Summary
Vi beskriver en icke-invasiv multimodal imaging strategi som bygger på Micro-CT och fluorescens molekylär tomografi för längsgående bedömning av lung fibros musmodell induceras av dubbel intratrakeal instillation av bleomycin.
Abstract
Idiopatisk lungfibros (IPF) är en dödlig sjukdom kännetecknas av progressiv och oåterkalleliga förstörelsen av lung arkitektur, som orsakar betydande försämring i lungfunktion och efterföljande dödsfall från andningssvikt.
Patogenesen vid IPF i experimentella djurmodeller har inducerats av bleomycin administration. I denna studie undersöker vi ett IPF-liknande musmodell som induceras av en dubbel intratrakeal bleomycin instillation. Standard histologiska bedömningar används för att studera lungfibros är terminal ingrepp. Målet med detta arbete är att övervaka lungfibros genom noninvasiv avbildningstekniker såsom fluorescerande molekylära tomografi (FMT) och Micro-CT. Dessa två tekniker som valideras med histologi fynd skulle kunna representera en revolutionerande funktionell metod för icke-invasiv realtidsövervakning av IPF sjukdomens svårighetsgrad och förlopp. Fusion av olika tillvägagångssätt representerar ytterligare ett steg för att förstå IPF sjukdomen, där de molekylära händelser som inträffar i ett sjukdomstillstånd kan observeras med FMT och de efterföljande anatomiska förändringarna kan övervakas av mikro-CT.
Introduction
Idiopatisk lungfibros (IPF) är kronisk lungsjukdom med progressiv minskning av lungan fungerar som tyvärr ofta dödlig inom fyra år efter diagnos1. De viktigaste funktionerna i IPF är extracellulär matrix nedfall och fibroblast spridning, men patogenesen är ännu inte helt klarlagt. Den mest stöds hypotesen är att flera cykler av lung skador orsaka förstörelse av alveolära epitelceller som leder till förändring av mesenkymala cellcykeln spridning, överdriven ansamling av fibroblaster och myofibroblaster, och ökad matrix produktion. Medlare som är engagerade i dessa processer såsom matrix metalloproteinaser (MMP) har hittats dysreglerad i fibros utveckling antingen i mänskliga IPF bleomycin-inducerad djurmodeller. Okontrollerad MMP produktionen leder till en obalanserad kollagen nedfall inom lungan interstitium och alveolära utrymme, härma onormal såret reparation1,2.
En av de största hindren för läkemedelsutveckling är tillgången på tillgängliga musmodeller som efterliknar mänsklig patogenes och sjukdom fenotypen. Olika medel har använts för att framkalla lungfibros i djurmodeller: bestrålning skador, administration av asbest och kvarts, administrering av fibrinogenic cytokiner och bleomycin3,4. men bleomycin är mest använda hos möss, råttor, marsvin, hamstrar, kaniner5 eller stora djur (icke-mänskliga primater, hästar, hundar och idisslare)6,7. Bleomycin är ett antibiotikum som gjorts av bakterien Streptomyces verticillus8 och används som en anti-cancer agent9. Lungfibros är en vanlig biverkning av läkemedel och av denna anledning, det används i experimentella djurmodeller för att inducera lungfibros.
Fibrotiska lesioner uppstå i bleomycin-induced lung fibros modeller, 14-21 dagar efter bleomycin administrering. I presenteras arbetet använde vi ett nytt protokoll för att inducera lungfibros hos möss vid dubbel bleomycin intratrakeal instillation. Bleomycin musmodell är mycket tidskrävande eftersom nya läkemedel måste utvärderas på etablerade fibrotiska lesioner och testade för att skilja deras anti fibrotiska effekter från anti-inflammatoriska effekter.
Biokemisk bestämning av kollagen innehåll, morphometrical och histologiska analysen baserades på post mortem analys, begränsa möjligheten att följa patogenesen av sjukdomen i samma djur. Även om dessa parametrar ansågs en guld-standard för fibros utvärdering, de inte ger någon tids- eller rumslig distribution av fibrotiska lesionen och hindra ett sätt att undersöka processen av progression av sjukdomen. 10
Nyligen, icke-invasiv avbildningsteknik har tillämpats på monitor luftvägarna remodeling, inflammation och fibros progression i murina modeller: magnetisk resonanstomografi (MRT), Micro Datortomographyen (Micro-CT), fluorescens molekylär Tomografi (FMT) och självlysande (BLI)11,12,13,14,15,16,17,18,19 ,20,21. Vi föreslår en icke-invasiv tänkbar strategi för att övervaka längdriktningen lung fibros progression av FMT och Micro-CT vid olika tidpunkter efter en bleomycin utmana22.
