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Immunology and Infection

Multimodal 접근을 이미징 Bleomycin 유도 폐 섬유 증 생쥐에서의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라

doi: 10.3791/56443 Published: April 13, 2018

Summary

우리 비-침략 적 multimodal 접근 bleomycin의 이중 intratracheal 주입에 의해 유도 된 마우스 폐 섬유 증 모델의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라 이미지를 설명 합니다.

Abstract

특 발성 폐 섬유 증 (IPF) 치명적인 폐 질환 폐 기능 및 호흡 실패에서 후속 죽음에 상당한 저하를 일으키는 원인이 되는 폐 아키텍처의 진보와 돌이킬 수 없는 파괴에 의해 특징입니다.

실험 동물 모델에서 IPF의 병 인 bleomycin 관리에 의해 유발 되어 있다. 이 연구에서 우리는 이중 intratracheal bleomycin 주입에 의해 유도 된 IPF 같은 마우스 모델 조사. 폐 섬유 증 공부에 사용 하는 표준 조직학 평가 침략 터미널 절차. 이 작품의 목표 모니터링 하는 데 비 침 투 적인 이미징 기법 형광 분자 단층 (FMT)와 마이크로 CT 등을 통해 폐 섬유 증 조직학 결과 함께 유효성을 검사 하는 이러한 두 기술을 실시간으로 비-침략 적 IPF 질병 엄격과 진행의 모니터링을 위한 혁신적인 functional 접근을 대표할 수 있었다. 다른 방식의 융합이 나타냅니다 IPF 질병, 병 적인 상태에서 발생 하는 분자 이벤트 FMT 관찰 될 수 있다 및 후속 해 부 변화 마이크로-코네티컷으로 모니터할 수 있습니다 이해에 대 한 추가 단계를

Introduction

특 발성 폐 섬유 증 (IPF)은 불행히도 종종 치명적인 진단1의 4 년 이내 폐 기능의 진보적인 감소와 만성 폐 질환 이다. IPF의 주요 특징은 세포 외 매트릭스 증 착 및 섬유 아 세포 확산, 하지만 병 인은 아직 완전히 이해 되지 않습니다. 가장 지원된 가설 폐 상해의 여러 사이클 중간 엽 세포 주기 확산의 변경, 섬유 아 세포와 myofibroblasts, 과장 된 축적 하는 폐 포 상피 세포의 파괴를 일으키는 원인이 되 고 증가 매트릭스 생산입니다. 중재자와 같은 매트릭스 metalloproteinases (MMPs) 섬유 증 개발 인간의 IPF 또는 bleomycin 유발 동물 모델에서에서 dysregulated 발견 되었습니다 이러한 프로세스에 참여. 통제 MMP 생산 리드는 불균형된 콜라겐 증 착 폐 interstitium 및 치조 공간 내에서 비정상적인 상처 수리1,2를 흉내 낸.

약물 발견 및 개발에 대 한 주요 장애물 중 하나 인간의 pathogenesis 및 질병 표현 형을 모방 액세스할 수 마우스 모델의 가용성입니다. 다른 에이전트 동물 모델에서 폐 섬유 증을 유발 하는 데 사용 되었습니다: 방사선 손상, 석면, 실리 카, fibrinogenic cytokines 및 bleomycin3,4; 관리의 관리 그러나 bleomycin은 가장 사용 되는 쥐, 쥐, 기니 피그, 햄스터, 토끼5 또는 큰 동물 (비 인간 대주교, 말, 개 및 반추 동물)6,7. Bleomycin은 Streptomyces verticillus8 박테리아에 의해 항생제 이며 항 암 에이전트9로 사용 됩니다. 폐 섬유 증 및 이런 이유로 약물의 일반적인 부작용, 폐 섬유 증을 유도 하기 위해 실험 동물 모델에서 사용 됩니다.

Bleomycin 유도 폐 섬유 증 모델에서 거리 병 변 발생 bleomycin 관리 후 14-21 일. 제시 작품 우리 이중 bleomycin intratracheal 주입에 의해 쥐에서 폐 섬유 증을 유발 하는 새로운 프로토콜을 사용 합니다. Bleomycin 마우스 모델은 새로운 약물 설립된 거리 병 변, 평가 될 필요가 있기 때문에 매우 시간이 소모 하 고 항 염증 효과에서 그들의 반대로 거리 효과 구별 하는 테스트.

