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JoVE Journal Immunology and Infection
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Immunology and Infection

替代体外测定病毒衣壳结构完整性的方法

Published: November 16, 2017 doi: 10.3791/56444
Automatic Translation
1, 2, 1
1Department of Food, Bioprocessing, and Nutrition Sciences, North Carolina State University, 2Department of Chemical and Biomolecular Engineering, North Carolina State University

Summary

利用病毒基因组扩增的常规检测方法由于不能区分传染性的非传染性微粒而受到限制。本文的目的是提供的其他方法, 以帮助区分传染性病毒颗粒使用适结合, 动态光散射和透射电子显微镜详细的协议。

Abstract

人类病毒在全世界造成了相当大的公共卫生和经济损失。新兴的体外培养的进展尚不适用于常规的病毒检测。目前的检测和量化技术, 主要依靠核酸扩增, 不区分传染性的非传染性病毒颗粒。这篇文章的目的是介绍最近在一起使用的技术进展的具体细节, 以便获得关于病毒微粒传染性状况的进一步信息。一种方法是评估病毒 ssDNA 适与衣的结合。适具有易合成、改性、价格低廉、稳定等优点。另一种技术, 动态光散射 (dl), 具有观察衣壳行为在溶液中的优势。电子显微镜允许可视化的结构完整性的病毒衣。尽管前景看好, 但每种技术都存在一些缺陷, 如对样品基质中的正电荷分子的非特异性适结合, 对 dl 的纯化衣壳的要求, 电子显微镜的灵敏度较差。然而, 当这些技术结合使用时, 所产生的数据提供了关于病毒衣壳完整性的更全面的信息, 可以用来推断传染性, 这些信息对于准确评估灭活方法或病毒检测的解释。本文提供了使用这些方法来区分传染性的人病毒粒子的协议。

Introduction

人类病毒负责全球相当大的公共卫生负担, 每年造成大约6亿8500万疾病和21.2万人死亡1, 耗资数十亿美元的2,3。今天, 病毒检测和量化涉及基因组放大和/或 ligand-based 平台。前者通常是首选, 因为它比较敏感, 提供了定量信息, 并且通常具有较低的误报结果的风险4。最常见的病毒检测和定量的基因组扩增技术是逆转录酶定量聚合链式反应 (RT-qPCR)。因为它的目标和放大人类病毒基因组的一小部分, RT qPCR 单独是不能区分传染性和非传染性的粒子, 作为自由基因组 RNA, 受损衣含有基因组, 和衣致命突变/截断的基因组仍可通过 RT qPCR 放大。虽然最近已经报告了两个新的体外培养技术为人类病毒56 , 但它们仍然依靠 RT qPCR 进行病毒定量化, 而且还不是常规临床/环境的可行方法。测试人类的病毒。因此, RT-qPCR 仍然是临床/环境测试的黄金标准。

其他的体外方法是为了更好地估计病毒颗粒的传染性状态而开发的。这些方法一般可以归类为那些处理病毒衣壳完整性和评估基因组完整性的人。前者的做法更受欢迎。一个常用的方法是核糖核酸预处理前提取病毒基因组 RNA, 但这并不解释的病毒微粒, 保持完好, 但缺乏能力, 以约束宿主受体/因素, 以及病毒粒子, 有致命的突变或已截断或稍有损坏的基因组7。衣壳的完整性也可以根据病毒对人类病毒 co-receptor/因素的能力进行评估, 这些碳水化合物被称为组织血型抗原 (HBGAs)。HBGAs 是存在于宿主肠上皮细胞作为糖蛋白或脂 (在多个其他组织中) 的一部分, 并可能在体液中分泌, 如唾液。在其表面含有 HBGA 样物质的肠道细菌也被证明绑定人类病毒8,9,10, 这样的交互可能会促进病毒感染5。使用 HBGA 结合的基本概念是, 只有能够结合假定受体/共同的病毒粒子才能够感染细胞。多项研究表明, bead-based HBGA 结合在先核酸扩增是一种有前途的传染性判别方法11,12,13,14, 15,16。关于 HBGAs 的一个主要挑战是, 没有一个单一的 HBGA 类型可以约束所有人类病毒基因型。为了解决这一问题, 猪胃粘液蛋白, 其中含有 HBGAs, 已被用于取代纯化的 HBGA 碳水化合物的利益, 易于合成, 一致性, 降低成本。