Många vägar är involverade i upprättandet och utvecklingen av fibros och inte mycket är känt. Endast en djupare förståelse av dessa processer kunde översätta till mer målmolekyler som kan överföra till kliniken. Förmåga att longitudinellt följa MMP aktivering av fluorescens molekylär tomografi kopplat till upptäckt av parenkymal lungförändringar av mikro-CT kan användas i framtiden för åtkomst till det kliniska behandlingssvaret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurförsök som beskrivs häri godkändes av utskottet intramurala djurskydd för djurförsök Chiesi Farmaceutici och ERASMUS MC under protokollnummer: EMC 3349 (138-14-07) uppfyller den europeiska direktiv 2010/63 UE, Italienska D.Lgs 26/2014 och de revidera ”Guide för the hand och användningen av försöksdjur”23.
Obs: Före användning, honmöss inavlade C57Bl/6 (7-8 veckor gammal) var acklimatiserad i minst 7 dagar till lokala vivarium villkorar (rumstemperatur: 20-24 ° C, relativ luftfuktighet: 40-70%; 12-h ljus-mörker cykel), att ha fri tillgång till standard gnagare chow och avhärdat vatten.
1. intratrakeal behandling av möss med Bleomycin
- Förbered utrustningen för intra-trakeal instillation12,13,14.
- Sätta mössen i narkos kammaren ansluten till en isofluran spridare satts till 2,5 procent blandas med syre. Kontrollera om djup anestesi genom bristen på en tå-nypa svar. Effekten av narkos inträffade efter 3-5 min.
- Placera sövda musen på intubation plattformen, hänger det av dess incisiver placeras på tråd.
- Slå på laryngoskopet, ta ett par trubbiga slutade pincett och använda tången eller laryngoskopets tips att försiktigt öppna munnen.
- Dra ut tungan och håll den sida med pincett. Placera bladet laryngoskopet mot baksidan av munnen tills öppnandet av luftstrupen är visualiseras och hålla laryngoskopet på plats.
- Med den andra handen, infoga inloppsrörets ansluten till slutet av PE slangen in i luftstrupen, roterande tre-vägs ventilen. Leverera 50 µL av bleomycin (0,020 µg/mus). Efter instillation, genom att snabbt ta bort röret från luftstrupen att förhindra kvävning. Håll mössen upprätt i några sekunder.
- Administrera bleomycin intratracheally vid dag 0 och upprepar på dag 4 (figur 1).
- Ta bort musen från intubation plattformen och övervaka musen i 30 min (den tid som behövs för att återhämta sig helt från anestesi).
- Utföra i vivo imaging av möss lungorna av FMT och Micro-CT efter dubbel bleomycin instillation vid dag 7, 14 och 21.
2. in vivo Imaging av fluorescens molekylär tomografi
Obs: Förbered i förväg, en färsk stamlösning 6 nmol/ml av MMP känsliga fluorescerande substraten 680 i saltlösning (0,9% natriumklorid) och store skyddas från ljus vid 4 ° C före användning. Den är stabil i upp till 6 månader vid 4 ° C. Tillåta MMP imaging agent temperera vid rumstemperatur innan injicering i djur.
-
Sonden injektion
- Förbered utrustningen för intravenös injektion av MMP sonden lösningen. Pre varmt vatten vid 50 ° C att värma mus svansen.
- För att ta tag i musen kragen, ta den i svansen och låt det att greppa bur locket. Håller mössen över djurets axlar, sätta svansen i en bägare med varmt vatten, för 4 till maximalt 8 s termisk skada att förhindra termisk skada på svansen huden. Kontrollera venerna svullnad för enklare visualisering och införande av nål.
- Under förfarandet för injektion, sätta mössen i en plast fasthållning att hålla den stadig och dra svansen genom en speciell hål i ryggen. Hitta två kaudala venerna på vardera sidan av svansen; inte artären på undersidan av svansen.