콜라겐 콘텐츠, morphometrical 및 조직학 분석의 생 화 확 적인 결정 했다 같은 동물에 있는 질병의 병 인에 따라 가능성을 제한 하는 게시물 부검 분석을 기반으로 합니다. 비록 이러한 매개 변수는 섬유 증 평가 대 한 황금 표준 간주 됐다, 그들은 거리 병 변의 어떤 시간적 또는 공간적 분포를 제공 하지 않았고 질병 진행의 과정을 조사 하는 방법을 배제. 10

최근, 비-침략 적 이미징 기술을 적용 된 모니터 기도 개장, 염증, 및 murine 모델 진행 성 섬유 증: 자기 공명 영상 (MRI), 마이크로 컴퓨터 단층 촬영 (마이크로 CT), 형광 분자 단층 (FMT) 및 발광 (BLI)11,12,13,14,15,,1617,18,19 ,,2021. 우리는 경도 다른 시간 점에 후 한 bleomycin 도전22FMT와 마이크로 CT, 폐 섬유 증 진행을 모니터링 하는 비-침략 적 이미징 접근 방식을 제안 합니다.

많은 경로 설립 및 섬유 증의 개발에 참여 하 고 별로 알려져 있다. 이러한 프로세스의 더 깊은 이해만 병원으로 전송할 수 있습니다 더 많은 약물 목표 번역할 수 있습니다. 경도 마이크로-CT에 의해 폐 parenchymal 변경의 탐지를 결합 하는 형광 분자 단층에 의해 MMP 활성화를 모니터링 하는 기능 치료에 임상 응답 액세스 하려면 나중에 사용할 수 있습니다.

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Protocol

여기에 설명 된 모든 동물 실험 프로토콜 번호 아래 Chiesi Farmaceutici와 에라스무스의 동물 실험에 대 한 교내 동물 복지 위원회에 의해 승인 되었다: 유럽 지침 2010/63 UE 준수 EMC 3349 (138-14-07) 이탈리아 D.Lgs 26/2014 고 개정된 "가이드에는 관리 및 사용의 실험실 동물"23.

참고: 사용, 이전 여성의 타고 난된 C57Bl/6 (7-8 주 이전) 마우스 했다 acclimatized 로컬 물고기 조건에 적어도 7 일 동안 (실내 온도: 20-24 ° C, 상대 습도: 40-70%; 12-h 빛 어두운 주기에), 표준 설치류 차 우에 대 한 무료 액세스 하는 데와 부드럽게 탭 물입니다.

1. Intratracheal Bleomycin와 쥐의 치료

  1. 내부 tracheal 점12,,1314에 대 한 장비를 준비 합니다.
  2. 2.5% 산소와 혼합 설정 isoflurane 기화에 연결 된 마 취 약 실에 쥐를 넣어. 발가락-핀치 응답의 부족에 의해 마 취의 깊이를 확인 합니다. 마 취의 효과 3-5 분 후 발생 했습니다.
  3. 삽 관 법 플랫폼에 마 취 마우스 위치, 전선에 배치의 앞 니에 의해 매달려 있습니다.
  4. 후 두 경, 무뚝뚝한 끝난된 집게의 쌍을 켜고는 집게 또는 후 두 경의 팁 중 하나를 사용 하 여 부드럽게 입을 열.
  5. 혀를 꺼냅니다을 쪽 집게로. 기도 개방 시각까지 입 뒤쪽으로 후 두 경 블레이드를 놓고는 후 두 경 그 자리에 유지 합니다.
  6. 다른 한편으로는, 3-방향 밸브 회전 기관에 PE 튜브의 끝에 연결 된 배달 튜브 삽입. Bleomycin (0.020 µ g/마우스)의 50 µ L를 제공 합니다. 점, 후 신속 하 게 질 식 방지 하기 위해 기관에서 튜브를 제거 합니다. 쥐 잡고 몇 초 동안 직 립.
    1. 0에서 bleomycin intratracheally를 관리 하 고 하루 4 (그림 1)에서 반복 합니다.
  7. 삽 관 법 플랫폼에서 마우스를 제거 하 고 30 분 (마 취에서 완전히 복구 하는 데 필요한 시간)에 대 한 마우스를 모니터링 합니다.
  8. Vivo에서 이미징 FMT와 마이크로 CT 쥐 폐의 하루 7, 14, 및 21에서 더블 bleomycin 주입 후 수행 합니다.