摩尔et al.的最新出版物17引入了一套用于估计人类病毒衣壳完整性的新技术。代替 HBGAs, 摩尔et al.17研究了广泛反应的核酸适 (M6-2)18和广泛反应的单克隆抗体 (NS14)19到 heat-treated GII 的绑定. 4 悉尼病毒衣 (病毒样颗粒或 vlp), 并比较这对合成 HBGAs 的约束力。核酸适是短 (〜 20-80 nt) 单链核酸 (ssDNA 或 RNA), 折叠成独特的三维结构作为其序列的结果, 并绑定一个目标。因为它们是核酸, 所以成本更低;易于化学合成、纯化和改性;和稳定的热量。一些报告的适产生反对病毒存在, 其中一些表现出广泛的反应, 各种菌株18,20,21,22。例如, 摩尔et al.17表明, 适 M6-2 绑定到纯化、组装的人类病毒衣 (vlp), 并在依赖于病毒衣壳的 HBGA 中表现出类似的行为, 以维持更高的顺序 (例如,二级和第三级) 蛋白质结构发生绑定。另一方面, 在衣完全变性后, 有相当比例的病毒 vip 结合抗体 NS14 残留。摩尔et al.研究中病毒结合的评价17使用了类似于 ELISA 的简单的 plate-based 方法, 但适用于替代抗体 (因此该方法被称为 ELASA)。这种高通量的实验方法被用来评估不同的处理对病毒衣壳的影响, 这对了解病毒灭活的机制, 在接触物理或化学压力源时有价值然而, 这种方法的一个缺点是较低的灵敏度和缺乏耐受性的高级别的基质相关污染物, 导致非特异性的约束力适。

摩尔et al.17使用了另一种方法, 即动态光散射 (dl) 来监测病毒粒子在热处理时的聚集情况。dl 通常用于评估纳米粒子悬浮液的大小, 并已扩展到蛋白质23,24和病毒25,26,27。粒子在溶液中散射的光的强度随粒子大小的函数而波动, 从而允许计算扩散系数, 然后使用已确定的公式进行粒子直径。dl 技术可以区分分散粒子的水动力直径到纳米尺度, 它允许检测分散的病毒、单个衣壳蛋白或聚, 以及基于大小27的病毒聚合体。病毒聚集, 以增加的粒子大小为代表, 表明了衣壳完整性的损失。由于衣壳变性, 其结构被破坏, 疏水性残留物就会暴露, 导致微粒粘在一起形成聚合体。dl 可用于在指定处理后测量粒子大小或实时聚合的动力学17,28。这种方法的优点是可以在溶液中观察衣壳的行为, 但需要高浓度的纯化衣壳, 这可能并不完全代表该病毒在其自然状态。

摩尔et al.使用的最终方法17是透射电子显微镜 (TEM)。虽然这种方法缺乏敏感性, 不产生定量数据, 但它允许可视化不同处理对病毒衣壳结构的影响。虽然尚未理想的临床/环境设置, 这些方法的组合使用是有价值的了解人类病毒灭活。本文的目的是为 plate-based 结合测定 (ELASA)、dl 和 TEM 制备方法提供 in-depth 的协议, 用于研究热处理对衣壳中病毒衣壳的影响。在摩尔et al.中提供的完整性17。

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Protocol

1. Plate-based 结合法评价高阶病毒衣壳结构的损失

注意: 在这里提出的一个非常类似的 ELASA 协议已被发布 29 ,和类似的 ELASA 化验报告以前曾作为研究文章的一部分在别处 17 , 18 , 22 。