- Stick in nålen (26G) 1 mL sprutan i venen. Om nålen är korrekt placerad, injektion blir lätt och sonden lösningen kommer att flöda in i kärlet.
- Injicera lösningen MMP sonden på 10 mL/kg.
- Kassera injektionsnålen.
Obs: Den optimala imaging tidpunkten är 24 h efter MMP sonden injektion eftersom det är den tid som krävs av sonden som ska aktiveras. Om longitudinella studier utförs, är den optimala förnyad injektion tid 7 dagar, vilket möjliggör fullständig clearance av agenten från musen.
-
FMT imaging
Obs: Innan du börjar, ta alltid bort pälsen på och runt områdena av djur som skall avbildas, i detta fall bröstet, för att undvika spridning och absorbansen i vävnad.- Att söva musen, lägga den i narkos kammare och vrid isofluran ratten till 2,5% för induktion och 2% för underhåll.
- Initiera data förvärv programvaran och öppna en ny studie i databasen för experimentet.
- Innan bildtagning med FMT, överföra musen i imaging kassetten. Placera den sövda mus mitt i imaging kassett för att använda optimalt synfältet av FMT. Hålla mössen platt, säkert och försiktigt komprimerade mot både windows imaging kassettens. Justera höjden av knoppar på kassetten, och skjut den i dockningsstationen.
- Klicka på ämne i scanning-fönstret och klicka på Förhandsgranska för att se live-avbilden.
- Dra regionen scan tillräckligt stort så att vävnaden som omger det förvänta området av fluorescens fångas. Inklusive sammanlagt 25 scan punkter garantier blir regionen lungan helt skannade.
- När ROI dras, först lägga till återuppbyggnad kö och klicka sedan på Skanna för att bilden med musen. Kontrollera att rätt lasern på 680 nm är markerad.
- När bilden förvärvet slutförs, Placera musen tillbaka till sin bur. Var noga med det fullt återhämtar sig från anestesi.
- Kvantifiera picomoles av fluorescens i fönstret analys av programvaran analys med hjälp av ROI-verktyg och minska ROI runt 700-800 mm3 på signalen från regionen lung. Var försiktig med att utesluta lever signalen. Kopiera ROI på de andra ämnena som har dem liknande i dimension och justera deras placering i varje djur bild.
- Exportera bilder som jpg-filer.
3. in Vivo Imaging av mikro-CT
FÖRSIKTIGHET: Innan du börjar alltid ta bort metall smycken eller metallföremål nära imaging området, för att undvika spridning av röntgenstrålning.
Obs: Strålning-inducerad lungfibros är ett vanligt konstaterande under strålning induced lung skada24. Varken Micro-CT härrör index eller histologiska fynd associerade med lungfibros var närvarande i saltlösning behandlade kontroll möss på dag 21 utsätts för fyra Micro-CT imaging sessioner, vilket indikerar att den Röntga dos levereras till djuren under mikro-CT undersökningar inte var tillräcklig för att påverka resultaten.
- Slå på mikro-CT genom att trycka på knappen grön power och starta programvaran att värma upp röntgen källan. Använd små hål och djur sängen för möss imaging.
- Skapa databasen genom att klicka på ny databas för en ny och bygga webbläsaren baserad på antalet möss i experimentet, eller klicka på ansluta till befintlig databas för att spara data till en tidigare skapad.
- Innan du påbörjar skanning, Välj parametrarna förvärv i fönstret programvara styrning: röntgenrörets spänning, 90 kV; CT röntgen tube ström, 160 µA; Levande röntgenröret nuvarande, 80 µA; FOV, 36 mm; Ingen Usenets teknik; Skanna teknik, hög upplösning 4 min.
- Söva möss genom inhalation av 3% isofluran och placera dem på sängen in i hålet med en Kona som ger en konstant tillförsel av bedövningsmedel. Immobilisera tassar av möss med tejp på sängen så att bröstet att exponeras.
- Skjut instrument dörren och aktivera Live-läge att se muspositionen i realtid genom att trycka på slutarknappen. Flytta djur sängen att anpassa bröstet med synfältet (FOV) med hjälp av knapparna direkt ligger på CT instrumentet. Center skanna på musen; om inte justera position med vänster och höger pilar ligger på CT instrumentet.
