Summary
Vi beskriver en non-invasiv multimodale imaging tilgang baseret på Micro-CT og fluorescens molekylære tomografi langsgående vurdering af musen lunge fibrose model induceret af dobbelt intratrakeal instillation af bleomycin.
Abstract
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er en dødelig lungesygdom, præget af progressive og uafvendelige ødelæggelse af lungen arkitektur, der forårsager betydelig forringelse i lungefunktion og efterfølgende død fra respirationssvigt.
Patogenesen af IPF i eksperimentel dyremodeller har været foranlediget af bleomycin administration. I denne undersøgelse undersøger vi en IPF-lignende musemodel induceret af en dobbelt intratrakeal bleomycin instillation. Standard histologiske vurderinger bruges til at studere lungefibrose er invasive procedurer, terminal. Målet med dette arbejde er at overvåge lungefibrose gennem noninvasive billedbehandling teknikker såsom fluorescerende molekylære tomografi (FMT) og mikro-CT. Disse to teknologier valideret med histologi resultater kunne repræsentere en revolutionerende funktionelle tilgang for ikke-invasiv overvågning i realtid af IPF sygdommens sværhedsgrad og progression. Fusion af forskellige tilgange repræsenterer et skridt videre for at forstå IPF sygdom, hvor de molekylære begivenheder i en patologisk tilstand kan observeres med FMT og de efterfølgende anatomiske ændringer kan overvåges af mikro-CT.
Introduction
Idiopatisk lungefibrose (IPF) er kroniske lungesygdom med gradvise fald i lungefunktion, der er desværre ofte dødelig senest fire år efter diagnose1. De vigtigste funktioner i IPF er ekstracellulære matrix deposition og fibroblast spredning, men patogenesen er endnu ikke fuldt forstået. Den mest understøttede hypotese er, at flere cyklusser af lunge skader forårsager ødelæggelse af alveolær epitelceller, der fører til ændring af mesenchymale cellecyklus spredning, overdreven ophobning af fibroblaster og myofibroblasts, og øget matrix produktion. Mæglere involveret i disse processer såsom matrix metalloproteinases (MMPs) har fundet dysregulated i fibrose udvikling i menneskelige IPF eller bleomycin-induceret dyremodeller. Den ukontrollerede MMP produktion fører til et ubalanceret kollagen deposition i lunge interstitium og alveolær plads, efterligne unormal sår reparation1,2.
En af de vigtigste hindringer for drug discovery og udvikling er tilgængeligheden af tilgængelige musemodeller, der efterligner human patogenese og sygdom fænotype. Forskellige agenter har været brugt til at fremkalde lungefibrose i dyremodeller: bestråling skader, administration af asbest og silica, administration af fibrinogenic cytokiner og bleomycin3,4; dog bleomycin er mest anvendte i mus, rotter, marsvin, hamstere, kaniner5 eller i store dyr (ikke-menneskelige primater, heste, hunde og drøvtyggere)6,7. Bleomycin er et antibiotikum af bakterien Streptomyces verticillus8 og bruges som en anti-cancer agent9. Pulmonal fibrose er en almindelig bivirkning af lægemidlet og af denne grund, det er anvendt i eksperimentel dyremodeller til at fremkalde pulmonal fibrose.
I bleomycin-induceret lunge fibrose modeller forekomme fibrotisk læsioner 14-21 dage efter bleomycin administration. I det præsenterede arbejde brugte vi en ny protokol til at fremkalde lungefibrose i mus ved dobbelt bleomycin intratrakeal instillation. Bleomycin musen model er meget tidskrævende, fordi nye stoffer skal vurderes på etablerede fibrotisk læsioner, og testet til at skelne deres anti-fibrotisk effekter fra anti-inflammatoriske effekter.