  1. 对人类病毒的热处理 gii 4 悉尼衣
    1. 获得纯化的人类病毒主要衣壳蛋白 (VP1) 的 gii. 4 悉尼 (加入: JX459908) 组装在衣.
      注: 衣在研究中获得了 Atmar (休斯敦, 德克萨斯州贝勒医学院) 的礼遇.
    2. 稀释衣至50和 #181; 在1x 磷酸盐缓冲盐水 (PBS, pH 7.2) 中, 最大容积为15和 #181; L 在单个上限 PCR 管。确保该管含有至少 600 ng 的衣壳。确保每个治疗配体组合有 600 ng 的衣壳.
    3. 预热热循环到所需的热处理.
      注: 为本议定书的目的, 治疗68和 #176; C 为不同的时间 (0-25 min) 被选择了.
    4. 预热一个额外的热循环到4和 #176; C 用于立即冷却。在所需时间, 在热循环上添加带有衣壳溶液的管子。立即转移到预4和 #176; C 循环加热后5分钟。
      1. 包括95和 #176; C 作为变性衣壳控制的5分钟治疗。包括未经处理的 (23 和 #176; C) 衣壳溶液作为一个积极的控制。包括 PBS 与无衣壳作为一个额外的负面控制.
    5. 在离心机中短暂旋转, 将所有液滴放到管底, 并将 PBS 中处理过的衣壳溶液稀释到3和 #181;确保至少有200和 #181; 稀释的、经过处理的衣壳 (100 和 #181; l/井).
  2. 应用100和 #181; 每个井的衣壳解决方案, 确保每个处理至少有两个井。另外, 包括2控制井与100和 #181; L PBS 为每个配体;这提供了测定的背景吸光度。盖上盖板, 用石蜡膜封住边缘, 以减少蒸发, 然后在4和 #176 的摇箱上过夜; C 或室温下2小时.
  3. 用0.05% 吐温 20 (PBST) 在 PBS 中制作5% 脱脂牛奶固体 (w/v), 准备阻塞缓冲器.
  4. 从盘中取出经过处理的衣壳溶液。添加200和 #181; 阻塞缓冲区的 i/o。在室温或夜间孵育2小时, 密封在4和 #176; C.
  5. 准备化适 M6-2 18 、 29 和化合成 HBGA 血型 A 或化类型 H 的配体绑定解决方案。
    1. 将化适稀释到1和 #181; 我在核酸水中。确保200和 #181 有足够的解决方案; 每种治疗的总数量。将所选的化 HBGA 稀释到30和 #181; 在阻塞缓冲区中的 g/mL。确保有足够的200和 #181 的解决方案; 每种治疗的总容积.
      注: 使用较少的 HBGA, 10 和 #181; HBGA 0.25% 脱脂牛奶中的 PBST 可以替代。化 M6-2 和 HBGA 的浓度已经经过优化和报告.
  6. 删除阻塞缓冲区, 并使用200和 #181 清洗该板3次; PBST。用无菌纸巾把盘子倒置, 晾干残余的水分.
  7. 添加100和 #181; 配体结合液的 L/井, 确保每个热处理-配体组合有2口井。在室温下, 在60转1小时左右的轨道振动筛上孵化盖有盖子的盘子.
    注: 一定要包括2口井每一个未经处理的衣和完全变性衣为每个配体作为正负控制, 分别。此外, 还包括2和 #34; 没有衣壳和 #34; 每个配体的井为板材背景控制.
  8. 去掉配体溶液, 用200和 #181 冲洗3次井; PBST。将无菌纸巾上的盘子倒置, 以干燥残留的水分.
  9. 在 PBS 中添加100和 #181; 0.2 和 #181 的溶液的 L/井; 亲和辣根过氧化物酶。在室温下孵育15分钟, 在轨道振动筛上轻轻摇动.
    注意: 不同的亲和-辣根过氧化物酶结合物将有不同的浓度。请查阅用户和 #39 的手册, 以确定酶的 ELISA 应用的理想浓度范围, 并确保它是最佳的.
  10. 移除共轭解。用200和 #181 洗涤3次; 我/好 PBST将无菌纸巾上的盘子倒置, 以干燥残留的水分.
  11. 添加100和 #181; L/井33和 #39;, 55 和 #39;-tetramethylbenzidine (TMB) 衬底, 并允许颜色发展为 5-15 min. 观察任何颜色的负控制井, 并确保在复制板之间的同一时间持续发展。也要注意使用的平板读写器的吸光度范围.
    注: 根据所使用的配体/试剂的质量, 显影时间可能有所不同.
  12. 停止反应的发展与100和 #181; L/井1M 磷酸。立即阅读板 450 nm。保存数据.
    注: 酸的引入通常会使反应剧烈减慢, 但不会完全停止。在读吸光度之前, 不要把停止的盘子留在长时间内.