- Bekräfta optimal säng position genom roterande utlastningsanordningen genom att välja 90 ° och klicka på Ställ in. Se till att regionen att bilden är helt släpper FOV.
- Inte tillämpa någon Usenets teknik och starta sökningen genom att klicka på datortomografi . Klicka på Ja i meddelandet som informerar att röntgen källan aktiveras.
Obs: När Röntgenstrålarna är påslagna, orange lampan ovanpå instrumentet kommer att vara upplyst och skjutdörren blir omöjligt att öppna för säkerheten för operatören. När genomsökningen är klar öppnas ett nytt fönster av programvaran 2D Viewer visar den transaxial, koronala och sagittal segment av rekonstruktionen. - Kontrollera bildkvaliteten och se till att inte ha suddiga bilder från rörelser på grund av den låga nivån av anestesi. Om nödvändigt, upprepa genomsökningen.
- Placera djuren tillbaka i buren och vara säker på att de återhämta sig helt från anestesi.
4. bronkoalveolär Lavage
- Söva djur med 3% isofluran och offer av blödning från bukaorta.
- Använda sax för att exponera bröstkorg buren och hals. Sedan utsätta luftstrupen och göra ett litet snitt tillåta BAL förfarandet skall utföras med en 21-gauge lavage slang kopplad till en 1 mL spruta utan nålen. Uppmärksamma inte skär genom luftstrupen.
- För att utföra BAL, Fyll en 1 mL spruta utan nål med 0,6 mL steril lösning [10 x Hanks balanserad saltlösning (HBSS); 100 mM etylendiamintetraättiksyrans dinatriumsalt (EDTA); 1 mM 4-(2-hydroxy-ethyl)-1-piperazineethansulphonic syra (HEPES); destillerat vatten].
- In lavage röret i snittet i luftstrupen och långsamt injicera och ta ut lösningen 3 gånger, pausa på tredje uttaget till tillåta optimal insamling av BALF för efterföljande analys.
5. histologi och Histomorphometry
- Exponera och ta bort lungorna, blåsa upp dem med en kanyl genom luftstrupen genom skonsam infusion med 0,6 mL i 10% neutral buffrad formalin och lagra proverna i rumstemperatur i 24 h.
- Torkar ut prover genom olika passager i ökande koncentrationer av alkohol lösningar (60% etanol för 1 h, 70% etanol för 1 h, 90% etanol för 1 h, 95% etanol för 2 h, och 100% etanol för 2 h) använder en automatisk vävnadsprocessor.
- Placera exemplar i xylen för 2 h att göra dem genomskinliga. I slutet av uttorkning, infiltrera prover i paraffin vid 60 ° C för 3 h och bädda in dem i den automatiska processorn.
- Få 5 µm tjock seriell sektioner med hjälp av en roterande mikrotom.
- Deparaffinize och rehydrera diabilder i fallande kvaliteter av etanol och fläcken med Masson's Trichrome med en automatisk vävnadsprocessor.
- Manuellt fokus på lung skivor, skanning på 20 X förstoring med hjälp av en diascanner och ta digitala bilder av hela lungan sektioner med programvaran visning med en upplösning på 451 nm/pixel.
- Morfologiskt bedöma fibrotiska lungskada genom semikvantitativt och kvantitativa parametrar enligt följande:
- Bestämma den Ashcroft poängen. Semi kvantitativt grade morfologiska förändringar i lungan sektioner enligt den skala som definieras av Ashcroft10 ändrat av Hübner o.a. 25 använda systemet med 0-8 Poäng för att bedöma alla parenkymet i avsnitten lung.
- Bestämma kollagenhalten. Kvantifiera graden av fibros10,25 av Mikroskop bild analys programvara. Slumpmässigt Välj tre ROIs vid 10 X förstoring, per varje bild. Genom standardisering av tröskelvärdet färginställningar, upptäcka kollagen som grön-färgade område.