Biokemiske bestemmelse af kollagen indhold, morphometrical og histologiske analyse var baseret på post mortem analyse, begrænse muligheden for at følge patogenesen af sygdommen i de samme dyr. Selv om disse parametre blev betragtet som en guld standard for fibrose evaluering, de ikke giver nogen tidsmæssige eller rumlige fordeling af fibrotisk læsion og udelukker et måde at undersøge processen for sygdomsprogression. 10
For nylig, non-invasiv billeddiagnostik teknologier er blevet anvendt til skærm luftvejene remodeling, inflammation og fibrose progression i murine modeller: magnetisk resonans Imaging (MR), Micro computertomografi (mikro-CT), fluorescens Molekylær Tomografi (FMT) og en bioluminescerende (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Vi foreslår en non-invasiv billeddiagnostik tilgang for at overvåge langs lunge fibrose progression af FMT og Micro-CT på forskellige tidspunkter efter en bleomycin udfordre22.
Mange veje er involveret i etablering og udvikling af fibrose, og ikke meget er kendt. Kun en dybere forståelse af disse processer kan oversættes til mere stof mål, der kan overføres til klinikken. Evnen til at overvåge langs MMP aktivering af fluorescens molekylære tomografi koblet til påvisning af lunge parenkymalt ændringer af Micro-CT kan anvendes i fremtiden at få adgang til den kliniske respons på behandlingen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg beskrevet heri blev godkendt af murene dyrevelfærd Udvalget for dyreforsøg af Chiesi Farmaceutici og ERASMUS MC under protokolnummer: EMC 3349 (138-14-07) i overensstemmelse med det europæiske direktiv 2010/63 UE, Italienske D.Lgs 26/2014 og den reviderede "Guide til the Care og brugen af forsøgsdyr"23.
Bemærk: Før brug, indavlede C57Bl/6 (7-8 uger gamle) hunmus blev akklimatiseret i mindst 7 dage til de lokale vivarium betingelser (stuetemperatur: 20-24 ° C, relativ fugtighed: 40-70%; 12-h lys-mørke cyklus), at have fri adgang til standard gnaver chow og blødgjort vand fra hanen.
1. intratrakeal behandling af musene med Bleomycin
- Forberede udstyr til intra-trakeal instillation12,13,14.
- Sætte mus i narkose salen tilsluttet en isofluran vaporizer på 2,5% blandet med ilt. Check for dybde af anæstesi af manglen på en tå-knivspids reaktion. Virkning af anæstesi opstod efter 3-5 min.
- Placer bedøvede musen på intubation platform, hænge den ved sin fortænder placeret på wiren.
- Slå laryngoscope, tage et par af stump endte pincet og bruge enten pincet eller laryngoscope's tip forsigtigt åbne munden.
- Træk tungen og holde den til side med pincet. Placer laryngoscope kniv mod bagsiden af munden, indtil åbningen af luftrøret er visualiseret og holde laryngoscope på plads.
- Med anden hånden, indsætte levering rør forbundet til slutningen af PE rør ind i luftrøret, roterende tre-vejs ventil. Levere 50 µL af bleomycin (0,020 µg/mus). Efter instillation, hurtigt fjerne røret fra luftrøret til at forhindre kvælning. Hold musene oprejst i et par sekunder.
- Administrere bleomycin intratracheally på dag 0 og Gentag på dag 4 (figur 1).
- Fjerne musen fra intubation platform og overvåge mus til 30 min (tid til at komme sig helt fra anæstesi).
- Udføre i vivo billeddannelse af musene lungerne af FMT og Micro-CT efter dobbelt bleomycin instillation på dag 7, 14 og 21.
2. in vivo billeddannelse af fluorescens molekylære tomografi
Bemærk: På forhånd, forberede en frisk stamopløsning af 6 nmol/mL MMP følsomme fluorescerende substrat 680 i saltopløsning (0,9% natriumchlorid) og opbevares beskyttet mod lys ved 4 ° C før brug. Det er stabilt i op til 6 måneder ved 4 ° C. Tillad MMP imaging agent til Reagensglasset stuetemperatur før injektion i dyr.