2。Plate-based 测定结果的分析

  1. 在电子表格程序中保存原始吸光度数据。用特定的处理和配体产生每个井对的平均吸收。使用这些平均值进行所有后续分析.
    注: 比较两个井的吸收, 以确保没有对水井有显着不同的价值观.
  2. 分析绝对衣壳完整性 (所有绑定), 减去 #34 的原始吸光度; 没有衣壳和 #34; 从其他所有样品的吸光度值中控制.
    注: 另外, 由于高阶 (二级、三级、第四系) 结构损失, 可直接分析。而不是减去阴性 (无衣壳) 控制的吸收, 减去完全变性衣壳控制的价值。这消除了所有的绑定信号, 由于非特异绑定到仪器, 以及绑定由于衣壳序列。HBGA 和适 M6-2 显示几乎没有约束力的完全变性衣壳, 所以任何方法产生类似的结果。在选择要使用的分析时, 必须考虑非特异适绑定的假阳性信号.
  3. 与阴性或变性控制调整的吸收, 划分治疗吸收由他们各自正面 (没有治疗) 控制吸收并且乘100。这提供了被处理的衣壳相对于未经治疗的控制信号的百分比.
  4. 要估计每个配体的结合信号的程度, 可归因于衣壳序列, 减去和 #34; 没有衣壳和 #34; 从初始吸收的负控制, 并采取变性衣壳的调整吸收。除以正控制信号的调整吸光度, 并乘以100。这给出了明显比例的信号, 由于配体结合到变性衣壳/衣壳序列.

3。用于检测热处理后病毒聚集的 dl

注意:下面的步骤可能是特定于所使用的软件和仪器, 但可以适用于类似的设备.

  1. 在 dl 仪器软件中创建一个新的大小 SOP 使用: 材料 = 蛋白质, 分散剂 = PBS, 温度 = 25 和 #176; C, 平衡时间 = 0 秒, 细胞类型 = 一次性试管 (小容量, ZEN0040), 测量角度 = 173 和 #176; 反向散射,测量持续时间 = 自动, 测量数 = 3, 测量之间的延迟 = 0 秒, 数据处理: 分析模型 = 一般用途 (正常分辨率)。对所有其他参数使用默认设置.
  2. 选择软件中的绿色运行箭头, 并命名该示例.
  3. 按照1.1.1 通过1.1.4 的步骤进行 vlp 的热处理.
  4. 在 1x PBS 中稀释热处理后的 vlp 1:10, 最终浓度为5和 #181;选)用1和 #181 过滤样品; m 孔径大小, 除去尘埃颗粒;dl 对尘埃非常敏感, 因为大颗粒比小颗粒散射的光要多得多.
  5. 传输50和 #181; 将稀释的 vlp 成小容量的一次性试管。将试管插入仪器的样品室.
  6. 开始运行, 并使用 #39; 相关和 #39;, #39; 累积量拟合和 #39;, #39; 专家建议和 #39; 选项卡, 用于评估数据质量.
    1. 在运行过程中, 检查多索引值是否小于 0.3, 表示质量度量. #160; 在和 #8216; 多视图和 #8217; 选项卡上, 确保相关系数在短时间内是恒定的且接近, 但不超过 1,并在以后的时间急剧下降到 0, 颗粒大小的特点。使用 #8216; 专家建议和 #8217; 在测量期间对数据质量进行反馈的选项卡.
    2. 测量完成后, 再次检查多索引值小于0.3。确保累积量拟合线紧跟数据点并 #8216; 累积值拟合 #8217; 选项卡.
  7. 将每个测量所报告的 Z 平均粒子直径的平均值作为每个样本的粒度。在 nm 和 #176 中绘制直径; C.

4。实时检测病毒聚合的 dl

注意: 下面的步骤可能是特定于所使用的软件和仪器, 但可以适应和应用于类似的设备.