- Bestämma området alveolär luft. Kvantifiera området alveolära luften som en indirekt parameter fibros10,25. Med hjälp av samma programvara och ROIs ansökt om andelen fibros, upptäcka området luft inom de ROIs använder en vit tröskel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Spontan resolution av lung fibros lesioner observerades tre veckor efter enda bleomycin administration och måttlig strukturförändringar Markera gränserna för denna modell. Endast förebyggande behandling kan utföras på grund av det smala terapeutiska fönstret som inte representerar klinisk praxis17.
Här visar vi att vårt protokoll av dubbel bleomycin intratrakeal instillation kunna utveckla långvarig lungfibros i möss18. Experimentell design visas i figur 119,20,21. Målet med denna studie är att titta på lung fibros progression i möss med icke-invasiv avbildningsteknik. Bleomycin var intratracheally administreras två gånger (vid dag 0 och 4; 1 mg/kg av bleomycin i 50 µL vid varje tillfälle). Tolv möss för varje grupp var intratracheally utmanas med samma volym av fordonet endast samtidigt som gruppen bleomycin att använda som kontroll. För bedömning av fibros gjordes en semikvantitativ histologisk analys utifrån Ashcroft poängsystem. 10
I detta arbete bedömde vi lungans fibros utveckling i bleomycin-inducerad musmodell med hjälp av Micro-CT och FMT tekniker i kombination med klassiskt histologi. Noninvasiv beskaffenhet avbildningstekniker representerar verkliga värde för preklinisk utvärdering av lung fibros progression och överenskommelse med histologin är ett utmärkt steg. Micro-CT imaging kunde spela en viktig roll i kvantifiering av parenkymal lungförändringar på grund av fibrotiska lesioner longitudinellt.
Histologi bilder av bleomycin behandlade gruppen visade en uttalad mönster av fibros start från dag 7, huvudsakligen som enda fibrotiska massorna, och utvecklats i dag 14 konfluenta konglomerat av ersätter kollagen och förblev oförändrat till dag 21 ( Diagram 2A - 2 C). Bleomycin behandling inducerad lunginflammation (figur 3A), där antalet WBC var signifikant högre i BALF bleomycin behandlade möss på 7, 14 och 21 dagar jämfört med vehikelgruppen. Intressant, höjdes lymfocyter och monocyt fraktioner också på varje gång av provtagning (siffror 3B-3 C); Däremot har en signifikant ökning av neutrofila fraktionen observerats vid dag 7 (figur 3D).
I denna studie användes Micro-CT att övervaka parenkymet lungförändringar longitudinellt. Progressiv anatomiska förändringar av lungan arkitektur vid olika tidpunkter för observation från baslinjen ses tydligt i mikro-CT prognoser (figurerna 4A-4B). Luftvägarna radien i den distala delen av bronker (siffror 5A och 5 C)19,20,21 och total lung fibros procentandel (siffror 5B och 5 D) kan kvantifiera fibros progression. Fibros procentandel kvantifiering i bleomycin behandlingsgrupp dag 7 (figur 5D) överskattades något om jämfört histologi scoring. Detta kan förklaras av en dual reaktion av inflammation och fibros debut, vilket gör det svårt att skilja mellan de två symtom. Luftvägarna radien och andelen fibros var utvalda från bildbehandling av mikro-CT prognoserna för kvantifiering av lung parenkymal förändringar (Siffrorna 5 C-5 D)19,20,21 . Dessa mikro-CT parametrar är mycket väl överens med histologiska fynd som visas i Siffror 2A/2 C.
Micro-CT imaging direkt återspeglas de patologiska och terapeutiska förändringarna av lungparenkym och FMT teknik som kvantitativ information mer relaterade till proteinuttryck velat IPF. För denna studie valde vi en MMP sonden baserat på dess relevans för IPF och vi hittade specifik MMP aktivering i bleomycin behandlade möss (figur 6)18. Rollen som MMP har undersökts genom att injicera antingen fordon eller bleomycin behandlade möss med MMP aktiverbara fluorescerande sonder vid valda tidpunkter. Tjugofyra timmar efter injektionen, var mössen fotograferad av FMT avslöjar att fibrotiska möss kan aktivera specifika MMP fluorescerande sonden i vivo (siffror 6A-6 D)18 och ex vivo (figur 6E)18 .