-
Sonden injektion
- Forberede udstyr til intravenøs injektion af MMP sonde løsning. Pre varmt vand ved 50 ° C varme mus hale.
- At fast forstå mus lurvet, tage det i halen og lade det greb bur låget. Holder mus tværs over dyrets skuldre, sætte hale i et varmt vand bægerglas, for 4 til maksimalt 8 s termisk skade termisk skade på halen huden. Kontrollere venerne hævelse for lettere visualisering og nål indsættelse.
- Under den indsprøjtning procedure, sætte mus i en plastik Tilbageholderen at holde den stabil og træk hale gennem en særlig hul i ryggen. Find de to caudale årer på hver side af halen; ikke arterien på undersiden af halen.
- Indsætte nålen (26G) 1 mL sprøjte ind i venen. Hvis nålen placeres korrekt, injektion bliver let og sonde løsning vil flyde ind i fartøjet.
- Injicere MMP sonde løsning på 10 mL/kg.
- Kassér nålen.
Bemærk: Den optimale Billeddannende tidspunkt er 24 h efter MMP sonde indsprøjtning fordi det er den tid, der kræves af sonden skal aktiveres. Hvis longitudinelle studier udføres, er optimal reinjektion tid 7 dage, hvilket giver mulighed for komplet regnskabsafslutningen for agenten fra musen.
-
FMT imaging
Bemærk: Før du starter, fjerne altid pels på og omkring områderne af dyret, der skal være afbildet i dette tilfælde brystet til at undgå spredning og absorbans i væv.- At bedøver musen, sætte det i narkose kammer og drej isofluran skiven til 2,5% for induktion og 2% for vedligeholdelse.
- Initialisere data erhvervelse softwaren og åbne en ny undersøgelse i databasen for eksperimentet.
- Før du starter imaging med FMT, overføre musen til den billeddiagnostiske kassette. Opstille den bedøvede mus midt i imaging kassette for at optimalt brug af synsfeltet af FMT. Holde musene flad, sikker og forsigtigt komprimeret mod både windows i imaging kassetten. Justere højden af knapper på kassetten, og skub den derefter ind i docking-stationen.
- Klik på emnet i vinduet scanning og klik på Vis udskrift for at se live-billeder.
- Trække regionen scan tilstrækkelig stor, så vævet omkring den forventede område af Fluorescens er fanget. Herunder ialt 25 scan point garantier bliver regionen lunge helt scannet.
- Når ROI er trukket, først klikke på Føj til genopbygning kø , og klik derefter på Skan for at billedet med musen. Sørg for, at den korrekte laser på 680 nm vælges.
- Når image erhvervelse er fuldført, skal du placere musen tilbage i sit bur. Sørg for den fuldt genindvinder fra anæstesi.
- Kvantificere picomoles af fluorescens i vinduet analyse af analyse software ved hjælp af værktøjet til Afkastningsgrad og reducere ROI omkring 700-800 mm3 på signalet kommer fra lunge-regionen. Vær omhyggelig med at udelukke det lever signal. Kopiere ROI på de andre emner til at få dem ens i dimension og justere deres holdning i hvert dyr billede.
- Eksportere billeder som jpg-filer.
3. in Vivo billeddannelse af Micro-CT
Forsigtig: Før du starter, altid fjerne metal smykker eller metal objekter nær imaging-området, til at undgå spredning af røntgenstråler.
Bemærk: Stråling-induceret lungefibrose er et fælles resultat under stråling induceret lunge skade24. Mikro-CT afledt indekser hverken histologiske fund tilknyttet lungefibrose var til stede i saltvand behandlede kontrol mus dag 21 underkastes fire mikro-CT billeddannelse sessioner, der angiver, at X-ray dosis leveres til dyrene i løbet af Micro-CT undersøgelser ikke var tilstrækkelig til at påvirke undersøgelsesresultaterne.