2. 형광 분자 단층에 의해 vivo에서 이미징

참고: 사전, MMP 민감한 형광 기판 680 생리 식 염 수 (0.9% 나트륨 염화 물), 및 저장소에 사용 하기 전에 4 ° C에서 빛에서 보호의 6 nmol/mL의 신선한 재고 솔루션을 준비 합니다. 그것은 4 ° c.에서 최대 6 개월 안정 MMP 이미징 에이전트 동물에 주입 하기 전에 실내 온도에 equilibrate를 허용 한다.

  1. 프로브 주입
    1. MMP 프로브 솔루션의 정 맥 주입을 위해 장비를 준비 합니다. 미리 따뜻한 물 열 마우스 꼬리를 50 ° C에서.
    2. 마우스 아저씨를 단단히 파악 꼬리 고 케이지 뚜껑 그립 수 있도록. 동물의 어깨에 걸쳐 쥐를 잡고, 꼬리 꼬리 피부에 열 부상을 방지 하기 위해 최대 8 s 열 부상 4 따뜻한 물 비 커에 넣어.  정 맥이 쉽게 시각화 및 바늘 삽입에 붓기를 확인 하십시오.
    3. 주입 절차 동안 꾸준히 유지 하 고 뒤에 특별 한 구멍을 통해 꼬리를 당겨 플라스틱 restrainer에 쥐를 넣어. 꼬리;의 양쪽에 두 개의 꼬리 정 맥을 찾아 아니라는 꼬리의 동맥
    4. 정 맥에 1 mL 주사기의 바늘 (26 G)를 삽입 합니다. 바늘은 제대로 배치 하 고, 주입 쉽게 되며 프로브 솔루션 선박에 흐를 것 이다.
    5. 10 mL/kg에서 MMP 프로브 솔루션을 주입.
    6. 바늘을 삭제 합니다.
      참고: 최적의 이미징 시간 포인트는 24 시간 MMP 프로브 주입 후 활성화 되는 조사에 필요한 시간 때문에. 종 적 연구를 수행 하는 경우 최적의 재 주입 시간 마우스에서 에이전트의 완전 한 정리를 위한 수 있는 7 일입니다.
  2. FMT 이미징
    참고: 시작 하기 전에, 항상 제거는 모피에 그리고 동물의 영역 주위, 가슴, 산란과 조직에 흡 광도을 피하기 위해이 경우에 이미지를.
    1. 마우스를 anesthetize, 마 취 실에서 그것을 넣어 고 유도 대 한 2.5% 및 유지 보수에 대 한 2 %isoflurane 다이얼.
    2. 데이터 수집 소프트웨어를 초기화 하 고 실험에 대 한 데이터베이스에서 새로운 연구를 엽니다.
    3. 시작 하기 전에, FMT와 이미징 이미징 카세트에 마우스를 전송 합니다. 최적은 FMT의 보기의 필드를 사용 하 여 카세트 이미징 중간 마 취 마우스를 놓습니다. 이미징 카세트의 두 창에 대 한 생쥐 플랫, 안전 하 고 부드럽게 압축 하십시오. 손잡이 카세트에 의해 높이 조정 하 고 도킹 스테이션에 밀어.
    4. 검색 창에서 제목 에 클릭 하 고 라이브 이미지를 볼 미리 보기 를 클릭 합니다.
    5. 조직 주변 형광의 예상된 지역 캡처 있도록 충분히 큰 검사 영역을 그립니다. 25 검색 포인트 보장의 총 포함 폐 지역 완전히 스캔 한 것입니다.
    6. 투자 수익 그려집니다, 일단 먼저 재건 큐에 추가 클릭 하 고 스캔 이미지는 마우스를 클릭. 있는지 확인 680에서 정확한 레이저 nm을 선택.
    7. 이미지 수집 완료 되 면, 그것의 감 금에 다시 마우스를 놓습니다. 그것은 마 취에서 완전히 복구 해야 합니다.
    8. ROI 도구 를 사용 하 여 분석 소프트웨어의 분석 창에서 형광의 picomoles를 계량 하 고 폐 지역에서 나오는 신호에 700-800 밀리미터3 주위 투자 수익 감소. 간 신호를 제외 하려면 주의 해야 합니다. 그들이 비슷한 차원에서 각 동물 이미지에 그들의 위치를 조정 하는 다른 과목에 투자 수익을 복사 합니다.
    9. Jpg 파일로 이미지를 내보냅니다.