Figur 1 : Experimentell inrättats för bleomycin-inducerad mus lungfibros. C57BL/6 honmöss hade antingen koksaltlösning eller bleomycin ingjutit intratracheally på två tillfällen, dag 0 och 4. Möss var fotograferad av en mikro-CT-skannern vid baslinjen (dag 0), 7, 14 och 21 dagar. Grupper av 12 möss offrades på 7, 14 och 21 dagar och deras lungor bedömdes för kollagen nedfall att korrelera histologiska resultat med bilder tagna av µCT. Denna siffra har ändrats från publicerad artikel21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: histologisk analys tidsförloppet för bleomycin inducerad lungfibros i möss.
(A) kvantifiering av lungfibros av Ashcroft Poäng antingen fordon eller bleomycin behandlade möss vid olika tidpunkter. Experimentet upprepades tre gånger och varje punkt representerar det medelvärde ± SEM 12 djur. Statistisk analys har utförts av ANOVA följt av Tukey's test. * p < 0,05; ** p < 0,01.
(B) Ashcroft Poäng frekvensfördelning fördelas i lindrig, måttlig och svår underkategorier.
(C) representativa histologi av Masson's Trichome färgas mus lung sektioner för intratracheally dubbel ingjutit bleomycin eller saltlösning behandlade möss på 7, 14 och 21 dagar efterbehandling (förstoring 10 X, skala bar 200 µm). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: cellulär infiltration tid jagar in i BALF av bleomycin inducerad lungfibros i möss.
(A) antalet WBC, (B) monocyter, (C) lymfocyter och (D) neutrofiler. Celler som finns i BALF var uttryckt som antalet celler * 103/µl. Experimentet upprepades tre gånger och varje punkt representerar det medelvärde ± SEM 9 djur. Statistisk analys har utförts av ANOVA följt av Dunnetts test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4 : Längsgående Micro-CT imaging projektioner av bleomycin-inducerad lungfibros och fordonets behandlade möss. (A) Micro-CT, bleomycin behandlas mus och (B) mikro-CT, saltlösning behandlade mus vänligen klicka här för att visa en större version av denna siffra.
Figur 5 : Airways, fibros lung lober kvantifiering och segmentering utifrån upprepade mikro-CT imaging.
(A) Airways var uppdelad i en central och distala del. (B) den distala delen av luftvägarna är den intrapulmonell tarmkanalen som används för att identifiera och dela upp i lungan lober som: rätt kraniala lob (RCrL), höger mitten lob (RMdL), rätt kaudala lob (RCdL), rätt tillbehör lob (RAcL) och vänster lunga (LL). (C) luftvägarna radie och (D) totalt lung fibros kvantifiering antingen fordon eller bleomycin behandlade möss vid olika tidpunkter. Varje punkt representerar det medelvärde ± SEM 5 djur, för sammanlagt 30 möss. Statistisk analys har utförts av ANOVA följt av Dunnetts test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Denna siffra har ändrats från publicerad artikel21. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur. 6. tid kursen av fluorescens signal mätt med FMT inbleomycin induced lung fibros möss. In vivo (A och B) och ex vivo (C och D) FMT representativa bilder av möss som injicerats med MMP sonden behandlats med fordon eller med bleomycin. (E) den totala mängden lung fluorescens signal beräknas automatiskt av FMT bildbehandlingsprogram. Experimentet upprepades tre gånger och varje punkt representerar medelvärde ± standardavvikelsen för 9 djur. Statistisk analys har utförts av ANOVA följt av Dunnetts test. * p < 0,05; ** p < 0,01. Denna siffra har ändrats från publicerad artikel18. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Trots många forskargrupper fokuserar på att utveckla nya läkemedel för behandling av IPF, för tillfället finns bara två tillgängliga för patienter. Det finns ett brådskande medicinska behov att hitta effektivare behandlingar7 eftersom bara lung transplantationis kunna förlänga överlevnaden av 4-5 år26. Den grundläggande förutsättningen för translationell medicin och utveckling av nya läkemedel är tillgången på en djurmodell som efterliknar funktionerna i IPF och i vilka interventionsstudier är prediktiva för framgång i kliniken. Nyttan av de befintliga lungfibros djurmodeller är dock fortfarande kontroversiell27. Vi utvecklar en ny musmodell av lungfibros som kräver en dubbel instillation av bleomycin som beskrivs i figur 118. Imaging tekniker är kraftfulla verktyg för att visualisera sjukdomsprogression och farmakologiska behandlingssvaret. Denna djurmodell återgetts bättre mänskliga funktioner i IPF och icke-invasiv teknik kunde skapa en bro mellan inställningar för preklinisk och klinisk praxis27.