  1. 在 dl 仪器软件中创建一个新的大小 SOP 使用: 材料 = 蛋白质, 分散剂 = PBS, 温度 = 根据需要, 平衡时间 = 0 秒, 细胞类型 = 石英试管, 测量角度 = 173 和 #176; 反向散射, 测量持续时间 = 自动,测量数 = 50 (可根据聚集速率增加或减少), 测量之间的延迟 = 0 秒, 数据处理: 分析模型 = 多个窄模式 (高分辨率)。对所有其他参数使用默认设置.
  2. 选择软件中的运行箭头打开并命名一个新的样本, 并允许仪器达到温度平衡.
  3. 将 vlp 在1X 和 #160 中挂起;P bs 在离心管中, 浓度为5和 #181; g/毫升和 200-500 和 #181 之间的体积; l 涡悬浮.
  4. 自旋向下 5-十年代在一个台式离心机的 vip 悬挂 de-gas。这有助于防止在热处理时气泡形成, 影响尺寸测量.
  5. 将 vip 悬挂转换为小体积石英试管-避免气泡和吸管慢慢地对试管壁。仪器达到温度平衡后, 将试管插入样品室.
  6. 等待十年代的样品温度平衡, 然后开始运行。在运行开始时启动计时器。在第一个测量结束时停止计时器。把这段时间作为第一个时间点。从软件记录的测量时间获取后续时间点.
  7. 启动运行, 并监视相关、分发适应和专家建议以评估数据质量.
    注: 当样品在聚合过程中被多时, 这些测量结果不一定少于0.3。
    1. 确保相关系数不变且接近, 但在短时间内不超过 1, 并且在一个或多个后期急剧下降, 这是粒度的特征.
    2. 确保分布适应线紧跟数据点.
  8. 分析大小数据。
    1. 确定每个测量时间点和初始时间点之间的时间差。测量工期并非完全相同.
    2. 使用强度分布, 记录每个测量/时间点的最大区域的峰值大小.
    3. 在最小值中绘制峰值直径与时间的图.

5。tem 样品制备

  1. 获得为 tem 设计的碳支撑膜 (镍) 网格.
    注: 咨询与核心设施的推荐试剂及其处理使用的设施显微镜。一定要在装有干燥剂或真空室的盒子里储存网格, 以尽量减少暴露在湿气中.
  2. 撕裂大约5厘米 x 5 厘米的滤纸。获得玻璃培养皿和适当的自闭式反向镊子, 设计用于显微镜.
  3. 切割约2.5 厘米 x 5 厘米的石蜡片。放在台式上.
  4. 热处理病毒 GII. 4 悉尼衣
    1. 按照上述步骤 1.1.1-1.1.5 中所述的热处理程序 (除: 使用 10 mM HEPES (pH 7.4) 进行治疗而不是 PBS, 不要进一步稀释衣治疗后 (保持50和 #181 的解决方案, 克/毫升)。吸管整个〜15和 #181; 在石蜡膜上除去经治疗的衣壳溶液.
  5. 使用镊子抓取网格边缘, 允许它们在边缘上关闭以容纳网格, 并将网格碳颠倒放在处理后的解决方案的顶部。让孵化10分钟, 使衣壳附着在网格上.
    1. 根据衣壳制剂的纯度, 如果需要, 在10-15 和 #181 的形式下添加冲洗 10 mM 的 HEPES 溶液; 在经过处理的衣壳液滴后, L 液滴放在线上.
    2. 10 分钟后, 用水滴拾取网格。将网格垂直放置在一张滤纸上, 使其远离水滴。选取 10-15 和 #181 的液滴; L HEPES 缓冲器与电网, 举行三十年代, 然后灯芯远离另一块滤纸洗.
  6. 将15和 #181; 在空白区域的石蜡膜上放置2% 铀醋酸液滴。
    1. 用网格提取铀乙酸的液滴, 并在四十五年代保存. 铀乙酸酯, 一定要除去大部分的溶液。将网格碳侧放在一块滤纸上, 小心网格不 #34; 粘 #34; 对镊子上的湿气。将过滤纸与网格放在一个开放的玻璃培养皿中.
      注意: 不要使用塑料培养皿, 因为网格会被静电吸引, 并成为粘在盘子里.
  7. 对所有处理进行重复。将培养皿半与网格干燥过夜, 在观察 TEM 之前晾干.
  8. 查阅相关机构的显微镜设备, 观察准备好的网格。一些设施允许使用者对他们的设施和 #39 设备的操作进行培训。有关特定显微镜的设置和观察的具体细节是 beyond 本文的范围.