- Drej på Micro-CT ved at trykke på knappen grøn strøm og starte softwaren til at varme op x-ray kilde. Bruge den lille bar og den animalsk bed for mus imaging.
- Oprette databasen ved at klikke på ny database til en ny og opbygge browseren baseret på antallet af mus i eksperimentet, eller klik på tilslutning til eksisterende database til at gemme data til en tidligere oprettet.
- Før du begynder scanningen, Vælg erhvervelse parametre i vinduet software kontrol: X-ray tube spænding, 90 kV; CT X-ray tube nuværende, 160 µA; Live X-ray tube aktuelle, 80 µA; FOV, 36 mm; Ingen gating teknik; Skan teknik, høj opløsning 4 min.
- Bedøver mus ved indånding af 3% isofluran og placere dem på sengen indsat i boringen med en næse kegle giver en konstant forsyning af anæstesi. Immobilisere poter mus med tape på sengen for at give bryst til at blive udsat.
- Skub instrument døren og drej på Live Mode at se mus position i realtid ved at trykke på knappen capture. Flytte animalske sengen for at justere brystet med field of view (FOV) ved hjælp af knapper er direkte placeret på CT instrument. Center scanning på mus; Hvis ikke justere stilling med venstre og højre pile beliggende på CT instrument.
- Bekræfte optimal bed position ved at dreje paafyldningsanordningen ved at vælge 90 ° og klikke på Angiv. Sørg for at regionen til at billedet er fuldt inde FOV.
- Ikke anvende nogen gating teknik og starte scanningen ved at klikke på knappen CT-scanning . Klik på Ja til den meddelelse, der oplyser at x-ray kilde vil være tændt.
Bemærk: Når x-stråler er aktiveret, den orange lampe på toppen af instrumentet vil blive belyst og skydedøren vil være umuligt at åbne for sikkerheden for operatoren. Når scanningen er færdig, vises et nyt vindue af 2D Viewer-softwaren viser transaxial, koronale, og sagittal udsnit af genopbygningen. - Kontrollere billedkvaliteten og sørg for ikke at have sløret billeder fra bevægelser på grund af det lave niveau af anæstesi. Hvis det er nødvendigt, gentage scanningen.
- Sted dyrene tilbage i buret og være sikker på, at de fuldt ud at genvinde fra anæstesi.
4. Bronchoalveolar Lavage
- Bedøver dyr med 3% isofluran og opofrelse af blødning fra den abdominale aorta.
- Brug saks til at udsætte thorax bur og hals. Så udsætte luftrøret og lave et lille snit til at tillade BAL proceduren skal udføres med en 21-gauge lavage tube knyttet til en 1 mL sprøjte uden nålen. Være opmærksomme på ikke at skære gennem luftrøret.
- For at udføre BAL, fylde 1 mL sprøjte uden nål med 0,6 mL steril opløsning [10 x Hank afbalanceret saltopløsning (HBSS), 100 mM ethylendiamintetra syre (EDTA), 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic syre (HEPES), destilleret vand].
- Indsæt lavage røret i snit i luftrøret og langsomt indsprøjtes og trække løsningen 3 gange, pause på den tredje tilbagetrækning at give optimale samling af BALF til efterfølgende analyse.
5. histologi og histomorfometri
- Afsløre og fjerne lungerne, puste dem med en kanyle gennem luftrøret af blid infusion med 0,6 mL af 10% neutral-buffered formalin og opbevare prøverne ved stuetemperatur i 24 timer.
- Dehydrere prøver gennem forskellige passager i stigende koncentrationer af alkohol løsninger (60% ethanol for 1 h, 70% ethanol for 1 h, 90% ethanol for 1 h, 95% ethanol i 2 timer, og 100% ethanol for 2 h) ved hjælp af en automatisk væv processor.
- Placer enhederne i xylen i 2 timer at gøre dem gennemsigtige. I slutningen af dehydrering, infiltrere prøver i paraffin på 60 ° C til 3 h og integrere dem i den automatiserede processor.