Men för att få tillförlitliga och reproducerbara data, är några steg avgörande. Den intratrakeal instillationen måste utföras när mössen är fullt anesthetized, använda ett standardiserat förfarande. Micro-datortomografen kräver mycket noggrann övervakning av anestesi, eftersom CT projektionerna är inhängnad av respiratorisk frekvens. Innan imaging, kontrollera att mössen har samma djup anestesi. Ett mycket viktigt steg för optisk imaging av FMT är avhårning. Innan du börjar, ta alltid bort pälsen på och runt bröstet, för att undvika spridning och absorbansen i vävnad. Sonden injektionen behöver korrigeras av djurets kroppsvikt.
Möjlighet att undersöka och kvantifiera en specifik molekylär avläsningssystem med anatomiska förändringar i samma möss vid olika tidpunkter representerar ett stort steg i förståelse fibros utveckling, ett uppenbart förskott för funktionella samt farmakologiska studier.
Detta multimodal imaging strategi är ett smart verktyg för att utvärdera läkemedel effekten, som ger mycket mer information jämfört med terminal bedömning, att översätta i en effektivare drug discovery-processen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna förklarar att de har inga konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Dr. Daniela Pompilio och Roberta Ciccimarra för teknisk hjälp.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| FMT 2500 Fluorescence Tomography System | Perkin Elmer Inc. | Experimental Builder | |
| MMPsense 680 | Perkin Elmer Inc. | NEV10126 | Protect from light, store the probe at 4 °C |
| TrueQuant software | Perkin Elmer Inc. | ||
| Female inbred C57BL/6 | San Pietro NatisoneHorst, The Netherlands (UD), | Prior to use, animals were acclimatized for at least 5 days to the local vivarium conditions | |
| Isoflurane | ESTEVE spa | 571329.8 | Do not inhale |
| Automated cell counter | Dasit XT 1800J | Experimental Builder | |
| Saline Solution, 0.9% Sodium Chloride (NaCl) | Eurospital | 15A2807 | |
| Quantum FX Micro-CT scanner | Perkin Elmer Inc. | ||
| Bleomycin sulphate from Streptomyces Verticillus | Sigma | B2434 | |
| Automatic tissue Processor | ATP700 Histo-Line Laboratories | ATP700 | |
| Embedding system | EG 1160 Leica Biosystems | EG 1160 | |
| Rotary microtome | Slee Cut 6062 | ||
| Digital slide scanner | NanoZoomer S60, Hamamatsu Photonics | ||
| NIS-AR image analysis software | Nikon | ||
| Masson’s Trichrome Staining | Histo-Line Laboratories | ||
| 10% neutral-buffered formalin | Sigma | HT5012-1CS | |
| Penn-century model DP-4M Dry power insufflator | Penn-century | DPM-EXT | |
| PE190 micro medical tubing | 2biological instruments snc | BB31695-PE/8 | |
| Syringe without needle 5 mL | Terumo | SS*05SE1 | Cut the boards of the piston by scissors |
| Hamilton 0.10 mL (model 1710) | Gastight | 81022 | |
| Discofix 3-way Stopcock | Braun | 4095111 | |
| Syringe with needle 1 mL | Pic solution | 3,071,260,300,320 | Use without needle |
| Plastic feeding tubes 18 ga x 50 mm | 2biological instruments snc | FTP-18-50 | Cut obliquely the tip |
References
- Wynn, T. A. Integrating mechanisms of pulmonary fibrosis. J. Exp. Med. 208 (7), 1339-1350 (2011).
- Wynn, T. A., Ramalingam, T. R. Mechanisms of fibrosis: therapeutic translation for fibrotic disease. Nat. Med. 18 (7), 1028-1040 (2012).
- Moore, B. B. Animal models of fibrotic lung disease. Am J Respir Cell Mol Biol. 49 (2), 167-179 (2013).
- Ackermann, M., et al. Effects of nintedanib on the microvascular architecture in a lung fibrosis model. Angiogenesis. , (2017).