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Representative Results

人类病毒的结构完整性 GII. 4 悉尼衣 (vlp) 使用了摩尔et al.提出的几种新方法进行了评估17. 首先, 进行了一项实验, 将衣的完整性作为其绑定一个假定的受体/共同 (HBGA) 或 ssDNA 适 (M6-2) 的能力的功能进行了比较 (图 1)。显示的结果以前是由摩尔et al.提供的17, 并证明了适 M6-2-capsid 绑定行为与病毒 HBGA 结合, 在接触到68° c 热处理时对各种曝光时间的影响是相似的。虽然 HBGA 结合信号比适 M6-2 稍早丢失, 但 M6-2 显示了一个类似的信号损失率计算后 vlp 被暴露在65° c 和68° c 的各种时间点 (表 1)17。这表明, HBGA 和适 M6-2 的约束力都是以类似的方式废除的。

dl 的测量表明, 由于蛋白质变性的聚合可能与配体结合信号的丢失 (图 2) 相对应, 因为在68° c 的大约18分钟的治疗后, 水动力直径大于 100 nm。这些条件是完全丧失 HBGA 结合和几乎所有的绑定信号丢失的适 M6-2 (和 #62; 80%) 发生 (图 1)17。TEM 的结果支持这些观察, 随着温度的增加, 在60° c 和80° c 1 分钟 (图 3a) 中, 衣的形态变化和结块变得越来越明显。在68° c 加热衣25分钟后观察到类似现象, 但 TEM 的分辨率较不明显 (图 3b)17。

Figure 1
图 1: 两个不同配体的构象依赖性结合到病毒 GII. 4 悉尼衣受热处理.净化 GII. 4 悉尼衣 (vlp) 在68° c 下接受热处理, 时间不同, 对血型 a HBGA 和适 M6-2 的结合使用 plate-based ELASA 结合试验进行了评价。Y 轴显示的吸光度信号的治疗 (曝光时间) 的百分比未经处理的衣壳控制。此图已被显示, 此图已从摩尔et al.中修改17误差线表示% 信号的±1标准偏差。数据至少有三复制板。请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 2
图 2: heat-treated 病毒的示例 dl 数据 GII. 4 悉尼衣显示理想和不明确/低质量的结果.衣 (vlp) 在65° c 和68° c 下进行热处理, 实时监测其大小。面板 (a) 对应于高质量、清晰的相关系数测量;和 (b) 到低质量、不明确的相关系数测量。面板 (c) 显示粒度数据, 显示68° c 处理的衣的清晰聚合轮廓;和 (d) 显示 heat-treated 衣的模糊粒度数据。其中一些数据被显示出来, 因此这个图像是从摩尔et al.中修改的。17 请单击此处查看此图的较大版本.

Figure 3
图 3: 病毒的 TEM. 4 悉尼衣受不同热处理的影响.纯化衣 (vlp) 受各种热处理和透射电镜观察。面板 (a) 显示在不同温度下加热的衣的数据 (60, 65、70、75和80° c) 为 1 min. 面板 (b) 显示衣受68° c 处理的 0-25 min. 缩放 (bar) 右侧照片代表 100 nm。这些图像显示在摩尔et al.17 请单击此处查看此图的较大版本.

指数衰变率 (% 信号/分钟)
温度 65° c 68° c
配
HBGA A 型 2.50 ±0.24 13.30 ±1.15
适 M6-2 2.47 ±0.66 13.18 ±0.47

表 1: 指数衰减率为病毒 GII. 4 悉尼衣处理在65° c 和68° c.衣在65° c 和68° c 时受到不同时间的热处理, 在4° c 时冷却, 其结合合成 HBGA 或适的能力被评估。然后计算每种温度下各配体的信号损耗率 (衰变率)。这些数据以前已在摩尔et al.中呈现17数据显示为% 信号/最小±1标准偏差的百分比信号。

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Discussion

这里描述的协议和技术提供了一种评估人类病毒衣壳完整性/功能的方法。这些方法可用于获得对病毒灭活治疗效果的机械论洞察力, 并有可能补充更多传统的失活评估方法, 如 RT qPCR 或斑块检测。例如, 仅通过斑块法对化学或物理失活的评价, 就可以衡量病毒失活的程度, 而不是该失活的根本机制。此外, 病毒聚集可能导致低估的效价, 因此高估治疗效果30。这些方法可以通过提供有关治疗对病毒衣壳完整性的影响的信息来进一步告知这一研究。最近, 两个体外(细胞培养) 培养方法为人类病毒已报告5,6;这些仍然依赖于 PCR 的病毒计数, 虽然理论上的 enteroid 模型可用于 TCID50 使用抗体染色的相对还原测定。本文所提出的方法可用于了解多种不同类型治疗的病毒灭活的完全机制, 而不仅仅是热处理。例如, plate-based 配体结合和 TEM 作为辅助 qPCR 和斑块测定数据的工具, 在测定铜表面的病毒失活机理时,31,32, 暴露于银二氢柠檬酸盐33, 以及高静水压处理14。