- Få 5 µm tykt seriel sektioner ved hjælp af en Rotationsmikrotom.
- Deparaffinize og rehydrere dias i faldende kvaliteter af ethanol og plette med Masson's Trichrome ved hjælp af en automatisk væv processor.
- Manuelt fokus på lunge skiver, scanning på 20 X forstørrelse ved hjælp af et dias scanner og fange digitale billeder af hele lunge sektioner ved hjælp af visning software med en opløsning på 451 nm/pixel.
- Morfologisk vurdere fibrotisk lunge skade af semi-kvantitative og kvantitative parametre som følger:
- Bestemme Ashcroft score. Semi-kvantitativt grade morfologiske ændringer i lunge sektioner efter skala defineret af Ashcroft10 ændres Hübner et al. 25 brug system af 0-8 score til at vurdere alle parenkym i afsnittene lunge.
- Bestemme kollagen indhold. Kvantificere graden af fibrose10,25 af mikroskop billede analyse software. Tilfældigt vælge tre ROIs ved 10 X forstørrelse, per hvert dias. Ved standardisering af farveindstillinger tærskel, opdage kollagen som green-farvede område.
- Bestemme området alveolær luft. Kvantificere området alveolær luft som en indirekte parameter fibrose10,25. Ved hjælp af den samme software og ROIs ansøgte fibrose brøkdel, opdage området luft ROIs ved hjælp af en hvid tærskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan opløsning af lunge fibrose læsioner observeret tre uger efter enkelt bleomycin administration og moderat strukturændringer fremhæve grænserne for denne model. Kun forebyggende behandling kan udføres på grund af den smalle terapeutisk vindue, der ikke repræsenterer klinisk praksis17.
Vi viser her, at vores protokol af dobbelt bleomycin intratrakeal instillation er i stand til at udvikle langtidsholdbare lungefibrose i mus18. Forsøgets udformning er vist i figur 119,20,21. Målet med denne undersøgelse er at se på lunge fibrose progression i mus med noninvasiv imaging technologies. Bleomycin var intratracheally administreres to gange (på dag 0 og 4; 1 mg/kg af bleomycin i 50 µL hver gang). Tolv mus for hver gruppe var intratracheally udfordret med den samme mængde af køretøjet kun på samme tid som gruppen bleomycin at bruge som en kontrol. For vurdering af fibrose, var et semi-kvantitative histologiske analyse gjort baseret på Ashcroft pointsystem. 10
Vi vurderede i den nuværende arbejde, lunge fibrose udvikling i bleomycin-induceret musemodel ved hjælp af Micro-CT og FMT teknologier i kombination med klassisk histologi. Hvilke noninvasiv imaging technologies repræsenterer reel værdi for præklinisk evaluering af lunge fibrose progression og aftalen fundet med histologi er en fortrinlig skridt. Mikro-CT billeddannelse kunne spille en vigtig rolle i kvantitativ bestemmelse af lungen parenkymalt ændringer som følge af fibrotisk læsioner på langs.
Histologi billeder af bleomycin behandlede gruppe viste en udtalt mønster af fibrose starter fra dag 7, hovedsageligt som enkelt fibrotisk masserne, og skred på dag 14 til sammenflydende konglomerater af erstatningsmedier kollagen og forblev uændret indtil dag 21 ( Tal 2A - 2 C). Bleomycin behandling induceret lungebetændelse (fig. 3A), hvor antallet af WBC var betydeligt højere i BALF af bleomycin behandlede mus på 7, 14 og 21 dage sammenlignet med køretøjet gruppe. Interessant nok, var lymfocyt og monocyt fraktioner også øget på hver gang af stikprøver (tal 3B-3 C); derimod er en betydelig stigning i den neutrofile brøk blevet observeret på dag 7 (figur 3D).