3. 마이크로-CT에 의해 Vivo에서 이미징

주의: 시작 하기 전에, 항상 제거 어떤 금속 보석 또는 엑스레이의 비 산을 방지 하려면 이미징 인근의 금속 물체.

참고: 방사선-유도 폐 섬유 증 방사선 중 일반적인 찾는 유도 폐 상해24입니다. 마이크로-CT 파생 지표도 폐 섬유 증과 관련 된 조직학 발견 당일 21 4 마이크로-CT 세션 이미징, 엑스레이 복용량 동물에 마이크로-CT 동안 배달 나타내는 대상이 염 분 처리 통제 쥐에 있는 참석 했다 시험 결과 영향을 미칠 충분 하지 않았다.

  1. 마이크로-CT 녹색 전원 버튼을 눌러 켜고 x-ray 소스를 따뜻한 소프트웨어를 실행. 마우스 이미지에 대 한 작은 구멍 및 동물 침대를 사용 합니다.
  2. 새로운 것에 대 한 새 데이터베이스 를 클릭 하 여 데이터베이스를 만들 고 빌드 브라우저는 실험에서 쥐의 수에 따라 또는 기존 데이터베이스에 연결 이전에 생성 한 데이터를 저장 하려면 클릭 합니다.
  3. 소프트웨어 제어 창에서 수집 매개 변수를 선택 스캔을 시작 하기 전에: x 선 관 전압, 90 k v; CT x-선 튜브 전류, 160 µ A; 라이브 x 선 관 전류, 80 µ A; FOV, 36 밀리미터; 아니 제어 기술; 스캔 기술, 높은 해상도 4 분.
  4. 3 %isoflurane 흡입에 의해 쥐를 anesthetize 하 고 마 취의 지속적인 공급을 제공 하는 코 콘 구멍에 삽입 하는 침대에 그들을 배치. 테이프 가슴 노출 될 수 있도록 침대에 있는 쥐의 발 고정
  5. 도어를 계기 고 캡처 버튼을 누르면 실시간으로 마우스 위치를 볼 수 있는 라이브 모드 를 켭니다. 직접 CT 장비에 있는 단추를 사용 하 여 시야 (FOV)와 가슴에 맞게 동물 침대를 이동 합니다. 마우스에 스캔 센터 그렇지 않다면 CT 장비에 있는 왼쪽 및 오른쪽 화살표와 위치를 조정.
  6. 90 ° 을 선택 하 고 설정을 클릭 하 여는 갠트리 회전 하 여 최적의 침대 위치를 확인 합니다. 지역 이미지에는 FOV 안에 완벽 하 게 다는 것을 확인 하십시오.
  7. 하지 어떤 제어 기법을 적용 하 고 CT 스캔 버튼을 클릭 하 여 스캔을 시작. x 선 소스 설정 되어있을 것입니다 알려 주는 메시지를 클릭 합니다.
    참고: 일단 엑스레이 켜져 악기 위에 주황색 램프 조명 될 것입니다 하 고 슬라이딩 도어 연산자의 안전에 대 한 열 수 있을 것입니다. 검사가 완료 되 면 transaxial, 화관, 재건의 화살 슬라이스를 보여주는 2D 뷰어 소프트웨어의 새로운 창이 나타납니다.
  8. 이미지 품질을 확인 하 고 마 취의 낮은 수준으로 인해 움직임에서 이미지를 흐리게 하지 않도록 주의 하십시오. 필요한 경우 스캔을 반복 합니다.
  9. 감 금 소에 다시 동물을 놓고 그들은 마 취에서 완전히 복구 해야 합니다.

