-CT רכישה דורש ניטור מדויק מאוד של ההרדמה, כי ההשלכות CT הן פיקוח על ידי תדירות הנשימה. לפני הדמיה, בדוק כי העכברים יש העומק באותה ההרדמה. צעד חשוב מאוד עבור הדמיה אופטית מאת FMT היא אפילציה. לפני שמתחילים, תמיד להסיר את הפרווה סביב החזה, כדי למנוע פיזור ספיגת ברקמות. הזריקה בדיקה צריך לתקן זאת באמצעות משקל הגוף של בעל החיים.
אפשרות לחקור ולכמת read-out מולקולרי ספציפי בשינויים אנטומיים בעכברים אותו בנקודות זמן שונות מייצג צעד ענק בהתפתחות ההבנה פיברוזיס, מקדמה ברור פונקציונלי, כמו גם תרופתי מחקרים.
זה יחידנית או משולבת הדמיה הגישה הוא כלי חכם כדי להעריך את יעילות התרופה, מתן מידע רב יותר לעומת הערכה מסוף, תרגום בתהליך גילוי התרופה יעילה יותר.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
המחברים מצהירים כי יש להם אין אינטרסים מתחרים.
Acknowledgments
המחברים רוצה להודות ד ר דניאלה Pompilio, רוברטה Ciccimarra לקבלת עזרה טכנית.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , National Research Council. Washington DC. (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