I denne undersøgelse, blev mikro-CT brugt til at overvåge lunge parenkym ændringer på langs. Progressive anatomiske ændringer af lunge arkitektur på forskellige tidspunkter af observation fra baseline er klart set i Micro-CT fremskrivninger (tal 4A-4B). Luftvejene radius i den distale del af bronkial træ (tal 5A og 5 C)19,20,21 og samlede lunge fibrose procentdel (tal 5B og 5 D) kunne kvantificere fibrose progression. Fibrose procentdel kvantificering i bleomycin behandling gruppe på dag 7 (fig. 5D) var lidt overvurderet hvis i forhold til histologi scoring. Dette kan forklares ved en dobbelt reaktion af inflammation og fibrose debut, hvilket gør det svært at skelne mellem de to symptomer. Luftvejene radius og procentdelen af fibrose blev udvalgt fra billedbehandling af Micro-CT fremskrivninger for kvantificering af lunge parenkymalt ændringer (Tal 5 C-5 D)19,20,21 . Disse Micro-CT parametre er meget godt i samarbejde med histologiske fund som vist i Tal 2A/2 C.
Mikro-CT billeddannelse direkte afspejles de patologiske og terapeutiske ændringer af lunge parenkym og FMT teknologi fastsat kvantitative oplysninger mere relateret til protein udtryk gerne IPF. For denne undersøgelse, vi valgte en MMP sonde baseret på dens relevans for IPF og vi fandt særlige MMPs aktivering i bleomycin behandlede mus (figur 6)18. MMPs rolle er blevet undersøgt ved at injicere enten køretøj eller bleomycin behandlede mus med MMP aktiverbar fluorescerende sonder på valgte tidspunkter. Fireogtyve timer efter injektion, var musene afbildet af FMT afslørende at fibrotisk mus kan aktivere specifikke MMP fluorescerende sonden i vivo (tal 6A-6 D)18 og ex vivo (fig. 6E)18 .
Figur 1 : Eksperimenterende oprettet for bleomycin-induceret mus lungefibrose. C57BL/6 hunmus havde enten saltvand eller bleomycin indpodet intratracheally på to gange, dag 0 og 4. Mus blev afbildet af en mikro-CT-scanner på baseline (dag 0), 7, 14 og 21 dage. Grupper af 12 mus blev ofret på 7, 14 og 21 dage og deres lunger blev vurderet for kollagen deposition at korrelere histologiske resultater med billeder fremstillet af µCT. Dette tal er blevet ændret fra udgivet artikel21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: histologiske analyse gang kursus med bleomycin induceret lungefibrose i mus.
(A) kvantificering af lungefibrose af Ashcroft score enten køretøj eller bleomycin behandlede mus på forskellige tidspunkter. Eksperimentet blev gentaget tre gange og hver punkt repræsenterer den gennemsnit ± SEM 12 dyr. Statistisk analyse er blevet udført af ANOVA efterfulgt af Tukey's test. * p < 0,05; ** p < 0,01.
(B) Ashcroft score hyppighed distribution tildelt i mild, moderat og svær underkategorier.
(C) repræsentative histologi Massons trichome farves mus lunge sektioner for intratracheally dobbelt indpodet bleomycin eller saltvand behandlede mus på 7, 14 og 21 dage post behandling (forstørrelse 10 X, skala bar 200 µm). Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Cellular infiltration tidsforløb i BALF af bleomycin induceret lungefibrose i mus.
(A) antallet af WBC, (B) monocytter, (C) lymfocytter og (D) neutrofile. Celler findes i BALF var udtrykt som antal celler * 103/µL. Eksperimentet blev gentaget tre gange og hver punkt repræsenterer den gennemsnit ± SEM 9 dyr. Statistisk analyse er blevet udført af ANOVA efterfulgt af Dunnett's test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4 : Langsgående mikro-CT billeddannelse fremskrivninger af bleomycin-induceret lungefibrose og køretøj behandlede mus. (A) mikro-CT, bleomycin behandlede mus og (B) Micro-CT, saltvand behandlede mus venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5 : Airways, fibrose lunge lapper kvantificering og segmentering baseret på gentagne mikro-CT billeddannelse.