4. Bronchoalveolar 게

  1. 복 부 대동맥에서 출혈 하 여 3 %isoflurane 희생 동물을 anesthetize.
  2. 가 위를 사용 하 여 흉부 새와 목. 다음 기도 하 고 발 프로시저 프로시저 바늘 없이 1 mL 주사기에 부착 된 21-게이지 게 튜브를 사용 하 여 수행 하는 작은 절 개를 만들기. 주의 기도 통과를 하지.
  3. 발을 수행 하려면 채우기 1 mL 주사기 바늘 없이 살 균 솔루션의 0.6 mL [10 x 행 크의 균형 소금물 (HBSS); 100 mM ethylenediaminetetraacetic 산 (EDTA) 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic 산 (HEPES); 소 주 물]입니다.
  4. 기도에 절 개에 게 튜브를 삽입 천천히 주입 하 고 철회 솔루션 3 번 후속 분석을 위해 BALF의 최적의 컬렉션을 허용 하도록 제 3 철수에 일시 중지.

5. 조직학 및 Histomorphometry

  1. 노출 및 10% 중립 버퍼링 포 르 말린의 0.6 mL와 함께 부드러운 주입에 의해 그들을 기도 통해 정 맥을 팽창, 폐를 제거 하 고 24 시간 실 온에서 샘플을 저장할.
  2. 탈수 알코올 솔루션 (1 시간에 대 한 60% 에탄올, 1 시간, 1 시간에 대 한 90% 에탄올, 2 h에 대 한 95% 에탄올에 대 한 70% 에탄올과 2 h에 대 한 100% 에탄올)의 농도 증가에 다른 통로 통해 샘플 자동 조직 프로세서를 사용 하 여.
  3. 표본 2 h 반투명 하 게 그들에 대 한 크 실 렌에 놓습니다. 탈수의 끝에, 샘플 3 h에 대 한 60 ° C에 파라핀을 침투 하 고 자동화 된 프로세서에서 그들을 포함 합니다.
  4. 5 µ m 두께 직렬 섹션 로타리 톰을 사용 하 여 얻을.
  5. Deparaffinize 하 고 에탄올의 내림차순 학년에서 슬라이드를 rehydrate Masson의 Trichrome 자동 조직 프로세서를 사용 하 여와 얼룩.
  6. 수동으로 슬라이드 스캐너를 사용 하 여 20 배 확대 스캔 폐 조각에 집중 하 고 451 nm/픽셀의 해상도와 보기 소프트웨어를 사용 하 여 전체 폐 섹션의 디지털 이미지를 캡처.
  7. 형태학 상으로 평가 거리 폐 상해 반 정량적, 양적 매개 변수에 의해 다음과 같습니다.
    1. Ashcroft 점수를 결정 합니다. 애쉬 크 로프트10 Hübner 외. 수정 정의 규모에 따라 폐 섹션에서 반 정량적 학년 형태학 변화 25 0-8의 시스템을 사용 하 여 폐 섹션에서 모든 실질 평가 점수.
    2. 콜라겐 콘텐츠를 결정 합니다. 현미경 이미지 분석 소프트웨어에 의해 섬유 증10,25 의 정도 수량화 합니다. 각 슬라이드 당 10 배 확대에 세 ROIs를 임의로 선택 합니다. 색상 임계값 설정의 표준화, 녹색 얼룩이 진 지역으로 콜라겐 검색할.
    3. 치경 공기 영역을 결정 합니다. 섬유 증10,25의 간접 매개 변수로 치경 공기 지역 계량. 동일한 소프트웨어 및 ROIs는 섬유 증 소수 부분에 대 한 적용, ROIs 흰색 임계값을 사용 하 여 내부 공기 영역을 감지 합니다.

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Representative Results

폐 섬유 증 장애의 자연 해상도 3 주 후이 모델의 한계를 강조 하는 단일 bleomycin 관리 및 적당 한 구조 변화를 관찰 했다. 예방 치료만 임상 연습17나타내지 않는 좁은 치료 창 때문 수행 될 수 있습니다.

여기, 우리는 이중 bleomycin intratracheal 주입의 우리의 프로토콜은 쥐18에 오래 견 딘 폐 섬유 증을 개발할 수 보여 줍니다. 실험 설계는 그림 119,,2021에 표시 됩니다. 이 연구의 목표는 비 침범 성 이미징 기술로 쥐에 폐 섬유 증 진행에서 보는 것입니다. Bleomycin은 두 번 투여 하는 intratracheally (0-4; 하루에 1 mg/kg의 각 경우에 50 µ L에 bleomycin). 각 그룹에 대 한 12 마우스 컨트롤 사용 하 여 차량의 동일한 볼륨 bleomycin 그룹으로 동시에만 도전 하는 intratracheally 했다. 섬유 증의 평가 대 한 반 정량 조직학 분석이 이루어졌다는 Ashcroft에 따라 시스템을 채 점. 10