- Moore, B. B., Hogaboam, C. M. Murine models of pulmonary fibrosis. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 294 (2), 152-160 (2008).
- Organ, L., et al. A novel segmental challenge model for bleomycin-induced pulmonary fibrosis in sheep. Exp Lung Res. 41 (3), 115-134 (2015).
- Organ, L., et al. Structural and functional correlations in a large animal model of bleomycin-induced pulmonary fibrosis. BMC Pulm Med. 15, 81 (2015).
- Shen, B., Du, L., Sanchez, C., Edwards, D. J., Chen, M., Murrell, J. M. Cloning and characterization of the bleomycin biosynthetic gene cluster from Streptomyces verticillus ATCC15003. J Nat Prod. 65 (3), 422-431 (2002).
- Yu, Z., et al. Targeted Delivery of Bleomycin: A Comprehensive Anticancer Review. Curr Cancer Drug Targets. 16 (6), 509-521 (2016).
- Ashcroft, T., Simpson, J. M., Timbrell, V. Simple method of estimating severity of pulmonary fibrosis on a numerical scale. J Clin Pathol. 41 (4), 467-470 (1988).
- Stellari, F., et al. In vivo imaging of the lung inflammatory response to Pseudomonas aeruginosa and its modulation by azithromycin. J Transl Med. 13, 251 (2015).
- Stellari, F., et al. In vivo monitoring of lung inflammation in CFTR-deficient mice. J Transl Med. 14 (1), 226 (2016).
- Stellari, F. F., et al. In vivo imaging of transiently transgenized mice with a bovine interleukin 8 (CXCL8) promoter/luciferase reporter construct. PloS one. 7 (6), 39716 (2012).
- Stellari, F. F., et al. Enlightened Mannhemia haemolytica lung inflammation in bovinized mice. Vet Res. 45, 8 (2014).
- Tassali, N., et al. MR imaging, targeting and characterization of pulmonary fibrosis using intra-tracheal administration of gadolinium-based nanoparticles. Contrast Media Mol Imaging. 11 (5), 396-404 (2016).
- Ma, X., et al. Assessment of asthmatic inflammation using hybrid fluorescence molecular tomography-x-ray computed tomography. J Biomed Opt. 21 (1), 15009 (2016).
- Van de Velde, G., et al. Longitudinal micro-CT provides biomarkers of lung disease that can be used to assess the effect of therapy in preclinical mouse models, and reveal compensatory changes in lung volume. Dis Model Mech. 9 (1), 91-98 (2016).
- Stellari, F. F., et al. Heterologous Matrix Metalloproteinase Gene Promoter Activity Allows In Vivo Real-time Imaging of Bleomycin-Induced Lung Fibrosis in Transiently Transgenized Mice. Front Immunol. 8, 199 (2017).
- Hellbach, K., et al. X-ray dark-field radiography facilitates the diagnosis of pulmonary fibrosis in a mouse model. Sci Rep. 7 (1), 340 (2017).
- Zhou, Y., et al. Noninvasive imaging of experimental lung fibrosis. Am J Respir Cell Mol Biol. 53 (1), 8-13 (2015).
- Ruscitti, F., et al. Longitudinal assessment of bleomycin-induced lung fibrosis by Micro-CT correlates with histological evaluation in mice. Multidiscip Respir Med. 12, 8 (2017).
- Stellari, F., et al. Monitoring inflammation and airway remodeling by fluorescence molecular tomography in a chronic asthma model. J Transl Med. 13, 336 (2015).
- Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, 8th ed. , National Research Council. Washington DC. (2011).
- Meganck, J. A., Liu, B. Dosimetry in Micro-computed Tomography: a Review of the Measurement Methods, Impacts, and Characterization of the Quantum GX Imaging System. Mol Imaging Biol. , (2016).
- Hubner, R. H., et al. Standardized quantification of pulmonary fibrosis in histological samples). BioTechniques. 44 (4), 507-514 (2008).
- King, T. E., Pardo, A., Selman, M. Idiopathic pulmonary fibrosis. Lancet. 378 (9807), 1949-1961 (2011).
- De Langhe, E., et al. Quantification of lung fibrosis and emphysema in mice using automated micro-computed tomography. PloS one. 7 (8), 43123 (2012).