(A) Airways blev opdelt i en central og distale del. (B) den distale del af luftvejene er den intrapulmonary tarmkanalen bruges til at identificere og opdele i lunge lapper som: højre kranie lap (RCrL), højre midterste lap (RMdL), højre caudale lap (RCdL), højre tilbehør lap (RAcL) og venstre lunge (LL). (C) i luftvejene radius og D alt lunge fibrose kvantificering enten køretøj eller bleomycin behandlede mus på forskellige tidspunkter. Hvert punkt repræsenterer den gennemsnit ± SEM af 5 dyr, for i alt 30 mus. Statistisk analyse er blevet udført af ANOVA efterfulgt af Dunnett's test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra udgivet artikel21. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Figur. 6. tid løbet af fluorescens signal målt ved FMT inbleomycin induceret lunge fibrose mus. In vivo (A og B) og ex vivo (C og D) FMT repræsentative billeder af musene injiceret med MMP sonde behandlet med køretøjet eller med bleomycin. (E) det samlede beløb for lunge fluorescens signal blev automatisk beregnet af FMT billede software. Eksperimentet blev gentaget tre gange og hver punkt repræsenterer gennemsnit ± standardafvigelsen for 9 dyr. Statistisk analyse er blevet udført af ANOVA efterfulgt af Dunnett's test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Dette tal er blevet ændret fra udgivet artikel18. Venligst klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trods mange forskergrupper med fokus på at udvikle nye lægemidler til behandling af IPF, for øjeblikket er kun to tilgængelige for patienter. Der er en medicinsk haster med at finde mere effektive terapier7 fordi kun lunge transplantationis købedygtig forlænge overlevelsen af 4-5 år26. Forudsætning for Translationel medicin og udviklingen af nye lægemidler er tilgængeligheden af en dyremodel, der efterligner funktioner af IPF og i hvilke interventionsforsøg er prædiktive for succes i klinikken. Nytten af de eksisterende pulmonal fibrose dyremodeller er dog stadig omstridt27. Vi udvikler en ny musemodel af lungefibrose, der kræver en dobbelt instillation af bleomycin som beskrevet i figur 118. Imaging-teknologier er kraftfulde værktøjer til at visualisere sygdomsprogression og farmakologisk respons på behandlingen. Denne dyremodel bedre sammenfattet de menneskelige egenskaber i IPF og noninvasive teknologier kunne skabe en bro mellem indstillinger for prækliniske og kliniske praksis27.
Dog er nogle skridt for at få robuste og reproducerbare data, afgørende. Intratrakeal instillation skal udføres, når musene er fuldt bedøvede, ved hjælp af en standardiseret procedure. Mikro-CT erhvervelse kræver meget præcis overvågning af anæstesi, fordi CT fremskrivninger er gated af respiratorisk hyppigheden. Før imaging, kontrollere, at musene har den samme dybde af anæstesi. Et meget vigtigt skridt for optiske billeddannelse af FMT er hårfjerning. Før du starter, Fjern altid pels på og omkring brystet, til at undgå spredning og absorbans i væv. Sonden injektion skal rettes af kropsvægt af dyret.
Mulighed for at undersøge og kvantificere en specifikke molekylære udlæsning med anatomiske ændringer i samme mus på forskellige tidspunkter repræsenterer et stort skridt i forståelse fibrose udvikling, et klart fremskridt for funktionelle samt farmakologiske undersøgelser.
Denne multimodale imaging tilgang er et smart værktøj til at vurdere stoffet effektivitet, giver meget mere information sammenlignet med terminal vurdering, oversætte i en mere effektiv drug discovery proces.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne erklærer, at de har ingen konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Forfatterne vil gerne takke Dr. Daniela Pompilio og Roberta Ciccimarra for teknisk hjælp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , National Research Council. Washington DC. (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