현재 작업에서 우리 함께 클래식 조직학 마이크로-CT 및 FMT 기술을 사용 하 여 bleomycin 유도 마우스 모델에서 폐 섬유 증 개발 평가. 이미징 기술의 비 침범 성 자연 폐 섬유 증 진행의 전 임상 평가 대 한 진정한 가치 나타내고는 조직학 발견 계약 한 훌륭한 단계 이다. 마이크로-CT 영상 경도 거리 병 변으로 인해 폐 parenchymal 변경의 정량화에 중요 한 역할을 재생할 수 있습니다.

조직학 그림은 bleomycin의 대우 그룹 하루 7, 주로 단일 거리 대 중에서 시작 하는 섬유 증의 발음된 패턴을 보여 하루 14 대체 콜라겐의 confluent 대기업에서 진행 하 고 하루 21 ( 까지 불변에 남아 있었다 그림 2A-2 C). Bleomycin 치료 유도 폐 염증 (그림 3A), WBC의 번호 7, 14, 21 일 비교 차량 그룹에서 치료 bleomycin 생쥐의 BALF에 훨씬 더 높은 했다. 흥미롭게도, 림프 구 및 monocyte 분수 또한 샘플링 (3B-3 C 수치);의 각 시간에 증가 했다 반면, 호 중구는 분수의 상당한 증가 하루 7 (그림 3D)에서 관찰 되었습니다.

이 연구에서는 마이크로-CT 경도 폐 실질 변화를 모니터링 하는 데 사용 되었다. 기준선에서 관찰의 다른 시간 지점에서 폐 건축의 진보적인 해부학 적 변화 마이크로 CT 계획 (그림 4A 4B)에서 명확 하 게 볼 수 있습니다. (그림 5A와 5 C) 기관지 나무19,,2021 의 총 폐 섬유 증 비율 (그림 5B, 5 D) 원심 부분에서 기도 반경 섬유 증 진행을 계량 수 있습니다. 하루 7 (그림 5D)에서 bleomycin 처리 그룹에서 섬유 증 비율 정량화는 조직학 점수를 비교 하는 경우 약간과 대 평가 했다. 이 두 증상을 구분 하기 어려운 만드는 염증 및 섬유 증 발병의 이중 반응에 의해 설명 될 수 있습니다. 기도 반지름과 섬유 증의 비율 폐 parenchymal 변화 (그림 5 C-5 D)19,20,21의 정량화에 대 한 마이크로-CT 예측의 이미지 처리에서 선정 되었다 . 이러한 마이크로-CT 매개 변수는 조직학 연구 결과와 아주 잘 그림 2A/2 C와 같이.

마이크로-CT 직접 이미징 폐 실질의 pathologic 및 치료 변화를 반영 하 고 FMT 기술 IPF 좋아 단백질 표정에 더 관련 된 양적 정보 제공. 이 연구에 대 한 IPF에 그것의 관련성에 따라 MMP 프로브 선택 하 고 우리는 bleomycin 취급 생쥐 (그림 6)18에 있는 특정 MMPs 활성화. MMPs의 역할 차량 또는 bleomycin을 주입 하 여 조사 되었습니다 선택한 시간 지점에서 MMP 참조 형광 프로브로 쥐를 취급. 주입 후 24 시간 특정 MMP 형광 프로브에 vivo에서 (그림 6A-6 D)18비보 전 (6 그림E)18 거리 쥐 활성화할 수 공개 FMT에 의해 쥐 몇 군데 있었다 .