在这些协议中有许多步骤, 注意方法上的细节是至关重要的。具体地说, 对于钢板的检测, 必须非常注意用于稀释配体的缓冲剂以进行装订。适 M6-2 和 ssDNA 适一般都对盐的浓度和缓冲条件敏感。使用带有适的非缓冲区可以蚀绑定。虽然适 M6-2 已成功地用于稀释人的粪便, 太多的粪便/基质干扰可以干扰绑定, 这是一致的观察其他人类病毒适18,22。造成这种情况的一个主要因素是, 适可以表现出一定程度的非特异性结合, 以积极带电的分子。因此, 这可能导致某种程度的假阳性信号, 在这里所描述的化验。这可以通过选择一个消极的控制, 要么是一个复杂的矩阵没有病毒或不相关的蛋白质。同样, 在结合缓冲液中使用的 HBGA 浓度和脱脂牛奶固体的数量会显著影响正面和背景信号。请注意, 不同的 HBGAs 对不同的人病毒菌株有不同程度的亲和力, 因此可能需要根据 HBGA 类型14、3133来优化绑定缓冲区。对于亲和-辣根过氧化物酶共轭的缓冲剂也应给予类似的考虑, 因为不同制造商的浓度可能不同;然而, 鉴于亲和-生物素相互作用的高度亲和性34, 可预期的变异性会少得多。由于这种 plate-based 方法具有高度的适应性, 因此对次优结果进行故障排除是相对简单的。例如, 在高背景信号的情况下, 可以通过提高脱脂乳浓度和降低配体浓度来进行优化, 并对低正向信号的板进行反之亦然的研究. 对于 TEM 来说, 最重要的考虑因素之一是在存储/处理网格时使用非静态材料 (如玻璃), 因为网格在诸如一次性的培养皿等材料的处理上极其困难。如果使用这种材料, 网格将倾向于 "跳跃" 并粘在材料上。此外, 应注意确保网格上没有残余水分。理想情况下, 如果可用, 应使用真空干燥。

在使用 dl 进行实验时, 样品的纯度是一个非常重要的考虑因素。用于将光散射强度的变化与直径相关联的函数依赖于具有 monomodal 或窄多模态粒子分布。杂质降低到纳米尺度, 包括蛋白质, 引入多和改变尺寸计算。此外, 光散射的强度与直径提高到6的功率成正比, 所以大颗粒如灰尘会极大地干扰测量。real-time 热处理过程中气泡的形成导致了由于气泡散射而产生的光的无意义结果。使用 dl 时, 还必须考虑衣壳 (vip) 浓度。样品浓度必须足够高, 以产生足够的信号和低到足以避免多次散射。这也是至关重要的输入正确的材料和分散剂的属性, 因为这些价值是由软件使用大小计算。特别是, 分散剂的粘度是温度的函数, 必须在热处理过程中相应地进行调整 (所使用的软件具有温度依赖性的水黏度)。

虽然这里描述的方法提供了多种机会来改进评估衣壳完整性的方法, 但它们并不完美。由于这些方法需要非常高浓度的病毒, 它们必须使用纯化, 组装衣而不是本地感染病毒。这里所用的 vlp 由人类病毒 (VP1) 的主要衣壳蛋白组成, 它组装成无病毒核酸的病毒衣壳。虽然这些 vlp 表现出抗原类似的行为, 以传染性病毒衣, 他们可能更容易失活。此外, vlp 是很难生产和纯化, 并没有现成的许多调查。使用纯化的人类病毒 (例如, 使用离心) 是可能的, 但病毒阳性人粪标本的可用性有限, 甚至与纯化, 病毒滴可能不够高, 以适应方法这里描述。目前正在进行的在粪便中使用 semi-purified 传染性病毒的优化化验的未来工作正在进行中。事实上, 这已经被证明为平板检测18,22, 但无疑会更复杂的 dl。还应指出, 这些方法只适用于应用物理 (热) 失活方法来评估衣壳的完整性, 这是已知的直接影响的衣壳。结果可能更模棱两可的是, 这些技术用于评估的衣壳完整性使用其他失活方法, 如化学剂或方法, 主要目标是破坏病毒基因组。然而, 一些报告已经证明了 HBGA 结合的性能评估化学灭活31,33,35,36,37。目前, 这里所报告的协议最好与传统技术 (如 RT qPCR 和 pl) 协同使用。aque 化验与代理病毒。