Figure 1
그림 1 : Bleomycin 유도 마우스 폐 섬유 증에 대 한 실험 설정. C57BL/6 여성 쥐 했다 염 분 또는 bleomycin 두 경우, 0-4 일에 intratracheally를 얻은. 마우스는 마이크로 CT 스캐너 기준선 (0 일)에 의해 7, 14, 21 일 몇 군데 있었다. 12 쥐의 그룹은 7, 14, 21 일에 희생 하 고 그들의 폐와 상관 관계를 조직학 결과 이미지 µCT에 의해 얻은 콜라겐 증 착에 대 한 평가 했다. 이 그림은 게시 된 기사21에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 2
그림 2: bleomycin의 조직학 분석 시간 과정 유발 생쥐에서 폐 섬유 증. 
(A) 애쉬 크 로프트에 의해 폐 섬유 증의 정량화 점수 중 차량 bleomycin 다른 시간 지점에서 마우스를 취급. 실험 3 번 반복 되었다 고 각 포인트 12 동물의 평균 ± SEM을 나타냅니다. 통계 분석 ANOVA Tukey의 테스트에 의해 다음에 의해 수행 되었습니다. * p < 0.05; * * p < 0.01입니다.
(B) 애쉬 크 로프트 점수 주파수 배급, 가벼운, 중간, 및 심한 하위 범주에 할당 된.
(C) 의 Masson Trichome의 대표적인 조직학 얼룩이 마우스 폐 얻은 intratracheally 더블에 대 한 섹션 bleomycin 또는 7, 14, 21 일 게시물 치료 (배율 10 배, 스케일 바 200 µ m)에서 염 분 처리 쥐. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 3
그림 3: 세포 침투 시간 과정으로 bleomycin의 BALF 유발 쥐에서 폐 섬유 증. 
WBC, (B) Monocytes, Lymphocytes (C) , 및 (D) 호 중구의 (A) 수입니다. 셀 BALF 있는 셀의 수로 표현 되었다 * 103/µL. 실험 3 번 반복 되었다 고 각 포인트 9 동물의 평균 ± SEM을 나타냅니다. 통계 분석 ANOVA Dunnett의 테스트에 의해 다음에 의해 수행 되었습니다. * p < 0.05; * * p < 0.01입니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 4
그림 4 : 경도 마이크로-CT 영상 예측 bleomycin 유도 폐 섬유 증 및 차량 취급 쥐. (A) 마이크로-CT, 취급 bleomycin 마우스 및 (B) 마이크로 CT, 염 분 처리 마우스 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 5
그림 5 : 항공, 섬유 증 폐 엽 정량화 및 세분화 반복된 마이크로 CT 영상 기반.
(A) 항공은 중앙과 말 초 부분으로 분할 되었다. (B) 기도의 원심 부분 이다 고로 폐 엽으로 분할 하는 데 사용 하는 intrapulmonary로: 오른쪽 두개골 엽 (RCrL), 오른쪽 중간 엽 (RMdL), 오른쪽 꼬리 엽 (RCdL), 오른쪽 액세서리 엽 (RAcL)와 왼쪽 폐 (청각). (C) 기도 반경 및 (D) 총 폐 섬유 증 정량화 차량 또는 bleomycin 다른 시간 지점에서 마우스를 취급. 각 포인트 30 쥐의 총 5 동물의 평균 ±를 SEM을 나타냅니다. 통계 분석 ANOVA Dunnett의 테스트에 의해 다음에 의해 수행 되었습니다. * p < 0.05; * * p < 0.01입니다. 이 그림은 게시 된 기사21에서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

Figure 6
그림입니다. 6. 시간 물론 FMT inbleomycin에 의해 측정 하는 형광 신호 유도 폐 섬유 증 쥐. 차량 또는 bleomycin vivo에서 (A와 B) 비보 전 (C 및 D) FMT 대표 이미지 MMP 프로브를 주입 하는 쥐의 치료. (E) 폐 형광 신호의 총 금액은 FMT 이미지 소프트웨어에 의해 자동으로 계산 됩니다. 실험 3 번 반복 되었다 고 각 포인트 9 동물의 평균 ± 표준 편차를 나타냅니다. 통계 분석 ANOVA Dunnett의 테스트에 의해 다음에 의해 수행 되었습니다. * p < 0.05; * * p < 0.01입니다. 이 그림은18게시 된 문서 수정 되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭 하십시오.

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Discussion

많은 연구 그룹 새로운 약물을 개발에 초점을 맞추고 IPF의 치료에 불구 하 고 현재 2만 사용할 수 있습니다 환자에 대 한. 의료 긴급 하기 때문에 더 효과적인 치료7 을 찾이 필요가 폐 transplantationis 4-5 년26의 생존을 머리말을 붙이는 수. 변환 의학 및 신약의 개발에 대 한 필수적인 전제 조건 어떤 중재 연구는 병원에서 성공의 예측에서 IPF의 기능을 모방 하는 동물 모델의 가용성 이다. 그러나, 기존의 폐 섬유 증 동물 모델의 유용성은 아직 논란이27. 우리는 bleomycin18 그림 1설명 된 대로의 이중 주입을 필요로 하는 폐 섬유 증의 새로운 마우스 모델을 개발 한다. 이미징 기술은 질병 진행 및 치료에 약리 응답을 시각화 하기 위해 강력한 도구입니다. 이 동물 모델은 더 나은 IPF의 인간의 기능을 지 고 비 침범 성 기술을 설정 전 임상 및 임상 연습27사이 다리를 만들 수 있습니다.

그러나, 데이터를 얻기 위해 강력 하 고 재현할 수, 일부 단계는 중요 합니다. Intratracheal 점 때 생쥐는 완전히 마 취, 표준화 된 절차를 사용 하 여 수행 되어야 합니다. 마이크로-CT 수집 CT 예측은 호흡 주파수에 의해 문이 있기 때문에, 마 취의 매우 정확 하 게 모니터링 필요 합니다. 이미징, 전에 쥐 마 취 같은 깊이가지고 확인 합니다. FMT에 의해 광학 이미징에 대 한 매우 중요 한 단계는 탈모. 시작 하기 전에, 항상 모피와 산란 및 조직에서 흡 광도 피하기 위해 가슴 주위를 제거. 프로브 주입은 동물의 몸 무게에 의해 수정 될 필요가 있다.

조사 하 고 다른 시간 지점에서 동일한 마우스 해 부 변화 특정 분자 읽어 계량 가능성 이해 섬유 증 개발, 기능 뿐만 아니라 약리에 대 한 명백한 사전에에서 거 대 한 단계를 나타냅니다. 연구입니다.

이 multimodal 접근을 이미징 터미널 평가, 보다 효율적인 약물 발견 과정에서 번역에 비해 훨씬 더 많은 정보를 제공 하는 약물 효능을 평가 하는 스마트 도구입니다.

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Disclosures

저자 들은 아무 경쟁 관심사를 선언 합니다.

Acknowledgments

저자 박사 다니엘 Pompilio와 로버 타 Ciccimarra 기술 도움에 감사 하 고 싶습니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
FMT 2500 Fluorescence Tomography System Perkin Elmer Inc. Experimental Builder
MMPsense 680 Perkin Elmer Inc. NEV10126 Protect from light, store the probe at 4 °C
TrueQuant software Perkin Elmer Inc.
Female inbred C57BL/6 San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD),  Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions
Isoflurane ESTEVE spa 571329.8 Do not inhale
Automated cell counter Dasit XT 1800J Experimental Builder
Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) Eurospital 15A2807
Quantum FX Micro-CT scanner  Perkin Elmer Inc.
Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus  Sigma  B2434 
Automatic tissue Processor  ATP700 Histo-Line Laboratories ATP700 
Embedding system  EG 1160 Leica Biosystems EG 1160
Rotary microtome  Slee Cut 6062
Digital slide scanner  NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics
NIS-AR image analysis software  Nikon
Masson’s Trichrome Staining Histo-Line Laboratories
10% neutral-buffered formalin Sigma HT5012-1CS
Penn-century model DP-4M Dry power insufflator Penn-century DPM-EXT
PE190 micro medical tubing 2biological instruments snc BB31695-PE/8
Syringe without needle 5 mL Terumo SS*05SE1 Cut the boards of the piston by scissors
Hamilton 0.10 mL (model 1710) Gastight 81022
Discofix 3-way Stopcock Braun 4095111
Syringe with needle 1 mL Pic solution 3,071,260,300,320 Use without needle
Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm 2biological instruments snc FTP-18-50 Cut obliquely the tip 

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References

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Multimodal 접근을 이미징 Bleomycin 유도 폐 섬유 증 생쥐에서의 경도 평가 대 한 마이크로-CT와 형광 분자 단층에 따라
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Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).More

Ruscitti, F., Ravanetti, F., Donofrio, G., Ridwan, Y., van Heijningen, P., Essers, J., Villetti, G., Cacchioli, A., Vos, W., Stellari, F. F. A Multimodal Imaging Approach Based on Micro-CT and Fluorescence Molecular Tomography for Longitudinal Assessment of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Mice. J. Vis. Exp. (134), e56443, doi:10.3791/56443 (2018).

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