这些协议提供了一个简单的替代手段, 以了解物理病毒灭活方法 (热) 对人类病毒的影响。这些方法可能会扩展, 以便与其他 non-enveloped 病毒 (例如、甲型肝炎和 e 病毒) 一起使用, 因为检测高阶蛋白质结构损失的总体原理是相同的。此外, 还应评估其他配体的行为和潜在用途, 以表明其对衣壳完整性的损失。将协议改编为更复杂的样本矩阵, 并提高它们的分析灵敏度 (检测限度) 也是一个合乎逻辑的未来方向。总的来说, 这里描述的方法提供了一个更容易接近的手段来确定人类病毒衣壳的完整性, 并获得对这种重要病原体的灭活治疗效果的机械洞察力。

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Disclosures

作者没有什么可透露的。

Acknowledgments

这项工作得到了农业和食品研究倡议的支持, 2011-68003-30395 号来自美国农业部、国家粮食和农业研究所通过 NoroCORE 项目进行的竞争性赠款。美国农业部提供了开放获取费用的资金。我们要感谢罗伯特 Atmar (贝勒医学院, 休斯敦, 德克萨斯州) 好心提供我们纯化的衣和瓦莱丽拉帕姆为她的协助与 TEM 图像。我们还要感谢弗兰克 n. 巴里帮助我们开始了实验。

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Plate-Based Binding Assay for Evaluating Loss of Higher Order Norovirus Capsid Structure
96-well, medium-binding polystyrene EIA plate Fisher (Costar) 07-200-36
Lid for 96-well plate Thermo Fisher 3098
Paraffin film (Parafilm) Thermo Fisher PM999
1x PBS (pH 7.2) Life Technologies 20012-050
Polysorbate 20 Sigma-Aldrich P9416
1x PBS (pH 7.2) + 0.05% Polysorbate 20 N/A N/A
Purified, assembled human norovirus GII.4 capsids N/A N/A
Individual 0.2 ml PCR tubes Genesee Scientific 22-154G
2 thermocyclers Bio-Rad 1861096
Tabletop mini centrifuge Fisher Scientific 12-006-901
Skim milk solids Thermo Fisher LP0031B
Synthetic histo-blood group type A disaccharide, biotinylated Glycotech 01-017
Biotinylated aptamer M6-2 (stock concentration 100 µM in nuclease-free water): 5'-/5Biosg/AGTATACGTATTACCTGCAGCTGGGAAGAGGTCCGGTAAATGCAGGGTCAGCCCGGAGAGCGATATCTCGGAGATCTTGC -3’ Integrated DNA Technologies N/A
Streptavidin-horseradish peroxidase conjugate (ELISA grade), We use Life Technologies SNN2004 Life Technologies SNN2004
3,3’,5,5’-tetramethylbenzidine (TMB) substrate, room temperature Thermo Fisher 50-76-00
1 M phosphoric acid N/A N/A
Microplate reader capable of reading 450 nm Tecan Infinite m200 Pro
Name Company Catalog Number Comments
Analysis of Plate-Based Assay Results
Microsoft Excel or similar program N/A N/A
Name Company Catalog Number Comments
Dynamic Light Scattering Experiments
Zetasizer ZSP, or similar particle size analysis instrument Malvern Instruments N/A
Vortex Fisher Scientifc 02-215-365
Quartz cuvette Hellma 104-002-10-40
Small volume disposable cuvette (to reduce VLP use) Malvern Instruments ZEN0040
Name Company Catalog Number Comments
Transmission Electron Microscopy Sample Preparation
Nickel electron microscopy grids with carbon support film Ladd Research 10880-100
Self-closing reverse electron microscopy tweezers Ted Pella 5372-NM
Qualitative filter paper Sigma-Aldrich (Whatman) WHA1002055
Glass petri dishes Sigma-Aldrich BR455743
100 mM stock HEPES solution (pH 7.2) N/A N/A
2% uranyl acetate N/A N/A

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References

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